Αφηρημένο

Η κακή ρύθμιση miRNAs παίζουν κρίσιμο ρόλο κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης και της εξέλιξης του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, η λειτουργία του miR-1228 * στη ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου διερευνήθηκε σε γαστρικό καρκίνο. Μειωμένη έκφραση του miR-1228 * παρατηρήθηκε σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Στη συνέχεια, ο ρόλος του miR-1228 * αξιολογήθηκε

in vivo

χρησιμοποιώντας το μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου. Σε αυτό το μοντέλο, miR-1228 * υπερέκφραση καταστέλλεται σχηματισμός ξενομοσχεύματος όγκου. Επιπλέον, αποδείξαμε miR-1228 * αρνητικά ρυθμιζόμενη δραστηριότητα NF-κΒ στη ΓΓΕ-7901 γαστρικά καρκινικά κύτταρα και διαπίστωσε ότι CK2A2 ήταν ο στόχος του miR-1228 *. Προς τα πάνω ρύθμιση του miR-1228 * μείωσε την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών και αύξησε το δείκτη επιθηλιακά E-cadherin, υποδηλώνοντας εν δυνάμει ρόλο της στην καταστολή επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι το miR-1228 * παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γαστρικής ανάπτυξη του καρκίνου και δείχνουν ότι η επιλεκτική αποκατάσταση του miR-1228 * μπορεί να είναι επωφελής για γαστρικά θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Jia L , Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Αποκατάσταση του miR-1228 * Έκφραση Καταστέλλει Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10.1371 /journal.pone.0058637

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 25, Οκτώβρη του 2012? Αποδεκτές: 5 Φεβ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12, Μάρ 2013

Copyright: © 2013 Jia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία σύντομη ( 20-23 νουκλεοτίδια σε μήκος), ενδογενή, μονόκλωνα RNAs τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου προκαλώντας μεταγραφική καταστολή ή mRNA αποικοδόμηση [1], [2]. Μέσω αυτών των μοριακών μηχανισμών, miRNAs κατέχουν φυσιολογικές βιολογικές λειτουργίες, όπως είναι η ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης. Επιπλέον, έχουν απορρυθμισμένη miRNAs δειχθεί ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους στη ρύθμιση καρκινογένεση και της εξέλιξης του καρκίνου [3], [4]. έκφραση αποκλίνουν από το φυσιολογικό miRNAs έχουν παρατηρηθεί σε πολλά είδη κακοηθειών περιλαμβανομένων γαστρικού καρκίνου [5].

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι ένα βιολογικό γεγονός επαναπρογραμματισμού που επιτρέπει επιθηλιακών κυττάρων να υποστούν πολλαπλές βιοχημικές αλλαγές να αποκτήσει μια μεσεγχυματικών κυττάρων φαινότυπο. Ενώ EMT είναι κρίσιμη για την κατάλληλη εμβρυϊκής ανάπτυξης, την αύξηση της στοιχεία δείχνουν ότι η ανώμαλη ενεργοποίηση του ΕΜΤ οδηγεί σε κακοήθη εξέλιξη του όγκου [6]. Έχει αποδειχθεί ότι EMT είναι μια βασική διαδικασία που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου, η οποία χαρακτηρίζεται από την απώλεια του επιθηλιακού δείκτη Ε-καδερίνης, η αύξηση του δείκτη μεσεγχυματικά βιμεντίνης, και η αύξηση της μεταναστευτικής και επεμβατική συμπεριφορά [7], [8].

Σε προηγούμενη μελέτη μας, αναλύοντας τη συστοιχία miRNA παγκρεατικής σφαιρών καρκίνου, miR-1228 * βρέθηκε ως ένας από τους σχετίζονται με τον καρκίνο miRNAs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εδώ, έχουμε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το miR-1228 * ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. έκφραση Αποκατάσταση miR-1228 * σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου. Μηχανιστικά, αποδείξαμε ότι το miR-1228 * αναστέλλει την ενεργοποίηση του NF-κΒ και πιθανώς καταστέλλει EMT.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC-7901 , AGS και BGC-823 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας (κινεζική Ακαδημία Επιστημών). Ένα φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακών κυττάρων γραμμή GES-1 αγοράστηκε από το Ινστιτούτο του Πεκίνου για την Έρευνα του Καρκίνου. Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε επωαστήρα CO2 5% σε RPMI-1640 (SGC-7901 και BGC-823), F-12K (AGS) ή ϋΜΕΜ (GES-1) μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου [ ,,,0],9], [10].

Κλινικά δείγματα

Πενήντα ζευγάρια του γαστρικού καρκίνου και των γειτονικών δειγμάτων ιστού μη-καρκίνου ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Zhejiang. Τα συμφωνημένα μη-καρκίνου παρακείμενους ιστούς ελήφθησαν τουλάχιστον 5 cm μακριά από την περιοχή του όγκου. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Δείγματα ιστών συλλέχθηκαν, καταψύχθηκαν ακαριαία εντός υγρού αζώτου και αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί [11]. Όλοι οι ιστοί είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη να γαστρική αδενοκαρκινώματα. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο Επιτροπή Δεοντολογίας της Zhejiang University College of Medicine. Η υπογεγραμμένη ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες ή από τους εκπροσώπους των ασθενών, αν δεν μπορεί να επιτευχθεί άμεσα συναίνεση.

RNA Extraction και Real-time PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από τα καλλιεργημένα κύτταρα ή ιστούς χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), και η συγκέντρωση του ολικού RNA προσδιορίστηκε. Σύνθεση cDNA και PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) και το TaqMan microRNA Assay Kit (Applied Biosystems), αντίστοιχα. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Το επίπεδο έκφρασης του miR-1228 * ομαλοποιήθηκε σε RNU6B. Τα PCR πραγματικού χρόνου αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η σχετική έκφραση των miRNAs υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την συγκριτική μέθοδο Ct [12].

Εμβολιασμός Δοκιμασία όγκου σε γυμνούς ποντικούς

Θηλυκά BALB /c αθυμικά γυμνά ποντίκια στην ηλικία 4 εβδομάδων αγοράστηκαν από το Κέντρο της Σαγκάης Εργαστήριο ζώων (κινεζική Ακαδημία Επιστημών). Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα εγκρίθηκαν από Πειραματικό Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων, Κολέγιο Ιατρικής του Πανεπιστημίου Zhejiang. miR-1228 * ή miR-NC σταθερή επιμόλυνση SGC-7901 κύτταρα αιωρήματα (2.5 χ 10

7 κύτταρα /ml) σε 200 μΙ μέσου χωρίς ορό εγχύθηκαν υποδορίως στα πλευρά γυμνών ποντικών, αντίστοιχα. Η ανάπτυξη του όγκου εξετάστηκε δύο φορές την εβδομάδα για 5 εβδομάδες και ο όγκος του όγκου (V) παρακολουθήθηκε με μέτρηση του μήκους (L) και το πλάτος (W) του όγκου με καλίμπρες και υπολογίζεται με τον τύπο V = 1/2 (L × W × W) [13].

τηλέφωνα μετανάστευση

Η ικανότητα μετανάστευσης των miR-1228 * ή miR-NC σταθερή επιμόλυνση SGC-7901 κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Transwells (μέγεθος πόρων 8 mm, Corning). Οι Transwells τέθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Προσφάτως επεξεργασία με θρυψίνη και πλυμένα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 100 μΐ RPMI1640 άνευ ορού που περιέχει 1% ορό εμβρύου μόσχου. Περίπου 1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο τοποθετήθηκε στον άνω θάλαμο του κάθε ενθέματος. 200 μΐ ΚΡΜΙ1640 που περιέχει 20% βόειο εμβρυϊκό ορό προστέθηκε στα κάτω θαλάμους. Μετά από επώαση για 24-48 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστή, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 95% απόλυτη αλκοόλη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες [14]. Τα κύτταρα στον εσωτερικό θάλαμο απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα και τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν και απεικονίστηκαν υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε μεγέθυνση χ 200 πάνω από πέντε τυχαία πεδία σε κάθε φρεάτιο. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Western Blot

Σύνολο πρωτεΐνες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ BCA (Pierce) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες των κυττάρων κλασματοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 12% SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου και ηλεκτρο-στυπώθηκε σε νιτροκυτταρίνη (NC) μεμβράνες για 2,5 ώρες στους 200 V. Η NC μεμβράνες επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθούμενο από ολονύκτια επεξεργασία με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C, και έπειτα με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (MBL). Μετά το πλύσιμο, τα αντιδραστικά ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης στυπώματος Western ECL (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα ήταν το μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-Ε-καδερίνης (Epitomics), αντι-βιμεντίνης (Epitomics), αντι-β-κατενίνης (Epitomics), αντι-σαλιγκάρι (Cell Signaling), αντι-Slug (Cell Signaling), αντι -ZEB1 (κυτταρική σηματοδότηση), αντι-ZEB2 (Santa Cruz), αντι-CK2A2 (Santa Cruz) και αντι-GAPDH (KangChen Biotech).

Η ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης, 3- μm σε πάχος, ψήθηκαν για 2 ώρες στους 60 ° C και αποπαραφινοποιήθηκαν. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα νατρίου (ρΗ 7,2) στους 95 ° C για 15 λεπτά και στη συνέχεια πλάκες ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Αφού υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 15 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή υπεροξειδάση, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό κατσίκας περιορίζοντας υγρό για 30 λεπτά για να μειωθεί η μη-ειδική σύνδεση και στη συνέχεια πολυκλωνικά κουνελιού αντι-Ε-καδερίνης (Santa Cruz) ή μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-βιμεντίνης (Epitomics) επωάστηκε τα τμήματα για 12 ώρες σε 4 ° C. Μετά επαναθέρμανση για 1 ώρα και έκπλυση 5 φορές, οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε για χρωματικές αντιδράσεις.

Κατασκευή πλασμιδίου και κυττάρων Η επιμόλυνση

Το miR-1228 * φορέα έκφρασης (miR-1228 *) ή αρνητικό μάρτυρα (miR-NC) δομήθηκε με κλωνοποίηση ανόπτηση ολιγονουκλεοτιδίων που περιείχε το βελτιστοποιημένο miR-1228 * στελέχους-βρόχου (ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν ως: άνω κλώνος, 5′-TGC TGG TGG ΟΟΟ ΟΟΟ GCA GGT ΟΤΟ ΤΟΟ ΤΤΤ ΤΟΟ CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 ‘ ?. κάτω αλυσίδα, 5’-ΚΔ GGT GGG CGG GGG GGT ΟΤΟ ΤΟΟ TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA ΚΔ GCC CCC GCC CAC C-3 ‘) ή αρνητικό μάρτυρα στελέχους-βρόχου σε φορέα pcDNA6.2-GW /EmGFP ( Invitrogen) [15]. Η περιοχή * υποκινητή miR-1228 2-kb ενισχύθηκε (εκκινητές σχεδιάστηκαν ως: προς τα εμπρός, 5’-ATC TAG GGT ACC CTC ACT ΤΟΟ AG CCA CAC AGA-3 ‘? Αντίστροφη, 5’-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA Γ.Ο.Σ. GGG GTG TG-3 ‘.) και coloned να pGL3-Enhancer (Promega) [16], όπως ονομάζεται το pGL3-miR-1228 * προαγωγέα. Η κενή pGL3-Enhancer Vector ενήργησε ως αρνητικό μάρτυρα (pGL3-ελέγχου). Το miR-1228 * περιοχή-στόχο της αλληλουχίας CK2A2 3’UTR συντέθηκε χημικά από Σαγκάη Biotech και εισάγεται κατάντη του πλασμιδίου pMIR-ΕΚΘΕΣΗ λουσιφεράσης (Applied Biosystems), όπως ονομάζεται pMIR-CK2A2. Ο κλώνος pReceiver-γ-συνδεδεμένη ORF με GFP-tag αγοράστηκε από GeneCopoeia. Για την παραγωγή σταθερών επιμολυσμένα κύτταρα, το miR-1228 * και κατασκευάσματα έκφρασης miR-NC επιμολύνθηκαν στην κυτταρική σειρά SGC-7901 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες, βλαστισιδίνη (14 μg /ml) προστέθηκε στο μέσο. Το pGL3-miR-1228 * προαγωγέα /ελέγχου, GFP-c-Rel /ελέγχου, pMIR-CK2A2 /ελέγχου ή φορέα ρεπόρτερ NF-κΒ (Promega) επιμολύνθηκαν παροδικά σε ΓΓΕ-7901 κύτταρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000, pRL-ΤΚ ( Promega) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική εξομάλυνση [17].

λουσιφεράσης δοκιμασία

δοκιμασία λουσιφεράσης δημοσιογράφος έγινε σε SGC-7901 κύτταρα. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και λύθηκαν σε Passive Lysis Buffer (Promega) και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν από 20 μΙ λύμα χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega) επί GloMax 20/20 φωτόμετρο (Promega). Όλα τα δεδομένα ελήφθησαν από το μέσο όρο των αποτελεσμάτων από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις.

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-1228 * σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο προσδιορίστηκαν με την Wilcoxon signed-rank test. Τα κλινικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square. t-test του Student και ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των

in vitro

και

in vivo

δεδομένων. Όλα

P

τιμές ήταν δύο όψεων και διαφορές ορίστηκαν ως στατιστικά σημαντική για

P

& lt? 0.05. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS V.16.0 (SPSS Inc). * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.01.

Αποτελέσματα

miR-1228 * είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο γαστρικό Καρκίνο

Κατ ‘αρχάς, να καθοριστεί αν η miR-1228 * εκφράζεται διαφορικά σε ανθρώπινα πρωτογενή γαστρικών καρκίνων, το επίπεδο έκφρασης του ώριμου miR-1228 * εξετάστηκε χρησιμοποιώντας TaqMan πραγματικού χρόνου PCR σε 50 ζεύγη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου και ιστών ζεύγος αντιστοίχιση γειτονικών noncancerous γαστρικών ιστών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-1228 * μειώθηκε σημαντικά σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τις παρακείμενες noncancerous γαστρικού ιστούς (Σχ. 1Α). Περίπου 72% των δειγμάτων του όγκου ήταν χαμηλότερες εκφράζεται με miR-1228 * (Εικ. 1Β). Χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCT αξίες, φορές αλλαγή του miR-1228 * & lt? 1.0 θεωρήθηκε χαμηλό, ενώ & gt? 1,0 θεωρήθηκε ως υψηλής έκφρασης [18]. miR-1228 * έκφραση αξιολογήθηκε επίσης σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και ένας αθανατοποιημένα κανονική γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακή κυτταρική σειρά (GES-1). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C, miR-1228 * ήταν σημαντικά χαμηλή έκφραση σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με GES-1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι miR-1228 * ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο.

(Α) Σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με ζεύγη γειτονικών noncancerous (κανονικό) γαστρικό ιστούς, ΜΙΚ-1228 * ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Η έκφραση του miR-1228 * αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και κανονικοποιούνται σε RNU6B. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται σε λογαριθμική κλίμακα. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων αναλύθηκαν με τη δοκιμασία Wilcoxon Signed-rank (n = 50). (Β) σχετική έκφραση του miR-1228 * σε 50 γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως 2

-ΔΔCT τιμές. (Γ) Η έκφραση του miR-1228 * σε 3 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και ένας αθανατοποιημένα κανονική γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακή κυτταρική σειρά (GES-1) διεξήχθη με PCR πραγματικού χρόνου και κανονικοποιήθηκε ως προς RNU6B. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, η = 3.

Η

Επιπλέον, miR-1228 * έκφρασης αξιολογήθηκαν σε σχέση με τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών. Όλοι οι ασθενείς δεν είχαν απομακρυσμένη μετάσταση και όλοι οι ιστοί ιστολογικά επιβεβαιωμένο με γαστρική αδενοκαρκινώματα. Όλες οι περιπτώσεις (n = 50) κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες: miR-1228 * χαμηλή έκφραση (n = 36) και miR-1228 * υψηλή έκφραση (n = 14). Η ομάδα χαμηλής έκφρασης miR-1228 * είχαν κλίσεις προς μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου. Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές σχέσεις μεταξύ του miR-1228 * έκφρασης και άλλα κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, ιστολογικό τύπο ή το στάδιο TNM (Πίνακας 1).

Η

Αυξημένη miR-1228 * Έκφραση Καταστέλλει ξενομοσχεύματος όγκου Σχηματισμός

για να εκτιμηθεί λειτουργικός ρόλος του miR-1228 * σε καρκίνο του στομάχου, η βελτιστοποιημένη miR-1228 * στελέχους-βρόχου κλωνοποιήθηκε στον φορέα pcDNA6.2-GW /EmGFP. Γαστρική κυτταρική σειρά SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με /EmGFP-miR-1228 * ή pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC γραμμές φορέα και σταθερές κυτταρικές pcDNA6.2-GW παρήχθησαν και το όνομά του miR-1228 * ή miR-NC, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ανάλυση RT-PCR έδειξε ότι miR-1228 * σταθερά κύτταρα είχαν μια αύξηση της τάξης του ώριμου miR-1228 * έκφραση κατά τη σύγκριση σε σταθερά κύτταρα miR-NC (Εικ. 2Α). Δεν υπήρξε καμία μορφολογική αλλαγή στο miR-1228 * σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. SGC-7901 κύτταρα με ή χωρίς επιμόλυνση του miR-1228 * εμφυτεύθηκαν υποδορίως στα πλευρά γυμνών ποντικών για να αξιολογήσει τις πιθανές επιπτώσεις των miR-1228 * σε γαστρικό ανάπτυξη του καρκίνου

in vivo

. Η υπερέκφραση του miR-1228 * κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 2Β). Μέχρι το τέλος της πειραματικής περιόδου, το μέγεθος και το υγρό βάρος των όγκων με miR-1228 * υπερέκφραση ήταν σημαντικά μικρότερο και χαμηλότερη από εκείνη της ομάδας ελέγχου (Σχ. 2C-D). Έτσι, τα δεδομένα δείχνουν ότι miR-1228 * αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος του γαστρικού καρκίνου κυττάρων

in vivo

.

(Α) miR-1228 * ήταν περισσότερο από δέκα φορές αλλαγές στη ΜΙΚ 1228 * σταθερά επιμολυσμένα SGC-7901 σε σύγκριση με το NC. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, η = 3. (Β) Αυξημένη miR-1228 * έκφραση καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος. Σταθερή διαμόλυνση SGC-7901 κυττάρων με miR-1228 * ή miR-NC εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Ο όγκος του κάθε όγκου μετρήθηκε δύο φορές κάθε εβδομάδα. Ο μέσος όγκος των όγκων που αναπτύχθηκε σε γυμνά ποντίκια παρουσιάζεται ως μέσο ± SEM, η = 6 ανά ομάδα θεραπείας. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων προσδιορίστηκαν με την αμφίδρομη ΑΝΟνΑ. (Γ) Σε σύγκριση με τον έλεγχο, τα ξενομοσχεύματα με miR-1228 * υπερέκφραση ήταν σημαντικά μικρότερες. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 5 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό. φωτογραφία δύο ομάδες »των όγκων εμφανίζεται. (Δ) όγκοι από κάθε ομάδα ζυγίστηκαν αμέσως μετά την αφαίρεση. Το βάρος του όγκου ενδείκνυται ως μέσοι όροι ± SEM, n = 6.

Η

NF-κΒ ενεργοποίησης είναι Υπεύθυνος για την χαμηλότερη έκφραση του miR-1228 * σε γαστρικός καρκίνος

Πρόσφατες εργασίες έχει έδειξαν ότι οι περισσότεροι miRNAs έχουν μεταγραφικού παράγοντα (TF) θέσεις πρόσδεσης και πολλές μελέτες έχουν αναφέρει ότι miRNAs μπορούσε να ρυθμιστεί από την TFS [19]. Εδώ χρησιμοποιήσαμε βιοπληροφορικής προγράμματα (Ανάδοχος 2,0 και P-αγώνα) για τον εντοπισμό δυνητικών ρυθμιστές των miRNA-1228 * [16], [17]. Βρήκαμε τρία c-Rel περιοχές δέσμευσης στη 2-kb miR-1228 * περιοχή υποκινητή (Εικ. 3Α). Δεδομένου ότι c-Rel υπομονάδα είναι ένα μέλος της οικογένειας των ΝΡ-κΒ και υπερενεργοποίηση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ έχει δειχθεί ότι σχετίζεται με καρκίνο του στομάχου [20], [21]. Υποθέσαμε ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ αποδίδεται στην αρνητική ρύθμιση του miR-1228 * σε γαστρικό καρκίνο.

(Α) Σχηματική αναπαραστάσεις της περιοχής του υποκινητή miR-1228 * (οι μαύρα βέλη είναι η c-Rel δέσμευσης domains), τόσο χαμηλότερη είναι η pGL3-miR-1228 * κατασκεύασμα προαγωγέα. (Β) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με pGL3-miR-1228 * προαγωγέα ή pGL3-ελέγχου, SGC-7901 κύτταρα διεγέρθηκαν με ή χωρίς ΤΝΡ-α ή /και PDTC επί 8 ώρες, στη συνέχεια μετρήθηκε η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla εκφράζεται από ρΡΙ_-ΤΚ και, στη συνέχεια, σε σύγκριση με το σχετικό επίπεδο λουσιφεράσης των pGL3-ελέγχου. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο.

#

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα του TNF-α-θεραπεία. (C) SGC-7901 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με pGL3-miR-1228 * προαγωγέα /pGL3-ελέγχου και GFP-c-Rel /GFP-ελέγχου, και η έκφραση της λουσιφεράσης σε σχέση ανιχνεύθηκε 48 ώρες αργότερα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε για δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla εκφράζεται από ρΡΙ_-ΤΚ και, στη συνέχεια, σε σύγκριση με το σχετικό επίπεδο λουσιφεράσης των GFP-ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM, n = 3.

Η

Για να αποδείξει την υπόθεσή μας, δημιουργήσαμε ένα λουσιφεράσης κατασκεύασμα με την περιοχή * υποκινητή miR-1228 και αξιολόγησε τη δραστηριότητά της σε απάντηση στην ενεργοποίηση του NF-κΒ. Ένα πείραμα διεξήχθη με καλλιέργεια SGC-7901 κυττάρων για 8 ώρες παρουσία του ΤΝΡ-α (50 ή 100 ng /ml, κλασικό NF-κΒ μονοπάτι ενεργοποιητή) και /ή διθειοκαρβαμιδική πυρρολιδίνη (PDTC, 100 μΜ), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αναστολέα του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ [22]. SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGL3-miR-1228 * προαγωγέα ή pGL3-ελέγχου, 24 ώρες αργότερα, επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα εκτέθηκαν για 8 ώρες για ΤΝΡ-α με ή χωρίς PDTC να ερευνήσει εάν ρυθμίζει την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ miR-1228 * δραστηριότητα του υποκινητή. Παρατηρήσαμε ότι η επεξεργασία του TNF-α αναστέλλεται σημαντικά miR-1228 * δραστηριότητα προαγωγέα και η αναστολή της NF-κΒ με PDTC απέτρεψε ΤΝΡ-α με τη μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων δραστηριότητας (Σχ. 3Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η NF-κΒ μπορεί να ρυθμίζει αρνητικά την ΜΙΚ 1228 * έκφρασης. Να καθορίσει περαιτέρω εάν NF-κΒ υπομονάδα c-συνδεδεμένη είναι υπεύθυνος για την απελευθέρωση των miR-1228 *, έχουμε επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα miR-1228 * προαγωγέα με ή χωρίς GFP-γ-συνδεδεμένη και παρατηρείται σημαντική μείωση της λουσιφεράσης δραστηριότητας GFP -c-συνδεδεμένη ομάδα από τον έλεγχο (Εικ. 3C). Συλλογικά, τα δεδομένα δείχνουν ότι η NF-κΒ υπομονάδες Γ-συνδεδεμένη συμβάλλει λειτουργικά στην αρνητική ρύθμιση του miR-1228 * σε καρκίνο του στομάχου.

miR-1228 * Καταστέλλει NF-κΒ Δραστηριότητα και CK2A2 Έκφραση σε ΓΓΕ-7901

για να διερευνηθεί η επίδραση του miR-1228 * επί της οδού NF-κΒ σηματοδότηση, NF-κΒ κατασκευάσματα δημοσιογράφος επιμολύνθηκαν είτε σε miR-1228 * ή miR-NC σταθερά επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα και τη δραστηριότητα των ΝΡ-κΒ λουσιφεράσης προσδιορίστηκε μετά από 48 ώρες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ μειώθηκε σημαντικά από την υπερέκφραση του miR-1228 * (Εικ. 4Α), υποδεικνύοντας μία αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ miR-1228 * έκφραση και δραστικότητα ΝΡ-κΒ. Να προσδιορίσει περαιτέρω κατάντη στόχοι του miR-1228 * στην οδό NF-κΒ, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις βιοπληροφορική και βρήκε CK2A2 ήταν ένα από τα πιθανά γονίδια-στόχους που είχαν προβλεφθεί. Χρησιμοποιώντας Miranda και RNA22 [23], [24], που βρίσκεται μία πιθανή θέση δέσμευσης για miR-1228 * στην 3’UTR του CK2A2 (Εικ. 4Β). CK2A2 είναι μία υπομονάδα της πρωτεΐνης κινάσης CK2 η οποία εμπλέκεται στο μονοπάτι ΝΡ-κΒ [25], [26] και η έκφραση αυτού έχει παρατηρηθεί να είναι up-ρυθμίζονται σε διάφορες καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου [27], [28]. Περαιτέρω έρευνες σχετικά με τη σύνδεση μεταξύ CK2A2 και miR-1228 * έδειξαν ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης του CK2A2 ήταν ταυτόχρονα προς τα κάτω-ρυθμίζονται κατά miR-1228 * σταθερή υπερέκφραση της ΓΓΕ-7901 κύτταρα (Εικ. 4C). Προκειμένου να εξακριβωθεί αν CK2A2 είναι ένα πραγματικό στόχο του miR-1228 *, ένα τμήμα της CK2A2 3’UTR που περιέχει τη θέση σύνδεσης κλωνοποιήθηκε στην 3’UTR του γονιδίου της λουσιφεράσης στο πλασμίδιο pMIR-REPORT [29]. Η ένταση φθορισμού του γονιδίου αναφοράς ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα που συν-επιμολύνθηκαν με pMIR-CK2A2 και miR-1228 * σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-1228 * αλληλεπιδρά με το CK2A2 mRNA 3’ΙΙΤΡ.

(Α) SGC-7901-miR-1228 * και SGC-7901-miR-NC είχαν επιμολυνθεί με τον δημοσιογράφο NF-κΒ κατασκευάσει, αντίστοιχα. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε για δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Τα αποτελέσματα είναι μέσα ± SEM, η = 3. (Β) Σχηματική γραφική παράσταση της υποθετικής θέσεως συνδέσεως του miR-1228 * στο CK2A2 προβλεφθεί από Miranda. (C) ανάλυση Western blot αποκάλυψε ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης του CK2A2 στο miR-1228 * σταθερή υπερέκφραση SGC-7901 κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με το miR-NC. Το επίπεδο του GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) miR-1228 * μείωσε σημαντικά την ανάγνωση της λουσιφεράσης, όταν συν-επιμολυσμένα με pMIR-CK2A2 3’UTR πλασμίδιο, που δείχνει την αλληλεπίδραση μεταξύ του miR-1228 * και CK2A2 3’ΙΙΤΡ σε αυτό το site. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla εκφράζεται από ρΡΙ_-ΤΚ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM, n = 3.

Η

miR-1228 * Αναστέλλει EMT

Έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στην EMT για εξέλιξης του καρκίνου [30], [31], και η αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ σε ορισμένες κυτταρικές γραμμές όγκου προκάλεσε αντιστροφή της ΕΜΤ [32]. Από miR-1228 * φαίνεται να ρυθμίζει αρνητικά την δραστικότητα του ΝΡ-κΒ, μπορούμε επομένως ερευνήθηκε αν miR-1228 * θα μπορούσε επίσης να ρυθμίζουν αρνητικά EMT σε γαστρικό καρκίνο. κηλίδα Western έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-1228 * στην SGC-7901 κύτταρα ρυθμισμένα προς τα κάτω δείκτες μεσεγχυματικών (βιμεντίνης, β-κατενίνης, σαλιγκάρι, Slug, και ZEB1 /2), ενώ τα επάνω ρυθμισμένη επιθηλιακά δείκτη Ε-καδερίνης (Εικ. 5Α ). Επιπλέον, miR-1228 * υπερέκφραση προκάλεσε μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης (Εικ. 5Β-Γ). Η ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω EMT πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις αλλαγές του miR-1228 * επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα στο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Αποδείχθηκε ότι η έκφραση του βιμεντίνης μειώθηκε και η έκφραση της Ε-καδερίνης αυξήθηκε σε σύγκριση με το οποίο στα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 5D). Τα παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν σε άλλο γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή AGS (Εικ. S1). Τα δεδομένα παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι miR-1228 * αποκατάσταση σε γαστρικό καρκίνο ρυθμίζει αρνητικά EMT.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των επιθηλιακών δείκτη (Ε-καδερίνης) και δείκτες μεσεγχυματικών (βιμεντίνης, β-κατενίνης, σαλιγκάρι , Slug, και ZEB1 /2) στο miR-1228 * σταθερά επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα και ελέγχου. δοκιμασία μετανάστευσης (Β) Transwell έδειξε ότι SGC-7901 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με miR-1228 * είχαν χαμηλότερα μεταναστευτικών δυναμικό σε σύγκριση με το miR-NC (× 100). (Γ) Το σχετικό επίπεδο της κυτταρικής μετανάστευσης παρουσιάζεται ως η μέση τιμή ± SEM, με βάση τρία ανεξάρτητα πειράματα. (D) Έκφραση EMT σχετίζονται δεικτών σε ξενομοσχεύματος όγκου. Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε μειωμένη βιμεντίνης και αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης σε miR-1228 * ξενομοσχεύματος όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο (χ 400).

Η

Συζήτηση

καρκίνο του στομάχου είναι η τέταρτη πιο κοινή κακοήθης όγκος σε όλο τον κόσμο και σήμερα είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο [33], [34]. Παρά το γεγονός ότι η τρέχουσα πρακτική που συνδυάζει χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία με τη χειρουργική εκτομή αύξησε σημαντικά τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι ακόμη χαμηλή. Η γαστρική καρκινογένεση θεωρείται ότι είναι μια πολυπαραγοντική και πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και την απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [35].

miRNAs είναι ενδογενή μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης σύντομο RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική φυσιολογία, την ανάπτυξη, και ασθένειες ρυθμίζοντας αρνητικά την έκφραση του γονιδίου. Αναλύσεις προφίλ έκφρασης miRNA έχουν δείξει ότι πολλές miRNAs έχουν παρεκκλίνοντα εκφράζονται και συσχετίστηκε με την ογκογένεση, την εξέλιξη και την πρόγνωση των διαφόρων αιματολογικών και συμπαγών όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου [36]. Για τον εντοπισμό και τη διαλεύκανση των βιολογικών λειτουργιών των miRNAs απορρύθμισης σε καρκίνο του στομάχου μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε καλύτερα την παθογένεση αυτής της θανάσιμης ασθένειας και παρέχει νέες ευκαιρίες για την ανάπτυξη θεραπειών miRNA-based. Για παράδειγμα, miR-221 και miR-222 έχει δειχθεί να ρυθμίζει θετικά γαστρικού τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή επιλέξτε αυτών miRNAs είναι επωφελής για γαστρικά θεραπείες του καρκίνου [37]. miRNAs παίζουν ένα ρόλο στην αιτιολογία και παθογένεση διαφόρων καρκίνων μέσω στόχευσης έναν αριθμό ογκογονιδίων ή καταστολέων γονίδια όγκου. miR-21 υπερεκφράζεται σε H. pylori λοίμωξη από γαστρικό βλεννογόνο και το γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Επιβάλλεται η έκφραση του miR-21 αυξάνει την ικανότητα εισβολής των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, RECK είναι ο άμεσος στόχος του miR-21 [38]. miR-218 αναστέλλει την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του στομάχου με τη στόχευση του υποδοχέα Robo1 [39]. Ueda et al [40] εντοπίζονται 22 έως ρυθμιζόμενα και 13 κάτω-ρυθμίζονται miRNAs στο γαστρικό καρκίνο έναντι βλεννογόνο μη-όγκου, χαμηλή έκφραση ας-7g και miR-433 και υψηλή έκφραση του miR-214 συνδέθηκαν με δυσμενή έκβαση της συνολικής επιβίωση ανεξάρτητα από την κλινική συμπαράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της το βάθος της εισβολής, μετάσταση λεμφαδένων, και το στάδιο. miR-375 είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο του στομάχου και να λειτουργεί ως καταστολέας όγκου για τη ρύθμιση του γαστρικού πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων δυνητικά με τη στόχευση του JAK2 ογκογονιδίου [10]. Μια άλλη μελέτη μας έδειξε miR-1228 * ήταν ένα επιθηλιακό καρκίνο σχετίζονται miRNA (αδημοσίευτη). Ωστόσο, μόνο λίγες έρευνες του miR-1228 * έχουν αναφερθεί. Guled et al [41] κατέδειξε ότι το miR-1228 * ήταν άκρως εκφράζεται σε κακόηθες μεσοθηλίωμα δείγματα σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα. Όμως, η βιολογική λειτουργία αυτού του miRNA δεν έχει ακόμη εκτιμηθεί. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε προσδιορίσει ότι miR-1228 * ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε περισσότερες από 70% των γαστρικών δειγμάτων καρκίνου όταν συγκρίνεται με μη όγκου των ομολόγων τους και να παρέχουν πειραματικές ενδείξεις ότι μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου μέσω ρύθμισης αρνητικά ΕΜΤ και την αναστολή της NF -κB δραστηριότητα.

Τα στοιχεία μας έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση του miR-1228 * σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Διάφοροι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν σε miRNA απορύθμιση, όπως η γενετική μετάλλαξη, επιγενετικής εκτροπή και απορυθμισμένη μεταγραφική δραστηριότητα [42]. ΤΡ θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση των miRNAs με σύνδεση σε περιοχές υποκινητών, είτε σε φυσιολογική ή παθολογική περιβάλλοντα [43]. Για να διερευνηθεί το πώς miR-1228 * είχε απελευθερωθεί σε γαστρικό καρκίνο, αναλύσαμε την περιοχή προαγωγού-2 kb ανοδικά του miR-1228 * και βρέθηκαν τρεις υποθετικές περιοχές δέσμευσης c-Rel. Αν και NF-κΒ είναι γνωστός για τη λειτουργία ενεργοποίησης της μεταγραφής του, πρόσφατες εργασίες με p65, RelB και γ-συνδεδεμένη έδειξε ότι NF-κΒ μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω συγκεκριμένα γονίδια [17], [44], [45]. Χρησιμοποιώντας ένα miR-1228 * κατασκεύασμα υποκινητή-αναφορέα το οποίο περιείχε 2-kb θραύσματα του miR-1228 * υποκινητή, βρήκαμε ότι το ΝΡ-κΒ ενεργοποιητής οδού TNF-α μειωμένη δραστικότητα προαγωγέα miR-1228 *. Και NF-κΒ αναστολέα PDTC αξιοσημείωτα ανταγωνίστηκε ΤΝΡ-α με τη μεσολάβηση miR-1228 * υποκινητή χαμηλή δραστηριότητα. Τα στοιχεία μας έδειξαν επίσης ότι το c-συνδεδεμένη ήταν σε θέση να συνδέεται άμεσα με το miR-1228 * υποκινητή και ρυθμίζουν αρνητικά την έκφρασή του. Δεδομένου ότι c-Rel υπομονάδα είναι ένα μέλος της οικογένειας των ΝΡ-κΒ, η ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ phenocopied τις επιδράσεις των c-Rel στη ρύθμιση miR-1228 * έκφραση, γεγονός που υποδηλώνει ότι NF-κΒ μονοπάτι αρνητικά που εμπλέκονται στην ρύθμιση προς τα κάτω του miR-1228 * σε γαστρικό καρκίνο. Επιπλέον, miR-1228 * υπερέκφραση οδήγησε επίσης στην προς τα κάτω ρύθμιση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας περιγράφουν μια διπλή αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ NF-κΒ και miR-1228 *. Ο ακριβής μηχανισμός για το πώς αυτό συμβαίνει αρνητικής ανάδρασης χρειάζεται να μελετηθεί περαιτέρω.

CK2A2 είναι μία υπομονάδα της CK2 πρωτεϊνικής κινάσης, η οποία είναι μια πολύ συντηρημένη και κινάση πανταχού παρούσα πρωτεΐνη σερίνη /θρεονίνη. Η υπερέκφραση του CK2 έχει παρατηρηθεί σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων αυτών του μαστικού αδένα, του προστάτη, του νεφρού, του πνεύμονα, της κεφαλής και του λαιμού και του στομάχου [27], [46]. Η υπερέκφραση του CK2 στους μαστικούς αδένες των διαγονιδιακών ποντικών προκαλεί υπερπλασία και δυσπλασία που τελικά οδηγούν σε αδενοκαρκινώματα [47]. CK2 υπερεκφράστηκαν στο κεφάλι και πλακωδών γραμμές καρκίνωμα αυχένα και τους ιστούς. Knockdown υπομονάδων CK2 διαφορικά ανέστειλε την υποβάθμιση ΙκΒα, ΝΡ-κΒ πυρηνικού εντοπισμού, φωσφορυλίωση, δέσμευσης DNA και τη δραστηριότητα ανταποκριτή [25]. CK2 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην Her-2 /neu σηματοδότηση, την προώθηση της αποδόμησης ΙκΒ και ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [26]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι miR-1228 * μείωσε την έκφραση του CK2A2 στο πρωτεϊνικό επίπεδο. Ο προσδιορισμός λουσιφεράσης με έναν δημοσιογράφο που περιέχει το miR-1228 * δεσμευτική ακολουθία στην 3’UTR του CK2A2 mRNA πρότεινε ότι το miR-1228 * στοχεύει άμεσα την 3’UTR της CK2A2. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η καταστολή της δραστηριότητας του NF-κΒ από miR-1228 * μπορεί να είναι μέσω της στόχευσης της έκφρασης CK2A2. EMT είναι τώρα όλα γνωστό ότι συμβαίνουν σε μια ποικιλία ασθενειών, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης του καρκίνου. Αναγνωρίζεται ότι ΕΜΤ είναι μια σημαντική διαδικασία για το σχηματισμό διάχυτη ιστολογία και να κινήσει τη μετάσταση ενισχύοντας την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων [48]. EMT ρυθμίζεται από διαφορετικές οδούς σηματοδότησης ογκογόνο όπως ΑΚΤ και NF-κΒ [49], [50]. Συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ έχει δειχθεί ότι προάγει EMT ενώ η αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ σε μεσεγχυματικά κύτταρο προκαλεί μια αντιστροφή της ΕΜΤ [30]. Η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης και κέρδος βιμεντίνης έκφρασης θεωρούνται οι πιο σημαντικές μοριακούς δείκτες του ΕΜΤ [51].