Αφηρημένο

Η ηπατική μετάσταση είναι μια σημαντική αιτία θνησιμότητας από καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν τη διαδικασία αυτή είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Η οστεοποντίνη (ΟΡΝ) είναι μία εκκρινόμενη γλυκοπρωτεΐνη φωσφορυλιωμένο που εμπλέκεται στη μετανάστευση των όγκων και τη μετάσταση. Ο ρόλος των ΟΡΝ στον καρκίνο είναι προς το παρόν ασαφές. Σε αυτή τη μελέτη, OPN mRNA εξετάστηκε σε ιστούς από CRC, παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο, και το ήπαρ μεταστατικών βλαβών χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Η έκφραση της πρωτεΐνης του OPN και των υποδοχέων της (ιντεγρίνης αν και CD44 v6) ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός ανοσοϊστοχημική (

IHC

) μέθοδο. Ο ρόλος των ΟΡΝ σε μετάσταση στο ήπαρ μελετήθηκε σε καθιερωμένες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές SW-480 επιμολυσμένα με sense- ή αντιπληροφοριακό-OPN πλασμίδια ευκαρυωτική έκφραση με κυτταρομετρία ροής και δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου Colo-205 και. Σβέσεως ανακατανομή μετά φωτολεύκανση (FRAP) χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη χάσμα λειτουργική ενδοκυτταρική επικοινωνία (GJIC) στους OPN-επιμολυσμένα κύτταρα. Διαπιστώθηκε ότι OPN ήταν εντόνως εκφρασμένο σε μεταστατικές ηπατικές αλλοιώσεις από CRC έναντι πρωτογενούς ιστού CRC και παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. Η έκφραση του OPN mRNA σε ιστούς όγκων ήταν σημαντικά σχετίζονται με τα στάδια CRC. έκφραση OPN ανιχνεύθηκε επίσης σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα γύρω CRC μεταστατικές αλλοιώσεις. Δύο γνωστοί υποδοχείς της OPN, ιντεγρίνης αν και πρωτεΐνες CD44v6, έντονα εκφράζεται σε ηπατοκύτταρα από το φυσιολογικό ήπαρ. κύτταρα CRC με εξαναγκασμένη έκφραση OPN παρουσίασαν αυξημένη heterotypic πρόσφυση με τα ενδοθηλιακά κύτταρα και να αποδυναμωθεί μεσοκυττάρια επικοινωνία. OPN διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην CRC μετάσταση στο ήπαρ μέσω της αλληλεπίδρασης με τους υποδοχείς της στα ηπατοκύτταρα, μειώθηκε ομοτυπική προσκόλληση, και την ενίσχυση της heterotypic πρόσφυση

Παράθεση:. Huang J, Παν C, Χου Η, Zheng S, Ding L ( 2012) οστεοποντίνη-αυξημένη ηπατική μετάσταση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (10): e47901. doi: 10.1371 /journal.pone.0047901

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 11, 2012? Αποδεκτές: 18η Σεπτεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 24 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81102012? https://www.nsfc.gov.cn/), Zhejiang έργο ταλέντα Qianjiang (2011R10029? https://kjt.zj.gov.cn/), και Zhejiang της ιατρικής έργα επιστημονικής έρευνας ταμείο (2010ZB073? https://www.zjtcm.gov.cn/) να LD. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) εξακολουθεί να είναι η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Περίπου το 50% των ασθενών έχουν μεταστάσεις CRC στο ήπαρ, αλλά μόνο το 10% -20% αυτών των ασθενών μπορούν να υποβληθούν σε χειρουργική εκτομή. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μετά από χειρουργική εκτομή του μεταστατικού όγκου είναι μόνο το 30% -40% [2], [3] .Οι μοριακών μηχανισμών που διέπουν CRC μετάσταση δεν είναι πλήρως κατανοητοί, αλλά οι πρόσφατες ενδείξεις δείχνουν ότι οστεοποντίνης (OPN) παίζει ρόλο στην ρύθμιση μετάστασης του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρου [4].

ΟΡΝ είναι ένα φωσφογλυκοπρωτεΐνης οποίο αρχικά απομονώθηκε από ανοργανοποιημένου οστική μήτρα [5], επίσης συχνά εκκρίνεται από διάφορα είδη καρκινικών κυττάρων, που είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του μαστού [ ,,,0],6], του προστάτη [7], [8], η ηπατική [9], το μελάνωμα [10], και άλλων όγκων [11]. OPN σήματα μέσω μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, όπως ιντεγκρίνες και CD44 [12], [13]. μελέτες γονίδιο-προφίλ έχουν εντοπίσει μια συσχέτιση μεταξύ προηγμένων και μεταστατικού καρκίνου του παχέος όγκους και υψηλή έκφραση του OPN [14]. Μια σημαντική επιρροή της OPN για μεταστατικό δυναμικό είναι μέσω κυτταρικής προσκόλλησης και της μετανάστευσης σε όλη την εξωκυττάρια μήτρα proteins22. Ωστόσο, οι λειτουργικές τους ρόλους και τους υποκείμενους μηχανισμούς των OPN στην παχέος μετάσταση δεν έχει τεκμηριωθεί.

Εδώ, μελετήσαμε το ρόλο της OPN στη μετάσταση του παχέος εντέρου στο συκώτι και τους μηχανισμούς με τους οποίους OPN προάγει τον καρκίνο του παχέος εντέρου μεταστατικό δραστηριότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

δείγματα όγκων από 44 περιπτώσεις CRC και 20 ασθενείς με ηπατική μετάσταση στο δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Zhejiang ελήφθησαν φρέσκα από χειρουργικές εκτομές με προηγούμενη συγκατάθεση. Η διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν 57 ετών κατά τη λειτουργία, που κυμαίνονται από 25 έως 84. παθολογικά χαρακτηριστικά συμπεριλαμβανομένης της θέσης του όγκου, το στάδιο και τη διαφοροποίηση καταγράφηκε. Η μελέτη αυτή έχει λάβει την έγκριση της ανθρώπινης δεοντολογίας στην έρευνα από την επιτροπή δεοντολογίας του Δευτέρου Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang.

Cell Culture

Δύο ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές Colo-205 και τα κύτταρα SW480 ελήφθησαν από το Cancer Institute του Πανεπιστημίου Zhejiang και διατηρήθηκαν σε RMPI-1640 με 10% ορό μοσχαριού στους 37 ° C με 5% CO

2.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

δείγματα ιστού καταψύχθηκαν ακαριαία αμέσως μετά τη χειρουργική εκτομή. Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ακεραιότητα RNA εξετάστηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος με πήκτωμα 1% φορμαλδεΰδης. 2.0 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με κιτ Super Script II RTPCR (Invitrogen). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 50 μΐ που περιείχε 1 μΙ RT μεταγραφής, 5 μΜ από κάθε εκκινητή, 0.5 μονάδα AmpliTaq DNA πολυμεράσης (Invitrogen). Ως εσωτερικός θετικός έλεγχος, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR διεξήχθη επί του γονιδίου GAPDH παράλληλα. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: OPN προωθητικός εκκινητής 5′-CAA ATACCCAGATGCTGTGGC-3 ‘? OPN αντίστροφο εκκινητή 5’-TCCTGGCTGTCCACATGGTC-3 ‘? GAPDH προς τα εμπρός αρχικό τεμάχιο 5’-CTTAGCACCCCTCCCCAAG-3 ‘? GAPDH αντίστροφο εκκινητή 5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3 ‘. OPN ανιχνευτή TaqMan 5’-TGACCCTACTCAGAAGCAGAATCTCCTAGCC-3 ‘? GAPDH TaqMan ανιχνευτής 5’-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 ‘. ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν σε μορφή πλάκας αντίδρασης 96 φρεατίων και τα σήματα φθορισμού ανιχνεύονται με ένα ΡΕ Applied Biosystems 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer). Τα σήματα φθορισμού μεταφράστηκαν σε C

τιμές Τ (όριο κύκλου? Που αντιστοιχεί στον αριθμό του κύκλου κατά την οποία ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά μια σημαντική αύξηση στο σήμα φθορισμού). Το επίπεδο της έκφρασης του mRNA του OPN = ΟΡΝ C

τιμή Τ /GAPDH C

T αξία.

PCR προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν επί πηκτών αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκαν. Τα προϊόντα PCR του αναμενόμενου μεγέθους κλωνοποιήθηκαν σε ρΟΕΜ-Τ-Easy (Promega) και οι αλληλουχίες των προκυπτόντων πλασμιδίων επιβεβαιώθηκαν.

Antisense- και Sense-OPN ευκαρυωτικοί Πλασμιδίων Έκφρασης

Για obtainan πλασμίδιο έκφρασης OPN αντι-νοήματος, δημιουργήσαμε ένα θραύσμα cDNA 201 bp (από 210 να 368) με τη χρήση PCR με εκκινητές OPN όπως αναφέρθηκε παραπάνω. cDNA θραύσμα στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός του

EcoR Ι θέση

του pcDNA 3.1 (+). Η αντίστροφη κατεύθυνση του κλωνοποιημένου cDNA επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA (Ο φορέας χαρακτηρίζεται OPN-αντινόημα).

Το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του OPN ελήφθη με RT-PCR. OPN αστάρι F: 5′-CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT – 3 ‘, R: 5′-CTC CTT ΤΤΑ ΑΤΤ GAC CTC AG – 3’. Τα 974 bp PCR προϊόντα κλωνοποιήθηκαν σε ένα ρΟΕΜ-Τ-Easy φορέα και αλληλουχήθηκαν επί αμφοτέρων των κλώνων με τη χρήση του ΑΒΙ PRISM ™ 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer). Το ORF του OPN στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα ευκαρυωτικής έκφρασης pcDNA 3.1 (+) για να δημιουργήσει pcDNA 3.1-OPN (ORF). (Ο φορέας ορίζεται OPN-νόημα).

Σταθερή έκφρασης κυττάρων Γραμμές

Τα πλασμίδια της OPN-αντίθετης φοράς, OPN-λογική και pcDNA3.1 (+) έχουν linearlized με

Βα ;

πέψη για 4 ώρες. διαμόλυνση DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Superfect Transfection (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με G418 για 3 ημέρες. Επιλεγμένοι κλώνοι συνενώθηκαν και να επεκταθούν. Οι καθιερωμένες κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και ανάλυση Western μπουλόνι.

In Situ

mRNA υβριδισμός (

ISH

)

Ειδικοί ανιχνευτές συμπληρωματικό το mRNA OPN σχεδιάστηκαν με βάση την GenBank J04765 (mRNA Human οστεοποντίνη, πλήρης cds). Αυτές οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίου έχουν 100% ομολογία με το γονίδιο ΟΡΝ και ελάχιστη ομολογία με άλλες αλληλουχίες γονιδίων θηλαστικών όπως αναζήτηση σε GenBank με φύσημα. DIG Kit Label RNA (SP6 /Τ7) (Roche) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί τόσο με νόημα και αντινόημα. Ιστούς παραφίνης κόπηκαν σε 4 μ μ. Οι πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,2% Μ HCl για 20 λεπτά. Μετά από πέψη με πρωτεϊνάση Κ, τα πλακίδια επωάστηκαν με διάλυμα προ-υβριδισμού (που περιέχει 500 μg /ml πολυ (Α)) στους 42 ° C για 30 λεπτά σε ένα θάλαμο υγρασίας. Το διάλυμα αντικαταστάθηκε με διάλυμα υβριδισμού (που περιέχει 0,3 μg /ml με νόημα ή αντι-νόημα RNA ανιχνευτή μόνο σκέλος αντίστοιχα, 50% φορμαμίδιο, 10% θειική δεξτράνη, και 2 χ SSC), και υβριδοποιήθηκε στους 42 ° C όλη τη νύκτα. Μετά πλύση με 2 χ SSC και 1 χ SSC για 15 λεπτά διαδοχή, τα πλακίδια αποκλείσθηκαν με PBS που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού για 10 λεπτά, επωάστηκαν με επισημασμένο με βιοτίνη ποντικού-αντίσωμα αντι-διγοξίνης για 30 λεπτά και στη συνέχεια με αλκαλική φωσφοεστεράσης -affinitin για 30 λεπτά. ΝΒΤ-ΒΟΙΡ χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση διαφανειών σε ρΗ 10 ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος. Μετά την αφυδάτωση, τα πλακίδια τοποθετημένα με υδατικά μέσα στερέωσης (Sigma).

Ανοσοϊστοχημεία Ανάλυση

αρουραίου αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα οστεοποντίνη (Chemicon, Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για

IHC

. Όλα τα τμήματα (5 μm πάχους) από τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες επικαλυμμένες με ζελατίνη. Για την ενίσχυση της έκθεσης στο αντιγόνο, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 χ EDTA στους 98 ° C για 10 λεπτά για το αντιγόνο ανακτήσει. Οι πλάκες επωάστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού ενδογενούς υπεροξειδάσης για την αναστολή της ενδογενούς υπεροξειδάσης, κατόπιν επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα (είτε αντι-OPN μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Akm2A1? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε αραίωση 1:200, ή μονοκλωνικό αντίσωμα ιντεγρίνης αν (P2W7? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) σε αραίωση 1:200, ή CD44v6 μονοκλωνικό αντίσωμα (ΜΑΒ-0038? Maixin, Fujian, Κίνα) σε αραίωση 1:100) σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά. Μετά ξεπλένεται με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, τα πλακίδια επωάστηκαν για 15 λεπτά με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη, πλύθηκαν και κατόπιν επωάστηκαν με το ένζυμο HRP συζυγούς (υπεροξειδάσης κοχλιαρίας) -στρεπταβιδίνη. Πρόσφατα παρασκευασμένη DAB (Zymed, South San Francisco, CA) χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για την ανίχνευση HRP. Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη και συναρμολογείται με υδατικά μέσα στερέωσης.

Πρόσφυση Κυττάρων Δοκιμασία

μονόφυλλο Colo-205 κύτταρα και SW-480 κύτταρα διατηρήθηκαν σε Ø 35 πιάτα mm και κανονικό μέσο μέχρι 70% -80% συρροή. Επισυνάπτεται κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν επί των κυττάρων μονοστιβάδος, αναμίχθηκαν καλά και επωάστηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους.

επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επώαση για 10 λεπτά, 20 λεπτά, 30 λεπτά και 40 λεπτά, και ο αριθμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. αναλογία προσκόλληση κυττάρου στη συνέχεια υπολογίστηκε: αναλογία προσκόλληση = (άθροισμα των κυττάρων προστιθέμενης αιωρούμενα κύτταρα) /άθροισμα των κυττάρων του δείγματος. δοκιμασία Ομότυπη προσκόλλησης πραγματοποιήθηκε με ίδιες κυτταρικές σειρές, το καθένα από αυτά μεταξύ των κυττάρων του ενδοθηλίου σκάφος ομφαλός κύτταρα ECV 304 χρησιμοποιήθηκε αντίστοιχα σε δοκιμασία ετερότυπη προσκόλληση.

Flow Cytometry Ανάλυση

1 × 10

δείγματα 6 /ml κυττάρων αιωρήθηκαν πολύ καλά σε PBS, αναμίχθηκαν με 20 μΙ CD44-FITC αντίσωμα, ελεγχόμενη με 20 μΙ IgG1 /αντισώματος 2α, κύτταρο επωάζεται με Ab σε ΘΔ για 20 λεπτά. Ξεπλένεται με PBS, αναμιγνύεται με 1% paraformal-καρβαλδευδη, στη συνέχεια ανιχνεύονται με FAC σάρωσης (BD εταιρείας, Cell Quest TM έκδοση 3.3 του λογισμικού).

Η αναδιανομή Gap-φθορισμού Μετά φωτολεύκανσις (Gap-FRAP) Μέθοδος

Cells 80% συρροή εξετάστηκαν για την αναδιανομή φθορισμού μετά φωτολεύκανση. Τα κύτταρα ξεπλένονται με Hanks (Ca

2+, Mg

2+), επωάστηκαν 15 λεπτά με 10 μg /ml 5 (6) -καρβοξυφλουορεσκεϊνη διοξεικό (CFDA) σε 37 ° C, 5% CO

2 . Μετά ξεπλένεται με PBS, επιλέχθηκε ένα κελί δίπλα σε άλλα κύτταρα και ο φθορισμός της ήταν Φωτολεύκανση κάτω LEICA TCS-SP μικροσκόπιο λέιζερ συν-εστίασης (Argon ακτίνα λέιζερ ιόντων, 518 nM, πρόγραμμα /lampse Ώρα για φωτολεύκανση και σάρωση, το λογισμικό Φυσιολογίας για την εικόνα και δεδομένα). Ψηφιακές εικόνες της φθορίζουσας εκπομπής διεγείρεται από ασθενείς παλμούς λέιζερ καταγράφηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα για 12 λεπτά (περίοδος σαρώσεως 1 λεπτό πριν και μετά φωτολεύκανση) και αποθηκεύονται για μετέπειτα ανάλυση. Σε κάθε πείραμα, ένας επισημασμένος, απομονωμένο κύτταρο αφέθηκε αλεύκαστα ως αναφορά για την απώλεια του φθορισμού λόγω της επαναλαμβανόμενης σάρωσης και διαρροή χρωστικής, και ένα απομονωμένο, λευκασμένο κύτταρο χρησίμευσε ως μάρτυρας.

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Αξιόπιστες-δείγματα

t

τεστ, ανεξάρτητα δείγματα

t

test και μονόδρομη χρησιμοποιήθηκαν ANOVA. Υπολογισμοί διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 λογισμικού.

P

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

OPN Έκφραση στην Πρωτοβάθμια CRC, CRC μεταστατικές βλάβες στο συκώτι, και των φυσιολογικών ιστών

Με βάση για ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αξίες, C

T είναι αντιστρόφως ανάλογη με την αξία ημερολόγιο του αρχικού αριθμού αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου. Βρήκαμε ότι OPN mRNA εκφράστηκε σε 44 περιπτώσεις των ιστών CRC αλλά σε διαφορετικά επίπεδα? η μέγιστη C

Τ τιμή ήταν 1,47 και η ελάχιστη τιμή ήταν 0,85, ±

s

= 1.15 ± 0.14. Όταν συνδυάζεται με τα παρακείμενα φυσιολογικά δείγματα, η μέγιστη C

Τ τιμή ήταν 1,75 και η ελάχιστη τιμή ήταν 0,94, ±

s

= 1.32 ± 0.18. (Ζεύγη δείγματα

t

δοκιμής,

t

= 5.81,

P

= 0.000). Η έκφραση OPN mRNA ήταν σημαντικά αυξημένη σε πρωτογενή ιστό CRC σε σύγκριση με τις γειτονικές φυσιολογικούς ιστούς.

ISH

, η θετική χρώση παρουσιάζει μπλε-μωβ κάτω από το μικροσκόπιο. Το mRNA OPN, το οποίο δείχνει ένα θετικό σήμα, βρέθηκε σε κυτταρόπλασμα των κυττάρων CRC στην πρωτοβάθμια βλάβες (× 400). β, Ο λεκές στο γειτονικό φυσιολογικό παχέος ιστούς ήταν αρνητική (× 400). c, OPN mRNA βρέθηκε σε κυτταρόπλασμα των ηπατικών κυττάρων CRC μεταστατικό ιστό. Παρακείμενο φυσιολογικό ήπαρ ιστούς λεκέδες αρνητικό (× 100).

Η

Στο 20 εξέτασε ιστούς του ήπατος μεταστατικού από CRC, η μέγιστη C

Τ τιμή ήταν 1,30 και η ελάχιστη τιμή ήταν 0,92, ±

s

= 1.07 ± 0.10. Σε σύγκριση με τον πρωτοπαθή καρκίνο, η έκφραση OPN mRNA σε ιστούς του ήπατος μεταστατικού ήταν υψηλότερη (ανεξάρτητο-δείγματα

t

δοκιμής,

t

= 2.12,

P

= 0,038).

με βάση το στάδιο Dukes, επτά επί συνόλου 44 ασθενών CRC ήταν στο στάδιο Α και το mRNA OPN σημαίνει C

αξία T ήταν 1,49 ± 0,38, 1,21 ± 0,28 για το στάδιο Β (17 ασθενείς), 1.11 ± 0,29 για το στάδιο Γ (18 ασθενείς), και 0,92 ± 0,32 για το στάδιο Δ (2 ασθενείς). Το επίπεδο έκφρασης των OPN mRNA σε ιστούς CRC σε πρώιμο στάδιο ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι τα οποία σε προχωρημένο στάδιο (one-way ANOVA,

P

= 0,031).

Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε

ISH

ανάλυση για να εκτιμηθεί περαιτέρω η έκφραση OPN mRNA και εντοπισμού. Στην ανάλυση αυτή, η θετική φαίνεται μπλε-μωβ κάτω από το μικροσκόπιο. OPN mRNA, το οποίο εμφανίζεται χρωματισμός του σήματος, βρέθηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων CRC τόσο στις πρωτογενείς βλάβες και ήπατος μεταστατικού ιστού. Το σήμα χρώση δεν ανιχνεύθηκε σε γειτονικό φυσιολογικό ορθοκολικό και φυσιολογικούς ιστούς ήπατος (

Σχ. 1

).

Χρησιμοποιώντας μία ανοσοϊστοχημική μέθοδο, μπορούμε επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι OPN πρωτεΐνη εκφράστηκε στο κυτταρόπλασμα του CRC κύτταρα τόσο στην πρωτογενή βλάβη και μεταστατικούς ιστούς. Οι καφέ κηλίδες θετικοί βρέθηκαν επίσης σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα γύρω από τον μεταστατικό ιστό. Παρακείμενο φυσιολογικό παχέος ιστούς παρουσίασαν κανένα σήμα. Ως έλεγχος, OPN πρωτεΐνες λεκέ στο φυσιολογικό ήπαρ ιστούς χωρίς CRC μετάσταση

(

Εικ. 2

)

.

IHC

, OPN πρωτεΐνες (καφέ θετική χρώση) εντοπίστηκαν στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων CRC στην πρωτοβάθμια βλάβες (x200). β Δίπλα κανονική του παχέος ιστούς ήταν αρνητικά (χ200). γ Θετική χρώση βρέθηκε τόσο στα κύτταρα CRC και τα γειτονικά φυσιολογικά ηπατοκύτταρα στους ιστούς του ήπατος μεταστατικού (x100). δ Ως μάρτυρες, OPN πρωτεΐνες λεκέ στο φυσιολογικό ήπαρ ιστούς χωρίς CRC μετάσταση ήταν αρνητική (x100).

Η

Η έκφραση της OPN υποδοχείς-ιντεγρίνης αν και CD44v6 χρώση σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα

OPN έχει δειχθεί αλληλεπιδρά με έναν αριθμό διαφορετικών ιντεγκρίνες μέσω του RGD αλληλουχία, συμπεριλαμβανομένων ανβ3, ανβ1 και ανβ5. CD44v6 είναι μια παραλλαγή ματίσματος του CD44 (CD44v) θα μπορούσε επίσης να συνδεθεί με ΟΡΝ και πιθανόν προάγει καρκινικών κυττάρων προσκόλληση στο αγγειακό ενδοθήλιο και τις μεμβράνες βάσεως, τότε ενισχύει την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινωμάτων του κόλου. Για την επαλήθευση αυτών των υποδοχέων στο φυσιολογικό ήπαρ, προσδιορίσαμε για ιντεγκρίνης ανβ1 και CD44v6 από την IHC. Βρήκαμε ότι τόσο ιντεγκρίνη ανβ1 και CD44v6 βάφτηκαν θετικά στα ηπατοκύτταρα σε φυσιολογικό ήπαρ ιστούς

(

Εικ. 3

).

Η

IHC

, πρωτεϊνών ιντεγρίνης αν (καφέ θετική χρώση) εντοπίστηκαν στο κυτταρόπλασμα των ηπατοκυττάρων (× 400). β, CD44v6 πρωτεΐνες (καφέ θετική χρώση) εντοπίστηκαν στο κυτταρόπλασμα των ηπατοκυττάρων (× 400).

Η

Η έκφραση του CD44 στην κυτταρική μεμβράνη με κυτταρομετρία ροής

CD44 παίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, αλληλεπίδραση κυττάρου-υποστρώματος, λεμφοκυττάρων, και μετάσταση όγκου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η υψηλή έκφραση του CD44 σε ορισμένους τύπους όγκων συνδέεται με την αιματογενή εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων.

Διαπιστώσαμε έκφραση CD44 σε κυτταρικές σειρές μεταφέρθηκαν μέσω κυτταρομετρίας ροής. Βρήκαμε ότι μετά από τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΟΡΝ, η έκφραση CD44 επί Colo-205-OPN-αντινόημα κυτταρικές μεμβράνες μειώθηκε από 54,28 ± 0,11 ± 35,35 να 0,24 σε Colo-205,

P

& lt? 0,01. Αντίθετα, η τιμή αυξήθηκε σε ΝΔ 480–κύτταρα OPN-έννοια με την οποία η έκφραση OPN ήταν επάνω-ρυθμίζονται από 2,65 ± 0,21 με 33,12 ± 0,15,

P

& lt?. 0.01

ομοτυπική και Ετερότυπη κυτταρικής προσκόλλησης

πρόσφυση των κυττάρων είναι ένας σημαντικός παράγοντας κατά τη διάρκεια της μετάστασης του καρκίνου. Η αποκόλληση των καρκινικών κυττάρων από την μητρική τους όγκους είναι μια αρχική εκδήλωση στην μετάσταση και σχετίζεται με την μείωση ομοτυπική προσκόλληση. Μόλις τα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από τον πρωτογενή όγκο, αυτοί αλληλεπιδρά με τα προϋπάρχοντα μεμβράνες ξενιστή σε ποικίλα στάδια της μεταστατικής καταρράκτη. Heterotypic πρόσφυση βοηθά τα καρκινικά κύτταρα ολοκληρωθεί όλη αυτή τη διαδικασία.

Διαπιστώσαμε την ομοτυπική και heterotypic ικανότητα προσκόλλησης σε Colo-205-OPN-αντίθετης φοράς και SW-480-OPN-αίσθηση ξεχωριστά. Ομφαλός κύτταρα ενδοθηλίου αγγείου ECV 304 χρησιμοποιήθηκε ως κύτταρα στόχοι σε ετερότυπη προσκόλληση. Ομοτυπική ικανότητα προσκόλλησης ενισχύθηκε μετά OPN-αντίθετης φοράς επιμόλυνση σε Colo-205, αλλά αποδυναμώθηκε σε SW-480-OPN-αίσθηση. Σε αντίθεση, heterotypic ικανότητα προσκόλλησης αποδυναμώθηκε σε Colo-205-OPN-αντίθετης φοράς, αλλά ενισχύθηκε σε SW-480-OPN-αίσθηση.

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

.

μεσοκυττάριου ενδοκυτταρική επικοινωνία (GJIC) με Gap-FRAP

GJIC αποτελείται από μεσοκυττάρια ανταλλαγή μορίων χαμηλού μοριακού βάρους, και είναι η μόνη μέσα για την άμεση επαφή μεταξύ κυτταροπλάσματα παρακείμενων ζωικών κυττάρων. Οι διαταραχές της GJIC έχουν συσχετισθεί με πολλές παθολογικές καταστάσεις, όπως η καρκινογένεση ή κληρονομική ασθένεια [15], επίσης μπορεί να διευκολύνει την απελευθέρωση ενός δυνητικά νεοπλασματικών κυττάρων από την ελέγχουσα του περιβάλλοντος ιστού, που οδηγεί σε προαγωγή όγκου [16].

Θα χρησιμοποιηθούν χάσμα-FRAP για τη μέτρηση της GJIC στο OPN επιμολυσμένα κύτταρα (SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN), ενώ Colo-205 ήταν κύτταρα ημι-ανάρτηση που δεν είχαν διατεθεί για τη μέθοδο αυτή. ανταλλαγή σημάτων κυττάρων ήταν μειωμένη και GJIC λειτουργία ανεστάλη. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (φορέας επιμολυσμένα κύτταρα SW-480-OPN, SW-480-pcDNA3.1 (+)), φθορισμός δεν ανακατανέμονται καλά σε κύτταρα SW-480-OPN-νόημα μετά από δύο 5 λεπτά και 10 λεπτά φωτολεύκανση. Μετά από 5 λεπτά φωτολεύκανση, το ποσοστό της ανακατανομής φθορισμού μετά φωτολεύκανση (FRAP%) ήταν 24,65 ± 4,08% στη ΝΔ-480-pcDNA3.1 (+) – OPN σύγκριση 44.74 ± 6.23% στη ΝΔ-480-pcDNA3.1 (+ ) (

t

= 17.07,

P

& lt? 0.001), και μετά από 10 λεπτά, το FRAP%, ακόμα και να ανασταλεί σε 25,98 ± 4,48% στη ΝΔ-480-pcDNA3.1 ( +) – OPN ενώ ήταν αναδιανέμονται σε 64,92% ± 5,39% στα κύτταρα SW-480-pcDNA3.1 (+) (

t

= 35.16,

P

& lt? 0.001) (

Εικ. 4

). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι OPN μπορεί να αναστείλει την λειτουργία GJIC και μειωμένη ανταλλαγή σημάτων μεταξύ αυτών των επιμολυσμένων κυττάρων SW-480.

ομοιόμορφη ένταση φθορισμού πριν φωτολεύκανση στο SW-480-pcDNA3.1 (+). α2, αποδυναμώνεται η ένταση φθορισμού μετά φωτολεύκανση στο SW-480-pcDNA3.1 (+). α3, αναδιανομή φθορισμού μετά από 10 λεπτά στο SW-480-pcDNA3.1 (+). β1, ομοιόμορφη ένταση φθορισμού πριν από φωτολεύκανση SW-480-pcDNA3.1 (+) κύτταρα OPN. β2, αποδυναμώνεται η ένταση φθορισμού μετά φωτολεύκανση SW-480-pcDNA3.1 (+) κύτταρα OPN. β3, αμυδρή αναδιανομή φθορισμού μετά από 10 λεπτά SW-480-pcDNA3.1 (+) κύτταρα OPN. c, το ποσοστό της ανακατανομής φθορισμού μετά φωτολεύκανση (FRAP%) σε SW-480-pcDNA3.1 (+) και SW-480-pcDNA3.1 (+) κύτταρα OPN. Μετά από 5 λεπτά φωτολεύκανση, το ποσοστό της ανακατανομής φθορισμού μετά φωτολεύκανση (FRAP%) 24,65 ± 4,08% στη ΝΔ-480-pcDNA3.1 (+) -OPN σύγκριση 44.74 ± 6.23% στη ΝΔ-480-pcDNA3.1 (+) (

t

= 17.07,

P

& lt? 0.001), και μετά από 10 λεπτά, το FRAP%, ακόμα και να ανασταλεί σε 25,98 ± 4,48% στη ΝΔ-480-pcDNA3.1 (+ ) -OPN ενώ ήταν αναδιανέμονται σε 64,92% ± 5,39% στα κύτταρα SW-480-pcDNA3.1 (+) (

t

= 35.16,

P

& lt?. 0.001)

Συζήτηση

Ανθρώπινο καρκίνου του παχέος εντέρου επηρεάζει σχεδόν 150.000 ασθενείς και 60.000 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες κάθε χρόνο. Το ήπαρ είναι το πρωτεύον εκτός του κόλου περιοχή για CRC μετάσταση και αντιπροσωπεύει την πιο κοινή θέση και την κλινική παρουσίαση για υποτροπή της νόσου σε ασθενείς που αποτυγχάνουν locoregioal θεραπεία [17]. Υπάρχουν λίγοι δείκτες όγκου που έχουν κλινική χρησιμότητα στη διαχείριση του CRC μετάστασης. Ακόμη και η εφαρμογή του πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη, carcinoembryoni αντιγόνο (CEA), έχει πρόσφατα αμφισβητηθεί [18]. ΟΡΝ είναι ένα υποψήφιο γονίδιο μετάστασης σε CRC. Με την εφαρμογή της γονιδιακής έκφρασης της τεχνολογίας και συγκεντρώθηκαν έκφραση δείγμα προφίλ [19], [20] προφίλ, OPN έχει αναγνωριστεί ως ο κύριος υποψήφιος κλινικό δείκτη της εξέλιξης CRC. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε ο ρόλος του στη ρύθμιση OPN ηπατική μετάσταση τελικών οργάνων.

Χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου, διαπιστώσαμε ότι OPN ήταν εντόνως εκφρασμένο σε μεταστατικές ηπατικές αλλοιώσεις από CRC έναντι πρωτογενούς ιστού CRC και παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. Επιπλέον, η έκφραση του mRNA OPN σε ιστούς όγκων ήταν σημαντικά σχετίζονται με τα στάδια CRC. Αυτά τα αποτελέσματα εμπλέκουν ότι ΟΡΝ είναι μια δυνητική δείκτης για εισβολή όγκου και ηπατική μετάσταση του CRC.

Αξίζει να σημειωθεί ότι, OPN mRNA βρέθηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων CRC με

in situ υβριδισμού

, αλλά όχι σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστούς ή στους περιβάλλοντες φυσιολογικούς ιστούς του συκώτια τους. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι η πρωτεΐνη OPN υπάρχει επίσης προφανώς στο κυτταρόπλασμα των παρακείμενων φυσιολογικών ηπατοκυττάρων που περιβάλλουν CRC ιστούς, και ότι η έκφραση της πρωτεΐνης σε OPN φυσιολογικό ηπατικό ιστό είναι αρνητική. Ωστόσο, εντοπίσαμε δύο υποδοχείς της OPN, integrinαv και CD44v6, σε κανονική ηπατικού ιστού. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι όταν τα καρκινικά κύτταρα CRC απομακρυνθεί από πρωτογενείς βλάβες, η πυλαία φλέβα η οποία αποτελεί απαραίτητη circumfluence φλέβα, επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να περάσουν μέσα από το ήπαρ. Τα καρκινικά κύτταρα που περιέχουν ΟΡΝ θα μπορούσαν να συσσωρευτούν στο ήπαρ μέσω μιας αλληλεπίδρασης μεταξύ ενός συνδετήρα και ενός υποδοχέα.

Εξετάσαμε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές για τη διερεύνηση του ρόλου της στη ρύθμιση OPN μετάσταση. Η κυτταρική σειρά Colo-205 διαμολύνθηκε με ένα OPN-αντινόημα ευκαρυωτικό πλασμίδιο για να αναστέλλουν την έκφραση πρωτεϊνών ΟΡΝ σε αυτή την κυτταρική γραμμή. SW-480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα OPN-νόημα ευκαρυωτικό πλασμίδιο, έτσι ώστε η πρωτεΐνη OPN εκφράζεται σε αυτή την κυτταρική σειρά.

Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων, Colo-205-OPN-αντιπληροφοριακό επιμολυσμένα κύτταρα συμπλέγματος (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ), ομοτυπική προσκόλληση ενισχύθηκε σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με την Colo-205-pcDNA3.1 (+). Ωστόσο, η ικανότητα προσκόλλησης εξασθένησε σε κύτταρα SW-480-ΟΡΝ-νόημα, και η κινητικότητα ενισχύθηκε σε αυτά τα κύτταρα που εκφράζουν OPN (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ταυτόχρονα, διερευνήσαμε την ετεροτυπική προσκόλληση με ECV304 ως κύτταρα-στόχους, heterotypic ικανότητα προσκόλλησης εξασθένησε σε Colo-205-OPN-αντιπληροφοριακά κύτταρα και ενισχύθηκε σε κύτταρα SW480-ΟΡΝ-νόημα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι OPN μειώνει την ομοτυπική προσκόλληση μεταξύ CRC κύτταρα και ενισχύει την ικανότητα ετεροτυπικές προσκόλληση μεταξύ κυττάρων και κυττάρων CRC ενδοθήλιο.

εισβολή και η μετάσταση είναι σημαντικά χαρακτηριστικά των κακοηθών όγκων. Η όλη διαδικασία της μετάστασης περιλαμβάνει πρόσφυση αγγειογένεση, την υποβάθμιση, την κίνηση, και επανασύνδεσης [21]. Οι παράγοντες προσκόλλησης εμπλέκονται ουσιαστικά στη διαδικασία. OPN είναι πιθανώς ένα από τα πολυάριθμα προγνωστικούς παράγοντες που σχετίζονται με την μετάσταση της CRC.

Λόγω της OPN, ομοτυπική ικανότητα πρόσφυσης είναι εξασθενημένο στα κύτταρα CRC και τα κύτταρα να αναχωρήσει από το δημοτικό χώρο πιο εύκολα, και να εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος. Το πρώτο βήμα της μετάστασης είναι έναρξη. Ωστόσο, τα κύτταρα CRC είναι πιο εύκολα να εισβάλουν ECM (ο επιπλέον κυτταρική μήτρα) όταν ετεροτυπική προσκόλληση ενισχύεται. Αυτά τα δύο βήματα είναι σημαντικά για μετάσταση σε κακοήθη καρκίνο.

GJIC έχει υποτεθεί ότι είναι απαραίτητη, εάν δεν είναι επαρκής, η βιολογική λειτουργία των κυττάρων σε μεταζώων ρύθμιση του ελέγχου ανάπτυξης, διαφοροποίησης και απόπτωσης των φυσιολογικών προγονικών κυττάρων [22 ]. Ενδοκυτταρική επικοινωνία σε πολλά όργανα διατηρείται μέσω διακυτταρικής καναλιών στενών τμημάτων του μεσοκυττάριου αποτελείται από συνδεσινών, μια μεγάλη πρωτεΐνη οικογένεια με έναν αριθμό ισομορφών. Αυτό GJIC επιτρέπει τη διάδοση των δυναμικών δράσης (π.χ. στον εγκέφαλο, την καρδιά), και την μεταφορά μικρών μορίων τα οποία μπορούν να ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη, διαφοροποίηση και λειτουργία. Η τελευταία έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου: μειωμένος GJIC συχνά σχετίζεται με αυξημένη ανάπτυξη του όγκου ή με τη διαδικασία της απο-διαφοροποίηση. Φθορισμού αναδιανομή μετά φωτολεύκανση (FRAP), εκδόθηκε για να παρατηρήσει την ανάκαμψη της έντασης φθορισμού στα λευκανθεί κύτταρα και συνεπώς να εκτιμηθεί ενδοκυτταρική επικοινωνία από διασταυρώσεις χάσμα.

Στη μελέτη μας, η αναδιανομή φθορισμού μετά φωτολεύκανση αποδυναμώθηκε σε SW-480 – κύτταρα OPN-αίσθηση. λειτουργία GJIC ανεστάλη και η ανταλλαγή του σήματος ήταν μειωμένη, λοιπόν αυτά τα καρκινικά κύτταρα πιο εύκολα αποσπάται από την πρωτοβάθμια βλάβες να ξεκινήσει το πρώτο στάδιο της μετάστασης παρεμπιπτόντως.

Με βάση τις μελέτες των συσχετιζόμενων μηχανισμούς ανάμεσα στην έκφραση της OPN και μετάσταση στο συνδυασμό με τις σχετικές βιβλιογραφίες, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ένας πιθανός μηχανισμός του OPN προώθηση CRC μετάσταση στο ήπαρ είναι η εξής: τα κύτταρα CRC εκφράζουν ΟΡΝ, η ικανότητα ομοιογένεια προσκόλληση μειώνονται, η λειτουργία της GJIC αναστέλλεται, η ικανότητα εισβολής και κίνηση είναι αυξημένη, γεγονός που καθιστά εύκολο για τα κύτταρα CRC να απομακρυνθεί από πρωτογενή βλάβη, να πάρει σε κυκλοφορία και να κινήσει τη διαδικασία της μετάστασης. Ταυτόχρονα, λόγω της ΟΡΝ, η έκφραση του CD44, ενός παράγοντα μετάστασης που σχετίζονται αυξάνεται επίσης. Η ετερότυπη προσκόλληση μεταξύ κυττάρων CRC, ECM και των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων είναι αυξημένη. Κατά τη διάρκεια της πυλαίας φλέβας παλλίρροια, OPN επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να εισβάλουν περιφερικά αγγεία, την εγκατάσταση και τη φύτευση στο ήπαρ. Επιπλέον, οι υποδοχείς του ΟΡΝ, CD44v6 και ιντεγρίνης αν βρέθηκαν στο ήπαρ. Η αλληλεπίδραση μεταξύ προσδεμάτων και υποδοχέων θα μπορούσε να εξηγήσει το ήπαρ προσφυόμενον κυττάρων CRC.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ΟΡΝ είναι ένας από τους σημαντικούς παράγοντες για την διείσδυση και μετάσταση όγκων. Η επίδραση στην ομοτυπική και heterotypic προσκόλληση στα κύτταρα CRC του OPN είναι απαραίτητη στη διαδικασία μετάσταση στο ήπαρ.

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Jiaping Peng και ο Δρ Xiaoming Fang για την πολύτιμη τους επιστημονικές συμβουλές κατά τη διάρκεια της μελέτης.