Αφηρημένο

Ιστορικό

Ως πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης, p70S6K παίζει σημαντικό ρόλο στον όγκο κύτταρα. Αποδεικτικά στοιχεία αποκάλυψε υπερέκφραση p70S6K και φωσφορυλιωμένων p70S6K (ρ-p70S6K) σε διάφορους ιστούς όγκου, με αυτές τις πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικοί δείκτες σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του ειδικού αναστολέα της p70S6K PF-4708671 σε NSCLC.

Μέθοδοι

Τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC (Α549, SK-MES-1 και NCI-Η460) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PF-4708671 σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις, συμπεριλαμβανομένων των 0,1 μΜ, 0.3 μΜ, 1 μΜ, 3 μΜ και 10 μΜ, και τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με Western κηλίδας. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκαν επιδράσεις PF-4708671, τόσο

in vitro

(κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, και εισβολή) και

in vivo

.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης του ρ-p70S6K και κατάντη τελεστή S6 μειώθηκαν σημαντικά από PF-4708671. Διαμετρικά αντίθετες, οι μεταγενέστεροι επίπεδα πρωτεΐνης του BAD, Caspase3 και ERK είχε αυξηθεί μετά τη θεραπεία με PF-4708671. Επιπλέον, PF-4708671 δραστικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής στο Α549, SK-MES-1 και κύτταρα NCI-H460

in vitro

, προκαλώντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G0-G1 φάση. Περιορισμένα αποτελέσματα του PF-4708671 παρατηρήθηκαν στην απόπτωση στα τρία NSCLC κυτταρικές σειρές αξιολογούνται. Είναι σημαντικό, PF-4708671 θα μπορούσε να αναστείλει την ογκογένεση σε άτριχα ποντίκια

in vivo

.

Συμπέρασμα

Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η p70S6K ειδικός αναστολέας PF-4708671 έχει ανασταλτικές επιπτώσεις στη NSCLC ογκογένεση

in vitro

και

in vivo

. Ως εκ τούτου, p70S6K θα πρέπει να θεωρηθεί ως νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο, και PF-470867 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φάρμακο που στοχεύει για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Qiu ZX, Sun RF, Μο XM, Li WM (2016) Η p70S6K ειδικός αναστολέας PF-4708671 παρεμποδίζει μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ανάπτυξης του καρκίνου. PLoS ONE 11 (1): e0147185. doi: 10.1371 /journal.pone.0147185

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 17, Νοεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 30ης Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 15, Ιανουαρίου, 2016

Copyright: © 2016 Qiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81372504), το Πρόγραμμα Στήριξης Επιστήμης και Τεχνολογίας του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας του Σιτσουάν επαρχία (2014SZ-0148), και το Διεθνές Πρόγραμμα συνεργασίας του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Sichuan (2014AA022202-2)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Ιστορικό

ο καρκίνος του πνεύμονα, μία από τις πιο κοινές κακοήθειες, είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, με τα υψηλότερα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας στην Κίνα. Περισσότερο από το 80% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα διαγιγνώσκονται ως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [1]. Παρά συνδυαστική θεραπεία με χειρουργική εκτομή, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, και βιολογική θεραπεία στόχου, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών από καρκίνο του πνεύμονα είναι μόνο 16%, που κυμαίνονται από 52,2% έως 4% σε ασθενείς με τοπικά και απομακρυσμένα στάδιο, αντίστοιχα [2]. Ως εκ τούτου, ο εντοπισμός των νέων στόχων και διευκρίνιση των αλλαγών σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσε να είναι επωφελής για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Ως πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης της οικογένειας κινασών AGC, p70S6K φωσφορυλιώνεται από διαφορετικούς παράγοντες ανάπτυξης και την ινσουλίνη -όπως παράγοντες μέσω του μονοπατιού PI3K /mTOR, και αλληλεπιδρά με S6, eIF4B, eEF2K, PDCD4 και πολλά άλλα υποστρώματα? Αυτό είναι σημαντικό για τον πολλαπλασιασμό επαγόμενο από μιτογόνα κυττάρου, επιβίωση, την κινητικότητα και την αντίσταση φάρμακο χημειοθεραπείας σε καρκινικά κύτταρα [3]. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του p70S6K και π-p70S6K σε διάφορους ιστούς όγκων είναι σημαντική στην πρόβλεψη φτωχή πρόγνωση, και συμβάλλει στην αντίσταση χημειοθεραπεία [4-14].

In vitro

υπερέκφραση p70S6K προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την αγγειογένεση, και η καταστολή της απόπτωσης [15, 16]. Εν τω μεταξύ, S6K1 knockdown αναστέλλει την έκφραση p70S6K και μειώνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μειώνοντας το σχηματισμό όγκου σε γυμνούς ποντικούς [17]. Επιπλέον, τα επίπεδα p70S6K και ρ-p70S6K είναι σημαντικά υψηλότερες από ό, τι στους όγκους σε φυσιολογικούς ιστούς από ασθενείς με NSCLC [18, 19]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ρ-p70S6K έχει στενή σχέση με τη μακροπρόθεσμη επιβίωση σε NSCLC [20]. Ως εκ τούτου, p70S6K διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον NSCLC, και την αξιολόγηση των υψηλής εξειδίκευσης αναστολείς p70S6K θα μπορούσε να βοηθήσει περαιτέρω προσδιορισμό αυτό το νέο θεραπευτικό στόχο για κλινική εφαρμογή.

Οι τρέχουσες μελέτες των θεραπειών στόχος για τον καρκίνο του επικεντρώνονται κυρίως σε αναστολείς mTOR [20] , ενώ τα έργα ειδικά για την αξιολόγηση των αναστολέων p70S6K στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα περιορίζεται [21-25]. Αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε στις συγκεκριμένες ρ70δ6Κ αναστολέα PF-4708671 για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της αναστολής p70S6K σε NSCLC [22].

Μέθοδοι

1. PF-4708671 (C

19Η

21F

3Ν

6)

PF-4708671 (# 559273 Calbiochem, Merck, USA) είναι ένας αναστολέας της S6K1 (Ki = 20 nM ? IC50 = 160 nM). 10 mg του PF-4708671 διαλύονται πλήρως εντός 1 ml DMSO και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για

in vitro

πειράματα. Για

in vivo

προσδιορισμούς, PF-4798671 διαλύθηκε σε 10% DMSO πρώτα και κατόπιν αραιώνεται σε 30% PEG400, 0,5% Tween 80 και 5% προπυλενογλυκόλη, για να επιτευχθεί μια τελική συγκέντρωση DMSO 1%.

2. Κυτταρικής καλλιέργειας

Τρεις μη-μικροκυτταρικό καρκίνο κυτταρικές σειρές πνεύμονα ελήφθησαν από Type Culture Collection της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Θα περιλαμβάνονται Α549 (αδενοκαρκίνωμα), ΝΟΙ-Η460 (καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου), και SK-MES-1 (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων) κυττάρων. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο περιβάλλον που περιέχει 5% CO2 στους 37 ° C.

3.

κηλίδος Western

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα χρησιμοποιώντας την φωσφορυλιωμένη κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης (keygen, Nanjing, Κίνα), και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Προσδιορισμού Πρωτεΐνης BCA (Thermo επιστημονικές, Rockford, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από διάφορα δείγματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση δωδεκύλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν πάνω σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billeraica, USA). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-p70S6K R365, αντι-ρ-p70S6K T389, αντι-ριβοσώματος πρωτεΐνη S6 A229 (# BS1568, # BS4440, # BS3610, 1? 1000, Bioworld Technology, Nanjing, Κίνα ), αντι-BAD, αντι-Caspase3, αντι-ΕΚΚ (# 9239P, # 96625, # 3552S, 1: 1000, Cell Signaling Technology), και αντι-β-ακτίνης (# 4970, 1: 5000, Cell Signaling Technology) αντισώματα, αντίστοιχα. πρωτεΐνες-στόχοι ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Philadelphia, USA) μετά από έκθεση σε χημειοφωταυγή HRP υπόστρωμα (Millipore, Billerica, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με την ποσότητα Ένα λογισμικό ανάλυσης 1-D (Bio-Rad).

4. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών NSCLC μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων kit-8 (CCK-8? Dojindo, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κύτταρα όγκου σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 ανά φρεάτιο. Μετά από επώαση σε παρουσία του PF-4708671 (0,1 μΜ, 0.3 μΜ, 1 μΜ, 3 μΜ και 10 μΜ) για 24, 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, αξιολογήθηκε ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. DMSO επεξεργασμένο ή κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Επιπλέον, ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67 εξετάστηκε με ανοσοϊστοχημεία σε nude ιστούς όγκων.

5. κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για κάθε κυτταρική γραμμή, περίπου 1 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επεξεργασία με 10 μΜ PF-4708671 για 24 ώρες? κατανομή του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης κυτταρικού κύκλου (keygen, Nanjing, Κίνα)? περιεχόμενα DNA προσδιορίσθηκαν σε Κυτταρόμετρο FACSCalibur Flow (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest και ΜΟϋΡΙΤ.

6. Κυττάρων εισβολή

κυττάρων εισβολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Millipore κύτταρο εισβολή δοκιμασίας (# ECM550, Millipore, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, μετά από θεραπεία με PF-4708671 στα 10 μΜ για 24 ώρες. Τα κυτταρικά εναιωρήματα που περιέχουν 1 × 10

6 κύτταρα /ml σπάρθηκαν πάνω στον άνω θάλαμο με μέσο συμπληρωμένο με 1% ορό. Media που περιέχει 20% FBS προστέθηκαν κάτω θαλάμους.

7. Κυτταρικής απόπτωσης

Περίπου 5 χ 10

5 κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή με PF-4708671 στα 10 μΜ για 24 ώρες, και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (KeyGen, Nanjing, Κίνα ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ο φθορισμός μετρήθηκε σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur. Αννεξίνης V-θετικά και 7ΑΑΌ-αρνητικά κύτταρα θεωρούνται ότι είναι αποπτωτικά. Επιπλέον, η μέθοδος TUNEL χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της απόπτωσης σε ιστούς όγκων ξενομοσχεύματος.

8.

In vivo

αποτελέσματα του PF-4708671 σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ιδρύθηκε με Η460 κύτταρα

Η460 κύτταρα, τα οποία παρουσίασαν τον υψηλότερο ρυθμό ανάπτυξης, επιλέχθηκαν για

in vivo

πειράματα. Θηλυκά γυμνά ποντίκια (4 εβδομάδες, 18 έως 20g) αγοράστηκαν από το Πεκίνο WeiTongLiHua πειραματόζωο τεχνική συνεργασία., LTD. (Κίνα), και στεγάζεται στο Κέντρο Ζώων της Δυτικής Κίνας Sichuan University, με /σκότους 12 ωρών φωτός 12h. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε συνθήκες SPF (Ειδική Pathogen Free). Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες τυχαία, και κάθε ομάδα περιείχε τρία ποντίκια (η = 3 /κάθε ομάδα). Τα τελικά σημεία της παρατήρησης ήταν ως εξής: 1) η διάμετρος των όγκων & gt? 3 εκατοστά? 2) μεταμοσχευθούν όγκοι είχαν νέκρωση ή /και φθορά? 3) φυσικό θάνατο. Η μέθοδος της θυσίας στο τέλος του vivo έρευνα αποκεφαλίστηκε μετά την αναισθησία υπό την προϋπόθεση της χωρίς άλλα ποντίκια θα μπορούσε να δει. Στην Ομάδα 1 (ομάδα Η460), 1 × 10

7 Η460 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς. Ομάδα 2 (αρνητικός έλεγχος, NC ομάδα) τα ζώα εγχύθηκαν κύτταρα όπως στο Ομάδα1? Τρεις ημέρες αργότερα, αυτοί χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς 200 μΙ του μίγματος διαλύτη (1% DMSO, 30% PEG400, 0,5% Tween80 και 5% προπυλενογλυκόλη) καθημερινά για 1 εβδομάδα. Στην Ομάδα 3 (Η460 + ομάδα PF4708671), τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως περιγράφεται για την Ομάδα 2, με 200 μΐ PF4708671 (50 mg /kg) αντί του μίγματος διαλύτη. Οι όγκοι μεγέθη μετρήθηκαν καθημερινά για περισσότερο από μία εβδομάδα (μακρά διάμετρος = α? Σύντομο διάμετρος = β), και όγκοι προκύπτει ως εξής: V = ab2 /2. ρυθμός αναστολής του όγκου = [(όγκου έλεγχο του βάρους-πειραματική βάρος του όγκου) /τον έλεγχο του βάρους του όγκου] x 100%. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου Δυτικής Κίνας.

9. Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία από το Microsoft Excel 2010. Χρησιμοποιώντας το SPSS 19.0 λογισμικό, t-test και ένας τρόπος-ANOVA εφαρμόστηκαν για την ανάλυση δεδομένων. Τα δεδομένα είναι μέση τιμή ± SD, και δύο όψεων

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

1. PF-4708671 αναστέλλει p70S6K και S6 φωσφορυλίωση

Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι οι συγκεκριμένες ρ70δ6Κ αναστολέα PF-4708671 μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση της p70S6K και κατάντη S6 του σε 0,1 μΜ (

P

& lt? 0,05) ? επίπεδα έκφρασης ρ-S6 μειώθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου (

P

& lt? 0,05). Αντίθετα, τα επίπεδα πρωτεΐνης του κατάντη BAD, Caspase3 και ERK αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία με PF-4708671 με τη συγκέντρωση του 1 μΜ. Ωστόσο, τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης p70S6K και S6 δεν είχε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δυο ομάδων ελέγχου και θεραπείας (Σχήμα 1, S1 αρχείου).

1. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του p70S6K, ρ-p70S6K, S6, και ρ-S6 μετά από θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις φαρμάκου. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. 2. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ρ-p70S6K και ρ-S6 υπό διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου.

P

& lt? 0.05: Η ομάδα θεραπείας από τα ναρκωτικά vs αρνητική ομάδα ελέγχου. Ν, αρνητικός έλεγχος? Α, Η460? Β, Α549? C, SK-MES-1.

Η

2. PF-4708671 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC

CCK-8 δεδομένα προσδιορισμού κατέδειξαν ότι οι ικανότητες πολλαπλασιασμού των τριών κυτταρικών γραμμών NSCLC σημαντικά αναστέλλονται από PF-4708671. Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας, PF-4708671 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό Η460 στα 10 μΜ, και Α549 και SK-MES-1 κύτταρο ποσά ήταν σημαντικά μειωμένες σε 3 μΜ και 0,1 μΜ, αντίστοιχα (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, Η460, Α549 και SK-MES-1 ρυθμούς ανάπτυξης των κυττάρων ήταν σημαντικά αναστέλλεται από PF-4708671 σε 0,3 μΜ, 0,1 μΜ και 0,1 μΜ, αντίστοιχα, 48 ώρες μετά τη θεραπεία (

P

& lt? 0.05). Όλες οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη πολλαπλασιασμό σε 72 ώρα μετά την αγωγή με 0,1 μΜ PF-4708671 (

P

& lt? 0,05). Σημαντικές χρόνου και εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (

P

& lt? 0,05). (Σχήμα 2)

ρυθμός αναστολής της διάδοσης = [1 – (πειραματική ομάδα τιμές – κενή τιμή) /(αρνητική τιμή ομάδα ελέγχου -. κενή τιμή)] × 100%

Η

3. PF-4708671 επηρεάζει NSCLC κυτταρικού κύκλου

Μετά τη χρώση του DNA από τα PI, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε σύλληψη του κυτταρικού κύκλου στην φάση G0 /G1 και για τις τρεις κυτταρικές σειρές ΜΜΚΠ (

P

& lt? 0,05). Εν τω μεταξύ, οι αναλογίες των κυττάρων σε S και G2 /M φάσεις μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα Α549 (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, μειωμένες ποσότητες φάσης S (Η460) και G2 φάση /M (SK-MES) κύτταρα ανιχνεύθηκαν επίσης (

P

& lt? 0,05). (Σχήμα 3)

(* p & lt?. 0.05, ομάδα θεραπείας από τα ναρκωτικά vs αρνητική ομάδα ελέγχου)

Η

4. PF-4708671 αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική διείσδυση

PF-4708671 ανέστειλε την ικανότητα εισβολής στις τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC αξιολογηθεί. Πράγματι, ο μέσος όρος του αριθμού των κυττάρων που διέρχονται από το εξωκυτταρικό γέλη μήτρα ήταν σημαντικά χαμηλότερες στις ομάδες θεραπείας σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες (

P

& lt? 0,05), με τα ποσοστά αναστολής εισβολή του 75,90%, 46,23% και 82,73%, για Η460, Α549 και SK-MES-1 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 4).

Η

5. PF-4708671 αυξάνει NSCLC κυτταρική απόπτωση

PF-4708671 έδειξε περιορισμένη επίδραση στην απόπτωση στις τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC, παρόλο που λήφθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές (

P

& lt? 0,05). Σε σύγκριση με αρνητικό ομάδες ελέγχου, τα ποσοστά απόπτωσης για Η460, Α549 και SK-MES-1 κυτταρικές σειρές αυξήθηκαν κατά 1,537%, 2,483% και 3,475%, αντίστοιχα (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 5).

Η

6. PF-4708671 αναστέλλει ογκογένεση

in vivo

Η

Όλα τα μεταμοσχευμένους όγκους αναπτύχθηκαν με επιτυχία σε κάθε ποντίκι, και όλα τα ποντίκια δεν έχουν κανένα σημάδι miscomfort ή /και την ταλαιπωρία μέχρι να τους θανατώσουν. Οι τάσεις των όγκων του όγκου σε γυμνά ποντίκια για κάθε ομάδα συνοψίζονται στον Πίνακα Α σε S1 και S2 File Σχ. Τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με τον συγκεκριμένο αναστολέα p70S6K PF470867 έδειξε φανερά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα 1 (Η460) και ομάδα 2 (NC) (όλα

P

& lt? 0,05). Όπως φαίνεται στον Πίνακα Β σε S1 αρχείων και S3 Σχ, βάρη και όγκοι των όγκων αποκόπηκε ήταν χαμηλότερες μετά από θεραπεία με PF470867 σύγκριση με τιμές ελέγχου (

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, όπως εκφράζεται από το Ki-67, ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα Η460 + PF4708671 σύγκριση με τιμές που λαμβάνονται για τις δύο ομάδες ελέγχου. Τέλος, η χρώση TUNEL επέδειξε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό αποπτωτικών για καρκινικά κύτταρα στην Ομάδα 3 σε σύγκριση με το μάρτυρα (Ομάδες 1 και 2) Οι τιμές (Σχήμα 6).

βέλη δείχνουν θετικά χρωματισμένα κύτταρα. Αρχική μεγέθυνση, × 400.

Η

Συζήτηση

p70S6K συμμετέχει σε ογκογενετικότητας και τον καρκίνο εξέλιξη, αλλά ο μηχανισμός στηρίζεται δράση του δεν είναι πλήρως κατανοητός. Μελέτες αξιολόγησης p70S6K σε σχέση με NSCLC είναι λιγοστές? έχουμε διαπιστώσει στο παρελθόν ότι p70S6K υπερέκφραση προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC, αναστέλλει την κυτταρική απόπτωση και ενισχύει την ικανότητα εισβολής. Για να κατανοηθεί περαιτέρω ο ρόλος των αναστολέων p70S6K σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, η παρούσα μελέτη αξιολόγησε τρεις NSCLC κυτταρικές γραμμές (Α549, SK-MES-1, και ΝΟΙ-Η460) αντιμετωπίστηκαν με PF-4708671, και αξιολογήθηκαν οι αλλαγές των κακοήθων φαινότυποι όπως πολλαπλασιασμό, την εισβολή και την απόπτωση φοροδιαφυγής.

όπως φαίνεται από τα παραπάνω, η p70S6K αναστολέας PF-4708671 ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση της p70S6K και το κλειδί καθοδικός τελεστής της S6, εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Επιπλέον, τα επίπεδα πρωτεΐνης του κατάντη BAD? Caspase3 και ERK, η οποία επηρεάζει την ικανότητα της απόπτωσης των κυττάρων, αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία με PF-4708671. Αυτό αποδείχθηκε ότι PF-4708671 θα μπορούσε να επηρεάσει την επιβίωση των κυτταρικών σειρών «NSCLC από τη ρύθμιση των σχετικών παραγόντων της απόπτωσης. Επιπλέον, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC η ώρα και η συγκέντρωση αναστέλλεται κατά εξαρτώμενο από PF-4708671, επιβεβαιώνοντας προηγούμενες εκθέσεις [15-17]. Έτσι, προτείνεται η ρύθμιση p70S6K σχετίζεται με την κυτταρική απόπτωση. Οι διαφορές σε ελάχιστες αποτελεσματικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου για τις κυτταρικές γραμμές NSCLC αξιολογούνται μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικά επίπεδα p70S6K τους και οι ρυθμοί ανάπτυξης: βρήκαμε ρυθμό αναστολής ανάπτυξης από 30 έως 40%

Υποθέσαμε ότι με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. , PF-4708671 μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι S6K1 και p70S6K είναι κρίσιμης σημασίας για την G1 σύλληψη [26-28]. Σταθερά, βρήκαμε ότι PF-4708671 επηρεάζονται διανομή του κυτταρικού κύκλου στις τρεις NSCLC κυτταρικές γραμμές αξιολογούνται, καθυστερώντας σημαντικά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1 φάση. Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων είναι η απόπτωση? μια δοκιμή φάσης Ι της LY2584702 αξιολόγηση των προηγμένων ασθενών με συμπαγείς όγκους δεν έδειξαν καμία εμφανή επίδραση κατά του όγκου με αυτό το φάρμακο [25]. Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, PF-4708671 είχε περιορισμένη επίδραση στην κυτταρική απόπτωση στα κύτταρα NSCLC, με ένα ρυθμό απόπτωσης κοντά στο 3% in vitro. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι οδοί p70S6K δεν μπορεί να εμπλέκεται στην κυτταρική απόπτωση. Ωστόσο, αυτή η μελέτη έδειξε επίσης ότι PF-4708671 αναστέλλει NSCLC ογκογένεση

in vivo

.

p70S6K υπερέκφραση δείχθηκε ότι σχετίζεται με επιθετική ασθένεια και κακή πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού [29]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε p70S6K υπερέκφραση προωθεί κυτταρική εισβολή

in vitro

. Είναι ενδιαφέρον ότι, PF-4708671 θα μπορούσε να αναστείλει την ικανότητα εισβολής των όλες τις κυτταρικές σειρές NSCLC αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Αντίθετα, μελέτες σε ασθενείς με NSCLC έδειξε ότι η έκφραση ρ-p70S6K δεν σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα και το στάδιο του καρκίνου [18-29]. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιβεβαιώσουν το ρόλο της p70S6K σε NSCLC εισβολή και τη μετάσταση

in vivo

.

Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν κάποιους περιορισμούς στην έρευνα μας. Πρώτα απ ‘όλα, αν και όλα τα κύτταρα ήταν NSCLC κυτταρικές σειρές, οι πηγές ήταν διαφορετικά. Έτσι, τα αποτελέσματα μας δεν θα μπορούσε να είναι απολύτως συνεπής, διότι μπορεί να υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί, μεταξύ διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο. Επιπλέον, η ποσότητα δεν ήταν αρκετά μεγάλο για πειράματα γυμνών ποντικών in vivo. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα χρειάζονται περαιτέρω σε βάθος έρευνα για να επιβεβαιωθεί.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας έδειξε ότι η p70S6K αναστολέας PF-4708671 θα μπορούσε να επηρεάσει τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και την εισβολή στα κύτταρα NSCLC. Η αναστολή του άξονα p70S6K-S6 οδήγησε σε ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου. Ως εκ τούτου, η συνδυαστική θεραπεία με αναστολέα της p70S6K και χημειοθεραπεία αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη νέα στρατηγική για τη θεραπεία NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του BAD, Caspase3 και ERK μετά από θεραπεία με PF-4708671

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. τάση αύξησης του όγκου του όγκου σε κάθε ομάδα άτριχων ποντικών (mm

3)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. Σύγκριση των μεγεθών των όγκων μεταξύ των ομάδων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s003

(ΔΕΘ)

S1 αρχείου. Πίνακας Α όγκου αύξηση του όγκου της κάθε ομάδας σε γυμνά ποντίκια (η = 3 /mm

3). Πίνακας Β όγκου ξενομοσχεύματα βάρος κάθε ομάδας ()

doi:. 10.1371 /journal.pone.0147185.s004

(DOCX)

Ευχαριστίες

Χάρη σε καθηγητή Μο XM μας έδωσε ένα καλό περιβάλλον εργαστηρίου και τον εξοπλισμό.