Abstract

σαλινομυκίνη έθεσε ελπίδα να είναι αποτελεσματική σε αντικαρκινικές θεραπείες λόγω της ικανότητάς της να υπερνικήσει απόπτωση αντίσταση σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων. Πρόσφατα, η αποτελεσματικότητά του έναντι κυττάρων καρκινώματος ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού (HCC) και τα δύο

in vitro

και

in vivo

καταδείχθηκε. Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης παραμένει ασαφής. Τελευταίες μελέτες που εμπλέκονται παρεμβολή με την οδό υποβάθμιση της αυτοφαγία. (PHH) επίσης επηρεάζονται Αυτή η μελέτη είχε σκοπό να διαπιστωθεί η επίδραση των σαλινομυκίνη για HCC-αυτοφαγία και αν πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα. Μετά την έκθεση των κυτταρικών σειρών HCC HepG2 και Huh7 σε ποικίλες συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (0-10 μΜ), διεξοδική ανάλυση των αυτοφαγικά δραστηριότητας χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και κυτταρομετρία ροής εκτελέστηκε. Τα αποτελέσματα του φαρμάκου αναλύθηκαν στις ρυθμίσεις της διέγερσης autophagy από ασιτία ή PP242-θεραπεία και συσχετίζεται με την κυτταρική βιωσιμότητα, τον πολλαπλασιασμό, επαγωγή απόπτωσης, συσσώρευση μάζας των μιτοχονδρίων και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σχηματισμός. Επιπτώσεις στην επαγωγή της απόπτωσης και τη λειτουργία των κυττάρων του PHH αναλύθηκε.

Καταστατική και τόνωσε δραστηριότητες αυτοφαγικά και οι δύο αποτελεσματικά καταστέλλεται στο HCC από σαλινομυκίνη. Αυτή η αναστολή συσχετίστηκε με δυσλειτουργικό συσσώρευση μιτοχονδρίων, αυξημένη απόπτωση και μείωση του πολλαπλασιασμού και τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Επιπτώσεις της σαλινομυκίνη τη δόση και το χρόνο που εξαρτάται και θα μπορούσε εύκολα να αναπαραχθεί από φαρμακολογικές και γενετικές αναστολή μόνη HCC-αυτοφαγία. Salinomycin έκθεση σε PHH οδήγησε σε παροδική διαταραχή της λειτουργίας του τη σύνθεση και τη βιωσιμότητα των κυττάρων χωρίς επαγωγή απόπτωσης. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι σαλινομυκίνη καταστέλλει την τελευταία στάδια της HCC-αυτοφαγία, οδηγώντας σε διαταραχή της ανακύκλωσης και τη συσσώρευση των δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων με αυξημένη ROS-παραγωγής τα οποία σχετίζονται με την επαγωγή της απόπτωσης

Παράθεση:. Klose J , Στάνκοφ MV, Kleine Μ, Ramackers W, Panayotova-Ντιμίτροβα D, Jäger MD, et al. (2014) Αναστολή της αυτοφαγικά Flux από σαλινομυκίνη Αποτελέσματα στο Αντικαρκινικό Επίδραση στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κύτταρα. PLoS ONE 9 (5): e95970. doi: 10.1371 /journal.pone.0095970

Επιμέλεια: Manlio Vinciguerra, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 10, Ιαν του 2014? Αποδεκτές: 1η Απριλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2014

Copyright: © 2014 Klose et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Heidelberger Stiftung Chirurgie και Gesellschaft der Freunde für Chirurgie (JK), KFO 250 (GB, MVS), Αναγέννηση EXC 62/1 (GB), και τα υπόλοιπα Kröner-Fresenius-Stiftung (FWRV? 2010_A49). Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν οικονομική στήριξη από την Deutsche Forschungsgemeinschaft και Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg στο πλαίσιο του προγράμματος χρηματοδότησης Open Access Publishing. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σαλινομυκίνη (Sal) είναι ένας πολυαιθέρας αντιβιοτικό ευρέως χρησιμοποιούμενο ως αντικοκκιδιακά στα πουλερικά [1] και συμπλήρωμα διατροφής σε μηρυκαστικά »και χοίρων φυλής [2], [3], λόγω αντιμικροβιακή δράση του. Πρόσφατα, το δυναμικό του Sal ως αντικαρκινικός παράγοντας έχει διευκρινιστεί [4]. Gupta et al. επέδειξε περισσότερο από 100 φορές την αποτελεσματικότητα του Sal σε σύγκριση με πακλιταξέλη για να σκοτώσει τον καρκίνο του μαστού βλαστικά κύτταρα σε ποντίκια [5]. Αργότερα, η αποτελεσματικότητα του Sal έναντι κυττάρων όγκου επαναβεβαιώθηκε σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές από διαφορετική προέλευση, συμπεριλαμβανομένων των στερεών και μη στερεές κακοήθειες [6] – [9]. Sal αντιπροσωπεύει επίσης μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για τη θεραπεία του ήπατος και των κακοηθειών όπως αποδεικνύεται για HCC

στο

vitro και

in vivo

[10]. Έχουμε επίσης δείξει πρόσφατα ότι Sal είναι εφικτό να σπάσει απόπτωση αντίσταση σε ανθρώπινα χολαγγειοκαρκίνωμα (CC) κύτταρα [11]. Παρ ‘όλα αυτά, ο ακριβής τρόπος δράσης του Sal ως αντικαρκινικός παράγοντας παραμένει ασαφής. Έχουν προταθεί αρκετοί μηχανισμοί, όπως αποκλεισμό μονοπάτι Άπτερος τύπου (Wnt) /β-κατενίνης [12] ή ενεργοποίηση των συμβατικών κασπάσης οδηγείται αποπτωτικών οδών [13]. Τον τελευταίο καιρό, ένας νέος μηχανισμός υπεύθυνος για την αντικαρκινική δράση του φαρμάκου που περιλαμβάνουν Sal μεσολάβηση μεταβολή της αυτοφαγικά δραστικότητα καρκινικών κυττάρων προτάθηκε. Αυτοφαγία είναι ένα μονοπάτι ανακύκλωσης για σωζόμενα πρωτεΐνες, οργανίδια ή κυτταρικές βλάβες. Σε κύτταρα όγκου αυτοφαγία υποτίθεται ότι προάγει την επιβίωση. Ανάλογα με το πειραματικό σύστημα, είτε αναστολή [14] ή την ενεργοποίηση [15] – [17] με Sal αυτής κυτταρικό μονοπάτι αποδόμησης έχουν αναφερθεί

Έτσι, σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εξακριβωθεί η αντι-καρκίνου. ιδιότητες της Sal σχετικά με HCC και να διαφωτίσει την επίδρασή της στο μηχανισμό προ-επιβίωσης των αυτοφαγία αυτών των καρκινικών κυττάρων. Από το προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της Sal έχουν προταθεί για τα ανταλλακτικά καλοήθη κύτταρα [9], έχουμε ακόμη ενδιαφέρονται για τις επιπτώσεις της στην πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (PHH). Δείξαμε ότι σαλινομυκίνη φαίνεται να καταστείλει τελευταία στάδια του HCC-αυτοφαγία, οδηγώντας σε μειωμένη ανακύκλωση και τη συσσώρευση των δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων με αυξημένη ROS-παραγωγή και επαγωγή απόπτωσης. Επιπλέον, μια προσωρινή μείωση της κυτταρικής λειτουργίας σε PHH μετά από έκθεση σε σαλινομυκίνη καταδείχθηκε.

Υλικά και Μέθοδοι

σαλινομυκίνη

Sal αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich και διαλύθηκε σε DMSO . Στοκ διαλύματα αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου ήταν στην περιοχή των παρόμοιων

in vitro

πειράματα [10], [11], [14].

απομόνωση ηπατοκυττάρων

Η απομόνωση πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων (PHH ) πραγματοποιήθηκε με 2-βήμα τεχνική διάχυση κολλαγενάσης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18] (βλέπε πληροφορίες υποστήριξης). Όλοι οι δότες ιστών έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για την πειραματική χρήση του δείγματος ήπατος. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Hannover Medical School.

Κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου HCC HepG2 (American Type Culture Collection (ATCC), ο αύξων αριθμός ΗΒ-8065) ​​και Huh7 [ ,,,0],19] καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (ΡΑΑ) συμπληρωμένο με 10% FCS, πενικιλίνη (50 U /ml) και στρεπτομυκίνη (50 mg /l) (Invitrogen). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 48 ώρες. Για μελέτες autophagy δύο κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε συμπληρωμένο ATCC-τυποποιούνται ΕΜΕΜ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ιδρύθηκε αναστολείς και ενεργοποιητές των autophagy χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις που έχουν αναφερθεί προηγουμένως σε ανάλογες

in vitro πειράματα

: 3 ΜΑ (0,4 έως 10 mM), LY294002 (0,8-20 μΜ), βινμπλαστίνη (0,5-10 μΜ), νοκοδαζόλη (0,5-10 μΜ), PP242 (5 μΜ), χλωροκίνη (CQ) (5-100 μΜ) και χλωριούχο αμμώνιο (ACH) (1-20 mM) [21]. Φυσιολογικές επαγωγή autophagy έχει εκτελεστεί χρησιμοποιώντας HBSS που περιέχει 6 mM γλυκόζη (μέσο λιμοκτονίας)

Πρόσφατα απομονωμένα PHH με βιωσιμότητας & gt?. 90% σπάρθηκαν επί 6- και 96-φρεατίων επικαλυμμένες με κολλαγόνο στα 1,5 και 0,05 × 10

6 βιώσιμα κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως, και καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας Williams ‘Μέσο Ε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Μετά την έκθεση σε διάφορες συγκεντρώσεις του Sal (0-10 μΜ) για 24/48 ώρες, ήταν περαιτέρω καλλιεργήθηκαν με κανονικό μέσο για άλλες 5 ημέρες. Το μέσο αλλάχθηκε καθημερινά. Υπερκείμενα και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση σε ημέρες 1/3/5.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων

PHH και ανθρώπινα κύτταρα HCC ερευνήθηκαν για

in vitro

κυτταρικής βιωσιμότητας από CellTiter 96AQueous One Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Promega) όπως περιγράφεται προηγουμένως [18]. Επιπλέον, ο κυτταρικός θάνατος και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας propidiumiodite (PI) δοκιμασία αποκλεισμού και κυτταρομετρία ροής. Εναλλακτικά απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας αλλαγές στην κυτταρική FSC έναντι SSC διάγραμμα σημείων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

HepG2 και Huh7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 × 10

3 /καλά σε μέσο μόνο ή με 1-10 μΜ Sal σε πλάκες 96-φρεατίων για 24 ώρες. Για τα τελευταία 16 ώρες καλλιέργειας τα κύτταρα δονήθηκαν με 1 μΟΐ

3Η-θυμιδίνη και ενσωμάτωση ανιχνεύεται από έναν β-μετρητή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11].

Annexin-V αναλύει

HepG2 και Huh7 κύτταρα αναλύθηκαν για επαγωγή απόπτωσης μετά από έκθεση σε 1-10 μΜ Sal για 24 ώρες εφαρμόζοντας το κιτ αννεξίνης-ν ανίχνευσης απόπτωσης (BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [11].

κατασκευάσματα και μόλυνση με ρετροϊό

Η πλασμίδια ρΒΑΒΕ-puro mCherry-EGFP-LC3B και pBABEpuro GFP-LC3 (N # 22418 και 22405), κατασκευασμένο από Τζαγιάντα Debnath [21], ελήφθησαν από Addgene. μεταγωγή κυττάρων και επιλογής πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20], [22]. Γενετική αναστολή της αυτοφαγία επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας

ATG7

shRNA μεσολάβηση γκρεμίζω (Santa Cruz). Η μη ειδική shRNA (έλεγχος), καθώς και copGFP εφαρμόστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Santa Cruz). Η μεταγωγή εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας λεντοϊού σωματίδια με κατασκευάσματα έως πέντε διακριτές έκφρασης όπως περιγράφεται αλλού [20]. αποτελεσματικότητα μεταγωγής ποσοτικοποιήθηκε με τον αριθμό των ΟΡΡ-θετικών κυττάρων και γενικά υπερέβη το 94% στο τέλος του επιλογή πουρομυκίνης.

Ανάλυση σαλινομυκίνη μεσολάβηση επιδράσεις στην δραστικότητα αυτοφαγικά HCC

αυτοφαγικά διαμερισμάτων ( προ-αυτοφαγοσώματα, αυτοφαγοσώματα και autophago-λυσοσώματα) αντιπροσωπεύουν ενδιάμεσα στοιχεία μιας δυναμικής διαδικασίας υποβάθμιση και το συνολικό ποσό τους σε ένα συγκεκριμένο χρονικό σημείο καθορίζεται από τη δυναμική της δημιουργίας και της υποβάθμισης [23] τους. Διενεργήσαμε μελέτες που μετρούν την αυτοφαγικά ροής σύμφωνα με τις πρόσφατες κατευθυντήριες γραμμές [23]. Αυτοφαγικά ροή αναφέρεται σε ολόκληρη τη διαδικασία της αυτοφαγία συμπεριλαμβανομένης της παράδοσης του φορτίου και την επακόλουθη υποβάθμιση autolysosomal. Μέτρηση της αυτοφαγικά ροής επιτρέπει τη διάκριση μεταξύ επαγωγής και αργά αναστολή της autophagosome ωρίμανσης καθώς οι δύο από αυτούς χαρακτηρίζονται με αυξημένη παρουσία αυτοφαγοσώματα [23], [24]. Μετατροπή της GFP-LC3-I στη GFP-LC3-II προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-LC-3B (Sigma-Aldrich) [23]. Αυτοφαγικά ροή αξιολογήθηκε ως συσσώρευση μη διασπασμένη GFP-LC3-II μετά το κλείδωμα της υποβάθμισης autophagosomal χρησιμοποιώντας ACH. μπάντες Πυκνότητας LC3-ΙΙ εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας LabImage1D Software (Solutions Kapelan Bio-Imaging) και ομαλοποιήθηκε ως προς την οπτική πυκνότητα (OD) του ακτίνης [24]. Επιπλέον, αυτοφαγικά ροής σε κυτταρικές σειρές HCC αναλύθηκε με ανίχνευση των αλλαγών στην κυτταρική συνολικό σήμα GFP-LC3 ή mCherry-GFP-LC3 χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, η αυξημένη ροή αυτοφαγικά αντιστοιχεί σε μια προοδευτική παράδοση της GFP-LC3 να autolysosomes για την υποβάθμιση και εξαφάνιση του σήματος. Επιπλέον, ανέστειλε αυτοφαγικά ροή μεταφράζεται σε μειωμένη εξαφάνιση GFP-LC3 και λόγω τη συστατική κυτταρική παραγωγή ανιχνεύεται ως αυξημένο ολικό κυτταρικό σήμα [20]. Η ανάλυση έγινε για LSR-II (BD Biosciences). Αυτοφαγικά ροή επίσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται σε μια συγκεκριμένη χρωστική που χρωματίζει επιλεκτικά διαμερίσματα αυτοφαγικά. έτσι αυτοφαγικά ροή ποσοτικοποιείται ως συσσώρευση αυτοφαγικά διαμερίσματα στα βασικά ή ενεργοποιείται συνθήκες (HBSS- ή PP242-επώασης) μετά την απόφραξη της υποβάθμισης autophagolysosomal από CQ ή ACH. Αυτό υπολογίζεται αφαιρώντας την αξία Cyto-ID MFI του δείγματος χωρίς CQ /ACH από την αξία Cyto-ID MFI του δείγματος με CQ /ACH για κάθε κατάσταση χρησιμοποιώντας τον τύπο: ΔMFI Cyto-ID = ΝΧΙ Cyto-ID (+ CQ /ACH) -. MFI Cyto-ID (-CQ /ACH)

μιτοχονδριακού

μάζα

το μιτοχονδριακό μάζα προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας Mitotracker Πράσινη FM (MTR πράσινο) χρώση σύμφωνα με το κατασκευαστή οδηγίες (Molecular Probes) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

ROS προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής εφαρμογή 5- (και-6) -χλωρομεθυλο-2 ‘ , 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξική ακέτυλο εστέρα (CM-H2DCFDA) χρώση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

ασπαρτική-αμινοτρανσφεράση διαρροή και ουρία σχηματισμός

ως μέτρο για τον βαθμό της κυτταρικής βλάψει τη δραστικότητα του ασπαρτικού-αμινοτρανσφεράσης (AST) προσδιορίστηκε για PHH καλλιέργειες. Επιπλέον, ο σχηματισμός της ουρίας ως δείκτης για τη λειτουργία των κυττάρων διερευνήθηκε. Και οι δύο παράμετροι εντοπίστηκαν σε υπερκείμενα καλλιεργειών από δοκιμασίες τυποποιημένη ενζυμική δραστηριότητα (Roche Molecular Diagnostics) εκτελείται από το κεντρικό εργαστήριο της Hannover Medical School.

σύνθεση Αλβουμίνη

εκτιμήθηκε Η σύνθεση της λευκωματίνης από PHH χρησιμοποιώντας η ανθρώπινη λευκωματίνη ELISA η ποσοτικοποίηση Set (Bethyl Laboratories) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27].

In vitro

μορφολογία

η μορφολογία του PHH συνδέονται με τις πλάκες επικαλυμμένες με κολλαγόνο αγωγή με /χωρίς Sal αξιολογήθηκε καθημερινά σε όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης.

ανοσοφθορισμού

PHH καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου επικαλυμμένα με κολλαγόνο σε 5 × 10

4 κύτταρα /θάλαμος. Μετά 24 ώρες επώαση με διάφορες συγκεντρώσεις Sal (0-10 μΜ) ή συνδέτη Fas (FasL) ως θετικός έλεγχος (1 μg /ml), η χρώση για απόπτωση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ M30 Cytodeath (TECOmedical GmbH) σύμφωνα με κατασκευαστή οδηγίες.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS 20.0 και GraphPadPrism 4. Η δοκιμασία Mann-Whitney-U, Μαθητών t-test και ANOVA με Dunnett post-hoc ανάλυση ήταν εφαρμόζονται κατά περίπτωση. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές με p & lt? 0,05. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Αποτελέσματα

Η έκθεση σε σαλινομυκίνη μειώνει σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC με επαγωγή απόπτωσης

Για επιβεβαιώνουν την αντικαρκινική επίδραση της Sal σε ανθρώπινα κύτταρα HCC, ερευνήσαμε κυτταρικής βιωσιμότητας εξής φάρμακο θεραπείας. Για το σκοπό αυτό, HepG2 και Huh7 κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις Sal (1-10 μΜ) για 24 ώρες που ακολουθείται από ανάλυση χρησιμοποιώντας το MTS-προσδιορισμού. η βιωσιμότητα των κυττάρων όγκου πράγματι μειώθηκε σημαντικά σε συγκεντρώσεις φαρμάκου πάνω από 2 μΜ Sal (Εικ. 1Α). Στη συνέχεια, οι επιπτώσεις επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων HCC προσδιορίστηκε με

3Η-Θυμιδίνη-ενσωμάτωση μετά από 24 ώρες επώαση με τον παράγοντα. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 1Β, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη στις δύο κυτταρικές σειρές με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτή η επίδραση ήταν ανιχνεύσιμη μετά την έκθεση σε μια μάλλον μέτρια δόση των 2 μΜ Sal. Υψηλότερες συγκεντρώσεις του φαρμάκου σχεδόν εντελώς μειωμένο πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων HCC.

HepG2 και Huh7 κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (1, 2, 5 και 10 μΜ) για 24 ώρες. (Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με MTS-δοκιμασία? υψηλές συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη βιωσιμότητα και των δύο κυτταρικών σειρών (n = 5). κύτταρα (Β) HCC αποκάλυψαν σημαντικά μειωμένο πολλαπλασιασμό μετά από έκθεση σε σαλινομυκίνη, όπως αποδεικνύεται από μειωμένη πρόσληψη

3Η-θυμιδίνης. (Γ) Χαμηλές συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (αριστερό πάνελ, συνεχής γραμμή) οδήγησε σε αύξηση αδύναμη των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (διακεκομμένη γραμμή στο επικάλυψη). Υψηλές συγκεντρώσεις σημαντικά επαγόμενη απόπτωση (δεξιά πάνελ, συμπαγής γραμμή). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές διασποράς-γραμμάρια αννεξίνης-ν

+ – κύτταρα ή συνοψίζονται ως μέση τιμή ± SD από n = 4 ανεξάρτητα πειράματα (D). * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Εμείς αναλύθηκαν περαιτέρω, αν Sal προκαλούμενη απόπτωση σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Όπως καταδεικνύεται στα Σχήματα 1C + D, παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση αννεξίνης-ν

+ κυττάρων μετά από έκθεση σε Sal σε κύτταρα HepG2. Σε κύτταρα Huh7 σημαντική επαγωγή απόπτωσης βρέθηκε σε συγκεντρώσεις Sal στο οποίο και πάνω 2 μΜ. Επαγωγή της απόπτωσης από Sal ήταν πιο αποτελεσματική στην HepG2 από ό, τι στα κύτταρα Huh7 (25,3% έναντι 14,3%).

σαλινομυκίνη αναστέλλει ροή αυτοφαγικά και οδηγεί σε συσσώρευση αυτοφαγικά υπόστρωμα

Για να εκτιμηθεί η επίδραση της Sal επί autophagy σε κύτταρα HCC, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία 10 μΜ Sal για 15 ώρες με και χωρίς ACH για το τελευταίο 1 ώρα. ανάλυση Ημι-ποσοτική στύπωμα Western κατέδειξε Sal-επαγόμενη αύξηση της LC3-II (Σχ. 2Α), η οποία υποστηρίζει έναντι Sal διαμεσολαβούμενη αναστολή πρώτα στάδια του σχηματισμού autophagosomal. Αντίθετα, αυτή μπορεί να αντιστοιχεί είτε σε αυξημένη παραγωγή autophagosome οφείλεται σε αυξημένη δραστηριότητα αυτοφαγικά ή καταστέλλεται ωρίμανση autophagosome [23]. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα και να αξιολογήσει αυτοφαγικά ροή από κηλίδα western εκτιμήσαμε τη συσσώρευση της μπάντας LC3-II μετά την ACH-μεσολάβηση απόφραξη της υποβάθμισης autophagolysosomal. Συσσώρευση της ζώνης LC3-ΙΙ υπολογίστηκε αφαιρώντας την πυκνομετρική ένταση του δείγματος χωρίς ACH από το δείγμα με ACH για κάθε συνθήκη (έλεγχος 3,6 – 1,0 = 2,6? Sal 03.07 – 01.06 = 2.1). Μειωμένη συσσώρευση της μπάντας LC3-II μετά την προσθήκη της ACH στην Sal-επεξεργασμένες καλλιέργειες (2.6 & gt? 2.1) πρότεινε ναρκωτικών με τη μεσολάβηση καταστολή της αυτοφαγικά ροής (Σχήμα 2Α.). Μια παρόμοια μείωση στην αυτοφαγικά ροή ανιχνεύθηκε ως αποτέλεσμα της vinblastine- και νοκοδαζόλη μεσολάβηση καταστολή της autophagosome ωρίμανσης (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

).

HepG2 και Huh7 κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (0.5, 2 και 8 μΜ) για διαφορετικά χρονικά σημεία και αναλύθηκαν ως προς τη δράση του αυτοφαγία. (Α) ανάλυση ανοσοκηλίδος του LC3-Ι και LC3-ΙΙ-ισομορφές (επάνω) με πυκνομετρία ποσοτική ανάλυση (κάτω) σε κύτταρα HepG2 αποκάλυψε Sal επαγόμενη LC3-ΙΙ-συσσώρευση οφείλεται στην αναστολή της αυτοφαγικά ροής όπως αποδεικνύεται από μειωμένη LC3-ΙΙ -accumulation μετά την προσθήκη του ACH. (Β) Βασικά και PP242-ενεργοποιημένα ροή αυτοφαγικά σε κύτταρα Huh7 (μαύρες μπάρες). Η θεραπεία με αναστολείς autophagy 3MA (2 και 10 mM), ACH (5 και 20 mM) ή CQ (5, 20 μΜ) για 24 ώρες εξουδετερώνει ενεργοποίηση PP242 του αυτοφαγικά ροής. (C) Αναστολή της ροής αυτοφαγικά σε κύτταρα Huh7 μετά shRNA μεσολάβηση knockdown του ATG7. (D + Ε) Μειωμένη συσσώρευση αυτοφαγικά διαμερισμάτων μετά την απόφραξη της υποβάθμισης autophagolysosomal από ACH δείχνει μειωμένη αυτοφαγικά ροή σε HepG2 (D) και Huh7 (Ε) κύτταρα κατεργασμένα με Sal για 24 ώρες. Δίπλα στο μπαρ γραφήματα είναι αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα που απεικονίζονται. Όλα τα πειράματα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από n = 3 ανεξάρτητα πειράματα * ρ & lt?. 0,05? ** P & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

Πριν θα μπορούσαμε να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της Sal για HCC ροή αυτοφαγικά, θα επικυρωθεί η παρακολούθηση κυτταρομετρίας ροής της ενδοκυτταρικής κύκλου εργασιών της αυτοφαγικά διαμερισμάτων στα κύτταρα HCC [25], [28]. ενεργοποίηση αυτοφαγία από PP242 οδήγησε σε σαφή αύξηση αυτοφαγικά ροής (Εικ. 2Β). Η προσθήκη αναστολέων autophagy όπως 3-ΜΑ, ACH, ή CQ οδήγησε σε μείωση του αυτοφαγικά ροής. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ραπαμυκίνη ή ασιτία (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

) και επιβεβαιώνεται εφαρμογής της δοκιμασίας σε κύτταρα HCC. Για να εξαιρέσετε τελικά πλειοτροφικές επιπτώσεις από τις φαρμακολογικές αναστολείς, διαπιστώσαμε αυτοφαγικά μέτρησης ροής με Cyto-ID χρησιμοποιώντας αυτοφαγία ειδικό shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του

ATG7

(Σχ. 2C).

Στη συνέχεια, θέλησε να αξιολογηθεί η επίδραση της Sal για αυτοφαγικά ροή HCC του. κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν σε παρουσία Sal (0.5, 2 και 8 μΜ) για 24 ώρες και συγκρίθηκαν με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Sal μείωσε αισθητά την αυτοφαγικά χρόνου ροής και με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, ακόμα και όταν αυτοφαγία προκλήθηκε από PP242 (Σχ. 2D). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας HUH7 κύτταρα (Σχ. 2Ε) και εναλλακτικές ενεργοποίηση με ραπαμυκίνη ή πείνα (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

).

Τέλος, εφαρμόσαμε την παρακολούθηση της ενδοκυτταρικής LC3-κύκλου εργασιών [22] . Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα HepG2 που εκφράζουν σταθερά LC3-GFP. Η επώαση με 3 ΜΑ (2 και 10 mM), LY (2 και 10 mM), νοκοδαζόλη (2 και 10 μΜ) ή ACH (0,8 και 4 mm) για 7 ώρες οδηγήσει στη συσσώρευση σήματος GFP-LC3, όπως αναμενόταν (Σχ . 3Α). Η πείνα αύξησε τη ροή αυτοφαγικά όπως ανιχνεύεται με μειωμένο σήμα LC3-GFP σε κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας περισσότερο αποικοδόμηση (Σχ. 3Α), ένα αποτέλεσμα το οποίο χάθηκε όταν φαρμακολογικές αναστολείς autophagy ήταν παρούσες (Εικ. 3Α). Στη συνέχεια τα κύτταρα HepG2 που εκφράζουν ιδιοσυστατικά πρωτεΐνη σύντηξης LC3-GFP καλλιεργήθηκαν με και χωρίς Sal για 24 ώρες. Sal ανέστειλε σημαντικά την αυτοφαγικά ροή όπως ανιχνεύεται από τη συσσώρευση του συνολικού κυτταρικού σήματος LC3-GFP (Σχ. 3Β). Και πάλι, οι επιδράσεις Sal για αυτοφαγικά ροή ήταν χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη και εύκολα αισθητή σε συγκεντρώσεις που έχουν αναφερθεί προηγουμένως για να ασκήσει αντικαρκινικές επιδράσεις [10]. Καταστολή της autophagy έχει συσχετιστεί με δυσλειτουργικές συσσώρευση μιτοχονδρίων με αυξημένη παραγωγή ROS [29], [30], η οποία μπορεί να προκαλέσει απόπτωση [29] – [32]. Έτσι, αναλύσαμε εάν η θεραπεία Sal συνοδεύτηκε από τη συσσώρευση των μιτοχονδριακών μάζας. Πράγματι, τα αποτελέσματα μας επιβεβαίωσαν δοσοεξαρτώμενη συσσώρευση του μιτοχονδριακού μάζας (Σχ. 3C). Επιπλέον, η συσσωρευμένη μιτοχόνδρια εμφανίζονται σημάδια δυσλειτουργίας, όπως καταδεικνύεται από την αυξημένη παρουσία της παραγωγής ROS (Εικ. 3D). Είναι σημαντικό, φαρμακολογικές και γενετικές αναστολή της αυτοφαγία στα κύτταρα HCC επανέλαβε εντελώς επιπτώσεις Sal στις δυσλειτουργικές συσσώρευση μιτοχονδρίων, η παραγωγή ROS και η βιωσιμότητα των κυττάρων. Με βάση αυτό συμπεραίνουμε ότι οι επιδράσεις Sal σε κύτταρα HCC θα μπορούσε τουλάχιστον εν μέρει να προκαλούνται μέσω της ικανότητάς της να καταστέλλει ροή αυτοφαγικά (βλέπε File S1 και η Εικ. S1).

(Α) Αναστολή της βασικής και HBSS που ενεργοποιείται αυτοφαγικά ροής σε κύτταρα HepG2 που εκφράζουν σταθερά LC3-GFP σε επεξεργασία με 3 ΜΑ (2 και 10 mM), LY (2 και 10 mM), νοκοδαζόλη (2 και 10 μΜ) ή ACH (0,8 και 4 mm) για 7 ώρες. (Β) Αναστολή της ροής αυτοφαγικά σε κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με Sal (0.5, 2 και 8 μΜ) για 24 ώρες (αριστερά) με αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα (δεξιά). (C) Flow-κυτταρομετρίας ανάλυση του συνόλου των μιτοχονδριακών μάζας χρησιμοποιώντας Mitotracker Green (MTR πράσινο) αποκαλύπτει τη συσσώρευση των δυσλειτουργικών μιτοχόνδρια. (Δ) Η απόδειξη της αυξημένης ROS-παραγωγή με τη χρήση CM-H2DCFDA (αριστερά) με τον εκπρόσωπο ιστογράμματα (δεξιά). Όλα τα πειράματα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από n = 3 ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01

Η

Η έκθεση των PHH να σαλινομυκίνη αποτελέσματα σε παροδική μείωση της κυτταρικής λειτουργίας και

in vitro

μορφολογία αλλά δεν οδηγεί σε απόπτωση

με βάση τις εκθέσεις ότι Sal εμφανίζει αντικαρκινικές επιδράσεις εναντίον των καρκινικών κυττάρων αλλά προκάλεσε μικρή απόπτωση σε κύτταρα μη όγκου και το γεγονός ότι το ήπαρ θα αποτελούσε όργανο-στόχο για την θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, εμείς επόμενη επικεντρώθηκε στην επίδραση Sal σχετικά πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα. Σε γενικές γραμμές, η θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις Sal (1-2 μΜ) για 24 ώρες δεν μετέβαλε ρητώς PHH-εμφάνιση (Σχ. 4Α). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, ηπατοκύτταρα εμφανίστηκε ελαφρώς προσβεβλημένη με ακανόνιστα κυτταρικές μεμβράνες. Υψηλότερες συγκεντρώσεις του Σαλ (5-10 μΜ) αν και εν μέρει ως αποτέλεσμα πιο προφανής αλλαγές: PHH έδειξαν σημάδια της καταστροφής της ακεραιότητας και ακόμα και απώλεια της συμβολής. Περαιτέρω επώαση αυτών των καλλιεργειών σε απουσία Sal οδήγησε σε πλήρη αποκατάσταση του PHH εκτίθενται σε χαμηλές και ενδιάμεσες δόσεις έως 5 μΜ. Αντίθετα, μετά από διέγερση με 10 μΜ Sal για 24 ώρες δεν υπήρχε φως μικροσκοπική ανίχνευση αποτελεσματική ανάκτηση για τις περισσότερες περιπτώσεις. Η επώαση των PHH για 48 ώρες είχε σαν αποτέλεσμα παρόμοια πρότυπα: (Εικ. 4Α). Κατεργασία με χαμηλές συγκεντρώσεις του παράγοντα προκάλεσε μάλλον περιθωριακό μορφολογικές αλλαγές ενώ υψηλότερες δόσεις πάλι θα μπορούσε να οδηγήσει σε κυτταρική μεταβολές

Μετά από μία ημέρα επώασης καλλιεργημένων PHH εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (1, 2, 5 και 10 μΜ) κατά τη στιγμή της έκθεσης ποικίλες (24 και 48 ώρες, αντίστοιχα). (Α) Απομείωση

in vitro

μορφολογία χωρίς επακόλουθη ανάκαμψη ήταν ανιχνεύσιμη μόνο μετά από θεραπεία με υψηλές συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (10 mM), ενώ η θεραπεία με έως 5 μΜ σαλινομυκίνη οδήγησε σε μορφολογικά ανάκαμψη μετά την πάροδο του παράγοντα. (Β + Γ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με MTS-προσδιορισμού. θεραπεία σαλινομυκίνη για 24 (Β) και 48 (C) ώρες οδήγησε σε μειωμένη σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά την ημέρα 1 και 3. Κατά την περαιτέρω ανάκτηση επώαση των κυττάρων παρατηρήθηκε όπως υποδεικνύεται από την αύξηση της παραγωγής του έγχρωμου formazaan-προϊόντος (n = 6) . (D + Ε) βλάβη των κυττάρων του PHH όπως αντιπροσωπεύεται από την απελευθέρωση AST ήταν ανιχνεύσιμο μόνο αμέσως μετά την έκθεση στο φάρμακο (ημέρα 1) έως 10 μΜ σαλινομυκίνη για 24 (D) και 48 (Ε) ώρες, αντίστοιχα. Η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (n = 3). Συνεχίζεται η επώαση συνοδεύτηκε από μόλις και μετά βίας μετρήσιμα απελευθέρωση AST. * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.005

Η

Στη συνέχεια ερευνήσαμε το

in vitro

κυτταρικής βιωσιμότητας της PHH χρησιμοποιώντας τον MTS-δοκιμασία. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε αμέσως μετά το φάρμακο έκθεσης (ημέρα 1), καθώς και τις ημέρες 3 και 5 παρακάτω Sal-θεραπεία. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 4Β, 24 ώρες έκθεσης εξασθενημένη σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα κατά τις ημέρες 1 και 3 σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Λήξη του φαρμάκου και τη συνεχή επώαση οδήγησε σε σχεδόν πλήρη ανάκτηση της PHH κατά την ημέρα 5 (Σχ. 4Β). Η διέγερση με Sal για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια παρόμοια δοσοεξαρτώμενη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και την επακόλουθη ανάκτηση. Ωστόσο, το τελευταίο δεν ήταν επαρκές, καθώς παρατηρείται μετά από 24 ώρες έκθεσης (Σχ. 4C).

Δεδομένου ότι η επώαση του PHH με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Sal κατέληξε σε μια ενδιάμεση μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και histomorphologic μετατροπές, εμείς διερευνηθεί αν παρομοίως θα μπορούσε να ανιχνευθεί άλλους δείκτες κυτταρικής βλάβης. Τα σχήματα 4D + Ε αποδείξει ότι συγκρίσιμες διαρροή της AST βρέθηκε ανάμεσα σε όλες τις πειραματικές ομάδες. Μια σημαντική κορυφή της AST απελευθέρωσης παρατηρήθηκε μόνο κατά την ημέρα 1 μετά από έκθεση σε 10 μΜ Sal αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Συνεχίζεται η επώαση χωρίς Sal οδήγησε σε μέτρια βασική απελευθέρωση της AST σε όλες τις ομάδες.

Στη συνέχεια αναλύσαμε εάν Sal-θεραπεία βλάπτει τη λειτουργία της PHH. Για το σκοπό αυτό, προσδιορίσθηκαν ουρία-σχηματισμό και λευκωματίνης σύνθεση του φαρμάκου εκτεθειμένα PHH. Όπως αποδεικνύεται στα Σχήματα 5Α + Β δεν υπήρχε σχετική μεταβλητότητα στην ουρία-σχηματισμό μετά από 24 ώρες διέγερση με Sal. Αντίθετα, μετά από 48 ώρες έκθεσης μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της ουρίας-σχηματισμού ήταν ανιχνεύσιμο, ιδιαίτερα κατά τις ημέρες 3 και 5, αλλά δεν έφθασε στατιστική σημασία (Εικ. 5Α + Β). Αλβουμίνη-σύνθεση με PHH εκτίθενται σε Sal για 24 ώρες χαρακτηρίζεται από δοσοεξαρτώμενη μείωση κατά την ημέρα 1 (Σχ. 5C + D). Παρέλευση της Sal προκάλεσε μια αργή ανάκαμψη της λειτουργικότητας των κυττάρων με μια συνεχή αύξηση της λευκωματίνης-παραγωγής, αλλά μετά από διέγερση με υψηλή ναρκωτικά συγκεντρώσεις. Μια παρόμοια αλλά ακόμα πιο έντονη επίδραση παρατηρήθηκε από 48 ώρες έκθεσης. Και πάλι, μετά την παρέλευση του παράγοντα συνεχής – βρέθηκε ανάκτηση PHH (Σχήμα 5C + D.)

Η λειτουργικότητα της PHH μετά τη θεραπεία με σαλινομυκίνη αναλύθηκε με σχηματισμό ουρίας και σύνθεση αλβουμίνης – αν και πολύ πιο αργή.. (Α) 24 ώρες έκθεσης σαλινομυκίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις δεν συνοδευόταν από σχηματισμό εξασθενημένη ουρία καθόλου. (Β) Σε αντίθεση, η θεραπεία για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση του σχηματισμού ουρίας σε ημέρες 1, 3 και 5, χωρίς να φθάσει στατιστική σημασία. σύνθεση (C + D) Αλβουμίνη ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την ημέρα 1 μετά από διέγερση με σαλινομυκίνη για 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα. Περαιτέρω επώαση οδήγησε σε συνεχή ανάκτηση της σύνθεσης λευκωματίνης στις ομάδες με 24 ώρες έκθεσης στο φάρμακο. Αντιθέτως, η θεραπεία για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μόνο μέτρια ανάκαμψη της σύνθεσης λευκωματίνης (n = 3). * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.005

Η

Τέλος, μας ενδιαφέρει να καθοριστεί αν η παροδική δυσλειτουργία του PHH μετά από 24 ώρες έκθεσης σε Sal συσχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 6, η έκθεση σε Sal δεν προκάλεσε απόπτωση αυτών των καλοηθών κυττάρων, σε αντίθεση με FasL-θεραπεία.

Καλλιεργημένα PHH εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σαλινομυκίνη (1, 2, 5 και 10 μΜ) για 24 ώρες. Η απόπτωση εντοπίστηκε από κιτ M30 Cytodeath. Η θεραπεία με Fas Ligand (FasL) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Χρώση των PHH με DAPI (μπλε) και κιτ M30 Cytodeath (κόκκινο) δεν αποκάλυψαν ενδείξεις για την επαγωγή της απόπτωσης σε PHH, ακόμη και μετά τη θεραπεία με υψηλές συγκεντρώσεις σαλινομυκίνης. Σε αντίθεση, FasL προκαλείται από σαφώς απόπτωση σε PHH.

Η

Συζήτηση

Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι Sal ασκεί μια προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα στα κύτταρα HCC από την αναστολή της αυτοφαγικά ροής η οποία οδηγεί σε συσσώρευση των δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων και την αύξηση της ROS-σχηματισμό. Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα πιστεύεται να βιώσουν πιο εγγενείς στρες και ως εκ τούτου, προβλέπεται να εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από αυτοφαγία για την επιβίωση [33] η μελέτη μας μπορεί να βοηθήσει να καταλάβουμε γιατί Sal σκοτώνει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα ενώ διαφυλάσσει καλοήθη κύτταρα. Η υπόθεση αυτή αυξάνεται με την παρατήρηση ότι η έκθεση της PHH να Sal οδηγεί μόνο σε παροδική διαταραχή της λειτουργίας των κυττάρων χωρίς ουσιαστική βλάβη.

Από HCC είναι η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου [34] και την πιο κοινή πρωτογενή ηπατική κακοήθεια με περιορισμένη θεραπεία επιλογές ιδιαίτερα σε προχωρημένο στάδιο της νόσου [34], [35], καινοτόμες θεραπευτικές προσεγγίσεις είναι απαραίτητες. Το δυναμικό του Sal για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ήταν αρχικά προτείνεται από την εργασία των Wang et al. ο οποίος κατέδειξε την αναστολή του πολλαπλασιασμού και διέγερση απόπτωσης σε HCC

in vitro

και

in vivo

μετά ναρκωτικά έκθεση [10]. Για να αναλύσουμε την ακριβή τρόπο δράσης της Sal εστιάσαμε στο μοριακό μηχανισμό της Sal στο HCC. Χρησιμοποιώντας HepG2 και Huh7 κύτταρα και ολοκληρωμένη ποσοτικές αναλύσεις, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι η Sal αναστέλλει αυτοφαγικά ροής σε ανθρώπινα κύτταρα HCC. Τα ακόλουθα ευρήματα μας οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι Sal μεσολάβηση αναστολή της αυτοφαγικά ροής μπορεί να ευθύνονται για την απόπτωση σε κύτταρα HCC. Πρώτον, επέδειξε μια δοσοεξαρτώμενη συσσώρευση δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων με αυξημένη ROS παραγωγής. Εξάλειψη των δυσλειτουργικών μιτοχόνδρια και έτσι μείωση του προ-αποπτωτικών σημάτων όπως το κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωσης θεωρούνται αναπόσπαστο μέρος του μηχανισμού προ-επιβίωσης autophagy [36]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτοφαγία έχει επανειλημμένα αποδειχθεί ότι είναι ζωτικής σημασίας για την απομάκρυνση των δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων [31], [37]. Ανιχνεύσιμες αλλοίωση του μιτοχονδριακού μάζας και ROS εμφανίστηκε μόνο μετά από σημαντική αναστολή της αυτοφαγικά ροής και ακολουθήθηκε από μια μαζική επαγωγή απόπτωσης και κυτταρικού θανάτου. Δεύτερον, υπό πειραματικές συνθήκες μας φαρμακολογικές και γενετικές αναστολή της αυτοφαγία επανέλαβε εξ ολοκλήρου τα γεγονότα αυτά. Ακόμη και αν κάποιος θεωρεί ότι το σύνολο σχεδόν των φαρμακολογικών αναστολέων παρούσα πλειοτροπικές επιδράσεις σε πολλαπλά μονοπάτια [23], το γεγονός ότι η γενετική αναστολή οδήγησε σε ανάλογη μεταβολή υποστηρίζει τη δυνατότητα που οι παρατηρήσεις μας είναι τουλάχιστον διαμεσολαβείται εν μέρει από την καταστολή της αυτοφαγικά ροής. Ο αντίκτυπος της Sal στην αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα αυτή τη στιγμή συζητείται αμφιλεγόμενα. Jangamreddy et al. * P & lt? 0,05?