Αφηρημένο

γαστρικός καρκίνος είναι μια σημαντική αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στους άνδρες και στις γυναίκες. Οι υποδοχείς του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα είναι EGFR, HER2, HER3 και HER4. Από τις τέσσερις υποδοχείς του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, EGFR και HER2 είναι γνωστά ογκογονίδια που εμπλέκονται στον καρκίνο του στομάχου. Μικρή, όμως, είναι γνωστή για το ρόλο που διαδραματίζουν οι HER3 και HER4 σε αυτή την ασθένεια. Λάβαμε ζεύγη δειγμάτων από τον όγκο και τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή που υφίσταται χειρουργείο για καρκίνο του στομάχου. Χρησιμοποιώντας RT-qPCR, εμείς ποσοτικοποιηθεί η έκφραση του mRNA των τεσσάρων υποδοχέων συμπεριλαμβανομένων των ισομορφών συρραφής HER4 και όλα τα προσδέματα ενεργοποίησης αυτών των υποδοχέων. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, η έκφραση της πρωτεΐνης του HER4 επίσης ποσοτικά. Βρήκαμε ότι η έκφραση HER2 mRNA ρυθμίζεται αυξητικά στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό συμφωνημένα (p = 0,0520). Όλες οι συνδέτες με συγγένεια για EGFR είχαν ρυθμίζεται προς τα πάνω, ενώ η έκφραση του EGFR ήταν αμετάβλητη. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε την έκφραση του mRNA του HER4 (p = 0,0002) και συνδέτη NRG4 του (p = 0,0009) που πρόκειται να ρυθμίζεται προς τα κάτω στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό συμφωνημένα. HER4 μειορρύθμιση καταδείχθηκε για όλα τα εναλλακτικά ματισμένες ισομορφές αυτού του υποδοχέα. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τη συμμετοχή των EGFR και HER2 στον καρκίνο του στομάχου και του προτείνουν μια ενδιαφέρουσα συσχέτιση της μειωμένης έκφρασης HER4 με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Nielsen ΝΑ, Friis-Hansen L, Poulsen SS, Federspiel Β, Sorensen BS (2014) Έκφραση του ΕΤΠ Οικογένεια στο γαστρικό καρκίνο: η ελαττωμένη HER4 και Ενεργοποίηση ρίζας NRG4 του. PLoS ONE 9 (4): e94606. doi: 10.1371 /journal.pone.0094606

Επιμέλεια: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Ιούλη, 2013? Αποδεκτές: 19 Μάρτη 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Nielsen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Δανικά Καρκίνου Κοινωνία # R2-A247-09-S2, της Δανίας MRC #FSS 09072153. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους για τους άνδρες και την πέμπτη συχνότερη αιτία στις γυναίκες. Γαστρικό καρκίνο αντιπροσώπευαν περίπου 990.000 νέες καταγεγραμμένες υποθέσεις και 738.000 θανάτους παγκοσμίως το 2008 [1]. Η μόλυνση με το

Helicobacter pylori

, τη διατροφή, το κάπνισμα και η κατανάλωση αλκοόλ αποτελούν καθοριστικούς παράγοντες που επηρεάζουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στομάχου [2], [3].

Η επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) οικογένεια είναι ένα σύνθετο δίκτυο των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης και συνδέτες που αλληλεπιδρούν για να προκαλέσει διάφορες καταρράκτες σηματοδότησης. Η οικογένεια περιλαμβάνει τις τέσσερις υποδοχείς EGFR (HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3), και HER4 (ErbB4) [4]. Με εναλλακτικό μάτισμα, HER4 εκφράζεται σε έναν αριθμό ισομορφών. Στην τη juxtamembraneous περιοχή του HER4, συμπερίληψη είτε εξόνιο 15b ή εξόνιο 16 αποτελέσματα στις ισομορφές JMA ή JMB, αντίστοιχα [5] – [7]. Η ισομορφή JMA και όχι η ισομορφή JMB μπορεί να υποστεί επεξεργασία για να απελευθερώσει ένα διαλυτό HER4 ενδοκυτταρική περιοχή (ICD) που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα, τα μιτοχόνδρια και [8], [9]. Το εναλλακτικό μάτισμα στην κυτταροπλασματική περιοχή του HER4 δίνει λαβή για τις ισομορφές CYT1 και CYT2. Παράκαμψη του εξωνίου 26 καταλήγει σε ένα υποδοχέα (CYT2) λείπουν 16 από τα αμινοξέα του υποδοχέα πλήρους μήκους (CYT1) [10].

Οι συνδετήρες της οικογένειας EGF είναι επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF), μετασχηματιστικό αυξητικό παράγοντα-α (ΤΟΡ-α), αμφιρεγουλίνη και (AR) που είναι ειδικά για EGFR? σύνδεσης με ηπαρίνη EGF αυξητικό παράγοντα (ΗΒ-EGF), betacellulin (BTC), και επιρεγουλίνη (EPR) τα οποία δεσμεύουν τόσο EGFR και HER4? νεουρεγκιουλίνης 1 (NRG1) και NRG2 που δεσμεύουν τόσο HER3 και HER4? και τέλος NRG3 και NRG4 που είναι ειδικά για HER4 [11]. Όταν δεσμεύουν την ενεργοποίηση συνδέτη, οι υποδοχείς κάνουν ομο- και ετερο-διμερή. Η σύνθεση των εταίρων διμερισμού και προσδέματα ενεργοποίησης προσδιορίζει το σήμα που πρόκειται να υποστεί μεταγωγή στο εσωτερικό του κυττάρου [12], [13]. Η οικογένεια EGFR παίζει διάφορους ρόλους στην ανάπτυξη και τη συντήρηση των πολυάριθμους ιστούς, μεταξύ άλλων με τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης, απόπτωση, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση. Απορρύθμιση της σηματοδότησης από αυτό το σύστημα είναι συνδεδεμένο με την ανάπτυξη και την αύξηση των καρκίνων [14] – [17]

EGFR και HER2 είναι γνωστά ογκογονίδια σε γαστρικό καρκίνο [18], [19].. Το HER2 αναστολή trastuzumab αντίσωμα βελτιώνει επιτυχώς πρόγνωση όταν προστίθεται στο σχήμα χημειοθεραπείας σε ασθενείς με HER2-θετικό προχωρημένο γαστρικό καρκίνους [20]. Ένας αριθμός κλινικών μελετών έχουν επίσης διεξαχθεί για να δοκιμαστεί η δυνατότητα χρησιμοποίησης των αναστολέων EGFR σε γαστρικό καρκίνο [21], [22]. HER3 και HER4 θα μπορούσαν ενδεχομένως επίσης να είναι σημαντική στην αιτιολογία του καρκίνου του στομάχου? Ωστόσο, πληροφορίες σχετικά με τους ρόλους τους σε αυτή την ασθένεια είναι αραιή. Πράγματι, λίγα είναι γνωστά για το πρότυπο έκφρασης του πλήρους συστήματος ΕΤΠ. Λόγω της διαδραστικής φύσης των υποδοχέων EGF και συνδέτες, αποσαφήνιση των μηχανισμών ρύθμισης των EGF μέλη της οικογένειας απαιτήσεις λαμβάνοντας υπόψη όλους τους υποδοχείς και συνδέτες τους μαζί.

Για να διερευνήσουν το πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων EGF και συνδετήρων σε γαστρικό καρκίνο, λάβαμε ιστός από τον όγκο και τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή που υφίσταται χειρουργείο για καρκίνο του στομάχου. Χρησιμοποιήσαμε ζεύγη δειγμάτων ιστού για την εξασφάλιση έναντι του ενδο-ατομική διακύμανση που υπάρχει στη βασική έκφραση του συστήματος ΕΤΠ. Χρησιμοποιώντας RT-qPCR, έχουμε ποσοτικά την έκφραση του mRNA των τεσσάρων EGF υποδοχείς συμπεριλαμβανομένων των ισομορφών συρραφής HER4 και τους συνδετήρες ενεργοποιώντας αυτούς τους υποδοχείς.

Υλικά και Μέθοδοι

επιλογή των ασθενών και η συλλογή των βιοψιών

σε αυτή τη μελέτη κοόρτης, 38 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για αδενοκαρκίνωμα του κόμβου του στομάχου, του οισοφάγου ή της γαστροοισοφαγικής είχαν διαδοχικά συμπεριληφθεί από τον Ιούλιο του 2008 έως το Νοέμβριο του 2009. Όλα τα άτομα που παρέχεται τεκμηριωμένη έγγραφη συγκατάθεση. Η συλλογή των βιοψιών εγκρίθηκε από τις περιφερειακές επιτροπές δεοντολογίας της επιστήμης των Ζηλανδία, Δανία (αριθμός περιοδικό H-Β-2008-049), και η δημιουργία μιας βιοτράπεζας εγκρίθηκε από την Υπηρεσία Προστασίας της Δανίας δεδομένων (αριθμός περιοδικό 2008-41-2138). Βιοψίες ελήφθησαν τόσο από ιστό όγκου και του παρακείμενου κανονικού ιστού. Όλα τα δείγματα βιοψίας αξιολογήθηκαν από έναν έμπειρο παθολογοανατόμο για την επικύρωση της διάγνωσης. Προκαθορισμένα κλινικά δεδομένα προήλθαν από ιατρικές διαγράμματα και τις εκθέσεις παθολογίας. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών που δίνονται στον Πίνακα 1.

Η

RNA εξόρυξη

Οι βιοψίες τοποθετήθηκαν σε RNA

αργότερα

(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) αμέσως μετά την απομάκρυνση. RNA

αργότερα

απομακρύνθηκε πριν από την απομόνωση RNA, και προστέθηκε ΤπζοΙ (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Τα δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν σε Tissuelyser (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). RNA από ιστό απομονώθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την απομόνωση του RNA ΤπζοΙ (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Οι συγκεντρώσεις RNA μετρήθηκαν σε NanoDrop ND-1000 Φασματοφωτόμετρο. της ποιότητας του RNA ελέγχθηκε σε 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης (RT-Q-PCR)

cDNA συντέθηκε από 1 μα ολικού RNA με τη χρήση υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Η τελική αντίδραση αραιώθηκε σε συνολικό όγκο 200 μλ

1 μΙ cDNA χρησιμοποιήθηκε για qPCR χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο κύριο μίγμα (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) επί ενός LightCycler Roche 480 στο:. 95 ° C, 10 λεπτά? 50 κύκλοι των 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, συγκεκριμένη θερμοκρασία ανόπτησης για 10 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 5 sec? 99 ° C για 1 δευτερόλεπτο? 59 ° C για 15 δευτερόλεπτα? 95 ° C για 1 δευτερόλεπτο? ψύξη στους 40 ° C. Primer ακολουθίες και οι θερμοκρασίες ανόπτησης δίνονται στον Πίνακα 2.

Η

Το γονίδιο καταλληλότερο για ομαλοποίηση προσδιορίστηκε με την εφαρμογή του αλγορίθμου Normfinder [23] για τις ποσοτικοποιημένες συγκεντρώσεις GAPDH, β-ακτίνη, YWHAZ, SDHA και HMBS. SDHA αποδείχθηκε ότι ήταν το καλύτερο από τα πέντε. Δύο δείγματα εξαιρέθηκαν από τις αναλύσεις λόγω μη ανίχνευση του mRNA από οποιοδήποτε από τα γονίδια αναφοράς.

ανοσοχρώση

ιστούς παραφίνης μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη παραφορμαλδεϋδη από 13 αντιπροσωπευτικές ασθενείς ερευνήθηκαν ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας c-erbB-4 /, πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού-4 HER αραιωμένο 1/50 σαν το πρωτογενές αντίσωμα (RB-9045-P1, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Για τα τμήματα ανάκτησης αντιγόνου έβρασαν σε φούρνο μικροκυμάτων σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό, ρΗ 6.0. Η ανοσοαντίδραση οπτικοποιήθηκε με αντίσωμα αντι-κουνελιού βιοτινυλιωμένο κατσίκας αραιωμένου 1/200 (BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), που ακολουθείται από ένα προσχηματισμένο αβιδίνη και βιοτινυλιωμένη ραφανιδική υπεροξειδάση μακρομοριακό σύμπλοκο (ABC) αραιωμένο 1/100 (Κωδικός nr. PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Η αντίδραση αναπτύχθηκε με τη χρήση 3,3 -diaminobenzidine και αντιχρωματισμός διεξήχθη με Hemalum Mayer του. Ως αρνητικός έλεγχος, η ίδια διαδικασία διεξήχθη χωρίς πρωτογενές αντίσωμα.

Χρησιμοποιώντας Image Pro Plus (MediaCybernetics) Η ένταση χρώσης των αντιπροσωπευτικών εικόνων του όγκου έναντι του περιβάλλοντος ιστού βλεννογόνου εκτιμήθηκε. Δύο εικόνες του δείγματος όγκου και δύο εικόνες των γύρω βλεννογόνου συλλέχθηκαν από κάθε δείγμα ιστού και ο μέσος όρος των δύο τιμών υπολογίστηκε και χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση και αποτύπωση. Για μερικά δείγματα, μόνο ιστό του όγκου ή μόνο φυσιολογικού βλεννογόνου ήταν παρών και ήταν δυνατόν να γίνει σύγκριση της έκφρασης HER4 για αυτούς τους ιστούς. Paired t-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν η ένταση των ιστών όγκου ήταν διαφορετική από την ένταση των ιστών βλεννογόνου.

Αποτελέσματα

έκφραση του mRNA των υποδοχέων EGF σε γαστρικό καρκίνο

RNA που εξάγεται από 38 όγκους και αντίστοιχα δείγματα από το γειτονικό φυσιολογικό ιστό από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για καρκίνο του στομάχου χρησιμοποιήθηκε για RT-qPCR ποσοτικοποιήσεις. Η έκφραση του mRNA των τεσσάρων οικογένεια EGF υποδοχείς EGFR, HER2, HER3 και HER4 απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Είναι ενδιαφέρον ότι ο υποδοχέας HER4 υποβλήθηκε σε αρνητική ρύθμιση στον καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό (p = 0,0004). Για HER2, είδαμε μια προς τα πάνω ρύθμιση αυτού του υποδοχέα στον καρκινικό ιστό που ήταν πολύ κοντά στο να είναι σημαντική (ρ = 0,0520). EGFR και HER3 έκφραση mRNA ήταν un-άλλαξε στους όγκους σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό.

Όλες οι συγκεντρώσεις mRNA έκφραση είναι αυθαίρετες και αντιπροσωπεύουν την αναλογία της έκφρασης mRNA του γονιδίου στόχου διαιρούμενη με την έκφραση του mRNA του γονιδίου αναφοράς SDHA. έκφραση mRNA ποσοτικοποιήθηκε σε βιοψίες όγκου από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και του ζευγαρωμένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή. Οι τιμές P υπολογίζονται με βάση ένα paired t-test.

Η

HER4 υπάρχει ως διαφορετικά εναλλακτικά συγκολλημένα ισομορφές. Η juxtamembranous περιοχή μπορεί να αποτελούνται είτε από JMA ή JMB, και η κυτταροπλασματική περιοχή μπορεί να αποτελούνται είτε από CYT1 ή CYT2. Η προς τα κάτω ρύθμιση που παρατηρείται για τη συνολική έκφραση HER4 mRNA σε καρκινικό ιστό εφαρμόζεται σε όλες τις τέσσερις παραλλαγές του υποδοχέα (Εικόνα 2).

Όλες οι συγκεντρώσεις mRNA έκφραση είναι αυθαίρετες και αντιπροσωπεύουν την αναλογία της έκφρασης mRNA του γονιδίου στόχου διαιρούμενη με έκφραση του mRNA του γονιδίου αναφοράς SDHA. έκφραση mRNA ποσοτικοποιήθηκε σε βιοψίες όγκου από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και του ζευγαρωμένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή. Οι τιμές Ρ υπολογίζονται με χρήση ενός αντίστοιχου t-test.

Η

Για να φανεί καλύτερα το μέγεθος της HER4 αρνητική ρύθμιση στον ιστό του όγκου, θα χαράσσεται η καθοδική HER4 ή προς τα άνω ρύθμιση για κάθε ασθενή ξεχωριστά. Η έκφραση HER4 mRNA στον ιστό του όγκου, μείον την έκφραση HER4 mRNA στο συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό (ΔHER4) απεικονίζεται στο Σχήμα 3. Μια τιμή μικρότερη από 0 αντιπροσωπεύει μια αρνητική ρύθμιση. Αυτό το σχήμα δείχνει καθαρά ότι HER4 προς τα κάτω ρύθμιση είναι μια πολύ γενικός μηχανισμός που λαμβάνει χώρα στην πλειονότητα των ασθενών και ανεξάρτητα από τον εντοπισμό του όγκου.

Καταρράκτη οικόπεδο που απεικονίζει τη διαφορά στη συνολική έκφραση HER4 mRNA μεταξύ του ιστού του όγκου και της κανονικής ιστού για κάθε ασθενή (ΔHER4). Η διαφορά υπολογίζεται ως η έκφραση καρκινικού ιστού μείον την κανονική έκφραση ιστού, και ως εκ τούτου, μια αρνητική τιμή αντιπροσωπεύει μια προς τα κάτω ρύθμιση στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό. Ο εντοπισμός του όγκου των μεμονωμένων ασθενών απεικονίζεται στο σχήμα.

Η

έκφραση του mRNA της οικογένειας προσδεμάτων EGF σε γαστρικό καρκίνο

ΤΟΡ-α, αμφιρεγουλίνη, EGF και προσδένονται ειδικά EGFR. Ένα αμελητέο επίπεδο έκφρασης mRNA ανιχνεύθηκε για EGF τόσο του όγκου και του φυσιολογικού ιστού, και ως εκ τούτου αυτό πρόσδεμα δεν θεωρήθηκε για περαιτέρω ανάλυση. ΤΟΡ-α και την αμφιρεγουλίνη και οι δύο προς τα πάνω ρυθμισμένη σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό (Σχήματα 4α και β). HB-EGF, betacellulin, επιρεγουλίνη και έχουν συγγένεια και για τις δύο EGFR και HER4, και όλα αυτά τα προσδέματα επίσης υπερεκφράζονται σε καρκινικούς ιστούς (σχήματα 4 c, d, και e). Στο σύνολό τους, αυτό δείχνει ότι όλοι οι συνδετήρες EGFR ενεργοποίησης απορυθμίζεται στους όγκους.

Για NRG1 και NRG2 οι εναλλακτικά ματισμένες παραλλαγές α και β συμπεριλαμβάνονται. Όλες οι συγκεντρώσεις mRNA έκφραση είναι αυθαίρετες και αντιπροσωπεύουν την αναλογία της έκφρασης mRNA του γονιδίου στόχου διαιρούμενη με την έκφραση του mRNA του γονιδίου αναφοράς SDHA. έκφραση mRNA ποσοτικοποιήθηκε σε βιοψίες όγκου από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και του ζευγαρωμένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τον ίδιο ασθενή. Οι τιμές P υπολογίζονται με βάση ένα paired t-test.

Η

Από τις νεουρεγκιουλινών, NRG1 και NRG2 δεσμεύουν τόσο HER3 και HER4. Δεν παρατηρήσαμε καμία αλλαγή στην έκφραση είτε του α ή β των παραλλαγών του NRG1 και NRG2 (σχήματα 4F, g, h και i). NRG3 και NRG4 δεσμεύουν μόνο HER4. NRG3 δεν υφίστανται καμία μεταβολή στην έκφραση από την κανονική σε καρκινικό ιστό (Εικόνα 4ι). Ωστόσο, NRG4 ήταν μειωτικά στον καρκινικό ιστό σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό (p = 0.0009) (Σχήμα 4k). Αυτό αποδεικνύει ότι τόσο HER4 και ειδικών NRG4 συνδετήρα αυτού είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο.

Για να φανεί καλύτερα το μέγεθος της NRG4 αρνητική ρύθμιση στον ιστό του όγκου, θα χαράσσεται η καθοδική NRG4 ή προς τα άνω ρύθμιση για κάθε ασθενή ξεχωριστά. Η έκφραση του mRNA NRG4 στον ιστό του όγκου, μείον την έκφραση NRG4 mRNA στο συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό (ΔNRG4) απεικονίζεται στο σχήμα 5.

Καταρράκτη οικόπεδο που απεικονίζει τη διαφορά στην έκφραση του mRNA NRG4 μεταξύ του ιστού του όγκου και του φυσιολογικού ιστού για κάθε ασθενή (ΔNRG4). Η διαφορά υπολογίζεται ως η έκφραση καρκινικού ιστού μείον την κανονική έκφραση ιστού, και ως εκ τούτου, μια αρνητική τιμή αντιπροσωπεύει μια προς τα κάτω ρύθμιση στον ιστό του όγκου σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ιστό. Ο εντοπισμός του όγκου των μεμονωμένων ασθενών απεικονίζεται στο σχήμα.

Η

Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα ασθενείς που δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση των συνολικών HER4 στον ιστό του όγκου τους, σε 82% αυτών των NRG4 επίσης ρύθμιση προς τα κάτω και στο 86% ένα ή περισσότερες από τις EGFR-shared συνδέτες (HB-EGF, επιρεγουλίνη, betacellulin) ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω. Στο 36% των ασθενών με συνολική ρύθμιση προς τα κάτω HER4, οι τρεις από τις κοινές EGFR συνδέτες ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω.

Πρωτεΐνη έκφραση της HER με ανοσοϊστοχημεία

Λόγω της μετα-μεταγραφικής κανονισμούς, τα πρότυπα έκφρασης mRNA προσδιορίστηκε με RT-qPCR μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης. Για να εξασφαλιστεί ότι η παρατηρούμενη μείωση στην έκφραση HER4 mRNA στο καρκινικό ιστό των ασθενών με καρκίνο του στομάχου αντικατοπτρίζεται επίσης στο επίπεδο πρωτεΐνης, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση για σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό από όλους τους ασθενείς που περιλαμβάνονται στη μελέτη.

με την ποσοτικοποίηση του HER4 ένταση χρώσης σε αντιπροσωπευτικές περιοχές της από όγκο και τον περιβάλλοντα ιστό, βρήκαμε την καρκινικού ιστού να έχουν σημαντικά μικρότερη ένταση χρώσης HER4 σε σύγκριση με τον περιβάλλοντα κανονικό βλεννογόνο (p = 0.0029) (Σχήμα 6) .

Η ένταση χρώσης του εκπροσώπου εικόνες του όγκου σε σχέση με τον περιβάλλοντα ιστό του βλεννογόνου εκτιμήθηκε. Δύο εικόνες του δείγματος όγκου και δύο εικόνες του φυσιολογικού βλεννογόνου συλλέχθηκαν από κάθε δείγμα ιστού και ο μέσος όρος των δύο τιμών υπολογίστηκε. τιμή Ρ υπολογίζεται με χρήση ενός αντίστοιχου t-test.

Η

Οι αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες των χρώσεις που παρουσιάζονται στο Σχήμα 7. Στην κανονική γαστρικό βλεννογόνο υπήρχε μια ισχυρή ανοσοαντίδραση HER4 (Σχήμα 7 α). Ειδικά το βασικό μέρος του κυτταροπλάσματος και της πλευρικής κυτταρική μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων της επιφάνειας ήταν έντονα ανοσοαντιδραστική για HER4 (Σχήμα 5 β). Επίσης, οι τοιχωματικά κύτταρα έδειξαν πολύ ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα HER4 (Σχήμα 7 γ και δ). Οι χιτώνας και τα μυϊκά στρώματα ήταν αρνητικές. Στα αδενικές δομές ειδικά τα τοιχωματικά κύτταρα έδειξαν πολύ ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα HER4 (Σχήματα 7 γ και δ). Αρνητικοί έλεγχοι εκτελούνται χωρίς πρωτογενές αντίσωμα προκάλεσε καμία χρώση.

Α) Κανονική γαστρικό βλεννογόνο με ανοσοαντίδραση να HER4 κυρίως στο επιφανειακό επιθήλιο, αλλά και στους αδένες. Β) Μεγαλύτερη μεγέθυνση του γαστρικού επιθηλίου. Η ανοσοαντίδραση εντοπίζεται βασεοπλευρικά στα επιφανειακά επιθηλιακά κύτταρα – τόσο ως κυτταροπλασματική μεμβράνη και χρώση. Γ) Σε αδένες η πιο έντονη χρώση παρατηρήθηκε στα τοιχωματικά κύτταρα. Αυτά τα (D)) έχουν εύκολα αναγνωρίζονται από την παρουσία ενδοκυτταρικών cannaliculi. Ε) Η κανονική βλεννογόνος με ισχυρές ανοσολογικές αντιδράσεις στο άνω μέρος του σχήματος έρχεται σε αντίθεση με τις υποκείμενες αρνητική ιστό του όγκου. Μεγεθύνσεις A × 40, Β, G × 210, C × 130, D × 600? Ε χ 20.

Η

Στα γαστρικών καρκίνων μόνο μικρές περιοχές με καρκινικά κύτταρα είχαν θετική ανοσοαντίδραση να HER4, και το αρνητικό ιστό του όγκου σε αντίθεση έντονα με την λεκιασμένη φυσιολογικό βλεννογόνο γειτονικά προς τον όγκο (Σχήμα 7) . Στα κεντρικά τμήματα του ιστού του όγκου σχεδόν όλα τα κύτταρα ήταν εντελώς αρνητική, εκτός από μικρές ομάδες κυττάρων που θα μπορούσαν να είχαν χρώση ξεχωριστή μεμβράνη.

Συζήτηση

Η οικογένεια EGF αποτελείται από ένα αλληλεπιδρώντων δίκτυο των υποδοχέων και προσδεμάτων που πρέπει να θεωρηθεί ως σύνολο να κατανοήσουν την ρύθμιση της σηματοδότησης στην οικογένεια EGF. Προσδιορίσαμε το μοτίβο ρύθμιση της οικογένειας EGF στον ιστό του όγκου από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, καθώς και την αντιστοίχιση παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από τους ίδιους ασθενείς.

βρήκαμε τα δυναμικό σηματοδότηση του EGFR που πρόκειται να απορυθμίζεται στον ιστό του όγκου μέσω προς τα πάνω ρύθμιση όλων των συνδετήρων EGFR ενεργοποίηση, και βρήκαμε επίσης προς τα πάνω ρύθμιση του HER2 στον ιστό του όγκου που ήταν πολύ κοντά στο να είναι σημαντική (ρ = 0,0520). Αυτό είναι σε καλή συμφωνία με τα υπάρχοντα δεδομένα που δείχνουν ότι και οι δύο EGFR και HER2 σχετίζονται με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο [19]. Η σημασία του HER2 στο γαστρικό καρκίνο αποδεικνύεται από το γεγονός ότι η αναστολή αντίσωμα HER2 Το Herceptin είναι το μόνο εγκεκριμένο παράγοντας για στοχευμένη θεραπεία του γαστρικού καρκίνου [24].

Για HER3, δεν παρατηρήσαμε καμία εκφραστική κανονισμού σχετικά με το επίπεδο του mRNA. Ωστόσο, λίγες μελέτες σχετικά με HER3 σε γαστρικό καρκίνο έχουν αποδοθεί ένα ρόλο για HER3 σε γαστρικό καρκίνο. HER3 έχει συσχετιστεί με φτωχή επιβίωση, και η έκφραση πρωτεΐνης θετική HER3 ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε 18,6% των γαστρικών δειγμάτων καρκίνο σε σύγκριση με μόνο το 2,0% των δειγμάτων nontumorous [25] – [27]. Δεν βρήκαμε μια υψηλότερη έκφραση HER3 σε γαστρικό καρκίνο συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό στη μελέτη μας. Ωστόσο, μία διαφορά στις μεθόδους που χρησιμοποιούνται στις μελέτες (ανοσοϊστοχημεία vs RT-qPCR) μπορεί να ευθύνονται για μερικές από τις διαφορές στα αποτελέσματα. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να περιγράψει το σχέδιο κανονισμού σε κάθε ασθενή και όχι σε μια πισίνα των ασθενών με καρκίνο και μια πισίνα των ατόμων ελέγχου, και αυτό θα μπορούσε επίσης να ευθύνονται για μια διαφορά στα αποτελέσματα που επιτεύχθηκαν στις δύο μελέτες.

Βρήκαμε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των δύο HER4 και NRG4 συνδέτη ενεργοποίησης του στον ιστό του όγκου. Τα αποτελέσματά μας ενισχύεται από το γεγονός ότι βρήκαμε επίσης μια ρύθμιση προς τα κάτω, όταν χρησιμοποιείται επιπλέον δοκιμασίες για την ποσοτικοποίηση των ειδικών ισομορφών των HER4. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, επιβεβαιώσαμε ότι η κανονική γαστρικό ιστό είναι θετική για HER4, ενώ καρκινικού ιστού έχει πολύ χαμηλή ή καθόλου χρώση HER4.

Η μειωμένη έκφραση της έκφρασης mRNA HER4 στον ιστό του όγκου μπορεί να αποδοθεί σε μείωση της αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν HER4 ή σε μια μείωση στην έκφραση HER4 σε όλα τα κύτταρα που εκφράζουν HER4. Από ανοσοϊστοχημικές χρώσεις μας, παρατηρούμε ότι στα γαστρικά καρκίνους μικρές μόνο συμπλέγματα με καρκινικά κύτταρα είχαν θετική ανοσοαντίδραση να HER4, ενώ η μεγάλη πλειοψηφία των καρκινικών κυττάρων ήταν εντελώς αρνητική. Αυτό δείχνει ότι είναι ο αριθμός των κυττάρου που εκφράζει HER4 που μειώνεται στους όγκους. Σε αντίθεση με τον ιστό του όγκου, ο κανονικός ιστός είχε πολύ ισχυρή ανοσοαντιδράσεις να HER4. Είναι ενδιαφέρον, είναι κύτταρα ειδικά βλέννα που παράγουν και υδροχλωρικό οξύ παράγει τοιχωματικών κυττάρων που εκφράζουν πρωτεΐνη HER4.

Ο ρόλος των HER4 σε καρκινικής νόσου είναι αμφιλεγόμενη. Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, RT-qPCR ποσοτικοποίηση των HER4 και συνδετήρες της δείχνουν ότι HER4 συσχετίζεται με καλύτερη επιβίωση. Ειδικότερα, η συν-έκφραση HER4 μαζί με ειδικό συνδετήρα του, NRG4, συσχετίζεται ιδιαίτερα με την καλύτερη επιβίωση [28]. Ομοίως, HER4 συσχετίζεται με καλύτερη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [29]. Σε λαρυγγική καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, HER4 χάνεται σε όγκους προχωρημένο στάδιο [30], και HER4 βρίσκεται κυρίως σε χαμηλές σταδίων και μη μεταστατικών όγκων ξενομοσχεύματος σε παγκρεατικά καρκίνο [31].

Από την άλλη πλευρά, έκφραση πρωτεΐνης HER4, όπως προσδιορίζεται με ανοσοϊστοχημεία έχει συσχετισθεί με περιφερική μετάσταση και μειωμένο ρυθμό επιβίωσης σε στοματική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [32]. Σε μια μελέτη του καρκίνου του παχέος εντέρου στην οποία το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε επίσης με ανοσοϊστοχημεία, οι ασθενείς σε πρώιμα στάδια είχαν χαμηλότερο ποσοστό HER4 υπερέκφρασης από τους ασθενείς τελικού σταδίου [33]. Σε κακοήθειες του κεντρικού νευρικού συστήματος, HER4 κατέχει επίσης ένα ρόλο προαγωγής όγκων [34], [35].

Δεν γνωρίζουμε πολλά για το ρόλο της HER4 σε γαστρικό καρκίνο. Αριθ έκφραση HER4 mRNA ανιχνεύθηκε σε δύο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου [36]. έκφραση της πρωτεΐνης HER4 όπως ανιχνεύεται με ανοσοϊστοχημεία έχει βρεθεί ότι συσχετίζεται με το πρώιμο στάδιο, χαμηλότερης ποιότητας, και απουσία μεταστάσεων λεμφαδένα σε καρκίνο του στομάχου [25]. Αυτό είναι σε πολύ καλή συμφωνία με μια άλλη μελέτη που διερεύνησε προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε μακροχρόνια επιζώντες από μεταστατικό γαστρικό καρκίνο που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία στην οποία οι συγγραφείς ανέφεραν πιθανό ρόλο των HER4 ρύθμιση προς τα άνω σε αυτούς τους ασθενείς [37]. Μαζί με παρόντα αποτελέσματα μας, αυτά τα δεδομένα δείχνουν περαιτέρω ότι HER4 σηματοδότηση έχει μια προστατευτική λειτουργία κατά την καρκινογένεση στο γαστρικό περιοχή. Μια μελέτη διαπίστωσε το γονίδιο HER4 να ενισχύονται συχνά σε καρκίνο του στομάχου [38]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των μελετών μας δείχνουν ότι αυτό δεν μεταφράζεται με το επίπεδο έκφρασης HER4 αφού βρήκαμε μια ρύθμιση προς τα κάτω των HER4 mRNA και την έκφραση της πρωτεΐνης και όχι μια ρύθμιση προς τα πάνω.

Ακόμα κι αν δεν είχαμε βρει την έκφραση του EGFR να ρυθμίζονται, το δυναμικό σηματοδότηση μέσω αυτού του υποδοχέα αυξάνεται με την προς τα άνω ρύθμιση του συνόλου συνδετήρων της. Αυτό περιλαμβάνει τους συνδέτες από κοινού με HER4: HB-EGF, betacellulin και επιρεγουλίνη. Εκτός από την αυτοκρινή ενεργοποίηση EGFR, προς τα πάνω ρύθμιση αυτών των συνδετήρων δυνητικά οδηγεί σε αυξημένη δραστηριότητα των HER4. Η ενεργοποίηση της οδού EGFR είναι πράγματι ένας τρόπος για τα κύτταρα να γίνει όλο και καρκινογόνες. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη HER4 να έχουν αντι-καρκινογόνες λειτουργίες, μια ταυτόχρονη ενεργοποίηση αυτού του υποδοχέα θα σταματήσει την πολλαπλασιαστική πλεονέκτημα της ενεργοποίησης EGFR. Θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι αυτό το δυναμικό ενεργοποίησης του HER4 αποφεύγεται με την ταυτόχρονη μειορρύθμιση του υποδοχέα και των ειδικών NRG4 συνδετήρα αυτού.

Σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, η συνδυασμένη HER4 /NRG4 μονάδα σηματοδότησης μπορεί να είναι ανασταλτική της ανάπτυξης, και η συν-έκφραση HER4 μαζί με NRG4 είναι υψηλή συσχέτιση με καλύτερη επιβίωση, αν οι δύο πρωτεΐνες δρουν μαζί και όχι χωριστά [28].

Έχουμε επίσης πραγματοποιηθεί μια ανάλυση για να συγκρίνουν την έκφραση HER4 για την επιβίωση των ασθενών. Κάναμε παρατηρούμε μια τάση προς υψηλή έκφραση HER4 που συσχετίζεται με καλύτερη επιβίωση (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται), ωστόσο, λόγω του περιορισμού του αριθμού των ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, το αποτέλεσμα αυτό δεν βρέθηκε να είναι σημαντική και περαιτέρω μελέτες θα πρέπει για να αποσαφηνιστεί εάν ένας συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης HER4 και την επιβίωση μπορεί να βρεθεί στο γαστρικό καρκίνο. Μια συσχέτιση του επιπέδου έκφρασης των υποδοχέων EGF στην παρουσία των μεταστάσεων λεμφαδένων και την διεισδυτικότητα όγκου έδειξε μόνο HER2 να συσχετίζονται αντιστρόφως με αυτές τις παραμέτρους, ενώ δεν βρέθηκε κανένας συσχετισμός για το υπόλοιπο της οικογένειας EGF (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται).

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας προτείνουν έναν νέο ρόλο για HER4 σε καρκίνο του στομάχου. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε τόσο HER4 και ειδικών NRG4 συνδέτη του να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκινικό ιστό. Αυτό συνοδεύεται από αυξημένο δυναμικό σηματοδότηση του EGFR μέσω προς τα πάνω ρύθμιση όλων συνδέτες του και μια προς τα πάνω ρύθμιση του HER2.