Αφηρημένο

Η υψηλή νοσηρότητα και η θνησιμότητα των ασθενών με οισοφάγο (Ε) και γαστρο-οισοφαγική διασταύρωση (GEJ) καρκίνους, εντάλματα νέα προ-κλινικά μοντέλα για τον έλεγχο των ναρκωτικών. Εκτιμήθηκε η χρησιμότητα του πρωτογενούς ξενομοσχεύματα όγκου (PTXGs) ως προ-κλινικά μοντέλα. Κλινικοπαθολογοανατομικές, ανοσοϊστοχημικές δείκτες (p53, p16, Ki-67, Her-2 /

neu

και EGFR), και της παγκόσμιας προφίλ αφθονίας mRNA αξιολογήθηκαν για να προσδιοριστεί προκαταλήψεις επιλογή των δειγμάτων εμφυτεύονται ή μεταμοσχευμένα, σε σύγκριση με την υποκείμενη πληθυσμού . Εννέα πρωτογενή E /GEJ γραμμές αδενοκαρκινώματος ξενομόσχευμα περαιτέρω χαρακτηρίζεται για το φάσμα και τη σταθερότητα της γονιδιακής έκφρασης /πρωτεΐνης πάνω περάσματα. Επτά κύριες γραμμές ξενομοσχεύματος αδενοκαρκινώματος του οισοφάγου υποβλήθηκαν σε αγωγή με μεμονωμένα ή συνδυασμό χημειοθεραπείας. Οι όγκοι που εμφυτεύτηκαν (n = 55) σε NOD /SCID ποντίκια είχαν χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν πιο επιθετικό βιολογίας από τους όγκους που ποτέ εμφυτεύθηκαν (η = 32). Από αυτούς εμφυτεύονται, 21/55 μεταμοσχευμένα? μεταμόσχευση συνδέθηκε με πτωχά διαφοροποιημένο όγκους (ρ = 0.04) και των ηλικιωμένων ασθενών (p = 0.01). Έκφραση των ανοσοϊστοχημικών δεικτών ήταν παρόμοια μεταξύ δείγμα ασθενούς και τις αντίστοιχες ξενομοσχεύματος. διαφορές mRNA που παρατηρήθηκαν μεταξύ των όγκων των ασθενών και την πρώτη ξενομοσχεύματα πέρασμα οφείλονταν σε απώλεια ανθρώπινου στρώματος σε ξενομοσχεύματα σε μεγάλο βαθμό. μοτίβα mRNA της πρόωρης vs αργά ξενομοσχεύματα διόδου και των μικρών vs μεγάλους όγκους του ίδιου περάσματος ήταν παρόμοια. Πλήρεις αντίσταση ήταν παρούσα σε 2/7 ξενομοσχεύματα ενώ οι υπόλοιπες όγκοι έδειξαν διαφορετικούς βαθμούς ευαισθησίας, που παρέμεινε σταθερό σε όλη περάσματα. Λόγω της ικανότητάς τους να ανακεφαλαιώσω χαρακτηριστικά πρωτογενούς όγκου κατά τη διάρκεια της μεταμόσχευσης και σε όλη σειριακό πέρασμα, PTXGs μπορεί να είναι χρήσιμη κλινικά συστήματα για την αξιολόγηση της ευαισθησίας φαρμάκων ανθρώπινης Ε /καρκίνων GEJ

Παράθεση:. Dodbiba L, Teichman J, A Στόλου , της Ταϊλάνδης H, Starmans MHW, Navab R, et al. (2015) Καταλληλότητα Χρησιμοποιώντας προερχόμενων από ασθενή Μοντέλα ξενομοσχεύματος για Φαρμακολογική Αξιολόγηση των νέων θεραπειών για οισοφάγου /γαστρο-οισοφαγικής Junction καρκίνοι. PLoS ONE 10 (3): e0121872. doi: 10.1371 /journal.pone.0121872

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Κέντρο Καρκίνου, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: 13 του Ιουλίου, 2014? Αποδεκτές: 17, Φεβρουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2015

Copyright: © 2015 Dodbiba et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα έκφραση του mRNA αρχεία είναι διαθέσιμα από τη βάση δεδομένων GEO (αριθμός ένταξης: GSE58870).

Χρηματοδότηση: GL υποστηρίχθηκε από τον Alan B. Brown πρόεδρος στη Μοριακή Genomics, Posluns Ταμείο Οικογένεια και CCO πρόεδρος στο Experimental Therapeutics και πληθυσμιακές μελέτες. Η μελέτη αυτή διεξήχθη με την υποστήριξη του Ινστιτούτου του Οντάριο για την Έρευνα του Καρκίνου στο PCB μέσω της χρηματοδότησης που παρέχεται από την κυβέρνηση του Οντάριο. Λιβάδι υποστηρίχθηκε από ένα Ινστιτούτο του Οντάριο για την Έρευνα του Καρκίνου νέο βραβείο ανακριτών. PCB υποστηρίχθηκε από Terry Fox Ινστιτούτο Έρευνας Βραβείο Νέα ανακριτής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τις τελευταίες δεκαετίες, του οισοφάγου (Ε) και γαστρο-οισοφαγική διασταύρωση (GEJ) καρκίνου έχει δει μια δραματική αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης στις ανεπτυγμένες χώρες, ενώ η πενταετής επιβίωση παραμένει σε χαμηλά επίπεδα σε 19% [1]. Ο εντοπισμός των μεθόδων για να επιλέξετε τα κατάλληλα φαρμακευτικές θεραπείες, συνεπώς, δικαιολογημένη. Παραδοσιακά, τα πάνελ κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή ταχέως αντικαρκινικών παραγόντων [2,3]. Επιπλέον, ενέσεις κυτταρικών σειρών σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια είναι κοινές

in vivo

μοντέλα της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων [4,5]. Αν και προσεγγίσεις κυτταρικής σειράς έχουν συμβάλει σημαντικά στην ανάπτυξη φαρμάκων και τη βιολογία του καρκίνου, είναι ατελή μοντέλα για τον έλεγχο των ναρκωτικών [6]. Επιπλέον, τρεις ευρέως χρησιμοποιούμενες καρκινικές κυτταρικές σειρές E /GEJ βρέθηκαν πρόσφατα να έχουν μολυνθεί από άλλες κυτταρικές σειρές στις αρχές του πολιτισμού [7]. Έτσι, idetifying κατάλληλη προ-κλινικά μοντέλα ναρκωτικά δοκιμές αυτού του καρκίνου είναι μια πρόκληση.

Δημοτικό ξενομοσχεύματα όγκου (PTXGs) δείχνουν υπόσχεση ως εναλλακτική λύση προ-κλινικά μοντέλα για δοκιμή ευαισθησίας των ναρκωτικών. Οι PTXGs δημιουργούνται από εμφύτευση ενός κομματιού του όγκου απ ‘ευθείας από έναν ασθενή σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς και χρησιμοποιώντας το προκύπτον ξενομοσχεύματος για πειραματισμό. Πρωτογενής μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου του πνεύμονα [8], του μαστού [9], του παχέος εντέρου [10], το κεφάλι και το λαιμό [11] και καρκίνους E /GEJ [12] έχουν δείξει να ανακεφαλαιώσουμε τον ασθενή ιστολογία του όγκου και η μορφολογία των κυττάρων σε διάφορους βαθμούς. Οι φυσιολογικές συνθήκες όπως η θερμοκρασία, τα επίπεδα οξυγόνου, περιεκτικότητα σε θρεπτικά συστατικά

κλπ

. περισσότερο μοιάζουν με εκείνα που υπάρχουν σε ασθενείς με καρκίνο [6]. Επιπλέον, PTXGs δεν έχουν υποστεί τις πιέσεις επιλογής και σημαντικές μοριακές αλλαγές που εμπλέκονται στην δημιουργία κυτταρική σειρά και μακροπρόθεσμη ανάπτυξη [6], [13,14]. Έτσι, PTXGs θα μπορούσε να είναι πιο πιθανό να προβλέψουμε αντιδράσεις του φαρμάκου από κυτταρικές σειρές που καλλιεργούνται είτε

in vitro

ή

in vivo

. Ωστόσο, ενώ έχουν PTXGs δειχθεί ότι μιμούνται την αρχική ανταπόκριση του όγκου στη θεραπεία με αρκετή ακρίβεια [15-17], εξακολουθούν να εκτίθενται σε δυνάμεις επιλογής που σχετίζονται με τις διαφορές μεταξύ ανθρώπου και ποντικού μικροπεριβάλλοντα [18]. Έτσι, είναι σημαντικό να αξιολογηθεί ο βαθμός στον οποίο PTXGs αποκλίνουν από τις πρωτοπαθείς όγκους του ασθενούς στο γονιδιακό και πρωτεΐνες επίπεδο πριν από την επιβίβαση σε εκτεταμένες μελέτες φαρμάκων. Ανάπτυξης

Έχουμε περιγράφηκε προηγουμένως μοντέλο PTXG [12]. Το επόμενο λογικό βήμα είναι ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας μελέτης: να αξιολογήσει τη χρησιμότητα και τους περιορισμούς της χρήσης μοντέλων PTXG για τον έλεγχο των ναρκωτικών. Συγκεκριμένα, σε ποιο βαθμό είναι E /GEJ όγκους εκπρόσωπος των όγκων των ασθενών, στο πλαίσιο της φαρμακολογικής αξιολόγησης; Η δική μας πειράματα σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου έχουν εντοπίσει κοινά θέματα PTXG όπως: (i) η έλλειψη εμφύτευση πολλών όγκων? (Ii) απροσδόκητο θάνατο του ποντικιού, που οδηγεί στην ανάγκη να αλλάξει και να τρέξει τα πειράματα σε διάφορα περάσματα? (Iii) τεχνικούς λόγους, όπως η ανάγκη να επεκταθεί ξενομοσχεύματα σε μεγάλες ομάδες του πληθυσμού και να παγώσει κάτω νωρίτερα περάσματα για την εξασφάλιση της προσβασιμότητας για μελλοντικές μελέτες, με αποτέλεσμα να χρειαστεί να χρησιμοποιήσετε αργότερα περάσματα για τα πειράματα του φαρμάκου? και (iv) μια περιστασιακή αδυναμία να προσδιορίσει συγκεκριμένα μοντέλα PTXG με τα ίδια μοριακά χαρακτηριστικά που παρατηρούνται σε έναν ασθενή

Αυτά τα τεχνικά ζητήματα που εγείρουν τέσσερα σημαντικά μοντέλο-σχετικές ερωτήσεις, οι οποίες μπορεί να διατυπωθεί ως ελέγξιμες υποθέσεις:. (α) μοντέλα PTXG είναι αντιπροσωπευτικά του υποκείμενου πληθυσμού της γαστρο-οισοφαγικής καρκίνων (δηλαδή, την αξιολόγηση προκατάληψη μοσχεύματος), και αν δεν είναι πλήρως αντιπροσωπευτική, είμαστε σε θέση να περιγράψουν τι προκαταλήψεις υπάρχουν και πώς θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα συμπεράσματα? (Β) μοντέλα PTXG είναι χρήσιμες γενικά, ακόμη και σε μεταγενέστερα περάσματα, όπως τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων /πρωτεϊνών τους παραμένουν σταθερές? Η υπόθεση αυτή μετρά το βαθμό της σύγχυσης από πιέσεις επιλογής κατά τη διάρκεια του περάσματος? (Γ) PTXGs να ανακεφαλαιώσουμε το ευρύ φάσμα των μοριακών χαρακτηριστικών εκπρόσωπος της υποκείμενης πρωτογενείς καρκίνους τους? αυτό αντιμετωπίζει τις ανησυχίες της δεν βρίσκει την ετερογένεια μεταξύ καρκινικών αναγκαίο να αναπτυχθούν εξατομικευμένες προσεγγίσεις φάρμακο για τη θεραπεία? και (δ) PTXGs ανταποκριθεί στην φαρμακολογική θεραπεία με σταθερά σε πολλαπλά περάσματα. Έτσι, αξιολογήσαμε τη δυνατότητα της Ε /GEJ PTXGs να επαναλάβει ό, τι βρεθεί κλινικά σε ανθρώπινες E όγκους /GEJ, και οι συνθήκες υπό τις οποίες οι εν λόγω PTXGs είναι σκόπιμο να χρησιμοποιούνται ως μοντέλα προ-κλινικές δοκιμές του φαρμάκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικές και Παθολογικές Πληροφορίες ασθενούς

Όλοι οι ασθενείς είχαν προσληφθεί μέσω γραπτής συγκατάθεσης. την πληροφόρηση των ασθενών, συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας και της έκβασης (

i

.

e

. συνολική επιβίωση) λήφθηκε μέσω του συστήματος Ηλεκτρονικός Φάκελος Ασθενούς στο Πανεπιστημιακό Δίκτυο Υγείας (UHN), Τορόντο, Καναδά, από γαστρο -intestinal ογκολόγους. Το Διοικητικό Συμβούλιο UHN Ερευνητικής Δεοντολογίας (REB #: 06-0982-CE). Ενέκρινε τη μελέτη

Ζώα και ιστών Επεξεργασία

Μη-παχύσαρκοι διαβητικοί-Σοβαρή Συνδυασμένη Ανοσολογική Ανεπάρκεια (/SCID NOD) ποντίκια είχαν εκτραφεί εσωτερικά στο Οντάριο Ινστιτούτο Καρκίνου εγκατάσταση (OCI) φροντίδα των ζώων. Όλα τα ζώα κρατήθηκαν σε ένα παθογόνο περιβάλλον χωρίς σε ένα πρότυπο 12hr-ημέρα /κύκλο 12hr-νύχτα και ταΐστηκαν ένα πρότυπο αποστειρωμένο διατροφή ίζημα και νερό

κατά βούληση

. Τα ζώα θυσιάστηκαν με διοξείδιο του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από τις ηθικές κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής OCI Animal Care (πρωτόκολλο ζώο #: 1.293,16).

Ανθρώπινο E /GEJ καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή σε UHN, Τορόντο, Οντάριο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Συνοπτικά, φρέσκο ​​ιστός αποθηκεύθηκε σε RPMI 1640 (χωρίς FBS προστέθηκε) μέχρι να κόπηκε σε κομμάτια περίπου 5 χιλιοστά διαστάσεις και εμφυτεύεται υποδορίως στο πλευρό του NOD /SCID ποντίκια (εντός 24 ωρών από την εκτομή? Ωστόσο, καρκινικούς ιστούς τοποθετήθηκαν σε μέσα καλλιέργειας ιστού εντός ενός διάμεση τιμή 45 λεπτά μετά την εκτομή, και διατηρήθηκαν σε μέσα μέχρι την εμφύτευση). Δύο αντιπροσωπευτικά κομμάτια σώθηκαν στην ένωση βέλτιστη θερμοκρασία κοπής (OCT) (καταψύχονται στους -80 ° C για μοριακή εργασία) και φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) τμήματα για μοριακή και παθολογική ανάλυση, αντίστοιχα.

Επεξεργασία

κοόρτεις 10 εμφυτευμένων ποντίκια ανά σκέλος θεραπείας παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη όγκου. Μόλις ορατό, οι όγκοι μετρήθηκαν με τη χρήση μετρικών δαγκάνες (Scienceware, cat: 134160001) δύο φορές την εβδομάδα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν οι όγκοι έφθασαν 15-20 mm στη μακρύτερη διάσταση, η οποία θεωρείται μια ανθρώπινη τελικό σημείο από την επιτροπή φροντίδα των ζώων. Μόλις οι όγκοι έφθασαν περίπου 300-750 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ελέγχου και χημειοθεραπεία όπλων. Για πειράματα μόνη αγωγή, ομάδες ποντικών ενέθηκαν μία φορά ενδοπεριτοναϊκά με 6 mg /kg σισπλατίνης (1 mg /mL, Hospira, DIN: 02126613), 9 mg /kg πακλιταξέλης (2mg /ml, Hospira, DIN: 02296624) ή 100 mg /kg 5-φθοριοουρακίλη (15mg /ml, Hospira, DIN: 021827420), ενώ η ομάδα ελέγχου εγχύθηκε με φυσιολογικό ορό. Για πειράματα συνδυασμένη θεραπεία, η ομάδα χημειοθεραπεία υποβλήθηκε σε επεξεργασία μία φορά με 5.4 mg /kg σισπλατίνης (1 mg /mL, Hospira, DIN: 02126613) και 9 mg /kg πακλιταξέλης (2mg /ml, Hospira, DIN: 02296624), βασισμένη στο πειράματα τοξικότητας του ποντικιού. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 24 ώρες μετά την αρχική θεραπεία (χαρακτηρισμένα ως μικρούς όγκους) και στο τέλος του πειράματος (μεγάλους όγκους). Ένας μέσος όρος των δύο ποντίκια (1-3) ανά βραχίονα θυσιάστηκαν για συγκρίσεις. Οι όγκοι συλλέχθηκαν και αποθηκεύονται σε OCT και FFPE μπλοκ για τη μοριακή /παθολογική χαρακτηρισμό.

Η ανοσοϊστοχημεία μοριακών δεικτών

αξιολόγησε μια ομάδα μοριακών δεικτών με ανοσοϊστοχημεία (IHC) να μελετήσει τη σταθερότητά τους μέσα σε κάθε ξενομοσχεύματος. Δείκτες επιλέχθηκαν με βάση τη σημασία τους για τον καρκίνο του Ε /GEJ. τομές ιστού FFPE βάφτηκαν με αντισώματα έναντι ρ53 (κλώνος DO-7, Vector Laboratories, Burlington, Καναδάς, αραίωση: 1: 250), ρ16

ΙΝΚ4 & (ΜΤΜ εργαστήρια AG, Heidelberg, Γερμανία? όχι- αραιωμένο), Ki- 67 (κλώνος SP6, NeoMarkers, Rockford, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, την αραίωση: 1: 500), EGFR (κλώνος 31G7, Zymed, San Fransisco, ΗΠΑ, αραίωση: 1: 100), Her-2 /

neu

(κλώνος A0485, Dako, Μπέρλινγκτον, Καναδάς, αραίωση: 1: 25), HIF-1α (κλώνος 54, BD Biosciences, Franklin Lakes, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, την αραίωση: 1: 50) και CD31 (κλώνος PECAM1, Santa Cruz, USA, αραίωση: 1 : 1000). Ένας δείκτης χρώση χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της έκφρασης CD31 και HIF-1α χρησιμοποιώντας Aperio ImageScope θεατή. Όλα τα άλλα μοριακούς δείκτες αξιολογήθηκαν με τυφλό ομάδα παθολόγων. Χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός ενός βαθμολογίας αναλογία και μια βαθμολογία της έντασης. Η βαθμολογία αναλογία (ποσοστό θετικών καρκινικών κυττάρων) ήταν: 0: κανένα, 1: 1-24%, 2: 25-49%, 3: 50-74, 4: ≥75%. Η βαθμολογία της έντασης (ένταση της χρώσης από τα κύτταρα του όγκου) ήταν: 0: κανένα, 1: ασθενής, 2: μέτρια, 3: ισχυρή. Μια συνολική βαθμολογία ελήφθη με συνδυασμό και των δύο βαθμολογίες. Εν συντομία, ρ53 και ρ16 θεωρήθηκαν θετικά εάν χρώση εμφανίστηκε ενώ Ki-67 εκτιμήθηκε με βάση το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου. έκφραση EGFR μεμβράνης καθορίζεται EGFR-θετικότητα. Her-2 /

χρησιμοποιήθηκε neu

πρότυπο βαθμολόγησης? δείγματα θεωρούνται ότι έχουν παρόμοια έκφραση, αν διέφεραν κατά λιγότερο από μία βαθμολογία έντασης λεκέ (π.χ.. 2+ vs 3+). Δύο όψεων t-tests χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί διαφορές στην έκφραση για τις παραμέτρους αυτές.

RNA Extraction

RNA εξήχθη από τον Οκτώβριο ενσωματωμένα ξενομοσχεύματος και ανθρώπινου ιστού (δέκα χ 10μm φέτες πάχους κρυοστάτη) χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι-κιτ (Qiagen, 74104). ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με τη χρήση της Agilent-2100-Bioanalyzer και το RNA Nano-6000-kit (Agilent Technologies, 5067 – 1.511) και ποσοτικά με τη χρήση Nanodrop-ΝΔ-1000 Φασματοφωτόμετρο (Thermo-Scientific). αριθμούς ακεραιότητα του RNA (RIN) της 7+ ή 8+ ήταν ως cutoffs ποιότητας για τους ασθενείς και τα δείγματα PTXG, αντίστοιχα.

Επισήμανση και υβριδισμός

Τα δείγματα επισημαίνονται σύμφωνα με το GeneChip WT Terminal Σήμανση και υβριδισμός εγχειρίδιο, σε υβριδισμό με την οργάνωση Human Gene-1,1-ST συστοιχίες (Affymetrix) και σαρώνεται με το GeneChip Scanner 3000-7G (Affymetrix). Όλες οι συστοιχίες πέρασε κριτήρια ποιοτικού ελέγχου (Έκφραση Console λογισμικό, Affymetrix).

Στατιστική Ανάλυση

Για την ανάλυση χημειοευαισθησία, η καθυστέρηση στην ώρα για έναν όγκο να διπλασιαστεί σε όγκο συγκρίθηκε μεταξύ αντιμετωπίζονται γραμμές και τους αντίστοιχο χωρίς θεραπεία έλεγχοι. χρονικές καθυστερήσεις προσδιορίστηκαν με τη γραφική αναπαράσταση των όγκων του όγκου σε λογαριθμική κλίμακα Y και χαραχθεί μια οριζόντια γραμμή στο όγκο διπλασιασμό που συλλαμβάνονται τις καμπύλες ανάπτυξης του ελέγχου και της θεραπείας. Ο χρόνος καθυστέρησης προσδιορίστηκε ως η διαφορά στο χρόνο μεταξύ των δύο παρακολουθήσεις και αναφέρεται ως η χρονική καθυστέρηση διπλασιασμού. Ο μέσος χρόνος διπλασιασμού καθυστέρησης για ανθεκτικές έναντι ευαίσθητες γραμμές υπολογίστηκε με τη συγκέντρωση όλων των ποντικών ελέγχου και τη σύγκρισή τους με τις συγχωνευμένες τιμές των ποντικών που έλαβαν.

Πρόσθετες στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες για να καθορίσει προκατάληψη στο δείγμα της μελέτης και να προσδιορίσει τους παράγοντες που συνδέονται με την εμφύτευση. Δύο όψεων t-tests εφαρμόστηκαν σε όλες τις περιπτώσεις. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν σημαντικά όταν

σ

-τιμή & lt? 0,05. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SAS.v.9.2 (Cary, NC).

Gene ανάλυσης των χαρακτηριστικών

Τόσο πρωτοπαθούς όγκου του ασθενούς και να συνδυαστούν ξενομοσχεύματος δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις μεταγραφικό (συνολικά, 51 δείγματα αναλύθηκαν για αφθονία mRNA). Είκοσι ένα όγκοι αδενοκαρκινώματος προφίλ (12 μεταμοσχευμένα /9 μη μεταμοσχευμένα). Για οκτώ μεταμοσχευμένα πρωτογενή αδενοκαρκινώματα, ένα πέρασμα ένα δείγμα (Π1) ξενομοσχεύματος προφίλ. Επιπλέον, η ανάλυση διεξήχθη επί 21 αργότερα ξενομοσχεύματα διόδου (P3 μέσω Ρ12), εκ των οποίων εννέα ήταν από μικρά (νωρίς στην καμπύλη ανάπτυξης) όγκους και 12 ήταν από μεγάλους όγκους.

αξιολογούνται διαφορές στα προφίλ mRNA μεταξύ (α) οι όγκοι των ασθενών που εμφυτεύτηκαν

vs

εκείνους που δεν το έκαναν, (β) ξενομοσχεύματα P1

vs όγκους

P0 (πρωτοβάθμια), (γ) αργότερα ξενομοσχεύματα πέρασμα

vs

P1, και (δ) μεγάλης

vs

μικρούς όγκους ξενομοσχεύματος μέσα στο ίδιο σημείο. Για κάθε σύγκριση, ένα γονίδιο-σοφός γραμμικό μοντέλο ήταν σωστό να συγκρίνουμε τις δύο προϋποθέσεις, προσαρμοσμένο για σειρά παρτίδας και, όπου κρίνεται σκόπιμο, για τη διέλευση. Μια διόρθωση ποσοστό ψευδώς ανακάλυψη έγινε για να αντιπροσωπεύουν πολλαπλές δοκιμές [19].

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R (v2.15.3). Το πακέτα πλέγματος (v0.20-15) και latticeExtra (v0.6-24) χρησιμοποιήθηκαν για την γραφική αναπαράσταση. Προ-επεξεργασία δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο RMA [20] (πακέτο Affymetrix, v1.36.0) σε συνδυασμό με το επικαιροποιημένο σχολιασμούς ProbeSet (πακέτο hugene11stv1hsentrezgcdf, v15.0.0) [21]. Ένα φίλτρο έκφραση χρησιμοποιήθηκε για να αφαιρέσει πειραματικό θόρυβο. Ένα κατώφλι χαμηλής έντασης ορίστηκε με βάση τις εντάσεις γονίδιο χρωμόσωμα-Υ των πέντε θηλυκών δείγματα των ασθενών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Ανιχνευτές με μέση log

2-μετασχηματιστεί αξίας έκφρασης κάτω από πέντε αφαιρέθηκαν. Συνολικά, ~ 15.500 ανιχνευτές διατηρούνται.

Μια ανάλυση δύναμη εκτελέστηκε με τη συνάρτηση power.t.test (πακέτο στατιστικά v.2.15.3) για να εκτιμηθεί η πιθανότητα ότι θα μπορούσαν να προσδιοριστούν οι διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ ομάδες. Από τα δεδομένα της έκφρασης ήταν στο ημερολόγιο

2-χώρο, μια διαφορά στη μέση έκφραση ήταν ισοδύναμη με το ημερολόγιο

2-μετασχηματιστεί φορές αλλαγή. Ο αριθμός των παρατηρήσεων ανά ομάδα ορίστηκε σε 10 και το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 0,05 /15.500 = 3×10

-6 (

i

.

e

., Bonferroni διορθωμένο). Ισχύς υπολογίστηκε για ένα φάσμα πολλαπλών μεταβολών (