Abstract

Σωματικές μεταλλάξεις στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) γονίδιο που σχετίζεται με την κλινική απόκριση σε αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (ΤΚΙδ), όπως gefitinib, σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ( NSCLC). Ωστόσο, χουμικών ανοσοαποκρίσεων προς EGFR σε ασθενείς με NSCLC δεν έχουν καλά μελετηθεί. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η κλινική σημασία της ανοσοσφαιρίνης G (IgG) απαντήσεις σε EGFR-πεπτίδια που προέρχονται από ασθενείς με NSCLC που λαμβάνουν gefitinib. Οι τίτλοι IgG πλάσματος σε κάθε μία από 60 διαφορετικές EGFR πεπτίδια προερχόμενα 20-μερές μετρήθηκαν με το σύστημα Luminex σε 42 ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με NSCLC gefitinib. Οι σχέσεις μεταξύ των IgG τίτλοι ειδικού για το πεπτίδιο και παρουσία μεταλλάξεων EGFR ή την επιβίωση των ασθενών εκτιμήθηκαν στατιστικώς.

τίτλοι IgG εναντίον των egfr_481-500, egfr_721-740, και egfr_741-760 πεπτίδια ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε ασθενείς με εξόνιο 21 μετάλλαξη σε σχέση με εκείνους χωρίς αυτό. Από την άλλη πλευρά, οι τίτλοι IgG έναντι του egfr_841-860 και egfr_1001-1020 πεπτίδια ήταν σημαντικά χαμηλότερες και υψηλότερες, αντίστοιχα, σε ασθενείς με απαλοιφή στο εξώνιο 19. ανάλυση παλινδρόμησης Cox Πολυμεταβλητή έδειξαν ότι η IgG αποκρίσεις σε egfr_41_ 60, egfr_61_80 και egfr_481_500 ήταν σημαντικά προγνωστική για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη ανεξάρτητη από άλλα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, ενώ εκείνοι στην egfr_41_60 και egfr_481_500 πεπτίδια ήταν σημαντικά προγνωστικές για τη συνολική επιβίωση. Ανίχνευση IgG απαντήσεις σε EGFR-πεπτίδια προερχόμενα μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο για την πρόγνωση των ασθενών με ΜΜΚΠ που λαμβάνουν gefitinib. Τα αποτελέσματά μας μπορεί να προσφέρει νέες γνώσεις για την καλύτερη κατανόηση της χυμικής απαντήσεις σε EGFR σε ασθενείς με ΜΜΚΠ

Παράθεση:. Azuma K, Komatsu Ν, Hattori S, Matsueda S, Kawahara Α, Sasada T, et al. (2014) χουμικών ανοσοαποκρίσεων προς EGFR-πεπτιδίων που προέρχονται από Προβλέψτε Progression-Free και τη συνολική επιβίωση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς που ελάμβαναν το gefitinib. PLoS ONE 9 (1): e86667. doi: 10.1371 /journal.pone.0086667

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 29 του Αυγ 2013? Αποδεκτές: 12 Δεκέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιαν, 2014

Copyright: © 2014 Azuma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας: Grant-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Β), JSPs KAKENHI Grant αριθμό 19790571. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία. θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ένα από τα πιο μελετημένα υποδοχείς κινάσης τυροσίνης, είναι ένας πρωτότυπος υποδοχέας κυτταρικής επιφάνειας που μπορούν να στοχευθούν από φάρμακα κατά του καρκίνου του πνεύμονα. Η οικογένεια EGFR είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και μετανάστευσης [2]. Οι σωματικές μεταλλάξεις εις το γονίδιο EGFR έχουν ταυτοποιηθεί ως ένα σημαντικό καθοριστικό παράγοντα της κλινικής ανταπόκρισης στη θεραπεία με αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (ΤΚΙδ), όπως gefitinib και erlotinib, σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Οι περισσότερες από τις μεταλλάξεις του EGFR συμβαίνουν στα εξόνια 19 έως 21, οι οποίες κωδικοποιούν την περιοχή κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα. Διαγραφές στο εξόνιο 19 (όπως delE746-A750) και το σημείο L858R μετάλλαξη στο εξόνιο 21 είναι οι συχνότερες μεταλλάξεις που βρέθηκαν στο NSCLC, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 90% του συνόλου των μεταλλάξεων του EGFR. Αυτές οι μεταλλάξεις βρίσκονται συχνότερα σε γυναίκες ασθενείς, σε άτομα που δεν έχουν καπνίσει ποτέ, και σε ασθενείς Ασιατικής καταγωγής Ανατολή [3] – [5]. Υποψήφιοι κλινικές δοκιμές της θεραπείας του EGFR ΤΚΙ σε ασθενείς με NSCLC με

EGFR

μεταλλάξεις έδειξαν ποσοστά αξιοσημείωτη ανταπόκριση της τάξης του 80% [6] – [8].

Στο παρελθόν, έχουμε αναπτύξει εξατομικευμένες πεπτίδιο εμβολιασμού (PPV) ως ένα νέο τροπικότητα για θεραπεία καρκίνου, όπου τα αντιγόνα εμβολίου επιλέγονται βάσει των προϋπαρχόντων ανοσοαποκρίσεις έναντι αντιγόνων που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΑ) [9] – [13]. Έχουμε αναφερθεί ότι ανοσοσφαιρίνη G (IgG) απαντήσεις σε ΤΑΑ πεπτιδίων προερχόμενων CTL επίτοπο ήταν καλά συσχετίζεται με τη συνολική επιβίωση (OS) σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο που υποβάλλονται σε PPV [14], [15]. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι χυμική ανοσοαποκρίσεις έναντι ΤΑΑ πεπτιδίων προερχόμενων μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την κλινική πορεία των ασθενών με καρκίνο. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες πληροφορίες σχετικά με την κλινική σημασία των χυμικών ανοσοαποκρίσεων προς EGFR πεπτίδια που προέρχονται από ασθενείς με NSCLC.

Πρόσφατα, νέες τεχνολογίες υψηλής απόδοσης έχουν αναπτυχθεί για την ανακάλυψη βιοδεικτών που απεικονίζουν σαφώς κλινικά αποτελέσματα και /ή ανταπόκριση στη θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο [16] – [21]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τον υψηλής απόδοσης σύστημα συστοιχίας ανάρτησης Luminex να μετρηθεί IgG αποκρίσεις σε EGFR προερχόμενων πεπτιδίων σε ασθενείς με NSCLC. Εδώ αναφέρουμε για την πρώτη φορά που IgG απαντήσεις σε ορισμένες EGFR-πεπτίδια που προέρχονται ανιχνεύονται σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, και ότι θα μπορούσαν να είναι δυνητικά χρήσιμο πρόβλεψης της χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) και OS σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που λαμβάνουν gefitinib.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς, θεραπείες, και η συλλογή δειγμάτων

Είμαστε εγγεγραμμένοι 42 ασθενείς με NSCLC αγωγή με gefitinib μεταξύ 2006 Ιανουάριος και 2008 Δεκέμβριος σε ένα μόνο ίδρυμα (Kurume University Hospital, Kurume, Ιαπωνία) . Λεπτομέρειες σχετικά με τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών, όπως η ηλικία, το φύλο, την ιστολογία, το κάπνισμα, την κατάσταση απόδοσης (PS), το στάδιο, ανταπόκριση στη θεραπεία και τον τύπο του

EGFR

μεταλλάξεις ελήφθησαν από σχόλια γράφημα από ανεξάρτητο κριτικός ο οποίος αγνοούσε τα κλινικά μαθήματα (Πίνακας 1). Όλοι οι ασθενείς είχαν προχωρήσει NSCLC και έλαβε gefitinib (250 mg) από το στόμα μία φορά την ημέρα. Η απόκριση όγκου εξετάστηκε με αξονική τομογραφία (CT) και αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα Κριτήρια Αξιολόγησης απόκρισης σε συμπαγείς όγκους (RECIST). Απόκριση επιβεβαιώθηκε τουλάχιστον 4 εβδομάδες (για μια πλήρη ή μερική απόκριση) ή 6 εβδομάδες (για σταθερή νόσος) μετά την πρώτη τεκμηριωμένη. Δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν από τους ασθενείς πριν από την αγωγή gefitinib και καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Πλάσμα συλλέχθηκε επίσης από υγιείς δότες (HD) (n = 20, 59 +/- 11 χρόνια, αρσενικό = 8, Θηλυκά n = 12). Η παρούσα μελέτη συμμορφωθεί με τις διατάξεις της Διακήρυξης του Ελσίνκι, και εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου Kurume. Γραπτή ενημέρωση συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα μαθήματα.

Η

μετάλλαξη του EGFR ανάλυση

Οι μεταλλάξεις του γονιδίου EGFR εξετάστηκαν στα εξώνια 19 (Ε746-A750del) και 21 (L858R) με πεπτιδικά νουκλεϊκά οξύ-κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (ΡΝΑ-LNA) σφιγκτήρα PCR, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, γενωμικό DNA καθαρίστηκε από ιστούς παραφίνης χρησιμοποιώντας ένα κιτ QIAamp DNA Micro (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιούνται συνετέθησαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). PNA εκκινητές σφιγκτήρα και ανιχνευτές μεταλλαγμένο LNA αγοράστηκαν από FASMEC (Kanagawa, Ιαπωνία) και IDT (Coralville, ΙΑ), αντίστοιχα. σφιγκτήρας PNA-LNA PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα Σύστημα SDS-7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Πεπτίδια και μέτρηση των τίτλων IgG έναντι πεπτιδίων που προέρχονται από EGFR

Εξήντα διαφορετικές μη επικαλυπτόμενα πεπτίδια 20-μερές σχεδιάστηκαν από την αλληλουχία της πρωτεΐνης EGFR και συντίθεται από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Ε. Τα πεπτίδια διαλύθηκαν σε DMSO όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23]. Οι τίτλοι IgG ειδικού προς κάθε ένα από τα πεπτίδια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα multiplex συστοιχίας εναιώρημα σφαιριδίων στο σύστημα Luminex, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, 100 μΐ αραιωμένου πλάσματος επωάσθηκε με xMAP σφαιρίδια (Luminex Corp., Austin, ΤΧ), τα οποία επικαλύπτονται με τα EGFR-πεπτίδια που προέρχονται, σε μια πλάκα 96 φρεατίων φίλτρο (MABVN1250? Millipore Corp., Bedford, ΜΑ ) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε συσκευή ανακίνησης πλάκας. Η πλάκα στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με 100 μΙ βιοτίνη-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ανθρώπινης IgG (BA-3080? Vector Laboratories, Burlingame, CA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε συσκευή ανακίνησης πλάκας. Μετά την πλύση, 100 μΐ στρεπταβιδίνης-ΡΕ προστέθηκε στα φρεάτια, και η πλάκα επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε συσκευή ανακίνησης πλάκας. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές, ακολουθούμενη από προσθήκη 100 μΐ PBS σε κάθε φρεάτιο. Η ένταση του φθορισμού σε 50 μΙ από κάθε δείγμα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Luminex. Οι IgG τίτλοι ειδικού για το πεπτίδιο εκτιμήθηκαν ως προς την ένταση φθορισμού και εκφράζονται ως μονάδες ένταση φθορισμού (FIU), όπως έχει ήδη αναφερθεί [24]. Το επίπεδο αποκοπής ορίστηκε σε 10 ΜΧΠ επειδή οι καμπύλες ΜΧΠ που λαμβάνονται από τις δοκιμασίες αραίωσης δείγματος ήταν γραμμική από 10 έως 10.000 ΜΧΠ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

δοκιμασία log-rank αποκάλυψε ότι η θεραπεία gefitinib σημαντικά παρατεταμένη PFS (Α), αλλά όχι OS (Β), σε ασθενείς με μεταλλάξεις NSCLC EGFR. Σημαντικές διαφορές στην PFS (C), αλλά όχι σε OS (D), μεταξύ ασθενών με και χωρίς μεταλλάξεις του EGFR ήταν επίσης εμφανείς για μεταλλάξεις σε αμφότερα εξόνιο EGFR 19 (Ε746-A750del) και εξόνιο 21 (L858R). (Ε) Εξήντα διαφορετικά πεπτίδια 20-μερές σχεδιάστηκαν από την αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης EGFR. Οι αλληλουχίες που παρουσιάζονται στο κόκκινο (egfr_481-500, egfr_721-740, egfr_741-760, egfr_841-860 και egfr_1001-1020) αντιπροσωπεύουν τα πεπτίδια που παρουσιάζουν ειδικές IgG απαντήσεις που συσχετίστηκαν με μεταλλάξεις του EGFR. Οι αλληλουχίες που παρουσιάζονται στο μπλε (egfr_41_ 60, egfr_61_80 και egfr_481_500) αντιπροσωπεύουν τα πεπτίδια που παρουσιάζουν ειδικές IgG απαντήσεις που συσχετίστηκαν με PFS.

Η

Η στατιστική ανάλυση

Για να εξεταστεί κατά πόσον οι τίτλοι IgG έναντι κάθε ένα από τα 60 διαφορετικά πεπτίδια που σχετίζονται με την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR, διάμεσες τιμές τους συγκρίθηκαν μεταξύ των ασθενών με μεταλλάξεις του EGFR (delE746-A750 και L858R) και το EGFR φυσικού τύπου χρησιμοποιώντας το τεστ rank-sum του Wilcoxon. PFS ήταν υπολογίζονται από την ημερομηνία έναρξης της θεραπείας gefitinib είτε μέχρι την ημερομηνία της εξέλιξης της νόσου ή την ημερομηνία της τελευταίας επαφής. OS ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα από την ημερομηνία έναρξης της θεραπείας gefitinib μέχρι την ημερομηνία του θανάτου από οποιαδήποτε αιτία, ή από την ημερομηνία της τελευταίας επαφής. Να εξετάσει κατά πόσον οι τίτλοι IgG έναντι κάθε ένα από τα 60 διαφορετικά πεπτίδια που σχετίζονται με PFS ή OS, εφαρμόσαμε το αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο με αντι-πεπτίδιο IgG τίτλους, κατάσταση μετάλλαξης, την κατάσταση, το φύλο, και PS κάπνισμα ως επεξηγηματικές μεταβλητές. Εξετάσαμε, επίσης, κατά πόσο συνδέθηκαν με την ανταπόκριση του όγκου χρησιμοποιώντας λογιστικής παλινδρόμησης, όπου CR και PR θεωρήθηκαν ως απαντήσεις. Δεδομένου ότι εξετάστηκαν 60 διαφορετικά πεπτίδια, μια σοβαρή ζήτημα πολλαπλότητα υπήρχαν σε αυτή τη μελέτη. Ως εκ τούτου, εντοπίσαμε τα πεπτίδια που σχετίζονταν σημαντικά με PFS, OS, ή ανταπόκριση του όγκου ελέγχοντας το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) στο επίπεδο του 5%.

Σε αυτή τη μελέτη, ήταν πολύ δύσκολο να προσδιορίσει την αντι αυτο-πεπτίδιο αποκρίσεις IgG που θα ήταν χρήσιμες για την πρόγνωση από απλά χρησιμοποιώντας κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά και μόνο. Δεδομένου ότι ο αριθμός πεπτιδίων υπερβεί τον αριθμό των ασθενών, δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί η τυπική πολυμεταβλητή παλινδρόμηση Cox (πολλαπλή παλινδρόμηση). Για να αποφευχθεί η επιρροή των παρατηρήσεων, αντι-πεπτιδίου IgG ήταν log-μετασχηματισμένα (αντι-πεπτιδίου IgG 1), και επίσης τυποποιηθεί με μηδενική μέση τιμή και την τυπική απόκλιση μονάδα. Εφαρμόσαμε την υποχώρηση Cox με ποινή λάσο τύπου [25], [26], η οποία έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι είναι χρήσιμα για την ανάλυση των μεγάλων διαστάσεων των δεδομένων. Δεδομένου ότι ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό της μεθόδου είναι λάσο ελάχιστες αναφορές του, συντελεστές παλινδρόμησης για αντι-πεπτιδίου IgG αποκρίσεις που δεν συνδέονται με PFS (OS) θα μπορούσε να εκτιμηθεί ως μηδέν. Με βάση αυτό το χαρακτηριστικό, εντοπίσαμε μερικά πεπτίδια που μπορεί να είναι χρήσιμη για την πρόγνωση. Να εξετάσει κατά πόσον ή όχι IgG απαντήσεις στα εντοπίστηκαν πεπτίδια ήταν, στην πραγματικότητα, χρήσιμο για την πρόγνωση, εφαρμόσαμε ανάλυση παλινδρόμησης Cox και ο χρόνος που εξαρτώνται από την ανάλυση ROC [27]. Περιοχές κάτω από την καμπύλη ROC (AUCs) εκτιμήθηκαν για τα αποτελέσματα των κινδύνων από Cox παλινδρόμησης με μόνο και επίσης κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά τόσο με αντι-πεπτίδιο IgG απαντήσεις και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Είχαν σχέση με τον έλεγχο της ισότητας των AUC υπολογίζοντας μια τιμή p εκκίνησης για 1000 επαναλήψεις. Η στατιστική ανάλυση έγινε με R έκδοση 2.13 και η SAS έκδοση 9.3 του λογισμικού (SAS Institute, Cary, NC).

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και την ανάλυση επιβίωσης

Τα κλινικά χαρακτηριστικά της οι 42 ασθενείς που φαίνονται στον πίνακα 1. Είκοσι-πέντε ασθενείς (60%) ήταν γυναίκες και 24 (57%) δεν είχαν καπνίσει ποτέ? Η διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν 63,5 συνολικών έτη (εύρος, 38 έως 82 ετών). Τριάντα-οκτώ ασθενείς (90%) είχαν αδενοκαρκίνωμα, 34 (81%) είχε μια καλή κατάσταση απόδοσης (Eastern Cooperative Oncology Group 0), και 15 (36%) έλαβαν gefitinib ως πρώτης γραμμής χημειοθεραπεία. Όσον αφορά τον τύπο του

EGFR

μετάλλαξη, 8 ασθενείς (19%) είχαν διαγραφές στο εξόνιο 19, 13 (31%) είχαν τη μετάλλαξη L858R στο εξόνιο παρερμηνεύσιμη 21, και 21 (50%) είχαν το άγριο -τύπου

EGFR

.

Κατά το χρόνο της ανάλυσης, η μέση περίοδος παρακολούθησης ήταν 418 ημέρες (εύρος 16 έως 1532 ημέρες). Η διάμεση PFS ήταν 201 ημέρες (εύρος, 11 έως 1.379 ημέρες), και η διάμεση OS ήταν 418 ημέρες (εύρος, 16 έως 1.532 ημέρες). Kaplan-Meier ανάλυση PFS και OS μετά την έναρξη της θεραπείας gefitinib παρουσιάζεται στο Σχήμα 1. Η δοκιμασία log-rank αποκάλυψε ότι το gefitinib θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντικά μεγαλύτερη PFS σε ασθενείς με μεταλλάξεις του EGFR σε σχέση με εκείνους χωρίς αυτά (διάμεση τιμή των 347 έναντι 54 ημέρες,

P

= 0.0029) (Σχ. 1Α), ενώ δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο OS μεταξύ των δύο ομάδων ασθενών (διάμεση τιμή των 575 έναντι 368 ημέρες, αντίστοιχα,

P

= 0,1095) (Σχ. 1Β). Οι διαφορές στην PFS, αλλά όχι OS, μεταξύ των ασθενών με μεταλλάξεις και εκείνων με τον EGFR φυσικού τύπου ήταν εμφανείς για τους δύο τύπους μετάλλαξης EGFR (Σχ. 1C και 1D).

Συσχέτιση μεταξύ τίτλοι IgG έναντι EGFR- πεπτίδια που προέρχονται και οι μεταλλάξεις του EGFR σε ασθενείς με NSCLC αγωγή με gefitinib

Εξετάσαμε τίτλοι IgG έναντι κάθε 60 διαφορετικά πεπτίδια σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς με NSCLC χρησιμοποιώντας το σύστημα Luminex. Αναλύσαμε το εάν οι IgG τίτλοι ειδικού για το πεπτίδιο συσχετίστηκαν με την παρουσία μεταλλάξεων EGFR, και βρήκαν ότι οι τίτλοι IgG ειδικού προς τα egfr_481-500, egfr_721-740, και egfr_741-760 πεπτίδια ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε ασθενείς με μετάλλαξη exon21 σε σχέση με εκείνους χωρίς αυτό (P = 0,017 για egfr_481-500? P = 0.036 για egfr_721-740? P = 0,007 για egfr_741-760) (Πίνακας S1). Για τα τρία αυτά πεπτίδια, οι μέσες τιμές των IgG τίτλων πεπτιδίου-ειδικά σε ασθενείς με εξόνιο 21 μετάλλαξη ήταν περίπου διπλάσια από εκείνα σε ασθενείς χωρίς εξόνιο 21 μετάλλαξη (Πίνακας S1). Από την άλλη πλευρά, ο τίτλος του IgG ειδικά για την egfr_841-860 πεπτιδίου ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς με απαλοιφή στο εξώνιο 19 σε σχέση με εκείνους χωρίς αυτό (Ρ = 0,047), ενώ ο τίτλος του IgG ειδικά για την egfr_1001-1020 πεπτιδίου ήταν σημαντικά υψηλότερη σε εκείνους με απαλοιφή στο εξώνιο 19 (Πίνακας S1). IgG απαντήσεις σε άλλα πεπτίδια δεν έδειξε σημαντική συσχέτιση με μεταλλάξεις του EGFR.

Σχέση μεταξύ τίτλοι των IgG έναντι πεπτιδίων EGFR που προέρχονται και την επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC αγωγή με gefitinib

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω αν η πεπτίδια συγκεκριμένες τίτλοι IgG ήταν καλά συσχετίζονται με PFS ή OS σε ασθενείς με NSCLC που λαμβάνουν θεραπεία gefitinib. Στην παλινδρόμησης Cox, IgG αποκρίσεις έναντι 38 και 32 EGFR πεπτίδια προερχόμενα έδειξε ρ-τιμές μικρότερες από 5% για PFS και OS, αντίστοιχα. Όταν FDR ελέγχεται στο επίπεδο του 5%, IgG αποκρίσεις έναντι 35 και 20 πεπτίδια χαρακτηρίζεται ως σημαντική για PFS και OS, αντίστοιχα (Πίνακας S2). Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον οι τίτλοι IgG έναντι κάθε πεπτίδιο συσχετίστηκαν με ανταπόκριση όγκων (CR ή PR). Η ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε ότι δεν υπήρχαν πεπτιδίου-ειδικών IgG αποκρίσεις που σχετίζονται με απόκριση του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Προσδιορισμός των IgG αποκρίσεις πεπτιδο-ειδικά χρήσιμα για την πρόγνωση

Όπως φαίνεται παραπάνω, IgG απαντήσεις σε πολλά από τα EGFR-πεπτιδίων που προέρχονται συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με PFS και /ή OS. Δεδομένου ότι πολλές ζεύγη πεπτιδίων ήταν μέτρια ή συσχετίζεται έντονα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), προτάθηκε ότι μέτρηση των τίτλων IgG έναντι σχετικά μικρού αριθμού πεπτιδίων μπορεί να είναι επαρκώς προγνωστικός. Με Cox παλινδρόμησης με το λάσο ποινή, οι τίτλοι IgG έναντι των egfr_41_60, egfr_61_80 και egfr_481_500 πεπτίδια είχαν σχετικά μεγάλες επιπτώσεις στην PFS (Σχήμα S1 Α). Εμείς που απασχολούνται τα τίτλοι IgG έναντι αυτών των τριών πεπτιδίων για την κατασκευή ενός κανόνα πρόβλεψη για PFS. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2Α, Cox παλινδρόμησης προσαρμογή για πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της PS, την ηλικία, το φύλο και το κάπνισμα, απέδειξαν ότι όλα τα IgG αποκρίσεις έναντι των egfr_41_60, egfr_61_80, και egfr_481_500 πεπτίδια ήταν σημαντικά προγνωστικές και ανεξάρτητη από τυχόν κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά ( P = 0,001, P = 0,020 και Ρ = 0,028, αντίστοιχα).

η

με Cox παλινδρόμησης με το λάσο ποινή, οι τίτλοι IgG έναντι των egfr_41_60, egfr_481_500 και egfr_881_900 πεπτίδια φαίνεται να έχουν σχετικά μεγάλη επιπτώσεις στο λειτουργικό σύστημα (Σχήμα S1B). Δεδομένου ότι οι τίτλοι IgG έναντι του egfr_41_60 και egfr_881_900 πεπτίδια που συνδέονται στενά (Spearman rank του συντελεστή συσχέτισης 0,71? P & lt? 0.001), χρησιμοποιήσαμε μόνο τους τίτλους των IgG έναντι egfr_41_60 και egfr_481_500 για την κατασκευή ενός κανόνα πρόβλεψη για το OS. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2Β, Cox παλινδρόμησης έδειξε ότι οι IgG αποκρίσεις σε δύο πεπτίδια ήταν σημαντικά προγνωστικές, ανεξάρτητα από οποιαδήποτε κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά (Ρ = 0,018 για egfr_41_60 και Ρ = 0.027 για egfr_481_500).

Kaplan-Meier διαγράμματα οι PFS και OS με στρωματοποίηση με IgG τίτλους στα επιλεγμένα πεπτίδια που δείχνονται στο Σχήμα 2Α και Σχήμα 2Β, προκειμένου να κατανοήσουν οριακές επιπτώσεις τους, χωρίς προσαρμογή για κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Χρησιμοποιώντας το χρόνο που εξαρτάται από την ανάλυση ROC, εξετάσαμε επίσης κατά πόσον ή όχι την προσθήκη ειδικού για το πεπτίδιο τίτλους IgG με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά βελτίωσε την ακρίβεια πρόγνωση. Τα Σχήματα 3Α και 3Β δείχνουν τις καμπύλες ROC για 1 χρόνο και 2 ετών από την βαθμολόγηση κινδύνου εκτιμάται από την παλινδρόμηση Cox δίνονται στον Πίνακα 2Α (για PFS) και στον Πίνακα 2Β (για OS) με IgG τίτλους ειδικού για το πεπτίδιο και κλινικοπαθολογοανατομικές characteristcs και εκείνων με το τελευταίο μόνο. Οι καμπύλες ROC έδειξε ότι η προσθήκη του πεπτιδίου-ειδικών IgG τίτλοι με τα χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογοανατομικών οδήγησε σε σημαντική βελτίωση στην ικανότητα να προβλέψουμε PFS στο 1 έτος και 2 έτη (P & lt? 0.001 με σύγκριση των AUCs). AUCs του χρόνου που εξαρτώνται ROC για το 1-χρόνου και 2-χρόνια OS επίσης αυξήθηκαν σημαντικά με την προσθήκη των ειδικών για πεπτίδια τίτλοι IgG σε σύγκριση με μόνη κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3C και 3D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η προσθήκη IgG τίτλοι πεπτίδιο-ειδικά για τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά θα μπορούσε να οδηγήσει σε πιο ακριβή πρόγνωση τόσο PFS και OS.

Kaplan-Meier οικόπεδα της PFS (Α) και το λειτουργικό σύστημα (Β) σε ασθενείς που παρουσιάζουν υψηλότερο και χαμηλότερους τίτλους IgG έναντι επιλεγμένων πεπτιδίων, egfr_41_ 60, egfr_61_80, και egfr_481_500, παρουσιάζονται. Χαμηλότερες και υψηλότερες τίτλοι IgG ορίστηκαν με διάμεσες τιμές τους.

Η

Οι καμπύλες ROC για 1 έτος (Α) και 2 ετών (Β) PFS του κινδύνου βαθμολογία υπολογίζεται από Cox παλινδρόμησης δείχνουν μια ουσιαστικά βελτιωμένη συσχέτιση με 1 έτους και 2 ετών PFS. Οι καμπύλες ROC για 1 έτος (C) και 2 ετών (D) OS παρουσιάζονται επίσης.

Η

Συζήτηση

Οι πρόσφατες εξελίξεις στην μοριακή ογκολογία έχουν βελτιωθεί δραματικά την κατανόησή μας για το μονοπάτια ανάπτυξη και την επιβίωση του NSCLC. Για παράδειγμα, EGFR, ένα μέλος της HER ή Erb-Β οικογένεια κινασών τυροσίνης υποδοχέα, εμπλέκεται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του NSCLC. EGFR αποτελείται από ένα εξωκυτταρικό πεδίο σύνδεσης συνδετήρα, μία διαμεμβρανική περιοχή, και μια πολυλειτουργική κυτταροπλασματική ουρά με ενσωματωμένη δράση κινάσης [2], [28] – [30]. EGF είναι μία εκκρινόμενη αυξητικός παράγοντας των οποίων η σύνδεση με το EGFR επάγει δομικές αλλαγές, που οδηγούν σε σχηματισμό ομοδιμερούς υποδοχέα, που ακολουθείται από μια αύξηση της δραστικότητας κινάσης EGFR και επακόλουθη φωσφορυλίωση της ενδοκυτταρικής περιοχής [2], [28] – [30]. Η πλέον συχνά παρατηρούμενη μετάλλαξη στο EGFR είναι το L858R υποκατάσταση στο βρόχο ενεργοποίησης (Α-βρόχος), ή διαγραφή των οκτώ υπολειμμάτων στην περιοχή που εκτείνεται στα υπολείμματα 746-759, που εκτείνεται από τον κλώνο beta3 στην έλικα alphaC στην Ν-λοβού του ο τομέας κινάσης [2] – [5], [28] – [30]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι οι απαντήσεις IgG με τα πεπτίδια egfr_481-500, egfr_721-740 και egfr_741-760 ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με εξόνιο 21 μετάλλαξη. Από την άλλη πλευρά, οι IgG αποκρίσεις στην egfr_841-860 και egfr_1001-1020 πεπτίδια ήταν σημαντικά χαμηλότερες και υψηλότερες, αντίστοιχα, σε ασθενείς με απαλοιφή στο εξώνιο 19. Είναι ενδιαφέρον ότι, egfr_721-740, egfr_741-760, και egfr_841-860 βρίσκονται στον τομέα σύνδεσης ΑΤΡ, το οποίο κωδικοποιεί την περιοχή κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα, και χουμικών ανοσοαποκρίσεων προς αυτές τις αλληλουχίες συσχετίσθηκαν με την παρουσία του την ενεργοποίηση μεταλλάξεων EGFR, όπως L858R ή 746DEL. Από την άλλη πλευρά, egfr_1001-1020 βρίσκεται στο ρυθμιστικό πεδίο στο Ο-τερματική ουρά, η οποία μπορεί να αυξήσει την αυτοφωσφορυλίωση του EGFR [31]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι αυτή η περιοχή αλληλεπιδρά εκτενώς τόσο με την C-λοβού και Ν-λοβού του πεδίου κινάσης [32] – [33]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι ακολουθίες που σχετίζονται με τη δραστηριότητα της κινάσης της τυροσίνης σε EGFR μπορεί να είναι ανοσογόνες σε ασθενείς με μεταλλάξεις του EGFR, αν και περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να διευκρινιστούν οι μηχανισμοί των αυξημένων IgG απαντήσεις σε αυτές τις αλληλουχίες.

Η ανάπτυξη της ταχείας και ακριβή διαγνωστικές τεχνικές για την ανίχνευση μεταλλάξεων EGFR είναι ιδιαίτερα σημαντική για την επινόηση εξατομικευμένες θεραπευτικές ουσίες για τους ασθενείς με NSCLC με ενεργοποίηση μεταλλάξεων EGFR. Αρκετές ιδιαίτερα ευαίσθητες μέθοδοι για την ανίχνευση μεταλλάξεων EGFR σε δείγματα ιστών έχουν αναφερθεί [22], [37], αλλά η συλλογή του δείγματος για τις μεθόδους αυτές απαιτεί επεμβατικές διαδικασίες, όπως διαβρογχική βιοψία ή παρακέντηση υπεζωκότα. Σε αντίθεση, τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι η διαλογή των IgG αποκρίσεις σε EGFR πεπτίδια που προέρχονται στο περιφερικό αίμα θα μπορούσε να είναι εφικτή για την ανίχνευση μεταλλάξεων EGFR. Ανίχνευση χυμικών αποκρίσεων έναντι πεπτιδίων προερχόμενων EGFR χρησιμοποιώντας το σύστημα συστοιχίας αναστολής Luminex είναι απλή και μη επεμβατική. Ειδικότερα, η μέθοδος αυτή μπορεί να είναι χρήσιμη για τους ασθενείς με NSCLC, των οποίων ο όγκος των ιστών είναι δύσκολο να αποκτηθούν για λεπτομερείς παθολογικές και μοριακό χαρακτηρισμό.

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον IgG αποκρίσεις έναντι του EGFR-πεπτιδίων που προέρχονται μπορούσε να είναι προγνωστική της PFS και OS σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που λαμβάνουν gefitinib. Βρήκαμε ότι οι IgG αποκρίσεις έναντι των πεπτιδίων egfr_41_ 60, egfr_61_80 και egfr_481_500 είχε μεγάλες επιπτώσεις στην PFS, και ότι εκείνοι εναντίον egfr_41_60 και egfr_481_500 είχε μεγάλες επιπτώσεις στο λειτουργικό σύστημα. Είναι ενδιαφέρον ότι όλες αυτές οι αλληλουχίες που βρίσκονται στην εξωκυτταρική περιοχή. Η σύνδεση του EGF λαμβάνει χώρα εντός του αμινο-τερματικού 622 αμινοξέων εξωκυτταρική περιοχή, η οποία αποτελείται από τέσσερις τομείς, I-IV, του EGFR. Πρόσφατα, τα διαρθρωτικά στοιχεία έχουν δείξει πώς αντι-EGFR αντισώματα αναστέλλουν τη μεταγωγή σήματος από EGFR. Για παράδειγμα, η αλληλουχία egfr_481_500 ανήκει στην εξωκυτταρική περιοχή III, όπου αντισώματα αντι-ΕΟΡΚ, όπως cetuximab, nimotuzumab, και matuzumab, είναι γνωστό ότι δεσμεύονται και να μπλοκάρει την σύνδεση του EGF στον EGFR [34] – [36]. Αν και οι λόγοι για τους οποίους IgG αποκρίσεις σε αυτά τα πεπτίδια θα μπορούσαν να έχουν επίδραση στην επιβίωση δεν είναι πλήρως κατανοητοί, μια πιθανή εξήγηση είναι ότι η IgG κατά της εξωκυτταρικής περιοχής μπορεί να επηρεάσει την μεταγωγή σήματος από EGFR.

Εξετάσαμε πλάσμα από 20 υγιείς δότες (HD ) χρησιμοποιώντας το σύστημα Luminex για την ανίχνευση των αντισωμάτων έναντι egfr_41_ 60, egfr_61_80 και egfr_481_500 πεπτίδια. Βρήκαμε ότι οι τίτλοι των αντισωμάτων έναντι egfr_41_60, egfr_61_80, και egfr_481_500 στο πλάσμα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών με NSCLC και HD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με προηγούμενο εύρημα μας ότι τα αντισώματα εναντίον κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) επιτοπικά πεπτίδια που προέρχονται από πολλά από τα αντιγόνα που σχετίζονται με όγκο ανιχνεύθηκαν ως θετικά σε HD, και ότι οι τίτλοι τους δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών με καρκίνο και HD [38] . Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι χουμικών ανοσοαποκρίσεων προς EGFR θα μπορούσε να είναι ευρέως ανιχνεύσιμες όχι μόνο σε ασθενείς με καρκίνο, αλλά και σε HD, δεδομένου ότι αυτό το μόριο εκφράζεται παντού όχι μόνο τον καρκίνο ιστούς αλλά και σε φυσιολογικούς ιστούς.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ανίχνευση χουμικών ανοσοαποκρίσεων προς EGFR πεπτίδια που προέρχονται στο πλάσμα με τη χρήση του συστήματος συστοιχίας ανάρτησης Luminex μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος για όχι μόνο την ανίχνευση της παρουσίας μεταλλάξεων EGFR αλλά και την πρόγνωση των ασθενών που έλαβαν NSCLC EGFR-TKIs. Τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να παρέχουν νέες διορατικότητα για καλύτερη κατανόηση των χυμικών ανοσοαποκρίσεων προς EGFR σε ασθενείς με NSCLC. Δεδομένου ότι το κύριο μειονέκτημα αυτής της μελέτης ήταν μικρό μέγεθος του δείγματος της, μια περαιτέρω προοπτική μελέτη βρίσκεται σε εξέλιξη για να επιβεβαιώσει τα ευρήματα σε μεγαλύτερες ομάδες. Επιπλέον, θα είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί η κλινική εφαρμογή των ευρημάτων μας στην εξατομικευμένη θεραπεία για τους ασθενείς με NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

πορεία Λύση του regresson Cox με ένα λάσο ποινή για PFS (Α) και το λειτουργικό σύστημα (Β). (Α) Με Cox παλινδρόμησης με το λάσο ποινή, οι τίτλοι IgG έναντι των egfr_41_60, egfr_61_80 και egfr_481_500 πεπτίδια είχαν σχετικά μεγάλες επιπτώσεις στην PFS. (Β) Με Cox παλινδρόμησης με το λάσο ποινή, οι τίτλοι IgG έναντι των egfr_41_60, egfr_481_500 και egfr_881_900 πεπτίδια φαίνεται να έχουν σχετικά μεγάλες επιπτώσεις στο OS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0086667.s001

( TIF)

πίνακα S1.

Συσχέτιση μεταξύ της μετάλλαξης του EGFR και την έκφραση του πεπτιδίου σε ασθενείς με NSCLC. Εξετάσαμε τίτλοι IgG έναντι καθενός από 60 διαφορετικά πεπτίδια σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς με NSCLC που χρησιμοποιούν το σύστημα Luminex. Βρήκαμε ότι οι τίτλοι IgG ειδικού προς τα egfr_481-500, egfr_721-740, και egfr_741-760 πεπτίδια ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε ασθενείς με exon21 μετάλλαξη σε σχέση με εκείνους χωρίς αυτό. Από την άλλη πλευρά, ο τίτλος του IgG ειδικά για την egfr_841-860 πεπτιδίου ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς με απαλοιφή στο εξώνιο 19 σε σχέση με εκείνους χωρίς αυτό (Ρ = 0,047), ενώ ο τίτλος του IgG ειδικά για την egfr_1001-1020 πεπτιδίου ήταν σημαντικά υψηλότερη σε άτομα με απαλοιφή στο εξώνιο 19.

doi: 10.1371 /journal.pone.0086667.s002

(XLSX)

Πίνακας S2. ανάλυση

Cox παλινδρόμησης της PFS και OS για τους ασθενείς με NSCLC. Στην παλινδρόμησης Cox, IgG αποκρίσεις έναντι 38 και 32 EGFR πεπτίδια προερχόμενα έδειξε ρ-τιμές μικρότερες από 5% για PFS και OS, αντίστοιχα. Όταν FDR ελέγχεται στο επίπεδο του 5%, IgG αποκρίσεις έναντι 35 και 20 πεπτίδια χαρακτηρίζεται ως σημαντική για PFS και OS, αντίστοιχα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0086667.s003

(XLSX)