Αφηρημένο

Σκοπός

Η μεθυλίωση που προκαλείται αποσιώπηση των

PRSS3

έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται σημαντικά με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και την έκφραση του

C16orf74

θέση του γονιδίου έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζονται θετικά με

PRSS3.

ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει τη σχέση μεταξύ των

C16orf74

επίπεδο έκφρασης και εξέλιξης σε μη-μυϊκό διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης ( NMIBC).

Υλικά και Μέθοδοι

C16orf74

επίπεδα mRNA εξετάστηκαν με πραγματικό χρόνο μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) ανάλυση 193 δείγματα όγκων από ασθενείς αντιστρέψει με πρωταρχικό NMIBC. δεδομένα έκφρασης αναλύθηκαν από πλευράς των κλινικών και πειραματικών παραμέτρων. Kaplan-Meier καμπύλες και πολυπαραγοντικά μοντέλα Cox παλινδρόμησης, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η επιβίωση χωρίς εξέλιξη και για τον εντοπισμό ανεξάρτητη προγνωστική παράμετροι της εξέλιξης.

Αποτελέσματα

Ανάλυση χρησιμοποιώντας καμπύλες Kaplan-Meier έδειξε παρατεταμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη της υψηλής

C16orf74

-expressors σε σύγκριση με χαμηλής εκφραστές (p & lt? 0.001). Η πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox αποκάλυψε ότι η χαμηλή

C16orf74

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για την εξέλιξη της νόσου σε ασθενείς με πρωτοπαθή NMIBC (HR: 10.042, CI: 2,699 έως 37,360, p = 0,001)

Συμπεράσματα

Μειωμένη έκφραση του

C16orf74

συσχετίζεται σημαντικά με την πρόοδο στην πρωτοβάθμια NMIBC.

C16orf74

επίπεδο έκφρασης αντιπροσωπεύει ένα δυνητικά χρήσιμο δείκτη για την πρόβλεψη της εξέλιξης στην NMIBC ασθενείς με πρωτοπαθή

Παράθεση:. Kim WT, Yun SJ, Πάρκο C, Kim Ι.Γ, Σελήνη SK, Kwon TG, κ.ά. . (2010) Προσδιορισμός των

C16orf74

ως δείκτης της εξέλιξης στην Πρωτοβάθμια μη-Muscle διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 5 (12): e15260. doi: 10.1371 /journal.pone.0015260

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Αυγούστου 2010? Αποδεκτές: 2 Νοεμ του 2010? Δημοσιεύθηκε: 21 Δεκεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2010-0001730). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περισσότερο από το 90% των καρκίνων της ουροδόχου κύστης είναι μεταβατικό καρκίνωμα κυττάρων, και οι περισσότεροι είναι θηλώδη, καλά, ή μετρίως διαφοροποιημένων-μη-μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) [1] – [2]. Μετά ενδοσκοπική εκτομή, υποτροπής του καρκίνου εμφανίζεται στην πλειοψηφία (50-70%) των ασθενών με NMIBC [3]. Περίπου το 20% αυτών των ασθενών στη συνέχεια βιώνουν την εξέλιξη της νόσου σε μυϊκές διηθητικού καρκίνου της ουροδόχου κύστης (MIBC) μετά από κατάλληλη θεραπεία, συμπεριλαμβανομένων διουρηθρική εκτομή (TUR) και ενδοκυστικής θεραπείας με epirubicin, μιτομυκίνη-C, ή Bacillus Calmette-Guerin (BCG) [1] – [2]. Έτσι, η συχνή υποτροπή μετά από TUR και μετέπειτα εξέλιξη του καρκίνου είναι προβληματικές για τους ασθενείς όσο και για τους ουρολόγους. Σχεδόν το 25% των ασθενών με πρόσφατα διαγνωσμένο καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχουν MIBC, και η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των περιπτώσεων είναι υψηλής ποιότητας ιστολογικών. Σχεδόν το 50% των ασθενών με MIBC έχουν ήδη λανθάνουσα απομακρυσμένες μεταστάσεις κατά τη στιγμή της διάγνωσης [1] – [2]

Ένας αριθμός δυνητικών καρκινικών δεικτών έχουν ταυτοποιηθεί για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, αλλά λίγοι έχουν επιδείξει αποτελεσματικότητα στην. με την πρόβλεψη υποτροπής και εξέλιξης της νόσου. Ωστόσο, αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα γονίδια καταστολής

p53

,

RUNX3

,

RASSF1A

, και

PRSS3

συνδέονται στενά με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [4] – [7]. Συγκεκριμένα,

RASSF1A

και

PRSS3

μεθυλίωση υποστηρικτής συνδέεται με προχωρημένο στάδιο του όγκου [7], γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

PRSS3

με τη σειρά του έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται θετικά με το

C16orf74

έκφρασης [8].

Το

C16orf74

(MGC17624) γονιδιακό τόπο είναι σε χρωμόσωμα 16q24.1, και η λειτουργία του δεν έχει ακόμη χαρακτηριστεί. Τα αποτελέσματα αρκετών μελετών γονιδιώματος σε επίπεδο έχουν δείξει ότι

C16orf74

εμπλέκεται σε φλεγμονώδεις διαδικασίες. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF) -α είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της φλεγμονώδους καταρράκτη σε χρόνιες φλεγμονώδεις νόσους, και σε ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο,

C16orf74

συνδέεται στενά με ένα αντι-ΤΝΡ απάντηση [9].

C16orf74

είναι μια υποξία ρυθμίζεται γονίδιο [10] – [11]. Winter et al. [10] ανέφερε ότι

C16orf74

μεσαίο επίπεδο έκφρασης RNA είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση χωρίς υποτροπή σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.

C16orf74

έχει επίσης δειχθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε λεμφαδένα θετικούς μεταστάσεων σε ασθενείς με καρκίνωμα του στόματος γλώσσα πλακωδών κυττάρων [12], και να συσχετίζονται θετικά με

PRSS3

έκφραση στον καρκίνο του μαστού [8 ].

Πρόσφατα, ανέφερε την ταυτοποίηση μιας εξέλιξης που σχετίζονται με το γονίδιο ταξινομητής που είχε ισχυρή προγνωστική αξία όσον αφορά την έκβαση της νόσου σε NMIBC [13]. Στη μελέτη αυτή,

C16orf74

ήταν ένας από τους οκτώ υποψήφιων γονιδίων που ταυτοποιούνται για την πρόβλεψη της εξέλιξης της νόσου σε NMIBC, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή σχέση μεταξύ καρκίνου της ουροδόχου κύστης και

C16orf74

. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη σχέση μεταξύ των

C16orf74

και τα αποτελέσματα NMIBC χρησιμοποιώντας δεδομένα από μια προηγούμενη μελέτη πληθυσμού, καθώς και νέα κρούσματα, όλα με τη μακροπρόθεσμη παρακολούθηση

Αποτελέσματα.

1. αρχικά χαρακτηριστικά

Η μέση ηλικία των 193 ατόμων με πρωτογενή NMIBC ήταν 64,1 ± 14,0 χρόνια, και η μέση περίοδος παρακολούθησης ήταν 44,9 μήνες. Εβδομήντα ένας ασθενείς (36,8%) παρουσίασαν υποτροπή και 20 (10,4%) παρουσίασαν επιδείνωση. Τα άλλα χαρακτηριστικά κατά την έναρξη των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

2. Η αξία των

C16orf74

επίπεδο έκφρασης του mRNA ως προγνωστικός δείκτης για την εξέλιξη

Η σχέση μεταξύ του

C16orf74

επίπεδο έκφρασης του mRNA και ο χρόνος έως την εξέλιξη αναλύθηκε. Χρησιμοποιώντας μια καμπύλη ROC, μια τιμή αποκοπής (11.7784) για την εξέλιξη με τη μεγαλύτερη συνδυασμένη ευαισθησία (53,2%) και η ειδικότητα (85%) προσδιορίστηκε. Χρόνος έως την εξέλιξη ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των υψηλών και χαμηλών

C16orf74

ομάδες έκφραση του mRNA, σε αυτό το διάστημα έως την πρόοδο στον τομέα της υψηλής

C16orf74

ομάδα έκφραση ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από την ομάδα χαμηλής έκφρασης (p & lt? 0.001) (Εικ. 1). Στην μονοπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox πολλών κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητών (ηλικία, φύλο, το μέγεθος του όγκου, τον αριθμό, την ποιότητα, το στάδιο, ενδοκυστική θεραπεία, και

C16orf74

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA), την ηλικία, την ενδοκυστική θεραπεία και

C16orf74

επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για την πρόοδο (p = 0,031, ρ = 0,034 και ρ & lt? 0.001, αντίστοιχα). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox, την ηλικία και το χαμηλό

C16orf74

επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε ασθενείς με πρωτοπαθή NMIBC (HR: 1,049, CI: 1,005 – 1,094, p = 0,030? Και ΥΕ : 10.042, CI: 2,699 – 37,360, p = 0,001, αντίστοιχα) (Πίνακας 2). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox σε ασθενείς με ενδοκυστική θεραπεία, την ηλικία και τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης του mRNA C16orf74 ήταν σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε ασθενείς με πρωτοπαθή NMIBC με ενδοκυστική θεραπεία (HR1.055, CI: 1,005 – 1,108, p = 0,031? και HR: 14.170, CI:. 2,719 έως 73,837, p = 0,002, αντίστοιχα)

η

Συζήτηση

η θρυψίνη είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεάσης σερίνης που κωδικοποιείται από τρεις τρυψινογένη γονιδίων που περιλαμβάνουν

PRSS1

,

PRSS2

και

PRSS3

κωδικοποιούν τρυψινογόνο Ι, trypsionogen II και τρυψινογόνου IV (επίσης γνωστή ως mesotrypsinogen), αντίστοιχα [14] – [16] . Το ένζυμο αυτό έχει γίνει γνωστό ως ισχυρός πρωτεολυτικό ένζυμο που μπορεί να καταστρέψει ιστό [17] – [18]. Υπάρχουν αντικρουόμενες αναφορές στη βιβλιογραφία του ρόλου των θρυψίνη ή PRSS3 στην πρόοδο του όγκου, με ορισμένες μελέτες ανάθεση θετικό ρόλο [19] – [23], ενώ άλλοι έχουν αναφέρει ότι η θρυψίνη ή PRSS3 παίζει ένα ρόλο κατασταλτικό όγκου. Η έκφραση του PRSS3 μειώνεται στην κύστη, του οισοφάγου, και γαστρικών καρκίνων, και η απώλεια της έκφρασης PRSS3 οφείλεται σε επιγενετικό σίγηση μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού [7], [24] – [25]. Ειδικότερα, σίγηση του

PRSS3

από μεθυλίωση ανάδοχος έχει σημαντική συσχέτιση με επεμβατικές το στάδιο του όγκου στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [7].

Η έκφραση του

C16orf74

έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζονται θετικά με

PRSS3

. Hockla et al. [8] αναφέρει ότι

C16orf74

ρυθμίζεται προς τα κάτω από το νοκ ντάουν του

PRSS3

και υπερεκφράζεται από mesotrypsin θεραπεία. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν υπάρξει αναφορές για μια ένωση του

C16orf74

με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, εκτός των όσων αναφέρονται σε προηγούμενες εργασίες από τους συγγραφείς [13]. Εδώ, αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του mRNA της

C16orf74

και την πρόοδο στην πρωτοβάθμια NMIBC. Μειωμένη έκφραση του

C16orf74

συσχετίστηκε σημαντικά με την εξέλιξη της νόσου σε ασθενείς NMIBC, γεγονός που υποδηλώνει ότι

C16orf74

έχει ένα ρόλο κατασταλτικό όγκου, παρόμοια με

p53, RUNX3

και

PRSS3

, στην εξέλιξη της νόσου. Μέχρι σήμερα, η λειτουργία του

C16orf74

είναι άγνωστη, και επιπλέον μελέτες για να καθορίσουν την ακριβή διαδρομή μέσω της οποίας

C16orf74

επιρροές εξέλιξη στην πρωτοβάθμια NMIBC.

Σε γενικές γραμμές, οι κλινικές και έχουν παθολογικές παραμέτρους όπως είναι ο βαθμός του όγκου, το στάδιο του όγκου, λεμφική εισβολή, το μέγεθος του όγκου, της ΚΑΚ, θηλώδες ή στερεά αρχιτεκτονική του όγκου, και πολυεστιακότητα κρίθηκε χρήσιμο προγνωστικό παραμέτρους για την εξέλιξη της νόσου σε NMIBC. Από αυτούς τους παράγοντες, γενικά βαθμό του όγκου, το στάδιο, και η παρουσία της ΚΑΚ θεωρούνται το πιο σημαντικό. Στην παρούσα μελέτη, ενδοκυστική θεραπεία ήταν ένας παράγοντας κινδύνου για την πρόοδο κατά την μονοπαραγοντική ανάλυση. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με ενδοκυστική ήταν σε μια ομάδα κλινικά υψηλό κίνδυνο για υποτροπή ή εξέλιξη, παρά ότι το πληγέν θεραπεία εξέλιξη [26]. Διάφοροι μοριακοί δείκτες έχουν επίσης αξιολογηθεί για την εξέλιξη της νόσου. Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν εντοπίσει υποθετικών γονιδίων εξέλιξη που σχετίζονται με NMIBC χρησιμοποιώντας ανάλυση γονιδιακής έκφρασης [27] – [29]. Wang et al. [27] πρότεινε ένα πάνελ 57 γονιδίων για να βοηθήσει στην πρόβλεψη της εξέλιξης στην NMIBC. Birkhahn et al. [28] ανέφερε ότι

HRAS

,

VEGFR3

, και

VEGF

επίπεδα έκφρασης που σχετίζονται με την εξέλιξη της με 81% ευαισθησία και 94% ειδικότητα. Eguchi et al. [29] ανέφεραν ότι η απώλεια της 8p23.3 είναι ένας δείκτης για την πρόβλεψη της εξέλιξης και της επανάληψης στο NMIBC. Προηγουμένως, εντοπίσαμε έναν υποψήφιο πρόοδο που σχετίζονται με το γονίδιο ταξινομητής που είχε ισχυρή προγνωστική αξία όσον αφορά την έκβαση της νόσου σε NMIBC [13]. Παρά το γεγονός ότι

C16orf74

είναι ένα ενιαίο μοριακό δείκτη μέσα σε αυτό το υποψήφιο πρόοδο που σχετίζονται με το γονίδιο ταξινομητή, ήταν αρκετή για να προβλέψει τον κίνδυνο εξέλιξης σε NMIBC με ισχυρή αναλογία κινδύνου άνω των 10 κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση.

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της

C16orf74

σε ανθρώπινους ιστούς πρωτογενούς NMIBC σε ένα σχετικά μεγάλο πληθυσμό με μια μακροχρόνια περίοδος παρακολούθησης, μαζί με αρκετές γνωστές κλινικούς παράγοντες κινδύνου, όπως η ηλικία , το μέγεθος του όγκου, τον αριθμό των όγκων, T-κατηγορία, βαθμό του όγκου, και ενδοκυστική θεραπεία [30] – [31]. Αυτές οι πτυχές του σχεδιασμού της μελέτης δανείζουν δύναμη με τα αποτελέσματα, και έντονα δείχνουν ότι

C16orf74

μπορεί να είναι μια κλινικά χρήσιμη προγνωστικό παράγοντα της εξέλιξης στην πρωτοβάθμια NMIBC.

Εν κατακλείδι, μειωμένη έκφραση του

C16orf74

συσχετίστηκε σημαντικά με την πρόοδο στην πρωτοβάθμια NMIBC, και το επίπεδο έκφρασης του

C16orf74

ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό καθοριστικός παράγοντας για την εξέλιξη του όγκου.

C16orf74

μπορεί να διαδραματίσει καθοριστικό ρόλο στην εξέλιξη της NMIBC. Έτσι,

C16orf74

επίπεδο έκφρασης αποτελεί ένα χρήσιμο δείκτη για την πρόβλεψη της εξέλιξης στην NMIBC ασθενείς με πρωτοπαθή.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Ηθική Δήλωση

Η επιτροπή δεοντολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Chungbuk εγκριθεί το πρωτόκολλο αυτό, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε θέμα. Συλλογή και ανάλυση όλων των δειγμάτων εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Πανεπιστημίου Chungbuk.

2. Ασθενείς και δείγματα ιστών

δείγματα Δημοτικό NMIBC από ασθενείς με καρκίνωμα από μεταβατικό επιθήλιο ιστολογικά-επαληθεύεται λαμβάνονται στο ινστιτούτο μας χρησιμοποιήθηκαν για την παρούσα μελέτη. Ασθενείς με ταυτόχρονη καρκίνωμα

in situ

(CIS) ή μια περίοδο παρακολούθησης βραχυπρόθεσμα (λιγότερο από 6 μήνες), και εκείνων που υποβλήθηκαν σε ριζική κυστεκτομή ή για τους οποίους υπήρξε ατελής συλλογή δεδομένων, αποκλείστηκαν για να κάνουν το πληθυσμός της μελέτης πιο ομοιογενής. Ένα σύνολο από 193 στοιχειώδη δείγματα NMIBC αναλύθηκαν.

Όλοι οι όγκοι macrodissected, συνήθως εντός 15 λεπτών από χειρουργική εκτομή. Κάθε κύστη δείγμα καρκίνος επιβεβαιώθηκε από παθολογική ανάλυση ενός τμήματος του δείγματος του ιστού σε φρέσκο ​​κατεψυγμένες τομές από δείγματα TUR, και στη συνέχεια καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Μια δεύτερη TUR διεξήχθη 2-4 εβδομάδες μετά την αρχική εκτομή όταν ένα δείγμα καρκίνου της ουροδόχου κύστης δεν περιλαμβάνει κατάλληλη μυς ή όταν υψηλού βαθμού του όγκου ανιχνεύθηκε [32]. Οι ασθενείς που είχαν όγκο Τ1, πολλαπλούς όγκους, μεγάλοι όγκοι (≥3 εκατοστά σε διάμετρο), ή υψηλού βαθμού Ta NMIBC έλαβαν ένα κύκλο της ενδοκυστικής θεραπείας (BCG ή μιτομυκίνη-C) [26], [32]. Εάν ένας ασθενής αρνήθηκε ενδοκυστική θεραπεία, δεν χορηγήθηκε μετά TUR. Η ανταπόκριση στη θεραπεία εκτιμήθηκε με κυστεοσκόπηση και ουροποιητικού κυτταρολογία. Οι ασθενείς που ήταν απαλλαγμένα από τη νόσο μέσα σε 3 μήνες μετά τη θεραπεία αξιολογήθηκαν κάθε 3 μήνες για τα πρώτα 2 χρόνια και στη συνέχεια κάθε 6 μήνες μετά [26], [32]. Όγκοι οργάνωσαν και κλιμακώνονται ανάλογα με τη ΤΝΜ ταξινόμηση 2002 και το σύστημα ταξινόμησης του ΠΟΥ του 1973, αντίστοιχα [32] – [33]. Υποτροπή ορίστηκε ως υποτροπή του πρωτογενούς NMIBC με χαμηλότερη ή ίδια παθολογική στάδιο, και την εξέλιξη ορίστηκε ως νόσος με ένα ανώτερο στάδιο TNM κατόπιν υποτροπής.

3. Εκχύλιση RNA και η κατασκευή του cDNA

RNA απομονώθηκε από ιστό χρησιμοποιώντας 1 ml ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και ομογενοποίηση σε μια 5-ml γυάλινο σωλήνα. Το ομογενοποιημένο μεταφέρθηκε σε έναν 1,5-ml σωλήνα και στη συνέχεια αναμιγνύεται με 200 μΐ χλωροφορμίου. Μετά από επώαση για 5 λεπτά στους 4 ° C, το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε για 13 λεπτά (min) στα 13.000 χ

g

στους 4 ° C. Η ανώτερη υδατική φάση μεταφέρθηκε σε έναν καθαρό σωλήνα και στη συνέχεια προστέθηκαν 500 μΐ ισοπροπανόλης. Το μίγμα επωάστηκε για 60 λεπτά στους 4 ° C, και στη συνέχεια ο σωλήνας υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση για 8 λεπτά στις 13.000 χ

g

, 4 ° C. Η ανώτερη υδατική φάση απορρίφθηκε και αναμίχθηκαν με 500 μΙ 75% αιθανόλης, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 13,000 χ

g

, 4 ° C. Μετά την απόρριψη του άνω υδατική στιβάδα, το ίζημα ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου, διαλύθηκε σε πυροανθρακικό διαιθύλιο (DEPC) νερό, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C. Η ποιότητα και η ακεραιότητα του RNA επιβεβαιώθηκαν με χρώση αγαρόζης ηλεκτροφόρηση γέλης και βρωμιούχο αιθίδιο, που ακολουθείται από οπτική επιθεώρηση κάτω από υπεριώδες φως. cDNA παρασκευάστηκε από 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ First-Strand cDNA Synthesis (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

4. Real-time PCR

πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ρότορα Gene 6000 μέσου (Corbett Έρευνας, Mortlake, Αυστραλία) για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του

C16orf74

. PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο διεξήχθησαν σε σωλήνες μικρο-αντίδραση (Corbett Research, Mortlake, Australia) χρησιμοποιώντας SYBR Προμίγμα ΕΧ Taq (TAKARA ΒΙΟ INC., Otsu, Japan). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση ήταν

C16orf74

(179 ζεύγη βάσεων) αίσθηση (5′-ΑΑΤ GTG TGT CAG CAG CAG CA-3 ‘) και αντι-νόημα (5′-ΤΤΤ CTC CAT CAT CTG GGC AC-3 »). Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 10 μΐ που αποτελείται από 5 μΐ 2 Χ ρυθμιστικού SYBR premix EX Taq, 0,5 μΙ εκάστου των 5′- και 3’-εκκινητή (10 pmol /μl), και 1 μΙ του δείγματος cDNA. Το προϊόν καθαρίστηκε με κιτ QIAquick Extraction (Qiagen, Hilden, Γερμανία), ποσοτικοποιηθεί με ένα φασματοφωτόμετρο (Perkin Elmer MBA2000, Fremont, CA), και στη συνέχεια αλληλουχήθηκαν με έναν αλληλουχητή φθορισμού αυτοματοποιημένο λέιζερ (ΑΒΙ PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WI). Δέκα-φορές σειριακές αραιώσεις γνωστή συγκέντρωση του προϊόντος (από 100 pg /μl σε 0,1 pg /μl) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία της πρότυπης καμπύλης για PCR πραγματικού χρόνου. Η πραγματικού χρόνου PCR συνθήκες ήταν ως ακολούθως: 1 κύκλος για 20 δευτερόλεπτα (sec) στους 96 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 2 sec στους 96 ° C για μετουσίωση, 15 δευτερόλεπτα στους 60 ° C για ανόπτηση, και 15 sec στους 72 ° C για επέκταση. Το πρόγραμμα τήξη διεξήχθη στους 72-95 ° C με ταχύτητα θερμάνσεως 1 ° C ανά 45 δευτ. Φασματικά δεδομένα συλλήφθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Rotor-Gene Real-Time Λογισμικό Ανάλυσης 6.0 Build 14 (Corbett Έρευνας, Mortlake, Αυστραλία). Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν.

αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH)

αναλύθηκε ως ενδογενής έκφραση γονιδίου αναφοράς RNA και γονίδιο ομαλοποιήθηκε με την έκφραση του

GAPDH

.

5. Η στατιστική ανάλυση

Για να εξομαλύνει την εξαιρετικά ασύμμετρη κατανομή των επιπέδων έκφρασης του mRNA της

C16orf74

, τα δεδομένα μετατράπηκαν φυσικό καταγραφής και στη συνέχεια μετατρέπονται πάλι για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων [34]. χαρακτηριστικά που λειτουργούν δέκτη (ROC) καμπύλες χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί το βέλτιστο σημείο αποκοπής του επιπέδου mRNA που απέδωσε την υψηλότερη συνδυασμένο ευαισθησία και ειδικότητα για την εξέλιξη. Χρησιμοποιώντας αυτές τις τιμές, οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε υψηλές ή χαμηλές

C16orf74

ομάδες έκφρασης. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του χρόνου εξέλιξης, και οι διαφορές εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας στατιστικές log-rank. Η προγνωστική αξία του

C16orf74

από την άποψη της εξέλιξης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας πολυπαραγοντική Cox μοντέλων παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL), και μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

.