Αφηρημένο

Ιστορικό

Autophagy έχει παράδοξη και πολύπλοκες λειτουργίες στην ανάπτυξη του καρκίνου, και τα γονίδια που σχετίζονται με αυτοφαγία (ATG) αποτελούν βασικούς ρυθμιστές στην αυτοφαγία. Μέχρι τώρα, πάνω από 30 διαφορετικές πρωτεΐνες ATG έχουν ταυτοποιηθεί σε ζυμομύκητες, και των ομολόγων τους θηλαστικά έχουν επίσης αναφερθεί. Αν και οι ρόλοι των λίγων πρωτεϊνών ATG στον καρκίνο έχουν χαρακτηριστεί, ο ρόλος του ATG10 είναι σχεδόν εντελώς άγνωστη.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Για να διερευνηθεί η κλινικοπαθολογοανατομικών ρόλος του ATG10 σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αναλύσαμε την έκφραση ATG10 σε ορθοκολικό καρκίνο και τους ιστούς κυτταρικές σειρές. ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης έδειξε ότι ATG10 είναι ιδιαίτερα αυξημένες σε ορθοκολικό καρκίνο (ιστός – 18/37 περιπτώσεις, 48%? κυτταρική γραμμή -8/12 κυτταρικές σειρές, 66%). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά έδειξε ισχυρή συσχέτιση του πάνω ρύθμιση ATG10 με λέμφου όγκου κόμβο μετάσταση (p = 0.005) και εισβολή (ρ & lt? 0.001). Επιπλέον, και τα δύο 5-ετή επιβίωσης ελεύθερης νόσου και τη συνολική επιβίωση των ασθενών που φέρουν όγκους που δεν εκφράζουν ATG10 ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά των ασθενών που φέρουν ATG10 εκφράζουν όγκους (p = 0,012).

Συμπέρασμα /Σημασία

η αυξημένη έκφραση των ATG10 στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται με lymphovascular εισβολή και λεμφαδένα μετάσταση υποδεικνύοντας ότι ATG10 μπορεί να είναι ένας πιθανός προγνωστικός maker σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Jo YK, Kim SC, Πάρκο IJ , Πάρκο SJ, Jin DH, το Χονγκ SW, et al. (2012) αυξημένη έκφραση των ATG10 στον καρκίνο του παχέος εντέρου σχετίζεται με Lymphovascular εισβολή και μετάσταση λεμφαδένα. PLoS ONE 7 (12): e52705. doi: 10.1371 /journal.pone.0052705

Επιμέλεια: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Γερμανία

Ελήφθη: 23 Μάρ, 2012? Αποδεκτές: 19 Νοέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Jo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Κέντρο για την Ανάπτυξη και την εμπορευματοποίηση της Anti-Cancer Therapeutics και την κορεατική Υγείας 21 R & amp? D Έργου (A062254 και A102059, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων, Κορέα), την Ασάν Ινστιτούτο Επιστημών ζωής (2011-069 ), και η βασική επιστήμη Πρόγραμμα Έρευνας (2010-0009164, το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Κορέα). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το 26S σύστημα ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος είναι ένα από τα σημαντικότερα μονοπάτια που ρυθμίζουν τον κύκλο εργασιών πρωτεΐνη στα κύτταρα. Autophagy είναι ο μηχανισμός σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνα για την απομάκρυνση των μακρόβιων πρωτεϊνών και χύδην τζίρο κυτοσολικά συστατικών. Αυτοφαγοσώματα είναι διπλής μεμβράνης κυστίδια που καταποντίσει υποστρώματα στόχο και ασφάλεια με λυσοσώματα για την παραγωγή autolysosomes [1]. σχηματισμό Autophagosome ρυθμίζεται από μια οικογένεια εξελικτικά συντηρημένο γονίδιο αυτοφαγία που σχετίζονται με (ATG) πρωτεΐνες [2], [3].

ουμπικουϊτίνη (Ub) σύζευξη είναι μια καλά συντονισμένη γεγονός που απαιτεί Ε1, Ε2, και ένζυμα Ε3 [4]. Δύο συστήματα σύζευξη πρωτεΐνης, η οποία είναι παρόμοια με εκείνα που εμπλέκονται στην πρωτεΐνη ubiquitylation, απαιτούνται για αυτοφαγικά κυστίδια [3]. ATG7 δρα ως Ε1-όπως την ενεργοποίηση του ενζύμου, σύνδεση με ATG8 /LC3 ή ATG12. Ενεργοποιημένος ATG8 ή ATG12 στη συνέχεια μεταφέρεται στα Ε2 ενζύμων που ομοιάζουν με σύζευξη, ATG3 και ATG10. Τέλος, η ATG8-φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (ΡΕ) και των συζυγών ATG12-ATG5 σχηματίζονται. Οι ATG12-ATG5 συζυγούς σχηματίζει ένα σύμπλοκο με ATG16 να ενεργεί ως Ε3 ένζυμο που μοιάζει για το συζυγές ATG8-ΡΕ, το οποίο συνδέεται με τη μεμβράνη autophagosome μέσω μιας αντίδρασης λιπιδίωση [2]. Μεταλλάξεις στις θέσεις πρόσδεσης του ATG7 και ATG10 αποτραπεί ο σχηματισμός του συζυγούς ATG12-ATG5 [5]. Επειδή autophagy εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες και την ομοιόσταση, η απορρύθμιση του συστήματος αυτού φαίνεται να παίζει ένα ρόλο σε πολλές ανθρώπινες παθοφυσιολογικές καταστάσεις όπως νευροεκφυλιστική ασθένεια, διαβήτη τύπου 2, μολυσματική ασθένεια, έμφυτη άνοση ασθένεια, καθώς και τον καρκίνο [6].

Όπως και άλλες ασθένειες, ο ρόλος της αυτοφαγία στον καρκίνο είναι αρκετά περίπλοκη. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων ATG (ή ρυθμιστές τους), άμεσα ή έμμεσα την επιτάχυνση της ανάπτυξης των όγκων [7], [8]. Επιπλέον, μειώθηκε αυτοφαγία ενισχύει νέκρωση που εξαρτώνται από τη φλεγμονή, την προώθηση της περαιτέρω ανάπτυξης των όγκων [9]. Ωστόσο, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη autophagy μπορεί επίσης να βοηθήσει την ανάπτυξη του όγκου. Πράγματι, αυτοφαγία προάγει κυτταρική επιβίωση μετά από πιέσεις από τη ρύθμιση της μεταβολικής ομοιοστασίας. καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν σε υποξία και αποσύνδεση από τα γύρω κύτταρα. Έτσι, θα μπορούσε να προωθήσει autophagy ογκογένεση και τη μετάσταση αυξάνοντας την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [7], [10]. Μέχρι σήμερα, πάνω από 30 διαφορετικές πρωτεΐνες ATG έχουν ταυτοποιηθεί σε ζυμομύκητες, και των ομολόγων τους θηλαστικού επίσης έχουν επίσης αναφερθεί [5], [11]. Αν και οι ρόλοι των λίγων πρωτεϊνών ATG στον καρκίνο έχουν χαρακτηριστεί, ο ρόλος του ATG10 είναι σχεδόν εντελώς άγνωστη. Εδώ, θα αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ της έκφρασης ATG10 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά των σποραδικών καρκίνωμα του παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση ATG10 συνδέεται στενά με λεμφαδένα μετάσταση και lymphovascular εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

ATG10 Up-ρύθμιση σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Για την αξιολόγηση ATG10 έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αναλύσαμε πρώτα ορθοκολικό καρκίνο ιστούς με στύπωμα Western. ιστούς όγκων και των γύρω φυσιολογικούς ιστούς τους λήφθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η έκφραση ATG10 σε όγκους ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη του παρακείμενου φυσιολογικού βλεννογόνου. ATG10 αυξήθηκε σε 18 από τις 37 περιπτώσεις (48%) του καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικ. 1a). Στη συνέχεια εξετάστηκε η έκφραση ATG10 σε ορθοκολικό κυτταρικές σειρές. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ιστούς όγκων, η έκφραση ATG10 ήταν υψηλότερη στις κυτταρικές σειρές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου AMC5, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO και CaCo2 ό, τι στην κανονική CCD841 ορθοκολικού κυτταρική γραμμή (Σχ. 1β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATG10 είναι επάνω ρυθμισμένο σε καρκίνο του παχέος εντέρου

(α) έκφραση ATG10 σε ορθοκολικό ιστούς εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western (n = 37?. Τ, καρκινικό ιστό? Ν, αντίστοιχο κανονικό ιστός). έκφραση ATG10 κανονικοποιήθηκε προς έκφραση ακτίνης (n = 37). (Β) ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης ATG10 σε αρκετές κυτταρικές σειρές ορθοκολικού (Normal – CCD841? Καρκίνος – HCT116, ΗΤ29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO, CaCo2). έκφραση ATG10 ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία.

Η

Σχέση μεταξύ ATG10 έκφρασης και την εξέλιξη του όγκου και εισβολή

Ερευνήσαμε περαιτέρω το ρόλο της ATG10 στην πρόοδο του όγκου και την εισβολή. Για να εξεταστεί κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, ανοσοϊστοχημική ανάλυση ενός ιστικού πίνακα με 127 παχέος δειγμάτων καρκίνου εκτελέσθηκε (Σχ. 2 και Πίνακας 1). Ιστοί χωρίς χρώση ή ασθενή χρώση (≤10%) έχουν κατηγοριοποιηθεί ως αρνητικό (-). Ιστούς με & gt? Χρώση 10% κατηγοριοποιήθηκαν ως θετικά (+). Τριάντα των δειγμάτων 127 του όγκου (24%) έδειξαν έκφραση ATG10. Η σχέση μεταξύ ATG10 έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά φαίνεται στον Πίνακα 2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση ATG10 ήταν ιδιαίτερα σχετίζεται με lymphovascular εισβολή (

P

& lt? 0.001) και μετάσταση λεμφαδένα (

P

= 0,005). Ωστόσο, η έκφραση ATG10 δεν συσχετίστηκε σημαντικά με την ηλικία, το φύλο, θέση του όγκου, καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο ορού, ή τον πολλαπλασιασμό του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η έκφραση ATG10 συνδέεται στενά με lymphovascular εισβολή σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Η

Το πρότυπο έκφρασης ATG10 σε καρκίνο του παχέος εντέρου προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική ανάλυση ενός μικροσυστοιχιών ιστού. (Α και β) Τα αρνητικά δείγματα (-) με ≤10% χρώσης (200), (γ και δ) δείγματα με 10% έως 50% χρώσης (+, × 200), και (ε και στ) δείγματα με & gt? 50 χρώση% (+, × 200).

η

Σχέση μεταξύ ATG10 έκφρασης και του ασθενούς επιβίωσης

Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι ATG10 συνδέεται στενά με την εισβολή του όγκου, η οποία είναι γνωστός παράγοντας κινδύνου για υποτροπή και την επιβίωση των αποτελεσμάτων. Έτσι, αξιολόγησε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης ATG10 και τα ποσοστά του 5-ετή επιβίωση ελεύθερη νόσου (DFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) σε ορθοκολικό ασθενείς. Τα 5-year DFS και OS ποσοστά των ασθενών που φέρουν όγκους που δεν εκφράζουν ATG10 ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά των ασθενών που φέρουν ATG10 εκφράζουν όγκους (5-ετή OS [μέση τιμή ± SEM], 76,4 ± 0,4%

vs.

57,5 ​​± 0,1%,

P

= 0.012?. 5-year DFS, 75,8 ± 0%

vs

42,8 ± 0,1%,

P

= 0,012) ( Σχ. 3). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ATG10 μπορεί να είναι ένας πιθανός προγνωστικός maker στην καρκίνο του παχέος εντέρου. Σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση με δυνατότητες μεταβλητές επιβίωση, λεμφαδένα μετάσταση μόνη συσχετίστηκε σημαντικά με παραμέτρους την επιβίωση, ενώ η έκφραση ATG10 δεν ήταν (αναλογία κινδύνου, 4.736

vs

1.404?. 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης, 1,763 έως 12,723

vs

0,676 έως 2,916?.

P

= 0,002

vs

0.363)

Η σχέση μεταξύ της έκφρασης ATG10 και 5-ετή επιβίωση ελεύθερη νόσου (. DFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) τα ποσοστά των ασθενών με καρκίνο του παχέος αναλύθηκαν με καμπύλες Kaplan-Meier.

η

κάτω ρύθμιση των ATG10 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος

Εμείς περαιτέρω εξέτασε την επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση των ATG10 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα HCT116. Η εξάντληση της έκφρασης ATG10 με παρεμβολή RNA καταστέλλεται ελαφρώς ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα HCT116, υποδηλώνοντας ότι ATG10 έχει λειτουργικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 4).

κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν παροδικά είτε με περιπλεγμένο αρνητικό siRNA (φεύγω γρήγορα) ή ATG10 ειδικό siRNA (siATG10), τότε ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν καθημερινά προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας CCK-8 (α). Η ρύθμιση προς τα κάτω των ATG10 από siRNA επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot (β). Τα δεδομένα που εκπροσωπείται από την μέση τιμή ± SEM (n = 3).

Η

Συζήτηση

Autophagy ελέγχεται από πρωτεΐνες ATG και τις ρυθμιστικές αρχές τους [5], [8]. ATG πρωτεΐνες ξεκινήσει σχηματισμό autophagosome μέσω του αυτοφαγικά σύστημα σύζευξης [2]. Ο ρόλος των ATG6 στον καρκίνο έχει χαρακτηριστεί. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι μειώθηκαν ATG6 έκφραση προάγει την ογκογένεση σε ζωικά μοντέλα, και ATG6 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [12] – [15]. Ωστόσο, ο ρόλος των άλλων πρωτεϊνών ATG στην ογκογένεση δεν είναι καλά κατανοητός.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε έκφραση ATG10 σε ασθενείς με σποραδική ορθοκολικό καρκίνο. ATG10 είναι μια Ε2-όπως ένζυμο που εμπλέκεται στην Ub-όπως τροποποίηση, η οποία είναι απαραίτητη για το σχηματισμό autophagosome. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι διάφορα υπερ-εκφράζεται Ub-Ε2 σαν πρωτεΐνες προωθούν την ανάπτυξη του όγκου σε διάφορους καρκίνους [16] – [18]. Ωστόσο, ο ρόλος του ATG10 στον καρκίνο δεν έχει ακόμη αξιολογηθεί. Σε αντίθεση με ATG6, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο, τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATG10 αυξάνεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, η έκφραση ATG10 συνδέθηκε έντονα με την εισβολή όγκου και μετάσταση. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι ATG10 μπορεί να είναι ένα ογκογόνο πρωτεΐνη. Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση της ATG10 υπερ-έκφραση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιώντας κύτταρα καρκινώματος που εκφράζουν σταθερά RKO ATG10. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η ανάπτυξη του όγκου δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από έκτοπη έκφραση της ATG10 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, knock-down της έκφρασης ATG10 με siRNA κατέστειλε ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα HCT116. Έτσι, συνεχίζουμε να διερευνηθεί η επίδραση της πάνω ρυθμισμένα ATG10 επί ογκογένεση.

Γενετικές αλλοιώσεις είναι υπεύθυνα για την αυξημένη έκφραση πολλών ογκογόνο πρωτεϊνών. Η χρωμοσωμική περιοχή του ATG10 (5q14) συχνά χάνεται στον καρκίνο των ωοθηκών, καρκίνο του στομάχου, και του καρκίνου του μαστού [19], [20]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες μικροσυστοιχιών DNA γονιδιώματος σε επίπεδο έχουν αποκαλύψει ότι η περιοχή 5q14 ενισχύεται σε neurofibrosarcoma και παγκρεατικού καρκίνου [21], [22]. παραλλαγές αριθμός αντιγραφής στο 5q14 σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν είναι καλά κατανοητοί. Έτσι, οι μελλοντικές μελέτες για να διαπιστωθεί αλληλομόρφων αλλαγές σε αυτό τον τόπο στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Autophagy φαίνεται να έχει διπλή λειτουργία στον καρκίνο. Ειδικότερα, η χρονική στιγμή της αυτοφαγία μπορεί να είναι σημαντική για την ανάπτυξη του όγκου. Στο αρχικό στάδιο της ογκογένεσης, αυτοφαγία φαίνεται να λειτουργεί ως καταστολέας όγκου. Ως αποτέλεσμα, αναστέλλοντας autophagy αυξάνει βλάβη του DNA, χρωμοσωμικές ανωμαλίες, όπως η απώλεια αλληλικές και το κέρδος, και το οξειδωτικό στρες, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε ογκογόνους γεγονότα [23], [24]. Ωστόσο, αυτοφαγία προωθεί επίσης την ογκογένεση. επαγωγή αυτοφαγία με απόσπαση από το εξωκυτταρικό επιβίωση των κυττάρων ασίστ μήτρα του όγκου κατά τη διάρκεια anoikis, η οποία συμβάλλει στη διάδοση και τη μετάσταση [25], [26]. Σε συμφωνία με αυτές τις προηγούμενες μελέτες, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση ATG10 συνδέεται στενά με lymphovascular εισβολή και μετάσταση λεμφαδένα σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα ευρήματα αυτά μπορούν να εξηγηθούν από τη σύνδεση των κόμβων όγκο αντικατασταθούν ή ενδοαγγειακή αδρανών όγκου με συστηματική λεμφαδένες μέσω lymphovascular κανάλια [27], [28]. Όγκου εισβολή και μετάσταση είναι γνωστοί παράγοντες κινδύνου για υποτροπή και την έκβαση επιβίωσης. Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, βρήκαμε ότι η έκφραση ATG10 σε όγκους που συνδέονται με χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ ATG10 έκφρασης και τα κλινικά αποτελέσματα θα πρέπει να επιβεβαιωθούν με μια μεγαλύτερη ομάδα για να κατανοήσουν καλύτερα το ρόλο της ATG10 στον καρκίνο.

Εν κατακλείδι, ATG10 ρύθμιση προς τα πάνω σε καρκίνο του παχέος εντέρου συνδέεται στενά με lymphovascular εισβολή και λέμφος μετάσταση στους λεμφαδένες, υποδεικνύοντας ότι ATG10 μπορεί να είναι χρήσιμο ως προγνωστικός δείκτης και ως θεραπευτικός στόχος σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα όγκου

Για την αξιολόγηση έκφραση ATG10, 37 ορθοκολικό καρκίνο δείγματα ιστών επιλέχτηκαν τυχαία από αρχειακό δείγματα από εκτομές πραγματοποιηθεί τον Ιούνιο του 1999 και τον Μάιο του 2003 το Ιατρικό Κέντρο Ασάν (Σεούλ, Κορέα). Για τη μεταγενέστερη κλινική επικύρωση των προτύπων έκφρασης διαφορικής πρωτεΐνης, αξιολογήσαμε δείγματα όγκων από ένα σύνολο 124 ασθενών με σποραδική ορθοκολικό καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων διαδοχικούς ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε εκτομή με θεραπευτική πρόθεση (R0 εκτομή, η = 119? R1 εκτομή, η = 5) (Τραπέζι 1). Οι ασθενείς με κληρονομικό μη-πολυποειδούς καρκίνο του παχέος εντέρου ή οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση αποκλείστηκαν, καθώς ήταν εκείνοι που υποβλήθηκαν σε προεγχειρητική θεραπεία chemoradiation. Υποτροπή, συμπεριλαμβανομένων των περιφερειακών και απομακρυσμένων μεταστάσεων, συνέβη σε 22 από 124 ασθενείς (17,7%) που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική εκτομή κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης (μέση τιμή, 58 μήνες? Εύρος, 3-123 μήνες). Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την IRB (επιτροπή δεοντολογίας), σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

CCD841 κύτταρα ήταν ευγενικά από τον Dr. SY Rha (Yonsei University, Σεούλ, Κορέα) [29]. Η κυτταρική γραμμή AMC5 προήλθε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Και άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές όπως HCT116, ΗΤ29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO και CaCo2 αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστήρα και διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Western Ανάλυση στυπώματος

πρωτεΐνες από ιστούς και κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος πρωτεΐνης (62.5 mM Tris-HCl, 25% γλυκερόλη, 2% SDS, 5% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 0,01% κυανούν βρωμοφαινόλης) (BioRad, Hercules, CA). Πρωτεΐνες (περίπου 50 ug) ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση του διαλύματος Bradford (BioRad) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και στη συνέχεια, διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (BioRad). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον ATG10 (1:3000? MBL, Ναγκόγια, Ιαπωνία) και ακτίνη (1:10,000? Chemicon International, Temecula, CA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού. (1:5000? Pierce, Rockford, IL)

ανοσοϊστοχημική χρώση

Tissue μπλοκ συστοιχία παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο ακριβείας (Beecher Instruments , Sun Prairie, WI). Η ανοσοϊστοχημική χρώση με βάση την επισημασμένη στρεπταβιδίνης-βιοτίνης μέθοδος διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ Dako LSAB (Dako, Carpinteria, CA) με μονοκλωνικά αντισώματα ATG10 (MBL). Ασθενής χρώση (≤10%) και καθόλου χρώση βαθμολογήθηκαν ως αρνητικά (-), και & gt? Χρώση 10% βαθμολογήθηκε ως θετικό (+). Δείγματα με αρνητική ανοσοχημική χρώση εξετάστηκαν δύο φορές για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA για ATG10 (siATG10, siGENOME SMART πισίνα) και ομελέτα ελέγχου μη στόχευση siRNA (Scramble) συντέθηκαν με Dharmacon, Inc. (Thermo Scientific, Chicago, IL). κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με 0,5 μmol /L siATG10 ή ομελέτα siRNA με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Στη συνέχεια, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CCK-8), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Dojindo Corporation, Japan). Εν συντομία, κύτταρα σε πλάκα 96 φρεατίων αναμείχθηκαν με 10 μΐ του CCK-8 λύση, και στη συνέχεια επωάστηκαν για μία ώρα σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Η επακόλουθη χρωματομετρική αλλαγή μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης Victor πλάκας μικροτιτλοδότησης (PerkinElmer) που να παρακολουθεί τις αλλαγές στην απορρόφηση στα 450 nm.

Στατιστική Ανάλυση

ανάλυση Cross-πίνακα χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher με δύο επαλήθευση όψης χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση ανοσοϊστοχημικά ευρήματα σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά και κλινικοπαθολογοανατομικών επανάληψη επίπτωση των ασθενών. Πρωτεύοντα καταληκτικά σημεία ήταν η επανεμφάνιση, 5-year DFS, και 5 ετών OS. ποσοστά επιβίωσης συγκρίθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier με τη δοκιμασία log-rank και ισχυροί παράγοντες επιβίωσης επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο παλινδρόμησης Cox. Το επίπεδο σημαντικότητας 5% επιλέχθηκε για κάθε ανάλυση. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS (έκδοση 19? SPSS Inc., Chicago, IL).