Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) συνδέεται με την απώλεια του μορίου προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου E-cadherin και η διατάραξη της σε κύτταρα κελί διασταυρώσεις, καθώς και με την απόκτηση των μεταναστευτικών ιδιοτήτων περιλαμβανομένης της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού ακτίνης και ενεργοποίηση της RhoA ΟΤΡάσης. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι αποπολυμερισμός του κυτταροσκελετού ακτίνης διαφόρων μεταστατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με κυτοχαλασίνη D (Cyt D) μειώνει τα επίπεδα μέγεθος των κυττάρων και F-ακτίνης και επάγει την έκφραση Ε-καδερίνης σε αμφότερα την πρωτεΐνη και το επίπεδο του mRNA. Επαγωγή Ε-καδερίνης ήταν δοσοεξαρτώμενη και παραλληλίζεται απώλεια των δεικτών μεσεγχυματικών Ν-καντερίνης και βιμεντίνη. επίπεδα Ε-καδερίνη αυξήθηκαν 2 ώρες μετά την προσθήκη του Cyt D σε κύτταρα που δείχνει μία απόκριση mRNA Ε-καδερίνης, αλλά μόνο μετά από 10-12 ώρες σε ΗΤ-1080 ινοσαρκώματος και MDA-MB-231 κύτταρα στα οποία το επίπεδο του mRNA Ε-καδερίνης ήταν μόνο ελάχιστα επηρεαστεί από τη θεραπεία Cyt D. Cyt D επήγαγε την πυρηνική κυτταροπλασματική μετατόπιση του ΕΜΤ-σχετίζεται SNAI 1 και SMAD1 παράγοντες /2/3 μεταγραφής. Σε μη μεταστατικό MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, που εκφράζουν Ε-καδερίνης και αντιπροσωπεύουν ένα μοντέλο καρκινικού κυττάρου για EMT, αποπολυμερισμό της ακτίνης με Cyt D προκάλεσε αυξημένα Ε-καδερίνης, ενώ ακτίνης σταθεροποίηση με Jasplakinolide μειωμένα επίπεδα Ε-καδερίνης. Αυξημένα επίπεδα E-cadherin λόγω Cyt D συσχετίστηκαν με μειωμένη ενεργοποίηση της Rho Α Έκφραση κυρίαρχο-αρνητικό Rho Ένα μεταλλαγμένο αυξηθεί και κυρίαρχο δραστικό Rho Ένα μεταλλαγμένο μειωμένα επίπεδα Ε-καδερίνης και εμπόδισε επίσης την επαγωγή Cyt D Ε-καδερίνης. Μειωμένη Rho A Ενεργοποίηση κατάντη της αναδιαμόρφωσης ακτίνης επομένως επάγει Ε-καδερίνης και αντιστρέφει ΕΜΤ σε καρκινικά κύτταρα. θεραπεία Cyt Α ανέστειλε τη μετανάστευση και, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, επαγόμενη κυτταροτοξικότητα των δύο κύτταρα ΗΤ-1080 ινοσαρκώματος και κανονικούς ινοβλάστες Hs27, αλλά μόνο επαγόμενη μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση σε ΗΤ-1080 καρκινικά κύτταρα. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι η αναδιαμόρφωση της ακτίνης είναι ένα ανάντη ρυθμιστή της EMT στο μεταστατικό καρκίνο κύτταρα

Παράθεση:. Shankar J, Nabi IR (2015) ακτίνη κανονισμού Κυτταροσκελετού επιθηλιακών μεσεγχυματικά μετάβαση σε κύτταρα μεταστατικού καρκίνου. PLoS ONE 10 (3): e0119954. doi: 10.1371 /journal.pone.0119954

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 18 Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 26 Γενάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 του Μάρτη, 2015

Copyright: © 2015 Shankar, Nabi. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση Cancer Research Society (IRN), μια καναδική Breast Cancer Foundation μεταδιδακτορικής έρευνας (JS) και ένα καναδικό Αντικαρκινική Εταιρεία Έρευνας Ινστιτούτο Καινοτομίας Grant (MR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ivan Nabi είναι ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου και αυτό δεν μεταβάλλει οι συγγραφείς » τήρηση PLoS One Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι ένα κυψελοειδές πρόγραμμα που απαιτείται κατά τη διάρκεια της κανονικής αναπτυξιακών διαδικασιών, όπως η εμβρυογένεση και ιστών αναδιαμόρφωση και στην εξέλιξη της ασθένειες όπως ο καρκίνος [1]. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, η διατάραξη του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) συμφύσεις απελευθερώνει επιθηλιακά κύτταρα από τον περιβάλλοντα ιστό. Τα απελευθερωμένα κύτταρα μεταμορφώνονται σε μεσεγχυματικά, τα μεταναστευτικά κύτταρα με μια ενισχυμένη ικανότητα να κινείται μέσα από το πλέγμα των τρισδιάστατων ECM. Η εντοπισμένη έκφραση των αυξητικών παραγόντων όπως του ΤΟΡ-β και EGF επάγει ΕΜΤ μέσω της ενεργοποίησης του Wnt και Notch οδούς και κατάντη ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής όπως Smad, σαλιγκάρι, Zeb και Twist σηματοδότησης. Η έκφραση των επιθηλιακών πρωτεΐνες προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου όπως Ε-καντερίνης ρυθμίζεται προς τα κάτω, ενώ τα μεσεγχυματικά πρωτεΐνες προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, όπως η Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και την πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας ινωδονεκτίνη και κολλαγόνο, αυξορυθμίζονται [1,2,3].

φλοιού οργάνωση νημάτια ακτίνης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των επιθηλιακών κυττάρων ενώ οι ακτίνης ίνες στρες βρίσκονται σε μεσεγχυματικά κύτταρα. Η ακτίνη κυτταροσκελετό αναδιαμόρφωση διαμεσολαβείται από τα Rho ΘΤΡάσες και αντιπροσωπεύει ένα βασικό μηχανισμό κρίσιμη για την κυτταρική μετανάστευση κατά την διάρκεια διαδικασιών όπως η μετάσταση του καρκίνου. Όσον αφορά την EMT, η ενεργοποίηση της RhoA οδηγεί σε ROCK-εξαρτώμενη κυτταροσκελετού της ακτίνης αναδιαμόρφωση και η διατάραξη των κυττάρων συμφύσεων με βάση E-cadherin [4,5,6,7,8,9]. Αρκετές ακτίνη κυτταροσκελετό που σχετίζονται πρωτεΐνες όπως α-ακτινίνη, ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης, ιντεγκρίνες, τροπομυοσίνες και μοεσίνη δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ [3,7,10,11,12,13,14]. ρυθμιστές της ακτίνης του κυτταροσκελετού επίσης αναγνωριστεί ως βασικοί παράγοντες της εξέλιξης λεμφώματος σε απώλεια-του-λειτουργία RNAi οθόνη μοντέλα όγκων ποντικών [15]. Η έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών ακτίνης όπως ARP2 /3 και WAVE2 συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε μαστού και του ήπατος καρκινωμάτων υποστηρίζουν ένα ρόλο για τη δυναμική του κυτταροσκελετού της ακτίνης και την οργάνωση ως κρίσιμες ρυθμιστές της εξέλιξης του καρκίνου [16]. Μια πρόσφατη μελέτη έχει επίσης ενοχοποιείται αυξηθεί μυοσίνη ΙΙΒ έκφραση και βαριάς αλυσίδας μυοσίνης ΙΙΑ φωσφορυλίωση στην ενίσχυση του μαστού μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων και εισβολή σε ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT [17].

Δείξαμε προηγουμένως ότι η μειωμένη έκφραση του pseudopod- εμπλουτισμένο πρωτεΐνες οδήγησε σε μειωμένη δυναμική κυτταροσκελετού της ακτίνης και το μέγεθος των κυττάρων που σχετίζονται με μια αντιστροφή του ΕΜΤ σε έξι μεταστατικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές [18]. Δείχνουμε τώρα ότι αποπολυμερισμός της ακτίνης του κυτταροσκελετού των καρκινικών κυττάρων με κυτοχαλασίνη D (Cyt D) επάγει πυρηνικά κυτταροπλασματική μετατόπιση του ΕΜΤ-σχετιζόμενων παραγόντων μεταγραφής, η αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη κυτταρικό σχήμα και το μέγεθος και μειωμένη ενεργοποίηση της RhoA. Σε MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, επαγωγή Ε-καδερίνης με αποπολυμερισμό της ακτίνης απαιτεί RhoA αδρανοποίησης ενώ κυρίαρχη ενεργή RhoA επάγει Ε-καδερίνης. Αυτό υποδηλώνει ότι η ακτίνη κυτταροσκελετό αναδιαμόρφωση ανάντη του RhoA σηματοδότησης παίζει ρόλο στην ΕΜΤ.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Ποντίκια Ε-καδερίνης (# 610182) και Ν -cadherin (# 610920) αντισώματα ήταν από BD Transduction Laboratories? αντι-β-ακτίνης ήταν από τη Sigma, αντι-βιμεντίνη (ab11256) ήταν από Abcam. SMAD1 /2/3 (Sc-7960), SNAI 1 (Sc-28199), RhoA (Sc-418), γ-Myc (Sc-789) αντισώματα ήταν από την Santa Cruz. Alexa488-, Alexa568-, και Alexa647-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα και ροδαμινο και Alexa568-συζευγμένο φαλλοειδίνη ήταν από την Molecular Probes. Αντιδραστήρια για πραγματικού χρόνου PCR ήταν από την Applied Biosystems? Το κιτ απομόνωσης RNA ήταν από την Qiagen. Cytochalasin D και Jasplakinolide ήταν από Calbiochem (Millipore). RhoA πλασμίδια ήταν ένα είδος δώρο από Nathalie Lamarche (Πανεπιστήμιο McGill). χάντρες RhoA, MLB ρυθμιστικού λύσης και Rac1 mAb ήταν από Millipore (Upstate).

καλλιέργειας κυττάρων, Western Blot και μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Ανθρώπινο MDA-231, MDA-435, DU145, ΗΤ1080, U251 , U87F-7, MCF-7 και κυτταρικές γραμμές Hs27 ήταν από την American Type Culture Collection. MDA-231, MDA-435, και Du145 διατηρήθηκαν σε πλήρες RPMI 1640 και ΗΤ-1080, U251, U87, MCF-7 και κύτταρα Hs27 σε DMEM συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 IU /mL πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη, και 25 mmol /L ρυθμιστικού διαλύματος HEPES για RPM1 και πυροσταφυλικό νάτριο για DMEM, αντίστοιχα στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Για στυπώματα Western, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν, συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Bradford και ίσες ποσότητες κυτταρικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν. Για ανοσοφθορισμό, κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες καθηλώθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη και αντίσωμα επισημασμένο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εικόνες συλλέχθηκαν με × 60 × 100 ή στόχους planapochromat (αριθμητικό άνοιγμα, 1.35) ενός ομοεστιακό μικροσκόπιο FV1000 Ολύμπου.

Rho ΟΤΡάσης δραστικότητα δοκιμασία

RhoA pull-down διεξήχθη σύμφωνα με τον κατασκευαστή πρωτόκολλο (Millipore) και τα επίπεδα του RhoA GTP και συνολική RhoA ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας RhoA αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology). Πριν από τη θεραπεία με τα κύτταρα Cyt D επιμολύνθηκαν παροδικά με RhoA πλασμίδια χρησιμοποιώντας Effectene (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

μετανάστευση των κυττάρων και την κυτταροτοξικότητα δοκιμασίες

Περίπου, 3 × 10

4 ΗΤ1080 και κύτταρα HS27 μεταφέρθηκαν σε μη επικαλυμμένα ενθέματα κύτταρο (μετανάστευση) 8-μm καλλιέργεια (BD Falcon) σε μέσο που περιείχε 2% ορό. Η διάταξη τοποθετήθηκε σε πλάκες 24 φρεατίων που περιέχουν πλήρες μέσο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν στο φίλτρο για 4-6 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cyt D και, ως έλεγχος όχημα, 1% DMSO, επί 12 ώρες. Μετά από 12 ώρες, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή του φίλτρου με μια μπατονέτα και μεταναστεύουν κύτταρα στο κάτω μέρος του φίλτρου σταθεροποιήθηκαν και χρωματίσθηκαν με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες, Για προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας, περίπου 7500 κύτταρα τόσο για ΗΤ-1080 και Hs27 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cyt D ή 1% DMSO για 10 ώρες και στη συνέχεια υδατοδιαλυτό τετραζόλιο (WST-1 αντιδραστηρίου) προστέθηκε στα επιμέρους φρεάτια. 2 ώρες μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου, η απορρόφηση αναγνώστηκε στα 450 nm. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Real-time PCR

RNA απομονώθηκε από κάθε ένα από την κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας το RNeasy μίνι κιτ Plus (Qiagen) και μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το High χωρητικότητα cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσίδα αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR) σε έναν ΑΒΙ 7500 Fast σύστημα με ανιχνευτές Taqman έθιμο για κάθε γονίδιο χρησιμοποιώντας Taqman Gene Expression Δοκιμασίες (Applied Biosystems). Σχετική έκφραση προσδιορίστηκε με χρήση πρότυπης καμπύλης και την έκφραση του γονιδίου κανονικοποιήθηκε ως προς 18S rRNA αφθονία.

Στατιστική ανάλυση

Στατιστική δοκιμές πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί το επίπεδο σημαντικότητας μεταξύ ομάδων ελέγχου και θεραπείας. Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών τουλάχιστον πειραμάτων. Δύο συγκρίσεις ομάδα (ελέγχου έναντι θεραπεύονται ή χρονικά σημεία σε σχέση με το χρόνο 0) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο Student t test (Σχ. 1, 2, 3, 4 και 5). Για πολλαπλές συγκρίσεις ομάδα (Εικ. 6), μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey διεξήχθη για να δημιουργήσει στατιστικά δεδομένα.

(Α) Du145, MDA-231, MDA-435, ΗΤ1080, U251 και U87 κύτταρα τοποθετούνται για 24 ώρες ήταν χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή κατεργασία με 100 μΜ Cyt D (Cyt D αγωγή) επί 12 ώρες, σταθεροποιήθηκαν και ανοσοφθορισμό επισημασμένο για Ε-καδερίνη (πράσινος) και F-ακτίνης (κόκκινο). Κλίμακα: 10 μm. (Β) Du145, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435, ΗΤ-1080, U251 και U87 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 μΜ) και το μέσο μέγεθος και F β-ακτίνης περιεχόμενο των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Μορφολογία Explorer Bioapplication ενός Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader. **

σ

& gt? 0,01 και *

σ

& lt? 0,05? σε σχέση με τον έλεγχο (μη επεξεργασμένα) κύτταρα.

Η

(Α) Du145, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435, ΗΤ-1080, U251 και U87 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με διάφορες συγκεντρώσεις του Cyt D (0, 10, 50, 100, 200 μΜ) και κυτταρολύματα στυπώθηκε για Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, βιμεντίνη και β-ακτίνης. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR για Ε-καδερίνη mRNA διεξήχθη σε ολικό RNA απομονώθηκε από το Du145, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435, ΗΤ-1080, U251 και U87 κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cyt D. Cyt D θεραπεία αυξημένη έκφραση mRNA Ε-καδερίνης σε όλα τα κύτταρα εκτός από τα ΗΤ1080 και MDA-231, όπου υπήρχε καθόλου ή ελάχιστη έκφραση. **

σ

& lt? 0,01, *

σ

& lt? 0,05? σε σχέση με τον έλεγχο (μη επεξεργασμένα) κύτταρα.

Η

(Α) Du145, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435, ΗΤ-1080, U251 και U87 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Cyt D για την υποδεικνυόμενη φορές και προϊόντα λύσης κυττάρου κηλιδώθηκε για Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, βιμεντίνη και β-ακτίνης. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR για Ε-καδερίνη mRNA διεξήχθη σε ολικό RNA απομονώθηκε από το Du145, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435, ΗΤ-1080, U251 και U87 κύτταρα επεξεργασμένα σε διαφορετικές χρονικό διάστημα με Cyt D . Cyt θεραπεία D αυξημένο επίπεδο έκφρασης mRNA Ε-καδερίνης σε όλα τα κύτταρα εκτός από τα ΗΤ1080 και MDA-231, όπου υπήρχε καθόλου ή ελάχιστη έκφραση. **

σ

& lt? 0,01, *

σ

& lt? 0,05? σε σχέση με το χρόνο 0.

Η

(Α) Du145, MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-435, ΗΤ-1080, U251 και U87 κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 100 μΜ Cyt D (Cyt D αγωγή) για 12 ώρες και ανοσοφθορισμό επισημασμένο για Smad1 /2/3 και SNAI 1, καθώς και Hoechst 33342 πυρηνική χρώση για. Αντιπροσωπευτικές εικόνες για MDA-MB-231 κύτταρα εμφανίζονται. (Β) Τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν για την πυρηνική διανομή των Smad1 /2/3 και SNAI 1 στον έλεγχο και Cyt D επεξεργασμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστό των συνολικών κυττάρων που δείχνει την πυρηνική διανομή για αυτές τις δύο πρωτεΐνες. Κλίμακα: 10 μm? **

σ

& lt? 0,01, *

σ

& lt? 0,05? σε σχέση με το μη επεξεργασμένο έλεγχο για κάθε κυτταρική γραμμή.

Η

κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με 100 μΜ Cyt D για 12 ώρες (Α) ή 0-400 ηΜ Jasplakinolide (JP) για 12 ώρες. (Β) και τα προϊόντα λύσης στυπώθηκαν για Ε-καδερίνη και β-ακτίνης. (Γ) RhoA GTP και το συνολικό επίπεδο RhoA προσδιορίστηκαν σε κύτταρα MCF-7 σε κατεργασία με 100 μΜ Cyt D για 12 ώρες. ***

σ

& gt? 0.001? σε σχέση με τον έλεγχο. (D) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν με κυρίαρχο-αρνητικό (DN), άγριου τύπου (WT) και κυρίαρχο-ενεργός (DA) RhoA για 48 ώρες μετά από την οποία τα λύματα των κυττάρων ανιχνεύθηκαν για c-myc, Ε-καδερίνης και β- ακτίνη. κύτταρα (Ε) Τα μη MCF-7 ή MCF-7 κυττάρων που επιμολύνθηκαν με κυρίαρχο δραστικό RhoA ενεργός υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μΜ Cyt D για 12 ώρες και προϊόντα κυτταρικής λύσης ανιχνεύτηκαν για c-myc, Ε-καδερίνης και β-ακτίνης.

(α) ΗΤ-1080 και Hs27 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με διάφορες συγκεντρώσεις Cyt D (0, 50, 100, 200 μΜ) και 1% DMSO ως ένας έλεγχος του οχήματος και προϊόντα λύσης κυττάρου κηλιδώθηκε για Ε-καδερίνης , Ν-cadherin, βιμεντίνη και β-ακτίνης. (Β) Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης, τα κύτταρα επιστρώνονται σε ένθετα κυτταρικής 8 μΜ για 4-6 ώρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Cyt D για 12 ώρες και ο αριθμός των κυτταρικών μεταναστεύουν μέσω του φίλτρου μετρήθηκαν. (Γ) Για την εκτίμηση κυτταροτοξικότητας του Cyt D, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Cyt Α για 10 ώρες. WST-1 αντιδραστηρίου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και μετά από δύο ώρες η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. *

σ

& gt? 0,05, **

σ

& gt? 0,01 και ***

σ

& gt? 0.001? κύτταρα κατεργασμένα DMSO σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα? Cyt D επεξεργασμένα κύτταρα σε σχέση με DMSO επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Αποτελέσματα

Ο παράγων αποπολυμερισμού ακτίνης cyt D προκαλεί κυτταρική συρρίκνωση και ΚΟΑ

Προηγουμένως αναφέρθηκε ότι μειώνεται κυτταροσκελετού ακτίνης δυναμική την εξάντληση του ψευδοποδίου εμπλουτισμένου AHNAK, Septin 9, eIF4E και S100A11 στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης και της απώλειας των δεικτών μεσεγχυματικών Ν-καδερίνης και βιμεντίνης, ουσιαστικά αντιστρέφοντας επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [ ,,,0],18]. Για να καθοριστεί εάν μεταβάλλοντας τη δυναμική κυτταροσκελετού της ακτίνης θα μπορούσε να επηρεάσει άμεσα ΕΜΤ αντιμετωπίσαμε έξι μεταστατικό καρκίνο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (προστάτη Du145, του μαστού MDA-MB-231 και ΜΒΑ-ΜΒ-435, γλοίωμα U251 και U87 και ινοσάρκωμα HT-1080) με τον αποπολυμερισμό της ακτίνης παράγων Cyt D. Τα κύτταρα εκτίθενται σε Cyt D (100 μΜ) για 12 ώρες έδειξαν μειωμένο μέγεθος και χρωματίστηκαν θετικά για Ε-καδερίνης (Εικ. 1Α). Du145, MDA-MB-435, ΗΤ-1080 και U87 κύτταρα έδειξαν συνδετική εντόπιση της Ε-καδερίνης, ενώ U251 και MDA-231 κύτταρα παρουσίασαν περισσότερο ενδοκυτταρική Ε-καδερίνης εντοπισμού (Εικ. 1Α). Αυξανόμενες συγκεντρώσεις Cyt D από 10 έως 200 μΜ είχε ως αποτέλεσμα την προοδευτική συρρίκνωση των κυττάρων και μειωμένη F-ακτίνη περιεχόμενο, ανιχνεύεται με φθορίζουσα επισήμανση με Alexa-568 φαλλοϊδίνη και ποσοτική ανάλυση με Cellomics ArrayScan VTI αυτοματοποιημένη απεικονίσεως φθορισμού (Εικ. 1Β).

Υψηλότερες συγκεντρώσεις του Cyt D αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και οδήγησε σε απώλεια των δεικτών μεσεγχυματικών βιμεντίνη και Ν-καδερίνης σε όλες τις έξι κυτταρικές γραμμές (Εικ. 2Α). Η πιο έντονη επίδραση παρατηρήθηκε σε 100 και 200 ​​μΜ Cyt D και συνοδεύτηκε από αυξημένη Ε-καδερίνης mRNA, προσδιορίστηκε με qPCR, στις περισσότερες κυτταρικές γραμμές, αν και σε μικρότερο βαθμό σε κύτταρα ΗΤ-1080 και όχι σε MDA-MB-231 (Εικ. 2Β). Η χρονική πορεία της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης και επαγωγή mRNA σε απόκριση προς 100 μΜ Cyt D ποικίλλει μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Για Du145, U251, MDA-MB-435 και, σε μικρότερο βαθμό U87, η έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης προκλήθηκε στις 2 ώρες και σχετίζεται με αυξημένη E-cadherin mRNA (Εικ. 3). MDA-MB-231 και ΗΤ-1080 κύτταρα έδειξαν μικρή ή καθόλου έκφραση της Ε-καδερίνης στο επίπεδο του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης προκλήθηκε μόνο μετά από 8-10 ώρες (Εικ. 3). Ως εκ τούτου, Actin αποπολυμερισμό με Cyt D οδηγεί σε αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης σε αμφότερα τα επίπεδα πρωτεΐνης mRNA με επαγωγή του mRNA Ε-καδερίνης που σχετίζονται με πιο ταχεία επαγωγή της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης.

Smad1 /2/3 και SNAI1 είναι παράγοντες μεταγραφής του οποίου πυρηνική έκφραση συνδέεται με EMT [19] και εντοπίζονται στον πυρήνα στα μεταστατικά κύτταρα που μελετήθηκαν [18]. Θεραπεία των κυττάρων MDA-MB-231 κυττάρων με 10 μΜ Cyt D είχε σαν αποτέλεσμα τη δραματική αναδιανομή του SNAI 1 και SMAD1 /2/3 στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 4 Α). Παρόμοια ανακατανομή Cyt D-εξαρτώμενη των δύο αυτών παραγόντων μεταγραφής ΕΜΤ-συνδέονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα παρατηρήθηκε για όλα τα έξι μεταστατικές κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν (σχ. 4 Β).

Actin αποπολυμερισμό ρυθμίζει RhoA

ενεργοποίηση

επομένως Διατάραξη του κυτταροσκελετού της ακτίνης επάγει επιθηλιακή μετάβαση στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε το ρόλο της ακτίνης δυναμικής του κυτταροσκελετού στην EMT σε επιθηλιακά, μη μεταστατικό MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού τα οποία εκφράζουν Ε-καδερίνης και έχουν καλά χαρακτηρισμένο ως μοντέλο για ΕΜΤ σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [20]. Όπως παρατηρήθηκε για το μεταστατικό κυτταρικές σειρές, επεξεργασία των κυττάρων MCF-7 με Cyt D προκαλούμενη αυξημένα επίπεδα Ε-καδερίνης (Εικ. 5 Α). Σε αντίθεση, η σταθεροποίηση του κυτταροσκελετού της ακτίνης με νανομοριακές συγκεντρώσεις του jasplakinolide, μειωμένα επίπεδα Ε-καδερίνης (Εικ. 5 Β). δυναμική ακτίνη επομένως επιπτώσεις Ε-καδερίνης έκφραση σε κύτταρα MCF-7. Ενεργοποιημένος RhoA πυροδοτεί ΕΜΤ [4,5,9] και επαγωγή Ε-καδερίνης με μειωμένα επίπεδα κατεργασία Cyt D της ενεργού RhoA σε κύτταρα MCF-7 (Σχ. 5C). Σταθερά, επιμόλυνση των κυττάρων MCF-7 με κυρίαρχο δραστικό ενεργό μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης RhoA ενώ επιμόλυνση με κυρίαρχο-αρνητικό RhoA αυξημένη Ε-καδερίνης έκφραση (Σχ. 5D). Επιπλέον, σε κύτταρα που εκφράζουν κυρίαρχη ενεργή RhoA, Cyt D δεν είναι πλέον επηρέασε τα επίπεδα Ε-καδερίνης (Εικ. 5 Ε). κατάσταση ενεργοποίησης RhoA κατάντη της ακτίνης δυναμική κυτταροσκελετού αποτελεί βασικό ρυθμιστή της έκφρασης Ε-καδερίνης σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα.

Cyt D δεν επάγει ΚΟΑ σε φυσιολογικούς ινοβλάστες

Για να ελέγξετε το καρκινικό κύτταρο ιδιαιτερότητα των Cyt D επαγωγή της Ε-καδερίνης, υποβάλλαμε σε αγωγή κύτταρα ΗΤ-1080 ινοσαρκώματος και το κανονικό ανθρώπινο Hs27 κυτταρική σειρά ινοβλαστών με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cyt D (50, 100 και 200 ​​μΜ), καθώς και με 1% DMSO, ως έλεγχος του οχήματος, για 12 ώρες. Όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως, η θεραπεία με Cyt D οδηγεί στην επαγωγή της Ε-καδερίνης σε ΗΤ-1080 με ταυτόχρονη απώλεια της Ν-καντερίνης και βιμεντίνης στα 50 μΜ Cyt D. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με Cyt D επί Hs27 δεν επηρέασε Ε-καδερίνης, Ν-καντερίνη ή έκφραση vimentin γεγονός που υποδηλώνει ότι Cyt D επαγωγή της ΚΟΑ είναι ειδικά για καρκινικά κύτταρα (Εικ. 6Α). Η θεραπεία με 10 μΜ Cyt D μείωσε σημαντικά τόσο τη μετανάστευση των ΗΤ1080 και των κυττάρων Hs27 σε σχέση με το DMSO 1% που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος οχήματος (Σχ. 6Β) υποδηλώνοντας ότι η μετανάστευση κυττάρου είναι περισσότερο ευαίσθητη σε διάσπαση ακτίνης του κυτταροσκελετού. προσδιορισμοί κυτταροτοξικότητας έδειξαν ότι Cyt D ήταν τοξικό για τα κύτταρα στα 100 και 200 ​​μΜ, αλλά όχι στα 10 και 50 μΜ, σε σύγκριση με 1% DMSO (Εικ. 6C).

Συζήτηση

οργάνωση ακτίνη είναι κρίσιμες για διάφορες κυτταρικές διεργασίες όπως η κυτταρική κινητικότητα, την κυτταρική διαίρεση, την κίνηση οργανίδιο, κυτταρική σηματοδότηση και την δημιουργία και τη διατήρηση των κυτταρικών κόμβων και το σχήμα των κυττάρων [21,22]. Κατά τη διάρκεια της EMT, οι αλλαγές στην οργάνωση της ακτίνης παρατηρήθηκε και η έκφραση πολλών ακτίνης ρυθμιστικών γονιδίων ρυθμίζεται προς τα πάνω [3,7,10,11,12,13,14]. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι η απώλεια της πρωτεΐνης συστατικών της ακτίνης πλούσια ψευδοπόδια των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μεταβάλλει τη δυναμική κυτταροσκελετού της ακτίνης, μειώνει το μέγεθος των κυττάρων και επάγει την έκφραση Ε-καδερίνης και ΜΕΤ [18]. Εδώ δείχνουμε ότι ένας παράγοντας ακτίνης αποπολυμερισμού, Cyt D, μειώνει το μέγεθος και το σχήμα των κυττάρων, αδρανοποιεί RhoA και επάγει την έκφραση της Ε-καδερίνης, ορίζει την ακτίνη κυτταροσκελετό ως ανάντη ρυθμιστή της ΕΜΤ στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η επαγωγή του ΜΕΤ μέσω της απώλειας ψευδοποδίου εμπλουτισμένου πρωτεΐνες AHNAK, Septin-9, eIF4E και S100A11, συσχετίστηκε με την απώλεια του F-ακτίνης και αυξημένη σταθερότητα του υπολειμματικού F-ακτίνης ίνες [18] . Σημαντικά, Cyt D δεν προκάλεσε ΜΕΤ σε κανονικούς ινοβλάστες γεγονός που υποδηλώνει ότι οι επιδράσεις αυτές είναι ειδικά για καρκινικά κύτταρα. Είτε η επαγωγή πληρούνται από αποπολυμερισμού ακτίνης σχετίζονται ειδικά με διάσπαση του κυττάρου όγκου ψευδοπόδια μένει να καθοριστεί.

Κυτταροπλασματικά αλληλεπίδραση τομέα της Ε-καδερίνης με σύμπλοκα προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου α και β-κατενίνης σχηματισμού στερεωμένο στο ακτίνη κυτταροσκελετό είναι κρίσιμη για την καθιέρωση του ομοτυπικής κόμβων κυττάρου-κυττάρου [23]. Έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία κυττάρων με υψηλότερες συγκεντρώσεις του Cyt D μειώνει τη διαπερατότητα των κυττάρων και σταθεροποιεί σφιχτών συνδέσεων [24]. Αποδείχθηκε περαιτέρω ότι η συναρμολόγηση του σφιχτά οδηγεί διασταύρωση προς επαγωγή Ε-καδερίνης υποδηλώνοντας ότι η σταθεροποίηση και ο σχηματισμός αυτών των κόμβων ρυθμίζουν Ε-καδερίνης επίπεδα έκφρασης [25]. Νωρίτερα είχε επίσης δείξει ότι η αποπολυμερισμού ακτίνης με Cyt Β και latrunculin Α επάγει την έκφραση Ε-καδερίνης επιφάνεια και μειωμένη Ν-καδερίνης και έκφραση βιμεντίνη σε βcells αρουραίου [26]. Η θεραπεία με Cyt D έχει επίσης αποδειχθεί ότι μειώνει βιμεντίνη έκφραση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [27]. Στη μελέτη μας, η θεραπεία των κυττάρων με Cyt D επάγει την έκφραση Ε-καδερίνης σε όλες τις έξι μεταστατικές κυτταρικές γραμμές και επίσης μειώνει δραματικά το μέγεθος των κυττάρων και το σχήμα (Σχ. 1, 2). Η θεραπεία με Cyt Α αύξησε σημαντικά το επίπεδο μεταγράφου Ε-καδερίνης σε όλες εκτός MDA-231 κύτταρα υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση κυτταροσκελετού της ακτίνης των επιπέδων Ε-καδερίνης συμβαίνει στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Σημαντικά, μια πιο ταχεία επαγωγή Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε σε κύτταρα που έδειξε επίσης αυξημένα επίπεδα Ε-καντερίνης mRNA που ορίζει ένα κρίσιμο ρόλο για de ηονο Ε-καδερίνης βιοσύνθεσης σε ΜΕΤ. Πράγματι, αυξημένα επίπεδα Zeb2, ένας μεταγραφικός καταστολέας της E-cadherin, ρυθμίζει προς τα κάτω E-cadherin τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης και προκαλεί EMT [28].

Αν και παρατηρήθηκε η πιο ισχυρή επαγωγή της ΚΟΑ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις του Cyt D (100 και 200 ​​μΜ) που συνδέονται με την τοξικότητα των κυττάρων 10-20%, παρατηρήθηκε με συνέπεια την επαγωγή της ΚΟΑ στις 50 μΜ Cyt D, ότι δεν συνδέθηκε με σημαντική τοξικότητα κυττάρου και, σε MDA-231 κύτταρα , στα 10 μΜ Cyt D. η μετανάστευση των κυττάρων αναστάλθηκε σε 10 μΜ Cyt D και οι υψηλότερες συγκεντρώσεις Cyt Α που επάγεται ΜΕΤ επίσης σχετίζεται με αυξημένη αναστολή της μετανάστευσης και μειωμένη F-ακτίνης επίπεδα (Σχ. 1Β). Εμείς δεν τήρησε την επαγωγή της ΚΟΑ σε φυσιολογικούς ινοβλάστες Hs27 σε οποιεσδήποτε συγκεντρώσεις Cyt Α δείχνει ότι η επαγωγή των επιθηλιακών δεικτών με αποπολυμερισμό ακτίνης είναι καρκινικό κύτταρο ειδικό. Ως εκ τούτου, πιο κυτταρικής μετανάστευσης είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στις αποπολυμερισμού ακτίνης από την αντιστροφή της EMT γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δύο αυτές ακτίνης που βασίζονται σε κυτταρικές αποκρίσεις ρυθμίζονται διαφορικά από κυτταροσκελετού της ακτίνης.

ενεργοποίηση RhoA μπορεί να ξεκινήσει EMT με την προώθηση της E-cadherin υποβάθμιση [4 , 5,6,9,29]. Σταθερά, παρατηρήσαμε ότι η ενεργοποίηση RhoA συνδέεται με μειωμένα επίπεδα Ε-καδερίνης. Ωστόσο, οι εκθέσεις δείχνουν ότι η μειωμένη δραστηριότητα RhoA απαιτείται για την EMT σε καρκίνωμα του παχέος εντέρου εξέλιξη [30]. Σε αντίθεση με μια προηγούμενη μελέτη που ανέφεραν την ενεργοποίηση των RhoA με επεξεργασία Cyt Α στην ελβετική 3Τ3 ινοβλάστες [31] παρατηρήθηκε μειωμένη δραστηριότητα RhoA στα κύτταρα μη μεταστατικό MCF-7 μετά τη θεραπεία Cyt Α, το οποίο συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης (Εικ . 5). Οι αντιθέσεις παρατηρήσεις μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν, ινοβλάστες vs επιθηλιακά κύτταρα MCF-7, ή τις υψηλότερες συγκεντρώσεις και μεγαλύτερους χρόνους επώασης που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας. Πράγματι, στην αγωγή της μελέτης τους ήταν για 6 ώρες με 0.5μg /ml (1 μΜ), σε αντίθεση με ολονύκτια επεξεργασία μας με 100 μΜ Cyt D, και αυξημένη ενεργοποιημένα RhoA παρατηρήθηκε για τις πρώτες 3 ώρες μόνο μετά την οποία υπήρξε μια μείωση στην ενεργοποιείται επίπεδα RhoA. Ως εκ τούτου, μειωμένη δραστηριότητα των RhoA που δραστηριοποιούνται στα κατάντη της απο-πολυμερισμού της ακτίνης επάγει την έκφραση Ε-καδερίνης και ΚΟΑ. Το γεγονός ότι Cyt D δεν αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με κυρίαρχη ενεργή RhoA υποδεικνύει ότι RhoA ενεργεί κατάντη της αναδιαμόρφωσης ακτίνης για τη ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης (Εικ. 5) και τη διαδικασία EMT. Η επεξεργασία των κυττάρων MCF-7 με jasplakinolide μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης υποδεικνύοντας ότι πολυμερισμού της ακτίνης και αποπολυμερισμό γεγονότα έχουν αντίθετα αποτελέσματα επί EMT. Είναι ενδιαφέρον, Cyt D επίδραση φάνηκε ειδικά για καρκινικά κύτταρα που υποδηλώνει ότι οι μικρές ρυθμιστικές μόριο του κυτταροσκελετού της ακτίνης θα μπορούσε να αναπτυχθεί δυνητικά όσο το δυνατόν θεραπευτικών παραγόντων.

Κανονισμός της δυναμικής της ακτίνης από φαρμακολογικών παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την έκφραση των δεικτών EMT, που καθορίζει η κρίσιμο ρόλο της δυναμικής ακτίνης σε EMT και υποδηλώνει ότι φαρμακολογική διαμόρφωση της δυναμικής της ακτίνης αντιπροσωπεύει μια έγκυρη προσέγγιση για τη στόχευση EMT στον καρκίνο. Η in vivo χρήση των διαμορφωτών της ακτίνης όπως cytochalasins, latrunculins, jasplakinolide και άλλους για τη θεραπεία του καρκίνου έχει περιορισθεί από καταδειχθεί παρενέργειές τους και την απουσία κατάλληλου συστήματος παράδοσης για στοχευμένη παράδοση σε κύτταρα όγκου [32,33]. Ωστόσο πρόσφατα δείχθηκε ότι Cyt D ενθυλακωμένο σε λιποσώματα PEG βελτίωσε τη διαλυτότητα και τη βιοδιαθεσιμότητα του Cyt D και επάγεται ισχυρά αντικαρκινικά αποτελέσματα σε μοντέλα ποντικού [34]. Προσδιορισμός των άλλων ενώσεων που μπορεί να προκαλέσει ΚΟΑ πιο συγκεκριμένα μπορεί να αντιπροσωπεύουν εναλλακτικές προσεγγίσεις για τη στόχευση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον καρκίνο.