Αφηρημένο

Ανθρώπινο καρκίνωμα παχέος εντέρου (HCT-8) κύτταρα δείχνουν μια σταθερή μετάβαση από χαμηλή σε υψηλή μεταστατική κατάσταση, όταν καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλα μαλακά υποστρώματα (21 kPa). Αρχικά επιθηλιακά (Ε) ως προς τη φύση, τα κύτταρα HCT-8 γίνονται στρογγυλεμένες (R) μετά από επτά ημέρες καλλιέργειας σε μαλακό υπόστρωμα. R κύτταρα εμφανίζουν έναν αριθμό μεταστατικών χαρακτηριστικά [1]. Εδώ, χρησιμοποιούμε κλίση υποστρώματα δυσκαμψία, έναν αισθητήρα δύναμης βιο-MEMS, και σε αντίθεση δοκιμασίες Coulter για να μελετήσει mechanosensitivity και την πρόσφυση των Ε και R κύτταρα. Θεωρούμε ότι HCT-8 κύτταρα χάνουν mechanosensitivity όπως αυτά υφίστανται E-to-R μετάβασης. δυσκαμψία HCT-8 R κυττάρων, εξάπλωση περιοχή, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση να γίνει αναίσθητη στο υπόστρωμα ακαμψία σε αντίθεση με τα επιθηλιακά ομόλογό τους. Είναι πιο μαλακό, πολλαπλασιαστικές και μεταναστευτικές σε όλα τα υποστρώματα. R κύτταρα εμφανίζουν αμελητέα προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου ομοτυπική, καθώς και μη-ειδική προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος. Κατά συνέπεια, δείχνουν την ίδια περιοχή εξάπλωση σε όλα τα υποστρώματα, σε αντίθεση με E κύτταρα. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η Ε κύτταρα αποκτούν την αυτονομία και την ανεξαρτησία αγκυροβόλιο, και επομένως είναι δυνητικά πιο επεμβατική από κύτταρα Ε. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη αναφορά των ποσοτικών δεδομένων σχετικά με τις αλλαγές στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και την ακαμψία κατά την έκφραση ενός

in vitro

μετάσταση φαινότυπο

Παράθεση:. Tang Χ, Wen Q, Kuhlenschmidt φυματίωση, Kuhlenschmidt MS, Janmey PA, Σαΐφ TA (2012) Εξασθένηση των κυττάρων Mechanosensitivity στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα κατά τη διάρκεια

In Vitro

μετάσταση. PLoS ONE 7 (11): e50443. doi: 10.1371 /journal.pone.0050443

Επιμέλεια: Fan Yuan, το Πανεπιστήμιο Duke, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 του Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 22η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Tang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται οικονομικά από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (NSF) χορηγεί αρ ECCS 07-25831, 10 – 02165 και ΝΙΗ RO1 083272-03. XT χρηματοδοτήθηκε από το NSF Grant 0965918 IGERT: εκπαίδευση της επόμενης γενιάς των ερευνητών στο Κυτταρικής και Μοριακής Μηχανικής και βιονανοτεχνολογία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι περισσότεροι θάνατοι από καρκίνο που προκαλείται από τη μετάσταση και όχι από τον πρωτογενή όγκο μητρική [2], [3], [4], [5], [6]. Κατά τη διάρκεια της μεταστάσεως, τα κακοήθη καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από τον όγκο αποσπώντας ένα από το άλλο ή από άλλα κύτταρα και το εξωκυτταρικό πλέγμα (ECM) [2], [3], [6], [7]. Τα διέφυγαν κύτταρα εκφράζουν ενεργά πρωτεϊνάσες και μεταβάλλουν συνδέτες πρόσφυση τους να υποβαθμίσει και να τροποποιήσετε γύρω ECM τους [3], [4], [5], [8], [9]. Ταυτόχρονα, αυτοί ρυθμίζουν κινητικότητα και την αντοχή τους σε απόπτωση για την επιτυχή αγγειακή εξάπλωση και εισβολή των μακρινών υγιών οργάνων [6], [7], [10]. Παράλληλα, τα κύτταρα αυτά μειώσουν την ακαμψία τους [11], [12], [13], [14], δηλαδή, να αυξηθεί η συμμόρφωση τους να ρέει μέσα από μικρά τριχοειδή [4], [15], [16]. Μια ποσοτική μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια των πρώιμων φάσεων της μετάστασης? Ωστόσο, λείπει [17], [18], [19], [20], σε μεγάλο βαθμό λόγω των προκλήσεων στην ανίχνευση της έναρξης της μετάστασης

in vivo

και την ετερογένεια σε βιοχημικές και κυτταρικές ιδιότητες των μεμονωμένων όγκων κύτταρα [3], [17], [21], [22].

πρόσφατα ανακαλύφθηκε [1] ότι τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (HCT-8) μπορεί να εμφανίσει σταθερά ένα

in vitro

μετάσταση φαινότυπο (MLP), όταν καλλιεργούνται σε μαλακό υποστρώματα υδρογέλης με κατάλληλη μηχανική ακαμψία (πηκτές πολυακρυλαμιδίου με μέτρο Young: 21~47 kPa [1], [23]). HCT-8 κύτταρα είναι επιθηλιακά (Ε) στη φύση. Όταν καλλιεργήθηκαν σε μαλακό υπόστρωμα, αποτελούν την πρώτη διακριτή επιθηλιακά συστάδες ή νήσων. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα διασπώνται από τα νησιά, και να αναλάβουν ένα στρογγυλεμένο σχήμα (κύτταρα R). Αυτά τα κύτταρα είναι άκρως R πολλαπλασιαστικές, μεταναστευτικά και σημαντικά ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση Ε-καδερίνης – τυπικά χαρακτηριστικά της μετάστασης [1], [24]. Περαιτέρω, το Ε στην Ε μετάβαση είναι επαναλαμβανόμενη και μη αναστρέψιμη [1], [24]. Για σκληρά υποστρώματα (3 GPa υποστρώματα πολυστυρένιο), δεν συμβαίνει αυτό Ε στην Ε μετάβασης.

Σε αυτή τη μελέτη, θα παρουσιάσει την πρώτη λεπτομερή έρευνα της mechanosensitivity της τόσο πριν όσο και μετά την μετάσταση-όπως HCT-8 κύτταρα χρησιμοποιώντας μία διαβάθμιση υπόστρωμα ακαμψία. Η μελέτη αποκαλύπτει την απώλεια mechanosensitivity του HCT-8 κύτταρα R σε αντίθεση με αμφότερα τα Ε κύτταρα και φυσιολογικών ινοβλαστών. Η ακαμψία των κυττάρων R, που μετράται με AFM, γίνεται ανεξάρτητη από την ακαμψία του υποστρώματος. Σε αντίθεση, η ακαμψία των κυττάρων Ε συσχετίζεται με την ακαμψία του υποστρώματος. μετρητή Coulter και Bio-MEMS δοκιμασίες αποκαλύπτουν ότι R κύτταρα έχουν χαμηλή ομοτυπική προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και αμελητέα μη ειδική προσκόλληση σε σύγκριση με Ε κυττάρων.

Αποτελέσματα

1. Ασθενής προσκόλληση μεταξύ HCT-8 κυττάρων R και υπόστρωμα

Για να διερευνήσει τον τρόπο HCT-8 R κύτταρα αποκρίνονται σε διαφορετικά φυσιολογικά σχετικά υποστρώματα διαφορετικής ακαμψίας, HCT-8 κύτταρα R συλλέχθηκαν από μαλακά πηκτώματα ΡΑ, επεκτάθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​ακαμψίας κλίση υποστρώματα ΡΑ gel με ακαμψία μεταβάλλοντας συνεχώς από 1 έως 20 kPa (Εικ. 1a, από αριστερά προς τα δεξιά). Το υπόστρωμα της ακαμψίας κλίση είναι επικαλυμμένο με ένα ομοιόμορφο συγκέντρωση ινονηκτίνης να επιτραπεί η σύνδεση των κυττάρων με το υπόστρωμα [25], [26], [27]. Για σύγκριση, οι δύο HCT-8 E κύτταρα και κύτταρα νεφρού πιθήκου φυσιολογική ινοβλάστη (MKF), χωρίς προηγούμενη έκθεση σε πηκτώματα PA, απλώθηκαν στα ίδια υποστρώματα κλίση ακαμψία και επιφανειακή υποκατάσταση (Σχ. 1β και 1γ). Τα φυσιολογικά κύτταρα MKF επελέγησαν ως έλεγχος επειδή είναι γνωστόν ότι είναι μηχανοευαίσθητων στο υπόστρωμα ακαμψία [28]. Βρήκαμε, σε αντίθεση με HCT-8 E κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα MKF, HCT-8 R κύτταρα ιδιοσυστατικώς έδειξε πολύ περιορισμένες περιοχές επαφής υπόστρωμα ανεξάρτητα από την ακαμψία του υποστρώματος. επιφάνεια επαφής των κυττάρων R ‘με το υπόστρωμα είναι περίπου 40-60% της φαινομενικής προβλεπόμενης περιοχής τους. Όπως μετράται από 3D συνεστιακή μικροσκοπική απεικόνιση, το R περιοχή επαφής των κυττάρων με υπόστρωμα είναι μόνο 49.5 ± 20.9 μm

2 (n = 34), η οποία είναι 3,8 ± 0,3 φορές μικρότερα από τα κύτταρα Ε (n = 47), γεγονός που υποδηλώνει ότι το R κύτταρα έχουν ασθενέστερη πρόσφυση με το υπόστρωμα από τα κύτταρα Ε. Η ασθενής προσκόλληση του R κυττάρων με υπόστρωμα είναι επίσης συνεπές με την παρατήρηση ότι το R κύτταρα δείχνουν μια μικρότερη προβαλλόμενη επιφάνεια, από Ε κύτταρα στο ίδιο υπόστρωμα ακαμψία (Σχ. 1 d). Η προβλεπόμενη έκταση των απομονωμένων κυττάρων χωρίς οποιαδήποτε γειτονική επαφή κυττάρου, του είναι 1,9 0,6 φορές μικρότερη για το R κύτταρα (n = 68) από τα κύτταρα Ε (n = 61).

(α-γ) εικόνες αντίθεσης φάσης του τα συλλεχθέντα κύτταρα HCT-8 R, HCT-8 E κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα MKF στις βαθμίδας ακαμψία υποστρώματα γέλη ΡΑ. Οι αντίστοιχες 3 τετράγωνα (που περικλείεται από κίτρινα κουτιά παύλα) δείχνουν τα αντιπροσωπευτικά μεγεθύνεται απόψεις για 1-5 kPa, 8-12 kPa, και 15-20 kPa τομείς ακαμψία. Τα λευκά βέλη σε μεγεθυμένη απόψεις δείχνουν τα μονά κύτταρα μη-επαφής, ενώ τα κίτρινα βέλη δείχνουν τις επικοινωνώντας κύτταρα σε αποικίες. Κλίμακας μπαρ σε μεγεθυμένη πάνελ άποψη είναι 100 μm. (Δ) προβλεπόμενη έκταση της ενιαίας κυττάρων από 3 τύπους κυττάρων σε όλο το φάσμα δυσκαμψίας φαίνονται. Εδώ δεν έχουν καμία επαφή με τα γειτονικά τους κύτταρα σε διάφορα υποστρώματα ακαμψία. (Ε) Η περιοχή εξάπλωσης των μεμονωμένων κυττάρων σε επαφή με γειτονικά κύτταρα σε διάφορα υποστρώματα ακαμψία. (Στ) Η φαινόμενη περιοχή αποικία κυττάρων από 3 τύπους κυττάρων σε διάφορα υποστρώματα ακαμψία. (Ζ) Ο συντελεστής σχήματος του κυττάρου του 3 τύπους κυττάρων, τα οποία δεν είναι σε επαφή με τα γειτονικά τους κύτταρα σε διάφορα υποστρώματα ακαμψία. (Η) Ο συντελεστής σχήματος των κυττάρων των μεμονωμένων κυττάρων, τα οποία βρίσκονται σε επαφή με γειτονικά κύτταρα σε διάφορα υποστρώματα ακαμψία.

Η

HCT-8 R κύτταρα δείχνουν επίσης μια αξιοσημείωτη έλλειψη ευαισθησίας για την αλλαγή της μηχανικής-ακαμψία του τους υπόστρωμα καλλιέργειας. Διατηρούν ένα στρογγυλεμένο φαινότυπο και περιορισμένη περιοχή πρόσφυση σε υποστρώματα, ανεξάρτητα από την ακαμψία των υποστρωμάτων »(Σχήμα 1α, που υποδεικνύεται από λευκά βέλη?. Σχ. 1δ, 1ε και 1ζ). Όταν η ακαμψία του υποστρώματος κυμαίνεται σε 20-πλάσια περιοχή, η περιοχή εξάπλωσης των μεμονωμένων κυττάρων R αυξήθηκε μόνο περίπου 27%, (από 156,2 ± 42,1 μm

2 σε μια περιοχή 1 kPa (n = 62) για να 197,9 ± 83,6 μm

2 (n = 56) σε μια περιοχή 20 kPa) (Σχ. 1 d). Σε όλη την ακαμψία που εξετάστηκαν, η αύξηση στην περιοχή εξάπλωσης R κύτταρα δεν είναι τόσο δραματική όσο εκείνη των κυττάρων Ε και MKF. Στις 5 kPa, 10 kPa και 15 περιφέρειες kPa, περιοχές εξάπλωσής τους είναι 158,2 ± 40,3 μm

2 (n = 56), 182,3 ± 32,2 μm

2 (n = 63), και 190,9 ± 82,5 μm

2 (n = 57), αντίστοιχα (Σχ. 1 d). Επίσης, ο παράγοντας σχήματος R κυττάρων αλλάξει μόνο το 7% από 0,9 ± 0,2 σε μια περιοχή 1 kPa σε 0,8 ± 0,2 σε 20 kPa περιοχή (Σχήμα 1 g?. Ο συντελεστής σχήματος, S = 4 * πA /P

2, όπου Α είναι η επιφάνεια του κυττάρου και το Ρ είναι η περίμετρος. S = 1 για τέλεια κυκλικό σχήμα και 0 για ακανόνιστο σχήμα), υποδεικνύοντας συστατική στρογγυλεμένο σχήμα ανεξάρτητο από την ακαμψία του υποστρώματος. Στις 5 kPa, 10 kPa και 15 περιφέρειες kPa, οι παράγοντες σχήμα των μεμονωμένων κυττάρων R είναι 0,8 ± 0,1, 0,8 ± 0,2 και 0,9 ± 0,2, αντίστοιχα (Εικ. 1 g). Μετά από παρατεταμένη καλλιέργεια (60 ημέρες), το R κύτταρα δεν έδειξαν καμία αναστροφή προς μία επιθηλιακή μορφολογία σε κάθε υλικό, ανεξάρτητα από την ακαμψία, ακόμη και πολύ άκαμπτο πολυστερίνη (3 GPa) [1]. Επιπλέον, η καθημερινή καταγραφή μέσω μικροσκόπιο βίντεο δείχνει ότι η Ε κύτταρα δεν παρουσιάζουν κανένα σημάδι της απομείωσης της πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας, ακόμη και μετά από αρκετούς μήνες στον πολιτισμό. Σε αντίθεση, και οι δύο HCT-8 E κύτταρα και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν MKF για τον ίδιο τύπο των υποστρωμάτων κλίση ακαμψία δείχνουν προφανή ευαισθησία για τη μηχανική ακαμψία του υποστρώματος καλλιέργειας τους. Το άτομο απομονωμένο E κύτταρα εξαπλώνονται περιοχή αυξάνει 2.5 φορές πάνω από 20 φορές την αλλαγή ακαμψία του υποστρώματος, από 239,6 ± 191,9 μm

2 στην περιοχή 1 kPa έως 578,1 ± 429,8 μm

2 στις 20 kPa περιοχή (Εικ. 1b , που υποδεικνύεται με λευκά βέλη). Ως υποστρώματα γίνει άκαμπτο, οι HCT-8 E κύτταρα εμφανίζουν μια ευρύτερη περιοχή εξάπλωσης, με περιοχές εξάπλωσής τους 270,8 201,7 μm

2 (n = 51), 276,0 ± 104,8 μm

2 (n = 62), και 442.7 ± 367,7 μm

2 (n = 55), στις 5 kPa, 10 kPa και 15 περιφέρειες kPa, αντίστοιχα (Σχ. 1β). συντελεστής σχήματος τους μειώθηκε από 0,9 ± 0,2 για την περιοχή 1 kPa έως 0,6 ± 0,2 για το 20 kPa περιοχή (Εικ. 1 g). Απέναντι άλλα ακαμψία που δοκιμάστηκαν, οι παράγοντες ενιαία E κύτταρα σχήμα είναι 0,8 ± 0,2 (στις 5 kPa περιοχή), 0,8 ± 0,1 (στις 10 περιοχή kPa), και 0,7 ± 0,3 (στις 15 περιοχή kPa), αντίστοιχα. Η mechanosensitivity της MKF είναι ακόμα πιο έντονη σε σύγκριση με HCT-8 καρκινικά κύτταρα (Εικ. 1γ). Η περιοχή εξάπλωση των μεμονωμένων απομονωμένων κυττάρων MKF (Σχήμα 1γ?. Υποδεικνύονται με λευκά βέλη) αυξάνει 5 φορές κατά μήκος του υποστρώματος κλίση, από 286,4 ± 86,2 μm

2 (n = 46) σχετικά με την περιοχή 1 kPa έως 1421,7 ± 845,7 μm

2 (n = 31) στο 20 kPa περιοχή (Σχ. 1 d). Ως υπόστρωμα αυξάνει την ακαμψία, τους αυξάνεται περιοχή εξάπλωσης δραματικά, και 578,1 ± 373,1 μm

2 (n = 62), 749,9 ± 355,5 μm

2 (n = 63), και 1218,6 ± 773,5 μm

2 (n = 59), στις 5 kPa, 10 kPa και 15 περιφέρειες kPa, αντίστοιχα. Παράλληλα με την αύξηση της ακαμψίας του υποστρώματος, μεμονωμένα κύτταρα MKF εξαπλωθεί σε μια πιο ακανόνιστη μορφολογία, με συντελεστή το σχήμα τους να μειώνεται από 0,9 ± 0,1 στο 1 kPa σε 0,5 ± 0,2 για τις 20 περιφέρειες kPa, αντίστοιχα (Εικ. 1 g). Για τις ενδιάμεσες περιφέρειες δυσκαμψία, δηλαδή 5 kPa, 10 kPa και 15 περιφέρειες kPa, οι παράγοντες σχήμα των μεμονωμένων κυττάρων MKF είναι 0,7 ± 0,3, 0,6 ± 0,3 και 0,5 ± 0,3, αντίστοιχα. Η ασθενής πρόσφυση μεταξύ HCT-8 κυττάρων R και του υποστρώματος, καθώς και η ανεξαρτησία της μορφολογίας R κυττάρου από ακαμψία υπόστρωμα, υποδεικνύουν έντονα ότι R κύτταρα χάνουν εξάρτηση από την αγκύρωση και την επικοινωνία με μηχανικό μικροπεριβάλλον τους. Αυτό αγκύρωση-ανεξαρτησία μπορεί δυνητικά να προωθήσει R κύτταρα επιβίωση σε εναιώρημα, το οποίο αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό γνώρισμα του

in vivo

μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [2], [3], [4], [16], [22] .

2. HCT-8 R κύτταρα δείχνουν αδύναμα προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου

Σε υποστρώματα ακαμψίας κλίση, και οι δύο HCT-8 E κύτταρα και κύτταρα MKF δείχνουν σχηματισμό αποικίας κυττάρου, ειδικά σε σκληρότερες περιοχές (υποδεικνύονται με κίτρινα βέλη στο Σχ. 1 b και 1γ). Το μέγεθος της αποικίας συσχετίζεται θετικά με την ακαμψία του υποστρώματος. Την δυσκαμψία του υποστρώματος 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa και 20 kPa πήζει τα μεγέθη αποικία κυττάρων HCT-8 E κύτταρα είναι 2962,2 ± 1000,5 μm

2, 3662,1 ± 1105,3 μm

2, 4249,5 ± 919,5 μm

2, 9736,5 ± 4032,7 μm

2 και 11.748,7 ± 2144,9 μm

2, αντίστοιχα (Εικ. 1 στ). Για HCT-8 R κύτταρα στις ίδιες ακαμψία υποστρώματα, τα μεγέθη των αποικιών είναι σαφώς μικρότερα από Ε αντίστοιχά τους, ακόμη και όταν το R κύτταρα είναι σε επαφή με γειτονικά κύτταρα για 3 ημέρες (σχ. 1α). Σε δυσκαμψιών υπόστρωμα 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa και 20 kPa, τα μεγέθη αποικία R κυττάρων είναι, 1087,4 ± 338,3 μm

2, 1449,8 ± 343,4 μm

2, 3062,2 ± 1326,9 μm

2, 3849,6 ± 919,1 μm

2 και 3912,1 ± 1183,8 μm

2, αντίστοιχα (Εικ. 1 στ). Παρατηρήσαμε επίσης ότι μέσα αποικίες κυττάρων R, η περιοχή επαφής μεταξύ κυττάρων δεν είναι τόσο εκτεταμένη όσο σε αποικίες κυττάρων Ε. R κύτταρα φαίνεται να αγγίζει μόλις το ένα το άλλο στο σημείο-επαφές (Σχ. 1α). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν R προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου δεν είναι επαρκής για να σχηματίσει συνεκτική αποικίες ή κυτταρικών νησιά όπως κάνουν τα κύτταρα Ε και MKF.

Επιπλέον, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι, όπως HCT-8 E κύτταρα ή κύτταρα MKF υποβάλλονται σε ομοτυπική προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, μεμονωμένες περιοχές των κυττάρων τους και συντελεστή σχήματος κυττάρου γίνει αξιοσημείωτα λιγότερο υπόστρωμα ακαμψία-εξαρτώμενο (Σχ. 1β και 1γ, που υποδεικνύεται με κίτρινα βέλη). Επιμέρους τομείς των κυττάρων και των παραγόντων που το σχήμα του ενιαίου HCT-8 E κύτταρα στο εσωτερικό των κυττάρων νησιά την 1η τζελ kPa είναι 785,6 ± 299,4 μm

2 και 0.7 ± 0.1, αντίστοιχα, οι οποίες είναι παρόμοιες με αυτές στις 20 τζελ kPa, 892,8 ± 322,1 μm

2 και 0,6 ± 0,1 (Εικ. 1e και 1 ώρα). Τα ίδια χαρακτηριστικά που παρατηρούνται στην ενδιάμεση ακαμψία, η περιοχή των κυττάρων και συντελεστή σχήματος των επιμέρους HCT-8 E μέσα νησιά είναι 526,7 ± 187,0 μm

2 και 0,8 ± 0,1 σε 5 τζελ kPa, 633,9 ± 421,4 μm

2 και 0,6 ± 0,2 σε 10 γέλες kPa και 723,1 ± 515,2 μm

2 και 0,6 ± 0,2 σε 15 γέλες kPa. Για μεμονωμένα κύτταρα MKF μέσα νησιά, περιοχή κελιών τους και συντελεστή σχήματος είναι 928,5 ± 374,0 μm

2 και 0,5 ± 0,3 σε 1 τζελ kPa, 892,8 ± 415,7 μm

2 και 0,5 ± 0,3 σε 5 τζελ kPa, 1098.1 ± 564,6 μm

2 και 0,5 ± 0,2 σε 10 γέλες kPa, 1008,8 ± 223,7 μm

2 και 0,3 ± 0,2 σε 15 γέλες kPa, και 1160,6 ± 429,7 μm

2 και 0,4 ± 0,1 σε 20 γέλες kPa ( Εικ. 1e και 1 ώρα). Μόλις αυτά τα κύτταρα δημιουργήσει επαφές κυττάρου-κυττάρου, τα Ε και κύτταρα MKF δείχνουν εξάπλωση των κυττάρων σε πολύ μαλακό 1 πηκτώματα kPa, προτείνοντας τα σήματα μεταξύ κυττάρων ξεπερνούν τα σήματα κυττάρου-υποστρώματος (το αριστερό περιοχή στο Σχ. 1β και 1γ, που υποδεικνύεται από κίτρινο βέλη). Η πλειονότητα των HCT-8 κύτταρα R? Ωστόσο, παραμένουν στρογγυλεμένο, με το ίδιο εμφανές περιοχή κυττάρων και συντελεστή σχήματος με εκείνες του απομονωμένα κύτταρα R, ακόμη και όταν είναι σε επαφή με τα γειτονικά κύτταρα (Σχ. 1α, που υποδεικνύεται με κίτρινα βέλη). Αυτός ο φαινότυπος R κυττάρων οδηγεί σε γενικά μικρότερη περιοχή αποικία R κυττάρων σε σύγκριση με τα νησιά Ε κυττάρων που αποτελείται από παρόμοιους αριθμούς κυττάρων (Εικ. 1 στ). Οι επιμέρους τομείς κυττάρου και παράγοντες σχήματος των μεμονωμένων κυττάρων R μέσα αποικίες R κυττάρου επί 1 πηκτώματα kPa είναι 151,8 ± 33,4 μm

2 και 1.0 ± 0.1, αντίστοιχα, και είναι παρόμοια με εκείνα στις 20 πηκτώματα kPa (169,6 ± 30,5 μm

2 και 0,9 ± 0,2), αντίστοιχα, καθώς και εκείνες του ενιαίου κυττάρων R εμφανίζουν κανένα κυττάρου-κυττάρου επαφές (Εικ. 1e και 1 ώρα). Στις 5 kPa, 10 kPa και 15 τζελ kPa, στην περιοχή των κυττάρων και συντελεστή σχήματος των επιμέρους HCT-8 κύτταρα R στο εσωτερικό νησιά είναι 156,2 ± 52,3 μm

2 και 0.8 ± 0.1, 142.8 ± 47,2 μm

2 και 0,9 ± 0.0, και 160,7 ± 33,4 μm

2 και 0.8 ± 0.2, αντίστοιχα. Αυτό το μοναδικό φαινότυπος παραμένει ακόμα και μετά R κύτταρα καλλιεργούνται για τα πολύ άκαμπτα υποστρώματα πολυστυρενίου (3 GPa) για παρατεταμένους χρόνους καλλιέργειας (μήνες)? προτείνοντας και πάλι αδύναμη προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου μεταξύ R κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι κατά τη διάρκεια ή μετά την Ε-to-R μετάβαση, R κύτταρα αποκτούν αυτονομία κύτταρο που χαρακτηρίζεται από σημαντικά μειωμένη κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-υποστρώματος κόλλα επαφών.

3. R κύτταρα έχουν μειωμένη ομοτυπική δραστικότητα συγκόλλησης κυττάρου-κυττάρου

Εκτός εκτίμηση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου ποιοτικά με βάση την μορφολογία τους επαφή, χρησιμοποιήσαμε περαιτέρω τη δοκιμασία μετρητή Coulter για να μελετήσει ποσοτικά την λειτουργική απώλεια των HCT-8 κυττάρου-κυττάρου προσκόλληση παρακάτω E-to-R μετάβασης. Ο μετρητής Coulter μετρά το ρυθμό και το βαθμό της κυτταρικής προσκόλλησης με ποσοτικοποίηση της μείωσης του αριθμού των μεμονωμένων κυττάρων σε εναιώρημα ως κυτταρικά συσσωματώματα σχηματίζουν ως συνάρτηση του χρόνου [1], [29], [30]. Η κινητική του ειδικού ομοτυπική προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου για καρκινικό επιθηλιακών HCT-8 Ε και R κύτταρα μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν. Φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα (μη καρκινική) ΜΑ 104 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Βρήκαμε ότι εν διασπάσει HCT-8 κύτταρα R (που συλλέχθηκαν από 21 υποστρώματα kPa ΡΑ) εμφανίζεται αισθητά χαμηλότερο ρυθμό και την έκταση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, σε σύγκριση με τις αρχικές HCT-8 E κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υποστρώματα σκληρή πολυστερίνη (Εικ. 2). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μετά από 120 λεπτά επώασης, 84.8 ± 4.0% των κυττάρων R HCT-8 παρέμειναν ως απλά κύτταρα, σε αντίθεση με 37,6 ± 6,1% του αρχικού του HCT-8 E κύτταρα και 5.2 ± 0.7% των φυσιολογικών κυττάρων ΜΑ104 [1]. Αυτό το αξιοσημείωτο αποτέλεσμα δείχνει έντονα ότι η συγκολλητική δραστηριότητα των κυττάρων-κυττάρων των HCT-8 κύτταρα R είναι σχεδόν εντελώς χαθεί μετά αποστάσεις από τα νησιά των κυττάρων Ε. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με το εύρημα μας από μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης για την Ε κυττάρων [1], [24]. Η μείωση της κυτταρικής επιφάνειας συγκολλητικότητας παρατηρήθηκε επίσης όταν μετρήθηκε η μη ειδική δυνάμεις προσκόλλησης μεταξύ HCT-8 επιφάνειες και SiO

2 επικαλυμμένα ανιχνευτές Bio-MEMS.

(α) Σύγκριση των προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου τα ποσοστά της αρχικής HCT-8 E κύτταρα (ποτέ εκτεθειμένα σε 21 τζελ kPa PA), διαχώρισαν HCT-8 κύτταρα Ε συγκομίζονται από 21 τζελ kPa PA, και φυσιολογικά μη καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα ΜΑ104. HCT8 R κύτταρα έχουν το χαμηλότερο προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Κάθε σημείο δεδομένων αποτελείται από 3 αντίγραφα, και κάθε αντίγραφο που αποτελείται από 5 × 10

5 κύτταρα των αντίστοιχων κυτταρικών τύπων.

Η

4. αλλαγές στα κύτταρα δυσκαμψία αντανακλούν την mechanosensitivity

Εκτός από υπόστρωμα ακαμψία που εξαρτώνται από αλλαγές της κυτταρικής μορφολογίας, HCT-8 E κύτταρα έδειξαν επίσης ποικίλες κυτταρικές ακαμψία εξαρτάται από την ακαμψία του υποστρώματος πολιτισμό. Χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM), το κύτταρο ακαμψία του HCT-8 E κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί υποστρωμάτων ακαμψίας κλίση προσδιορίζεται με οδόντωση με χρησιμοποίηση προβόλους πυρίτιο νιτρίδιο με σταθερά ελατηρίου 148,14 pN /nm (με ταχύτητα οδόντωση συνεπής κύτταρο 0,1 μm /sec). θεωρία Hertz (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση του συντελεστή ελαστικότητας των δαντελένιων κυττάρων. Για να διευκολυνθεί η σύγκριση μεταξύ διαφορετικών κυττάρων στην ίδια δυσκαμψία του υποστρώματος, έχουμε ορίσει 5 ίσα-χώρος περιοχές σε όλο το φάσμα της ακαμψίας, με την περιοχή 1 που εκτείνονται σε μια ακαμψία 1-4 kPa, περιοχές 5 με ακαμψία 5-8 kPa, 9-12 kPa , 13-16 kPa, 17-20 kPa αντίστοιχα (Σχ. 3α). Χρησιμοποιώντας AFM, βρήκαμε HCT-8 E κύτταρα αυξάνουν κυττάρων ακαμψία τους, όπως τα υποστρώματα γίνονται πιο άκαμπτα. Από την περιοχή 1 έως περιοχή 5, HCT-8 E κύτταρα ακαμψία προοδευτικά αυξήθηκε από 1,4 ± 0,9 kPa σε 1,9 ± 0,8 kPa, σε 2,1 ± 1,4 kPa, σε 2,2 ± 1,3 kPa, και στο 3,8 ± 2,0 kPa, αντίστοιχα (η = 6 ~ 10 για κάθε περιοχή? Εικ. 3b). Ειδικότερα, αξίζει να σημειωθεί ότι η κλίση της αύξησης των κυττάρων ακαμψίας (Σχ. 3α) φαίνεται να ταιριάζει με την κλίση της αύξησης της ακαμψίας του υποστρώματος γέλης. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με εκείνα που αναφέρθηκαν προηγουμένως [25], και προτείνει ότι HCT-8 E κύτταρα είναι άκρως αποκρίνονται στην ευαίσθητη παραλλαγή του μικροπεριβάλλοντος μηχανικών σημάτων τους. Η ακαμψία του HCT-8 κύτταρα R? Ωστόσο, σε όλες τις διαφορετικές υποστρώματα ακαμψία, εμφανίζεται αμετάβλητο στο 0,5 ± 0,4 kPa, υποδεικνύοντας ότι το R κύτταρα έχουν πολύ περιορισμένη ή καθόλου αλληλεπίδραση με μηχανική μικροπεριβάλλον τους. Η μελέτη AFM ανέφερε επίσης ότι R κύτταρα είναι μηχανικά πιο μαλακό από τα κύτταρα Ε, η οποία δυνητικά μπορεί να ενισχύσει την πλαστικότητα τους για να καταστεί δυνατή η αποτελεσματικότερη εισβολή των ιστών στόχων παρακάτω

in vivo

μετάσταση.

Χρησιμοποιώντας Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης , η ακαμψία του HCT-8 E κύτταρα καλλιεργημένα πάνω στο υπόστρωμα κλίση προσδιορίζεται. Τα HCT-8 E κύτταρα αυξάνουν κυττάρων ακαμψία τους, όπως τα υποστρώματα γίνονται πιο άκαμπτα. Για να διευκολυνθεί η σύγκριση μεταξύ διαφορετικών κυττάρων στην ίδια δυσκαμψία του υποστρώματος, οι πέντε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους περιοχές σε όλο το φάσμα δυσκαμψίας που ορίζονται: περιοχή 1 καλύπτει 1-4 kPa, περιοχή 2 καλύπτει 5-8 kPa, περιοχή 3 καλύπτει 9-12 kPa, περιοχή 4 καλύπτει 13-16 kPa, και την περιοχή 5 καλύπτει 17-20 kPa. (Α) Από την περιοχή 1 έως περιοχή 5, η ακαμψία κύτταρο Ε αυξάνει προοδευτικά με τιμές 1,42 ± 0,85 kPa έως 1,90 ± 0,77 kPa, 2,06 ± 1,39 kPa, 2,15 ± 1,28 kPa, και 3,82 ± 1,98 kPa, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, σε υποστρώματα με γέλη ίδιο κλίση ακαμψία, οι μετα-μεταστατικά κύτταρα Ε δείχνουν σχεδόν αμετάβλητες κύτταρο ακαμψία. (Β) τις εικόνες αντίθεσης φάσης των HCT-8 E κύτταρα σε κλίση υποστρώματα PA.

Η

5. νησιά κυττάρων Ε εμφανίζουν υψηλή μη ειδική προσκόλληση σε σύγκριση με το R κύτταρα

Η επιφάνεια μη ειδική συμφύσεις των HCT-8 E κύτταρα (4

ης ημέρας του πολιτισμού για PA gel) και R κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικρο-κατασκευασμένα αισθητήρα δύναμης βιο-MEMS (Εικ. 4 και Υλικά και Μέθοδοι) [1], [30], [31]. Ο αισθητήρας αποτελείται από ένα δοκού microcantilever με βαθμονομημένο δύναμης-μετατόπισης σχέση (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Υπάρχει μια επίπεδη ανιχνευτή (πλάτος 15 μm και βάθος 5 μm) που συνδέεται με τη δοκό, η οποία σχηματίζει συγκολλητικό επαφή με τα κύτταρα (Σχ. 4α). Ο αισθητήρας αποτελείται από μονοκρυσταλλικού πυριτίου, και επικαλύπτεται με ένα λεπτό στρώμα του φυσικού οξειδίου του πυριτίου (SiO

2). Ο ανιχνευτής και ο αισθητήρας δεν είναι ενεργοποιημένα. Ο αισθητήρας χειραγωγείται με ένα στάδιο πιεζοηλεκτρική χ-γ-ζ. Η επίπεδη ανιχνευτής έρχεται σε επαφή με πλευρική κυρτή επιφάνεια E-κυττάρων νησιά «στο όριο. Κάθε νησί E-κύτταρο αποτελείται από 100 s κυττάρων με πολλαπλές κυψέλες στοίβαξη στο νησί περιφέρεια (Εικ. 4β). Μετά από μια επαφή 2 λεπτά, ο αισθητήρας δύναμης τραβιέται μακριά οριζόντια από το κύτταρο νησί με σταθερή ταχύτητα 2,1 ± 0,4 m /s (Εικ. 4γ). Ο χρόνος επαφής επιλέχθηκε ως 2 λεπτά, αφού η παρατεταμένη διάρκεια επαφής μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρική εναπόθεση ECM στο καθετήρα και περιπλέκουν την ανάλυση. Λόγω της προσκόλλησης κυττάρου-ανιχνευτή, η δέσμη του αισθητήρα παραμορφώνεται κατά τη διάρκεια της συστολής, δηλαδή κύτταρα εφαρμόσει μια δύναμη επαναφοράς κατά την απόσπαση. Η σύντομη διάρκεια επαφής μεταξύ του κυττάρου και του καθετήρα παρεμποδίζει την ενεργοποίηση των κυτταρικών ιντεγκρινών και το σχηματισμό οποιουδήποτε εστιακού πρόσφυση επί του ανιχνευτή (διαρκεί & gt? 30 λεπτά για να σχηματίσει [32], [33]). Ως εκ τούτου, μόνο μη ειδικές συγκολλητικές αλληλεπιδράσεις μπορεί να σχηματίζονται μεταξύ της επιφανείας του κυττάρου και του SiO

2-επικαλυμμένα ανιχνευτή.

(α) Το μη-λειτουργικοποιημένο μικρο λυόμενων Si αισθητήρα δύναμης με μια επίπεδη ανιχνευτή και με γνωστή σχέση δύναμης-παραμόρφωσης χειραγωγείται από έναν υψηλής ανάλυσης XYZ Piezo-στάδιο για να επικοινωνήσετε με πλευρική κυρτή επιφάνεια των κυττάρων νησιά »(στο επίπεδο xy). (Β) συνεστιακή μικροσκοπία του κυττάρου νησιά είναι το ύψος των νησιών είναι της τάξεως των 30-50 μm. Το κατακόρυφο ύψος του ανιχνευτή βιο-MEMS είναι 5~10 μm. (Γ) Μετά από μια επαφή 2 λεπτά, αισθητήρα δύναμης είναι οριζόντια τράβηξε μακριά σε μια σταθερή ταχύτητα 2,1 ± 0,4 m /s. Ενώ η κυτταρική προσκόλληση μεταξύ της επιφάνειας του ανιχνευτή και των κυττάρων εμποδίζει την απόσυρση του αισθητήρα, οι δοκοί του αισθητήρα παραμορφώνονται από δ, δίνοντας την δύναμη F. Σημειώστε ότι ο ανιχνευτής δεν είναι λειτουργοποιημένη. Η επαφή 2 λεπτά με τα πόδια μεταξύ του αισθητήρα και τα κύτταρα που εμποδίζει την ενεργοποίηση των κυτταρικών ιντεγκρινών και το σχηματισμό του κάθε κυττάρου εστιακής προσκόλλησης, η οποία λαμβάνει & gt?. 30 λεπτά για να σχηματίσουν

Η

Βρήκαμε ότι, κατά τη διάρκεια της ανάσυρσης των ο αισθητήρας βιο-MEMS, E-κύτταρο νησιά τεντώσει τοπικά από 15-20 μm με αποτέλεσμα ένα κωνικό σχήμα (βλέπε τις δύο σχηματικές αναπαραστάσεις στο Σχ. 4γ και αντίθετης φάσης εικόνες στο Σχ. 5). Σημείωση Αυτό το τέντωμα είναι διαφορετική από εκείνη που οφείλεται αποκλειστικά στην μεμβράνη πρόσδεσης, το οποίο αποτελείται από το τέντωμα μόνο του φωσφολιπιδίου διπλοστοιβάδα. Κατά τη διάρκεια της συστολής του καθετήρα, ο κώνος συνεχώς τεντωμένο με την αύξηση της γωνίας επαφής θ, ενώ το κύτταρο επαφή με τον ανιχνευτή σταγόνες με σταδιακό τρόπο (Εικ. 5b-5d). Η αύξηση της δύναμης μεταξύ των κυττάρων και ανιχνευτή αντικατοπτρίζεται στην προοδευτική αύξηση του χάσματος μεταξύ ενός σταθερού αναφοράς και τον ανιχνευτή (από D

0 έως D

1 και D

2). δύναμη των κυττάρων υπολογίζεται από την μεταβολή του διακένου και δύναμης-παραμόρφωσης βαθμονόμηση του ελατηρίου αισθητήρα. Σε μια κρίσιμη τιμή της δύναμης, F

γ, ο κώνος αποκολλάται ξαφνικά από ανιχνευτή (Σχ. 5d-e). Για το E-κύτταρα, F

c είναι η μέγιστη δύναμη στις καμπύλες δύναμης-μετατόπισης. Θεωρούμε F

c ως μέτρο της προσκόλλησης κυττάρου-ανιχνευτή. Μετρήσαμε Fc για 12 τέτοιες ομάδες κυττάρων και έλαβε F

c = 256,3 ± 33,7 nN (n = 12). Παρόμοια πειράματα με R κύτταρα εμφανίζουν αμελητέα προσκόλλησης κυττάρου-ανιχνευτή με F

c = 1,14 ± 0,13 nN (n = 25? Εικ. 6). Ως εκ τούτου, το R κύτταρα έχουν αμελητέα μη ειδική προσκόλληση σε σύγκριση με E κυττάρων και έτσι φαίνεται να είναι σε μια «λιπαίνονται» κατάσταση ίσως θα τους επιτρέπουν να προσαρμοστούν σε διέλευση από αγγειακή τριχοειδών κλινών κατά τη διάρκεια

in vivo

μετάσταση.

(α) ενδοκυτταρικής κολλητική δύναμη απόσπασης ενός κυττάρου νησί στον αισθητήρα MEMS. Η δύναμη αυξάνεται μονοτονικά με τέντωμα μέχρι την απόσπαση. (Β-ε) εικόνες αντίθεσης φάσης ενός τυπικού πειράματος προσκόλλησης. Force υπολογίζεται από την παραμόρφωση της δοκού αισθητήρα

D

και της καμπύλης βαθμονόμησης δύναμης-παραμόρφωσης. Η κρίσιμη αποκόλληση δύναμη, F

c, είναι η μέγιστη δύναμη στις καμπύλες δύναμης-μετατόπισης. Κατά το τέντωμα, η γωνία επαφής θ μεταξύ του ανιχνευτή και των κυτταρικών νησί αυξάνει, αλλά το μέγεθος της ζώνης επαφής μεταξύ του ανιχνευτή και του κυττάρου νησί κρατά μείωση. Κλίμακα bar = 40 um.

Η

(α) Κόλλα δύναμη της R κυττάρων σε MEMS καθετήρα, όπως ο καθετήρας κινείται μακριά από τα κύτταρα μετά από 2 λεπτά επαφής (n = 25). (είναι). εικόνες αντίθεσης φάσης του R κυττάρων και MEMS ιχνηλάτη όταν η μη ειδική προσκόλληση μεταξύ τους μετριέται. Η μέγιστη δύναμη αποκόλλησης μετράται είναι & lt? 2.5 nN, ενώ το κύτταρο παραμόρφωση είναι εμφανής. μπαρ κλίμακα:. 40 μm

Η

Συζήτηση

Για τις γνώσεις μας, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη για να περιγράψει και να αξιολογήσει τη μεταβολή της mechanosensitivity σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου κατά τη διάρκεια μιας μετάστασης που μοιάζει με μετάβασης που παράγεται από αποκλειστικά και μόνο με την αλλαγή της μηχανικής μικροπεριβάλλον κατά τη διάρκεια

in vitro

πολιτισμό. Σε μια προηγούμενη εργασία αυτή αναφέρεται HCT-8 κύτταρα εκτελέσει μια μετάβαση E-to-R για 21~40 υποστρώματα kPa δυσκαμψία [1]. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποιεί αποτελεσματικά μια συνδυαστική προσέγγιση του συστήματος προσδιορισμού χρησιμοποιώντας υποστρώματα ακαμψίας κλίση, δοκιμασία μετρητή Coulter, ατομικής δύναμης μικροσκοπία (AFM) και αισθητήρες δύναμης Bio-MEMS να εξερευνήσετε την ποσοτική αλλαγή mechanosensitivity του ανθρώπινου καρκινώματος παχέος εντέρου HCT-8 επιθηλιακά E κύτταρα που διέλευση προς τα κύτταρα Ε στρογγυλεμένο σχήμα. Βρήκαμε, που προκλήθηκε από τις κατάλληλες νύξεις ακαμψία του υποστρώματος, ώστε τα κύτταρα HCT-8 R χάνουν την ευαισθησία τους τόσο στο μικροπεριβάλλον του υποστρώματος, καθώς και η αλληλεπίδρασή τους με τα γειτονικά κύτταρα Ε και Ε. Ως αποτέλεσμα, HCT-8 R κύτταρα αποκτούν αυτονομία για επιβίωση αγκύρωση-ανεξάρτητος, κινητά κύτταρα, τα οποία είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό των πρώιμων γεγονότων της καρκινικών κυττάρων της μετάστασης [3], [4], [5], [6], [16], [20], [30], [34], [35].

Οι φυσικές ιδιότητες των υποστρωμάτων καλλιέργειας βρέθηκε να επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την φαινότυποι και έκφραση γονιδίων ενός αριθμού φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων [1], [17], [18], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55]. Για να ανταποκριθεί στο υπόστρωμα ερεθίσματα, τα κύτταρα να τηρούν και να εξαπλωθεί στο υπόστρωμα που ακολουθείται από την ανίχνευση και την επεξεργασία τόσο μηχανικά και χημικά σήματα [26], [37], [44], [46], [49], [53], [55 ], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Όπως δείξαμε προηγουμένως [1], μετά από 7 ημερών καλλιέργεια σε μαλακό υποστρώματα, HCT-8 κύτταρα υποβάλλονται σε Ε να R μετάβαση που χαρακτηρίζεται από το R κύτταρα σε διάσταση από την κυτταρική στιβάδα μητρική επιθηλιακών ή κύτταρο νησιά. Αυτά τα διαχωρισμένα κύτταρα Ε δείχνουν αξιοσημείωτα μειωμένη πρόσφυση (τόσο ειδική και μη ειδική [1], [24], [29]) σε σύγκριση με τους ομολόγους τους των κυττάρων του Ε. Σε αντίθεση με E κύτταρα, τα σε διάσταση HCT-8 κύτταρα Ε δείχνουν ανεξάρτητος αλληλεπιδράσεις κυττάρου-υποστρώματος υπόστρωμα-ακαμψία. πολλαπλασιασμό τους δεν θίγεται από την αδυναμία πρόσδεσης με το υπόστρωμα καλλιέργειας ή σε άλλα κύτταρα (Εικ. 1). Anchorage ανεξαρτησία είναι ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό γνώρισμα των μεταστατικών κυττάρων [7], [21], [36]. Πράγματι, μας πρόσφατη

in vitro

προσδιορισμούς κυτταρικής μεμβράνης εισβολή δείχνουν ότι HCT-8 R κύτταρα είναι σημαντικά πιο επεμβατική από Ε κυττάρων [24].

Η ανακάλυψή μας μιας E-to-R μετάβαση σε HCT-8 κύτταρα adenocarcimona παχέος εντέρου δείχνουν ότι κατάλληλο υπόστρωμα μηχανικά απαλότητα μπορεί να προωθήσει ή να βοηθήσει στην έναρξη των πρώιμων εκδηλώσεων σε καρκινικές κυτταρικές μετάσταση, και ειρωνική απώλεια mechanosensitivity, η οποία θα μπορούσε να βοηθήσει στην αγγειακή εξάπλωση σε άπω θέσεις στόχους ιστού. Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει ότι τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μπορεί να επιτύχει αυτό το γνώρισμα αποκλειστικά και μόνο από τον πολιτισμό στον κατάλληλα μαλακό υπόστρωμα. Είμαστε σήμερα αξιολογεί κατά πόσον R κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη μεταστατική συμπεριφορά σε μελέτες σε ζώα σε σύγκριση με τα Ε κύτταρα. Εάν το Ε να R μετάβαση συσχετίζεται με την απόκτηση της ενισχυμένης μεταστατική δραστηριότητα, χειρισμός του μηχανικού μικροπεριβάλλον μπορεί να χρησιμεύσει ως μια ελκυστική

in vitro

μοντέλο για τη διερεύνηση των πρώιμων γεγονότων της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων, καθώς και για τη διαλογή πιθανών αντι- μεταστατικό θεραπευτικούς παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Κυτταρική καλλιέργεια, απεικόνιση μικροσκοπία και ΡΑ παρασκευάσματα πήγματα

αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου κόλον HCT-8 κύτταρα (ATCC Νο .: CCL-244) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco Νο .: 23400-062) συμπληρωμένο με 2 γραμμάρια διττανθρακικό νάτριο ανά λίτρο, δίνοντας τελικές συγκεντρώσεις 10% ορό αλόγου (Gibco Νο .: 26050-088), 1 × αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό (Gibco Νο .: 15240-062) και 1 mM πυροσταφυλικού νατρίου (Gibco Νο .: 11360) [1]. κύτταρα ΜΑ104 (εμβρυϊκά αφρικανικού πράσινου πιθήκου νεφρό) ελήφθησαν από την ΜΑ Bioproducts και καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ (Gibco Νο .: 41500-018) συμπληρωμένο με 2 γραμμάρια ανά λίτρο HEPES, 2,2 γραμμάρια όξινου ανθρακικού νατρίου ανά λίτρο, 1 × αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό ως παραπάνω, και 5% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco Νο .: 16140). Το νεφρό πιθήκου ινοβλαστών (MKF) κυτταρική γραμμή (CV-1, ATCC, Manassas, VA) καλλιεργήθηκε σε ένα μέσο με 90% ϋΜΕΜ (ATCC, Manassas, VA), 10% FBS (ATCC, Manassas, VA) και 1 × αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό (Gibco Αρ .: 15240-062). Η πυκνότητα των κυττάρων πριν επιμετάλλωσης μετρήθηκε με το πρότυπο αιμοκυτταρόμετρο. Τυπική επωαστήρας καλλιέργειας κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να παρέχει την κατάσταση καλλιέργειας με επαρκή υγρασία, 37 ° C θερμοκρασία, και 5% CO

2. (1).