Αφηρημένο

Το DNA-δεσμευτική πρωτεΐνη AT-Rich Interactive τομέα 3Β (ARID3B) είναι αυξημένη στον καρκίνο των ωοθηκών και αυξάνει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου των ωοθηκών . Ωστόσο, σχετικά λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία ARID3B του. Σε αυτή τη μελέτη πραγματοποιούμε την πρώτη ευρεία οθόνη γονιδιώματος για ARID3B άμεση γονιδίων στόχων και ARID3B ρυθμίζονται μονοπάτια. Εντοπίσαμε και επιβεβαιώθηκε πολυάριθμα γονίδια στόχους ARID3B με χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) που ακολουθείται από μικροσυστοιχιών και ποσοτική RT-PCR. Χρησιμοποιώντας αλγόριθμους μοτίβο εύρεσης, χαρακτηρίσαμε θέση δέσμευσης για ARID3B, η οποία είναι παρόμοια με την προηγουμένως γνωστή θέση για την ARID3A ARID3B paralogue. Λειτουργικότητα αυτού προβλεπόμενη θέση καταδείχθηκε με ανάλυση chip. Έχουμε αποδείξει ότι το επόμενο ARID3B επάγει την έκφραση των στόχων της σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών. Εμείς επικυρωθεί ότι ARID3B προσδένεται σε έναν ενισχυτή υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και αυξάνει την έκφραση mRNA. ARID3B συνδέεται επίσης με τον προαγωγό του Wnt5A και του υποδοχέα του FZD5. FZD5 εκφράζεται έντονα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, και ρυθμίζεται προς τα πάνω από εξωγενή ARID3B. Τόσο ARID3B και έκφραση FZD5 αύξηση πρόσφυση σε εξωκυττάρια μήτρα (ECM) συστατικά συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου IV, φιμπρονεκτίνη και βιτρονεκτίνη. ARID3B-αυξημένη πρόσφυση σε κολλαγόνα II και IV απαιτούν FZD5. Αυτή η μελέτη αποδεικνύει άμεσα ότι ARID3B δεσμεύει γονιδίων-στόχων σε μία αλληλουχία-ειδικό τρόπο, με αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του γονιδίου. Επιπλέον, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ρύθμιση ARID3B των άμεσων γονιδίων-στόχων στο μονοπάτι Wnt προάγει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Παράθεση:. Bobbs Α, Gellerman Κ, Hallas WM, Joseph S, Yang C, Kurkewich J, et al. (2015) ARID3B Ρυθμίζει Άμεσα καρκίνου των ωοθηκών Προώθηση γονίδια. PLoS ONE 10 (6): e0131961. doi: 10.1371 /journal.pone.0131961

Επιμέλεια: Jinsong Zhang, Saint Louis University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 6η Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 8 του Ιούνη, 2015? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Bobbs et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου R00CA133190, https://www.cancer.gov/(KDCD), των ωοθηκών Cancer Research Ταμείο, Liz Βραβείο Tilberis Μελετητής, https://www.ocrf.org/(KDCD), Eck Ινστιτούτο για την Παγκόσμια Υγεία, Πανεπιστήμιο της Notre Dame, Pilot επιχορήγησης για Genomics πυρήνα, https://globalhealth.nd.edu/(KDCD ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στις Ηνωμένες Πολιτείες, ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η 5

ου πιο κοινός καρκίνος στις γυναίκες και το πιο θανατηφόρο γυναικολογικό καρκίνο. Το 2014, αναμένεται ότι υπήρξαν 21.980 νέες περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών και 14.270 θάνατοι [1]. Δείξαμε ότι η πρόσδεση του DNA ARID3B πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε καρκίνο των ωοθηκών ορώδες? έκφραση ARID3B στον πυρήνα συσχετίζεται με υποτροπή της νόσου [2, 3]. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει μηχανιστικά άμεση γονιδίων στόχων του ARID3B που μπορεί να συμβάλει στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών.

ARID3B ανήκει σε μια οικογένεια AT-Rich Interactive Τομέα (άγονες) πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αναδιάταξη της χρωματίνης και ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Αυτές οι πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από την περιοχή άγονη δέσμευσης DNA, μία άκρως συντηρημένη αλληλουχία από ~ 100 αμινοξέα [4]. ARID3B έχει μια άγονη περιοχή που μοιράζεται 89.9% ταυτότητα αμινοξέων με paralogue ARID3A του (ενεργοποιητή Β-κυττάρων που αρχικά ονομάστηκε «Φωτεινό») που έχει μια δεσμευτική συναίνεση ιστοσελίδα της «ΑΑΤΤΑΑ» [5-7]. δοκιμασίες μετατόπισης κινητικότητας έχουν δείξει ότι ARID3B μπορεί να δεσμεύσει Matrix περιοχές προσάρτησης που δεσμεύονται επίσης από ARID3A από IgH [8]. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι ARID3B συνδέεται με τον υποκινητή Oct4 και ρυθμίζει την έκφρασή του, ωστόσο, μια αμερόληπτη προσέγγιση για τον εντοπισμό άμεσων γονιδίων-στόχων ARID3B δεν έχει αναφερθεί [9].

Οι πρωτεΐνες άγονες εμπλέκονται στην ανάπτυξη και ιστών ειδική έκφραση γονιδίων, και παρεκκλίνουσα έκφραση έχει συνδεθεί με ογκογένεση [10].

Arid3b

είναι ένα βασικό γονίδιο? null έμβρυα πεθαίνουν μέσο της κύησης, εμφανίζουν σοβαρά ελαττώματα στη ανάπτυξη της καρδιάς, νευρικού ιστού, κρανιοπροσωπικών δομών, μπουμπούκια των άκρων, και το σχηματισμό του κορυφαίου κορυφογραμμής ενδοδερμικής [11-13]. ARID3B υπερεκφράζεται σε νευροβλάστωμα, ιδιαίτερα σταδίου IV όγκοι, και συνεργάζεται με MYCN να αυξήσει ογκογόνο δυναμικό και τον πολλαπλασιασμό [14, 15]. Σε ορώδης καρκίνος των ωοθηκών, ARID3B ανυψώνεται [2]. Πυρηνική έκφραση ARID3B συσχετίζεται με υποτροπή της νόσου [3]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ARID3B σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου [3] των ωοθηκών. Τα γονίδια-στόχους που ρυθμίζονται από ARID3B και οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους οι επιπτώσεις ARID3B ογκογένεση στον καρκίνο των ωοθηκών δεν είναι γνωστές.

Στη μελέτη αυτή προσδιορίζονται άμεσοι στόχοι του γονιδίου της ARID3B στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μέσω χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) ακολουθούμενη από την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών (τσιπ Chip). Οι περιοχές πρόσδεσης του ARID3B χαρακτηρίστηκαν με υπολογιστική βιοπληροφορική ανάλυση και έδωσε ένα άκρως συντηρημένη θέση πρόσδεσης. Μεταξύ των γονιδίων στόχων του ARID3B είναι μέλη των οδών EGFR, Notch, TNF, και σηματοδότηση Wnt. Ήμασταν ενδιαφέρεται ιδιαίτερα σε ισχύ ARID3B σχετικά με το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt, επειδή ARID3B έχει δεσμευτικό περιοχές σε τέσσερις Wnt γονίδια οδού: WNT5A, FZD5, APC, και MYC. WNT5A και FZD5 υπερεκφράζονται στον καρκίνο των ωοθηκών και συσχετίζονται με κακή πρόγνωση, και Wnt δραστηριότητα είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του θανάτου [16-19]. Προς τα πάνω ρύθμιση του FZD5 και η αύξηση WNT7A συνδέτη ανάπτυξη του όγκου και προσκόλληση κυττάρου [20]. Βρήκαμε ότι ARID3B αυξάνει την έκφραση της FZD5, APC, και MYC. Η υπερέκφραση του FZD5 ή ARID3B σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αυξάνει την πρόσφυση σε διάφορες πρωτεΐνες ECM, συμπεριλαμβανομένων ινονεκτίνη και βιτρονεκτίνη, ενώ knockdown του FZD5 ή επεξεργασία ARID3B αποτέλεσμα την απώλεια της πρόσφυσης σε ορισμένα στοιχεία της ECM. Επιπλέον, knockdown του FZD5 στα κύτταρα όπου ARID3B υπερεκφράζεται οδηγεί σε μειωμένη πρόσφυση και μειωμένη ARID3B επαγόμενη προσκόλληση προς κολλαγόνο II, κολλαγόνο IV, και τενασκίνη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η άμεση ρύθμιση του σηματοδότηση Wnt από ARID3B μπορεί να συνεισφέρει στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 37 ° C με 5% CO

2. OVCA429 κύτταρα (που παρέχεται από τον Dr. Bast, MD Anderson Cancer Κέντρο, Houston, ΤΧ και περιγράφεται στο [21]) αναπτύχθηκαν σε Ελάχιστο Βασικό Μέσο (ΜΕΜ). Έχουμε λάβει τα κύτταρα Skov3IP από τον Δρ Mills, MD Anderson Cancer Κέντρο, Houston, TX. Η παραγωγή των κυττάρων Skov3IP περιγράφεται στο Υυ et al [22]. κύτταρα Skov3IP αναπτύχθηκαν σε McCoys Media 5Α. Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Atlas, Ft. Collins, CO), 0,1 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 50 U /mL πενικιλλίνη, και 50 μg /mL στρεπτομυκίνη. κύτταρα OVCA429 και Skov3IP εκφράζοντας ARID3B, FZD5 (Plenti-C-mGFP, ΟηΟεηε, Rockville, MD), ή τον έλεγχο κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως και τα επίπεδα των ARID3B υπερέκφραση ήταν παρόμοιες με αυτές που επιτεύχθηκαν σε προηγούμενες μελέτες μας ( Σχήμα 1) [23]. Επεξεργασία του γονιδίου ARID3B σε OVCA429 κύτταρα επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας φορέα έκφρασης διαμολύνθηκαν sgRNA /Cas9 όλα-σε-ένα στόχευση ARID3B (ρ-CRISPR-CG01, Geneocopeia, Rockville, MD). Ως έλεγχος για CRISPR φτιαγμένος κυτταρικές σειρές, OVCA429 κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με μια νουκλεάση κλώνο Cas9 έκφρασης (CP-LvC9NU-01, Geneocopeia, Rockville, MD) και ένα κωδικοποιημένο φορέα ελέγχου sgRNA (ρ-CRISPR-LvSG02, Geneocopeia, Rockville, MD). Για FZD5 μεταγωγή, κύτταρα Skov3 (ATCC, Manassas, VA, USA, # ΗΤΒ-77) [24] χρησιμοποιήθηκαν στη θέση των κυττάρων Skov3IP εφόσον τα κύτταρα SKOV3IP μας εκφράζουν GFP και ο φορέας έκφρασης FZD5 εκφράζει GFP (Plenti-C-mGFP) . FZD5 knock-down επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα μεταγόμενο φορέα shRNA (pGFP-C-shLenti, ΟηΟεηε, Rockville, MD). κύτταρα OVCAR3 (ATCC, # ΗΤΒ-161) [25] αναπτύχθηκαν εντός μέσου RPMI με 20% FBS και 10 mg /mL ινσουλίνη. Caov3 (ATCC, # ΗΤΒ-75) [26] και 293FT (Life Technologies, Carlsbad, CA, # R700-07) [27] κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dubecco Τροποποιημένο Eagle Medium (ϋΜΕΜ) με 10% FBS. κύτταρα IOSE398 (από τον Dr. Stack, Harper Cancer Research Institute, Notre Dame, ΙΝ περιγράφεται στο [28]) αναπτύχθηκαν σε ένα 1: 1 μίγμα Media 199 και MCDB105, με 5% FBS και 50 μg /mL γενταμυκίνη. Όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας, εκτός από τις FBS ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Οι κυτταρικές σειρές επικυρωμένο την 1η Οκτωβρίου, το 2013, σε ATCC από STR προφίλ.

ARID3B έκφραση αξιολογήθηκε σε γονική, RFP εκφράζουν και 6XHis-ARID3B OVCA429 (Α) και Skov3IP (Β) κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιώντας τόσο qRT-PCR. (C) μία κηλίδα Western γονικής και ARID3B-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν επιβεβαιώνει αυτό το αποτέλεσμα.

Η

μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου των ωοθηκών

Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Notre Dame IACUC επιτροπή (πρωτόκολλο 14-060) και διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της πολιτικής των ΗΠΑ Δημόσιας Υπηρεσίας Υγείας για την ανθρώπινη φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων. Έξι εβδομάδων-παλιά γυναικεία γυμνά ποντίκια nu /nu (Charles River, Wilmington, ΜΑ) διατηρήθηκαν στο Freimann Κέντρο Διάδοσης Επιστημών Ζωής (Πανεπιστήμιο Notre Dame). Στην πιλοτική μελέτη (4 ποντίκια ανά ομάδα), 1×10

6 SKOV3IP-RFP ή SKOV3IP-ARID3B κύτταρα σε 200 μΙ αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS? 137 mM NaCl, 2.7 mM ΚΟΙ, και 11.9 mM ρυθμιστικό φωσφορικού, ρΗ 7.4 ) ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) σε γυμνά ποντίκια. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν εβδομαδιαίως για την ανάπτυξη του όγκου (με κοιλιακό και ραχιαίο εικόνας κάθε εβδομάδα). Η ανάπτυξη των όγκων και απεικόνισης αναφέρεται στο Roy, L., et al [3]. Από τα αποτελέσματα IP ανάπτυξη του όγκου σε ευρεία διάδοση εξάπλωση του όγκου, είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια τον όγκο του όγκου για πολλαπλούς όγκους

in vivo

. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν η

in vivo

απεικόνισης ανιχνεύεται πολλαπλές μεγάλους όγκους ή αν ποντίκια έδειξαν οποιαδήποτε σημάδια της ασθένειας συμπεριλαμβανομένης μιας διογκωμένη κοιλιακή χώρα.

Microarray Ανάλυση και Βιοπληροφορικής

Τρία δείγματα RNA καθένα από SKOV3IP-RFP και ασκίτη SKOV3IP-ARID3B υγρού /περιτοναϊκή πλύσεις προετοιμάστηκαν [3]. Η μικροσυστοιχία πραγματοποιήθηκε στο Μηχανισμό Notre Dame Genomics πυρήνα σε μια Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Τα επίπεδα έκφρασης καθετήρα που ομαλοποιούνται και συνοψίζονται με τη χρήση του GC ισχυρό μέσο multi-array (GCRMA) αλγόριθμο [29]. σύνολα ανιχνευτή ελέγχου και σύνολα ανιχνευτή που ήταν «μη ανιχνεύσιμο» φιλτραρίστηκαν για περαιτέρω ανάλυση. «Δεν ανιχνεύεται» ορίστηκε ως σύνολα ανιχνευτή που είτε να ονομάζεται «απών» από το Call Ανίχνευση Αλγόριθμος Affymetrix του (εγχειρίδιο με τίτλο «GeneChip Έκφρασης Ανάλυση Δεδομένων Βασικές αρχές Ανάλυσης», Affymetrix? Www.affymetrix.com) σε όλες τις έξι συστοιχίες, ή έχουν όλα την έκφρασή του αναφερθεί από GCRMA λιγότερο από 2,5. Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM, [30]) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ του ARID3B και RFP ελέγχους. Χίλιοι δώδεκα σειρές ανιχνευτών βρέθηκαν να είναι σημαντικές, με ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) λιγότερο από 10%. Από αυτά τα σύνολα ανιχνευτή, 199 ήταν κάτω ρυθμίζονται από ARID3B. Μια δεύτερη, πιο αυστηρή ανάλυση ομαλοποιηθούν τα στοιχεία των πρώτων μικροσυστοιχιών από RMA, και απαιτείται μια FDR λιγότερο από 5%. ανάλυση οδός διεξήχθη από διασταύρωση των στοιχείων ρυθμιζόμενων γονιδίων με τα συνδεδεμένα Gene Ontology (GO) τους όρους που αναφέρονται στο Ensembl βάση δεδομένων.

χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση ακολουθούμενη από μικροσυστοιχιών (τσιπ τσιπ)

Η ChIP- διαδικασία chip διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του Tamimi et. Αλ. [31]. Εν συντομία, Νί

2 + -ΝΤΑ μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκαν για να απομονωθούν διατμημένο σύμπλοκα χρωματίνης που περιέχει το -6-ARID3B πρωτεΐνη σύντηξης (His) από λύματα. Ένα θετικό μάρτυρα (100% των εισροών, δεν Ni

2 + -ΝΤΑ) και αρνητικό μάρτυρα (H2O συν Ni

2 + -ΝΤΑ προστίθεται στο δείγμα) συμπεριλήφθηκαν επίσης. υβριδοποίηση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Array NimbleGen Ανθρώπινα 2,1Μ Deluxe Promoter ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται παρακάτω. ακεραιότητα του δείγματος για πειραματικά δείγματα εισόδου chip και ελέγχου πιστοποιήθηκε με Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Ένα μg πειραματικών και ελέγχου δείγματα σημάνθηκαν με Cy3 και Cy5-σημασμένο τυχαίο εννεαμερή, αντίστοιχα (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI). Ένα δείγμα 34 μα εκάστου CY-χρωστική επισημασμένο προϊόν συγκεντρώθηκε και υβριδοποιήθηκε σε μία μικροσυστοιχία στους 42 ° C για 16-20 ώρες. Μικροσυστοιχίες πλύθηκαν, ξηράνθηκαν, και στη συνέχεια σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή NimbleGen MS200 στα 2 μm ανάλυση. εικόνες μικροσυστοιχιών έγιναν ορατά και αναλύθηκαν με λογισμικό NimbleScan v2.5 (Roche NimbleGen, Inc.).

Ο υπολογισμός της θέσης δέσμευσης ARID3B επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τόσο MEME (Πανεπιστήμιο του Queensland, Brisbane, της Αυστραλίας [32, 33] και ALLEGRO (Πανεπιστήμιο του Τελ Αβίβ, το Τελ Αβίβ, Ισραήλ) [34, 35]. Τα δεδομένα αλληλουχίας των ARID3B περιοχών δέσμευσης, όπως καθορίζεται από τα πειράματά μας ChIP-Chip εξήχθησαν χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη-χτισμένο perlscript. Οι κορυφαίοι ακολουθίες θέσης πρόσδεσης 50 ARID3B σαρώθηκαν για κοινά μοτίβα χρησιμοποιώντας MEME. σε μια παράλληλη ανάλυση, όλες οι ακολουθίες θέσης πρόσδεσης σημαντικές ARID3B συγκρίθηκαν ενάντια σε ένα γονιδίωμα φόντο χρησιμοποιώντας ALLEGRO.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

Ψαλιδισμένα χρωματίνης παρασκευάστηκε από 90% συρρέοντα καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα χρησιμοποιώντας την Pierce αγαρόζης ChIP Kit (Rockford, IL) και μια δημοσιευμένο πρωτόκολλο από Cold Spring Harbor [36]. DNA διάτμηση επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα EpiShear Probe Sonicator (Active Motif, Carlsbad, CA), με μια σειρά από 10 20 δευτερολέπτων παλμούς σε πλάτος 25%. Πενήντα μα κουρεύεται χρωματίνη χρησιμοποιήθηκε για κάθε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ). IP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντι-ARID3B αντίσωμα (Bethyl Laboratories, A302-564A, Montgomery, ΤΧ) ή IgG (Pierce, Rockford, IL) και πρωτεΐνεςμια-Αγαρόζη μαγνητικά σφαιρίδια. Ένα δείγμα του «DNA Input» συλλέχθηκαν πριν από την IP για εξομάλυνση. δείγματα ChIP ανάστροφα-διασυνδεδεμένη με θέρμανση στους 65 ° C για 4 ώρες υπό την παρουσία 20 μg πρωτεϊνάση Κ και 250 mM NaCl, και καθαριστεί χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης.

ChIP δείγματα DNA αναλύθηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR), χρησιμοποιώντας SSO Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Κάθε δείγμα ϋΝΑ τσιπ συγκρίθηκε με το κατάλληλο δείγμα DNA Εισόδου. Εκκινητές αγοράστηκαν από την Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ), και έχει σχεδιαστεί για να πλαισιώσει προτεινόμενες θέσεις δέσμευσης ARID3B:

EGFR F: CTCAAGTGTCTCATACTACC /R: GTCATTGGGCAAACCACTG

BTC F: GTCTCAGCCTCCCAAGTAGC /R: CTAACAGGTATAATGTCACAG

WNT5A F: AGTGATTCTCCTGCCTCAGC /R: TGGAAGGGATGAATTTGGTC

MYC F: GGAGGCCAGATGCATGAG /R: TAC CTA ΤΟΟ CTG ΤΤΑ GAA TC

FZD5 F: GCACAATGGCTCATGCTTG /R: CGCAATCTTGGCTCACTGC

APC F: CTCCTGACCTCAAGTGATCC /R: CAGTCACTGCTTATAGAATC

RIPK1 F: GTCTTGAACTCCTGACCTCG /

R: ACAGAAACTCCATGCAAACC

Notch2 F: GTCAGGAGTTTGAGACC /R: ACTGCAATCTCTGCCTCC

NUSAP1 F: TTCACATGCCTCATTAAGAG /R: TCCCGAGTAGCTGGGATTCC

CASP1 F: ACTCAAGCAATTCACTCACG /R: CATTCTGAGTCCAGAGCCTG

LPAR1F: TGAAGAGTTGCGTATTAAC /R: AGTTTCATGGGTGCTATACC

CENPN F: ATCTACTGTATGTCAGACAC /R: CAGGCACCCGATACCACG

CEP55: F: GCAGGAGTTCGTGATCAGAG /R: CCAGCTAATTCTGGGATCG

γονιδιακής έκφρασης

RNA από κύτταρα OVCA429 και Skov3IP απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) παρασκευάστηκε από 500 ng RNA χρησιμοποιώντας High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Waltham, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν είτε με τη χρήση iTaq Οικουμενική Κεφαλές Supermix (Bio-Rad) ή ο ΑΑΠ Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad). Όλα τα σύνολα εκκινητών γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν από Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ), με την εξαίρεση των ARID3B (από την Life Technologies, Carlsbad, CA). ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR qRT-) οι αντιδράσεις έτρεξαν σε τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς την έκφραση του GAPDH. Primer Αναλύσεις έχουν ως εξής: APC: Hs.PT.56a.3539689, ARID3B: HS01084949_g1, BTC: Hs.PT.56a.3511718, CASP1: Hs.PT.56a.39699622, CENPK: Hs.PT.56a.40187080. g, CENPN: Hs.PT.56a.22431568.g, CEP55: Hs.PT.56a.279272.g, EGFR: Hs.PT56a.20590781, FZD5: Hs.PT.56a.3585264, GAPDH: Hs.PT. 39a.22214836, MYC: Hs.PT.49a.3659201.g, Notch2: Hs.PT.512811432, NUSAP: Hs. PT.51.21077614, WNT5A:. Hs.PT.56a.22221435

Western Blot

λύματα πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου ελήφθησαν με λύση OVCA429 και Skov3IP καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0,5% EDTA, 0.1% SDS, και 1Χ Ανάσχεση Protease & amp? φωσφατάσης κοκτέιλ αναστολέα (Pierce, Rockford, IL)). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δικινχονινικού οξύ (BCA) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο (Pierce, Rockford, IL). Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: ARID3B (# A302-564A, Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ, Κουνέλι Polyclonal, συνθετικό πεπτίδιο αντιγόνο), FZD5 (# MC-4273, MBL, Woburn, ΜΑ, Κουνέλι Polyclonal, συνθετικό πεπτίδιο αντιγόνο) , β-ακτίνη (# AM1829b, Abgent, San Diego, CA, Mouse Monoclonal, Recombinant Protein αντιγόνο), GAPDH (# ab128915, Abcam, Cambridge, Αγγλία, Κουνέλι μονοκλωνικά, συνθετικό πεπτίδιο αντιγόνο), COXIV (# 4850, Cell Signaling Technology , κουνέλι πολυκλωνικά, συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα υπολείμματα που περιβάλλουν Lys29 της ανθρώπινης COXIV), και ARID3A (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, ένα είδος δώρο από H. Tucker UT Austin) που ακολουθείται από μία δευτερεύουσα αντι-κουνελιού συζευγμένο με HRP αντίσωμα (GE Health Care, Knox , ΣΕ). Απεικόνισης και ποσοτικοποίηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad Chemidoc XRS + Σύστημα, τρέχει Imager Εργαστήριο Λογισμικού (Hercules, CA).

Δοκιμασία ECM πρόσφυσης

Κινητά προσκόλληση σε συστατικά ECM προσδιορίστηκε με χρωματομετρική ECM κυττάρων Πρόσφυση Kit Array (Millipore, Billerica, ΜΑ). δοκιμασίες συνημμένο ECM έγιναν σε κύτταρα OVCA429 και Skov3 εκφράζοντας ARID3B, FZD5, FZD5 shRNA, ή περιέχουν CRISPR φτιαγμένος ARID3B. Μετά από 1 ώρα επώασης, τα μη-προσφυόμενα κύτταρα πλύθηκαν μακριά, με τα υπόλοιπα προσκολλητικά κύτταρα χρωματίζονται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν με νερό, και η χρωστική διαλυτοποιήθηκε με το ρυθμιστικό εκχύλισης κιτ. Φως απορρόφηση στα 540 nm μετρήθηκε σε ένα Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Για τον υπολογισμό των διαφορών στην κυτταρική προσκόλληση, οι μετρήσεις απορρόφησης αναφέρθηκαν ως φορές αλλάζουν με την πάροδο OVCA429-RFP ή προσκόλληση Skov3-RFP για κάθε συστατικό ECM.

TCF /Λεφ δημοσιογράφος δοκιμασία

επιμολυσμένα κύτταρα 293FT αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή σε μια πλάκα 12 φρεατίων, χρησιμοποιώντας Lipfectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), με 500 ng DNA. Όλα τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με TOPflash ή FOPflash πλασμίδια ανταποκριτές παράλληλα με έναν φορέα που εκφράζει δύναμη ARID3B (Plenti-suCMV-Κδν, Gentarget, San Diego, CA), FZD5 (Plenti-C-mGFP, ΟηΟεηε, Rockville, MD) Wnt5a (pLenti- C-mGFP), ή ένα κενό φορέα Plenti-C-mGFP. Όλα τα δείγματα επίσης συνεπιμολύνθηκαν με ένα στοιχείο ελέγχου λουσιφεράσης Renilla να ομαλοποιήσει για τον αριθμό των κυττάρων και την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Promega Luciferase Assay Διπλή (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και μετράται σε ένα φωτόμετρο TD 20/20 (Turner Designs, Sunnyvale, CA). Ένα παρόμοιο πείραμα διεξήχθη με 3Τ3 «Leading Light» κύτταρα (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). Καθώς αυτά τα κύτταρα εκφράζουν ένα Wnt λουσιφεράση Reporter, αυτοί επιμολύνθηκαν μόνο με τους προαναφερθέντες φορείς ARID3B, FZD5, και Wnt5a, και κανονικοποιήθηκαν με συγκέντρωση πρωτεΐνης. Όλες οι συνθήκες διεξήχθησαν εις τριπλούν και ομαλοποιούνται στη εσωτερικού ελέγχου ΚβηϊΙΙβ.

Στατιστικά

qPCR δεδομένων και την προσκόλληση κυττάρων Τ-στατιστικά στοιχεία υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη διαδικασία Smith-Satterthwaite με διακυμάνσεις άνιση πληθυσμού. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε σε συγκρίσεις με p-value 0,05 ή χαμηλότερη. Υπερεκπροσώπηση των γονιδίων Οντολογία (GO) όρους υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ Chi-Squared.

Αποτελέσματα

ARID3B δεσμεύει ρυθμιστικές περιοχές του DNA

Για να αποκτήσουν εικόνα για το πώς ARID3B ρυθμίζει την ωοθηκική ανάπτυξη του όγκου επιδιώξαμε να εντοπίσει ARID3B ρυθμιζόμενα γονίδια. Το πρώτο μας βήμα ήταν να εντοπίσει ρυθμιστικές περιοχές (όπως υποκινητές και ενισχυτές) που δεσμεύονται από ARID3B μέσω ανάλυσης τσιπ τσιπ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που υπερεκφράζουν ARID3B (6XHis-ARID3B). OVCA429 κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με ARID3B όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης των ARID3B στα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για το τσιπ-Chip ήταν πολύ υψηλή (περίπου 300-πλάσια αύξηση) επιλέξαμε για την επικύρωση των γονιδίων σε πιο μέτρια επίπεδα έκφρασης ARID3B που είναι πιο πιθανόν να απαντώνται

in vivo

(Σχήμα 1). Ψαλιδισμένα σύμπλοκα χρωματίνη συνδεδεμένο με His-tagged ARID3B απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Νί

2 + -ΝΤΑ μαγνητικά σφαιρίδια, μετά υβριδίζεται με ένα Array NimbleGen Ανθρώπινα 2,1Μ Deluxe Promoter. Στατιστική ανάλυση της συστοιχίας τσιπ Chip αποκάλυψε 2367 γονιδιωματικές περιοχές που δεσμεύονται από ARID3B (S1 πίνακα). Οι περιοχές του γονιδιώματος που προσδιορίζονται από ChIP-Chip κυμαίνονταν από 397 ζεύγη βάσεων σε 3198 ζεύγη βάσεων (διάμεση τιμή: 1.131 ζεύγη βάσεων).

Στη συνέχεια θα αξιολογηθεί εάν οι δεσμεύονται ARID3B γονίδια συγκεντρώνονται σε ξεχωριστές πορείες ή βιολογικές λειτουργίες. Οι περιοχές του γονιδιώματος που περιβάλλει κάθε θέση πρόσδεσης ARID3B σαρώθηκαν για μεταγραφή Έναρξη τοποθεσίες (TSS) στην εγγύτητα, αναθέτοντας έτσι σε κάθε θέση δέσμευσης για μια πιθανή ρυθμιστική περιοχή. Περίπου το 11% των θέσεων δέσμευσης ARID3B βρίσκεται με αυτόν τον τρόπο βρίσκονται στην περιοχή άμεσης υποκινητή ενός γονιδίου (που ορίζεται ως 0-2Kb από το TSS), 18% είναι σε μια κοντινή περιοχή ενισχυτή (2-5κβ από το TSS), 52 % είναι σε πιο απομακρυσμένες περιοχές ενισχυτή, και 19% είναι σε εσώνια (Σχήμα 2).

(Α) Κατανομή των ARID3B θέσεις σε σχέση με τη θέση έναρξης μεταγραφής του γονιδίου πλησιέστερο δέσμευσης. (Β) Γραφική αναπαράσταση του υπολογιστικά που προέρχονται ARID3B συναίνεση ιστοσελίδα, που παράγεται από MEME.

Η

Τα γονίδια με κοντινό δεσμευτική ομαδοποιήθηκαν με Gene Ontology (GO) όσον αφορά την βιολογική λειτουργία (Πίνακας 1) ARID3B. Πολλές από τις υποθετικές στόχων ARID3B έχουν GO όρων που συνδέονται με το κυτταρικό θάνατο και την απόπτωση (88 γονίδια), την ανάπτυξη της καρδιάς (21 γονίδια), την ανάπτυξη των νευρώνων (47), και βλαστικών κυττάρων δείκτες (6 γονίδια). Ένας μικρότερος αριθμός των γονιδίων που βρέθηκαν με τους όρους GO για οφθαλμός άκρων (2 γονίδια) και το σχηματισμό του προσώπου-κρανιακή (1 γονίδιο). Σημειώσαμε επίσης ότι ARID3B προσδένεται σε ένα αριθμό γονιδίων που εμπλέκονται στην κεντρομεριδίων ή μετάφαση (44 γονίδια). Οι κατηγορίες αυτές αντιπροσωπεύουν ένα υποσύνολο των βιολογικών λειτουργιών που ARID3B μπορούν να ρυθμίζουν και να εμπλέξει τους στόχους ARID3B σε πολλές διαδικασίες.

Η

ARID3B ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση

Είμαστε δίπλα θέλησε να προσδιορίσει ARID3B ρυθμίζονται τα γονίδια που είναι που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του όγκου απομονώσαμε κύτταρα από ένα μοντέλο ποντικού για καρκίνο των ωοθηκών. κύτταρα Skov3IP εκφράζουν κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) ή 6XHis-ARID3B και RFP ενέθηκαν σε γυμνά ποντίκια. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν. Συλλέξαμε ασκίτη ή περιτοναϊκή πλύσεις από Skov3IP-6XHis-ARID3B ή Skov3IP-RFP ξενομοσχευμάτων ασκίτη όπως περιγράφεται [3]. RNA συλλέχθηκε από τα κακοήθη ασκίτη σχηματίζουν Skov3IP-ARID3B ποντικών που φέρουν όγκο ή περιτοναϊκή πλύσεις από ποντικούς με όγκους Skov3IP-RFP. ανάλυσης μικροσυστοιχιών διεξήχθη χρησιμοποιώντας Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip. Σε αυτό το πείραμα υπήρχαν 813 γονίδια με αυξημένη έκφραση σε απόκριση σε ARID3B, και 201 γονίδια με μειωμένη έκφραση (S2 πίνακα). Μια πιο αυστηρές υπολογισμός των γονιδίων «ιδιαίτερα τροποποιημένα» (με βάση την κανονικοποίηση RMA με ψευδή Discovery Rate λιγότερο από 5%), απέδωσε 132 γονίδια με αυξημένη έκφραση, και 39 με μειωμένη έκφραση. Παρόμοια με τα δεδομένα τσιπ τσιπ μας, αυτά τα αποτελέσματα φιλτράρονται από τους όρους GO. Μεταξύ των γονιδίων τα οποία είναι ARID3B επαγόμενη είναι 44 γονίδια κυτταρικό θάνατο, 13 γονίδια ανάπτυξη καρδιά, 17 γονίδια νευρική ανάπτυξη, 37 γονίδια κυτταρική διαίρεση, και 9 γονίδια των βλαστικών κυττάρων (Πίνακας 2). Σε συμφωνία με τα δεδομένα ChIP-chip μας, αρκετά γονίδια που προσδιορίζονται ως άμεσοι στόχοι ARID3B προκλήθηκαν από ARID3B έκφρασης, συμπεριλαμβανομένης της Notch2, CASP1, CENPN και CENPK. Μια στατιστική ανάλυση των GO μακροπρόθεσμα την κατανομή διαπίστωσε ότι μετάφαση και κεντρομέρους που σχετίζονται με τους όρους ήταν σημαντικά υπερεκπροσωπούνται μεταξύ των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα πάνω από ARID3B, ενώ όσον αφορά την ανάπτυξη των νευρώνων ήταν υπερεκπροσωπούνται μεταξύ των γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται από ARID3B (S3 Πίνακας).

Χαρακτηρίζοντας τη θέση πρόσδεσης ARID3B

Η θέση δέσμευσης συναίνεση των paralogue ARID3A ARID3B που στο παρελθόν έχει αποδειχθεί ότι είναι «ΑΑΤΤΑΑ» [5]. Όπως περιγράφεται παραπάνω, γονιδιωματικές αλληλουχίες που δεσμεύονται από ARID3B ελήφθησαν με τσιπ Chip. Αυτές οι αλληλουχίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο ξεχωριστές αλγορίθμων μοτίβο-εύρεσης (MEME [32] και ALLEGRO [34]) για να βρουν μια κοινή ΑΤ-πλούσιο μοτίβο. Και οι δύο μέθοδοι έδωσαν ένα μοτίβο δέσμευσης συναίνεση «TGGGATTACAG.» (Σχήμα 2) Για να αποδειχθεί η λειτουργικότητα αυτού υπολογιστικά προέρχονται μοτίβο, εκτελέσαμε τσιπ για την ανίχνευση ARID3B δέσμευσης στις περιοχές ρυθμιστής γονιδίων που ταυτοποιούνται μέσω τσιπ Chip. Η σύνδεση με τις ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων αυτών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας qPCR εναρκτήρες σχεδιασμένους για να ενισχύσουν ένα 200-300bp περιοχή που περιέχει μία ή περισσότερες πιθανές θέσεις συνδέσεως ARID3B που προσδιορίζονται bioinformatically. Δείγματα ChIP παρασκευάστηκαν από Skov3IP και OVCA429 καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, χρησιμοποιώντας τόσο γονικές γραμμές και κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν 6XHis-ARID3B (Σχήμα 1). γονιδίων στόχων επιλέχθηκαν για την επικύρωση με βάση τα δεδομένα τσιπ τσιπ, και η βιολογική σημασία του γονιδίου. Τα επιλεγμένα γονίδια στόχοι χωρίστηκαν σε 4 κατηγορίες Gene Ontology: σηματοδότηση Wnt (Wnt5A, FZD5, MYC, APC) (Σχήμα 3Α), κυτταρικός θάνατος που σχετίζεται με (Notch2, CASP1, LPAR1 και RIPK) (Σχήμα 3Β), κυτταρική διαίρεση (CENPN, CENPK, NUSAP και CEP55) (Σχήμα 3C), και σηματοδότηση EGFR (EGFR και BTC) (Σχήμα 3D). Για κάθε περιοχή, τα αποτελέσματα qPCR της ARID3B ChIP ομαλοποιήθηκαν σε ένα δείγμα DNA εισόδου, και σε σύγκριση με ένα αρνητικό (IgG) έλεγχο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, σχεδόν σε όλες τις επιλεγμένες περιοχές στόχους έδειξε δεσμευτικός ARID3B ουσιαστικά πάνω από τον αρνητικό μάρτυρα σε τουλάχιστον μία κυτταρική γραμμή. Σχετική σύνδεση σε ARID3B ChIP έναντι του ισοδύναμου αρνητικός έλεγχος ήταν γενικά πολύ υψηλότερες σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ARID3B, σε σύγκριση με τις γονικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν κατά τη διεξαγωγή των τσιπ στην υψηλής ποιότητας ορώδες καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (OVCAR3), με σημαντική ARID3B σύνδεση βρέθηκε να Wnt5a, RIPK, BTC, και APC (Σχήμα 3Ε).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα ακολουθείται με qPCR διεξήχθη σε γονική και 6XHis-ARID3B Skov3IP και OVCA429 κύτταρα για να ανιχνευθεί σύνδεση του ARID3B να στοχεύουν τα γονίδια σε βασικούς οδούς. Όλοι οι αριθμοί αναφέρονται ως σχετική δέσμευση σε σύγκριση με το αντίστοιχο δείγμα DNA εισόδου. Παρενθέσεις δείχνουν ότι δεσμευτικός ως προς όλα τα δείγματα ARID3B-chip είναι σημαντικά υψηλότερο από το αντίστοιχο υπόβαθρο (IgG) του δείγματος (* -ρ-τιμής & lt? 0,05, ** – τιμή p & lt? 0.005). Ν = 3. Έχουμε επικυρωθεί ARID3B σύνδεση με γονίδια με Gene Ontology (GO) όρων που σχετίζονται με (Α) σηματοδότηση Wnt, (Β) κυτταρικό θάνατο και απόπτωση, ή (Γ) Τμήμα κυττάρων, ή (Δ) σηματοδότηση EGFR. (Ε) Παρόμοια αποτελέσματα τσιπ υψηλής ποιότητας ορώδες κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών OVCAR3.

Η

ARID3B μεταβάλλει την έκφραση των γονιδίων σε βασικές κυτταρικές οδούς

Στη συνέχεια διαπιστώσαμε αν ARID3B έκφραση μεταβάλλει την έκφραση των θεωρούμενων γονιδίων στόχων. Η εξωγενής έκφραση ARID3B αυξήθηκε γονίδια στο Wnt και μονοπάτια σηματοδότησης EGF από qRT-PCR. Σε OVCA429 κύτταρα, APC, FZD5, MYC και EGFR επάγονται από ARID3B. Σε κύτταρα Skov3IP, ARID3B αυξάνει FZD5, MYC, BTC, και EGFR (Εικόνα 4Α). Η συνεπής επαγωγή FZD5 και MYC είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα, δεδομένου ότι και οι δύο εκφράζονται συχνά σε υψηλά επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε σχέση με αθανατοποιημένα κύτταρα ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών (IOSE398) (Εικόνα 4Β και 4C). Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι ARID3B επάγει την έκφραση πολλών προβλέψει στόχους: ARID3B ρυθμίζεται προς τα πάνω Notch2, SORBS1, και CASP1 σε κυτταρικές γραμμές Skov3IP (Εικ 4D). Τα γονίδια αυτά θεωρήθηκαν των οφειλόμενων τόκων προς τους όρους Γονιδιακή Οντολογία τους. ARID3B δεσμεύει επίσης και διάφορα μετάφαση και γονιδίων που σχετίζονται με κεντρομεριδίου (Πίνακας 1). Εμείς επιβεβαίωσε τη δέσμευση της ARID3B σε ρυθμιστικές περιοχές CEP55, CENPN και CENPK χρησιμοποιώντας ChIP (Σχήμα 3C). Σε OVCA429 κύτταρα, CEP55 και CENPN αυξορυθμίζονται σημαντικά από ARID3B (Σχήμα 4Ε).

(Α) qRT-PCR διεξήχθη για γονίδια-στόχους για OVCA429 και Skov3IP γονικά κύτταρα και κύτταρα OVCA429 και Skov3IP εκφράζουν 6xHis-ARID3B. Ν = 5 (Β και Γ) qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ολικό RNA που παρασκευάζεται από IOSE398 και ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών για να μετρηθεί η έκφραση των θεωρούμενων ARID3B γονιδίων στόχων FZD5 και MYC. Ν = 3 (Δ) Ανάλυση qRT-PCR για τη γονική κύτταρα Skov3IP, Skov3IP-6XHis-ARID3B, και τα κύτταρα Skov3IP-RFP. Ν = 3 ανάλυση (Ε) qRT-PCR σε OVCA429 γονικά κύτταρα, 6XHis-ARID3B, και RFP εκφράζουν OVCA429 κύτταρα. Ν = 4. * = p & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0.005 (F) Western Blot χρησιμοποιώντας λύματα OVCA429, OVCA-6xHis-ARID3B, Skov3 και τα κύτταρα Skov3-6xHis-ARID3B για FZD5. Ν = 2.

Η

Από Wnt σηματοδότηση εμπλέκεται σε πολλές είδος των όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών ερευνήσαμε περαιτέρω ρύθμιση των FZD5 από ARID3B. Προς τα πάνω ρύθμιση FZD5 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με στύπωμα Western (Σχήμα 4F) στα οποία η έκφραση της πρωτεΐνης του FZD5 αυξήθηκε 9 φορές σε OVCA429 κύτταρα και 2,8-φορές σε κύτταρα Skov3 σε απόκριση προς έκφραση 6xHis-ARID3B. Αυτό αποδεικνύει ότι ARID3B ρυθμίζει FZD5

in vitro

.

Για να υποστηρίξει περαιτέρω το ρόλο της ARID3B στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, OVCA429 κύτταρα επιμολυσμένα με φορείς που εκφράζουν Cas9 νουκλεάση και RNAs οδηγό CRISPR στόχευση ARID3B. Σημαντική απώλεια της ARID3B έκφραση επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (Σχήμα 5Α) και μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου επαληθεύθηκαν με αλληλούχιση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έκφραση των γονιδίων στόχων ARID3B μετρήθηκε χρησιμοποιώντας qPCR όπως και πριν, συγκρίνοντας OVCA429 κυττάρων με CRISPR φτιαγμένος ARID3B έναντι OVCA429 κύτταρα που περιέχουν ένα στοιχείο ελέγχου Cas9 και κωδικοποιημένα διάνυσμα sgRNA. Βρήκαμε μειώθηκαν σημαντικά την έκφραση του EGFR στο CRISPR φτιαγμένος κύτταρα (Σχήμα 5Β), και το ίδιο για προ-αποπτωτική στόχους TRADD και ο υποδοχέας TNFR2 TNF, το οποίο εργαστήριο μας είχε προηγουμένως επαληθεύσει ότι ρυθμίζονται από ARID3B [23].

(Α) κηλίδα Western με τη χρήση ολόκληρου κυττάρου λύματος από τα κύτταρα OVCA429 και OVCA429 ARID3B CRISPR, με ανίχνευση για ARID3B. Ν = 2. (Β) qRT-PCR διεξήχθη για EGFR, TRADD, και TNFR2 σε ολικό RNA από κύτταρα OVCA429 μεταγωγή με Cas9 νουκλεάση και ένας έλεγχος ομελέτα CRISPR οδηγό RNA, και OVCA429 κυττάρων με ARID3B edited by στοχευόμενων φορέων CRISPR. (C) qRT-PCR διεξήχθη για ARID3B επί OVCA429-GFP και OVCA429 κύτταρα ταξινομημένο για μεσαίου ARID3B-GFP ή υψηλή έκφραση ARID3B-GFP. (D) qRT-PCR διεξήχθη για EGFR, TRADD, TNFR2, TNF, και TRAIL σε OVCA429-GFP, OVCA429 μέσο ARID3B-GFP, και OVCA429 υψηλής κύτταρα ARID3B-GFP. Ν = 3. * = p & lt? 0,05.