Αφηρημένο

Ιστορικό

ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Τα microRNAs (miRNAs, Mirs) παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. MiR-126 έχει δειχθεί ότι είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη σε CRC. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε τις πιθανές επιπτώσεις του miR-126 σε ορισμένες σημαντικές βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων CRC και διευκρίνισε τη ρύθμιση του υποστρώματος υποδοχέα ινσουλίνης 1 (IRS-1) και την πιθανή οδό σηματοδότησης της με miR-126.

Μέθοδοι

Η επίδραση του miR-126 επί IRS-1, ΑΚΤ, και ERK1 /2 έκφραση αξιολογήθηκε στις κυτταρικές γραμμές CRC ΗΤ-29 και HCT-116 με miR-126 μιμητικό ή αναστολέα για να αυξηθεί ή μειώνουν την έκφραση του miR-126. Επιπλέον, οι ρόλοι των miR-126 σε ρύθμιση των βιολογικών ιδιοτήτων των κυττάρων CRC αναλύθηκαν με miR-126 μιμούνται ή αναστολέα-επιμολυσμένα κύτταρα. Η 3′-μη μεταφραζόμενη περιοχή (3′-UTR) του IRS-1 ρυθμίζεται από miR-126 αναλύθηκε με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως διπλής λουσιφεράσης.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι IRS- 1 είναι η λειτουργική κατάντη στόχος του miR-126 με την άμεση στόχευση του 3′-UTR της IRS-1. Η ενδογενής miR-126 και εξωγενείς miR-126 μιμούνται ανέστειλε την έκφραση IRS-1. Επιπλέον, αποκτούν-of-λειτουργία ή μελέτες απώλειας λειτουργίας έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του miR-126 ρυθμισμένα προς τα κάτω IRS-1, καταστέλλεται ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK1 /2, CRC κύτταρα πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, εισβολή, και προκάλεσε τον κυτταρικό κύκλο σύλληψη, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική απόπτωση. Knockdown του miR-126 προωθούνται αυτές τις διαδικασίες σε HCT-116 κύτταρα και προωθείται ΑΚΤ και ERK1 /2 ενεργοποίηση με up-ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης IRS-1.

Συμπεράσματα

MiR-126 μπορεί να παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της βιολογικής συμπεριφοράς των κυττάρων CRC, τουλάχιστον εν μέρει, στοχεύοντας μονοπάτια σηματοδότησης IRS-1 μέσω της ΑΚΤ και ERK1 /2

Παράθεση:. Zhou Υ, Feng Χ, Liu ύλ, Ye sc, Wang Η, Tan Wk, et al. (2013) Down-κανονισμού του miR-126 συνδέεται με καρκινικά κύτταρα του παχέος πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή από Στόχευση IRS-1 μέσω της ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (11): e81203. doi: 10.1371 /journal.pone.0081203

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 31, Αυγούστου του 2013? Αποδεκτές: 14 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα για Διακεκριμένοι Νέα Ταλέντα στην Τριτοβάθμια Εκπαίδευση της Guangdong, Κίνα (αριθμός επιχορήγηση LYM11103). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις πιο κοινές ανθρώπινο γαστρεντερικό κακοηθειών στον κόσμο, με ετήσια αύξηση ποσοστό επίπτωσης και θνησιμότητας [1], [2]. Είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται τόσο στους άνδρες όσο και τις γυναίκες στην Κίνα [3]. Η παθογένεση της CRC δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Έχει προταθεί ότι παχέος καρκινογένεση περιλαμβάνει πολλαπλών σταδίων μοριακές διαδικασίες με την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων, η μετάλλαξη του αναντιστοιχία γονιδίων επιδιόρθωσης ή απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, τα οποία επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, εισβολή, απόπτωση, ή άλλες πτυχές των καρκινικών κυττάρων. Εκτός από την ενεργοποίηση γονιδίου και αδρανοποίηση, αυξάνοντας ενδείξεις υποδηλώνουν ότι microRNAs (miRNAs, Mirs) μπορεί να παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του CRC [4].

Ώριμη miRNAs είναι μία τάξη μικρών, μη κωδικοποιητικού μόρια RNA με ένα μήκος 20-25 νουκλεοτιδίων. Συνήθως αλληλεπιδρούν με τα στοιχεία miRNA αναγνώριση στο 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του mRNA που στόχου, ρυθμίζουν αποικοδόμηση του mRNA, ή να καταστείλει τη μετάφρασή τους ως σημαντική μετα-μεταγραφική ρυθμιστές. Οι miRNAs αποδειχθεί ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους σε πολλές βιολογικές διεργασίες όπως κυτταρική διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό, απόπτωση, φλεγμονώδεις και ανοσολογικές αποκρίσεις [5], [6]. Αύξηση στοιχεία έχουν δείξει ότι τα miRNAs εμπλέκονται κριτικά στην ογκογένεση. Ανάλογα με το κινητό πλαίσιο και στόχος γονίδια που ρυθμίζουν, miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [7], [8]. MiR-200 και miR-155 θα μπορούσε να εμπλέκεται στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή με τη ρύθμιση της μετάβασης επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά ή κυτταρική προσκόλληση [9], [10]. Zhang et al. ανέφεραν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της μετάστασης που σχετίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου-1 (MACC1) και miR-143 έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και απέδειξαν ότι η άμεση αναστολή της μετάστασης που σχετίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου-1 μετάφραση του mRNA που προκαλείται από miR-143 [ ,,,0],11]. Υπερ-έκφραση του miR-211 σε HCT-116 κύτταρα τροποποιημένα ρ53 συνδέονται με την πορεία ρυθμιστικές πρωτεΐνες, π.χ., MDM2, Bcl-2, Bcl-xL και Bax [12]. Πολυάριθμες μελέτες βρήκαν ότι miR-126 μειώνεται σημαντικά σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου και, ως εκ τούτου, μπορεί να παίζει ένα ρόλο ως καταστολέας όγκου. Για παράδειγμα, η χαμηλή έκφραση miR-126 παρατηρήθηκε σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και ταυτοποιήθηκε ως δυσμενής προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών [13]? έκφραση miR-126 μειώθηκε επίσης σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού, και μπορεί να παίζουν ρόλους στην ογκογένεση και ανάπτυξη με τη ρύθμιση της αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα /φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ οδού σηματοδότησης [14]. Η έκφραση του miR-126 σε ιστούς CRC ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε μη καρκινικούς ιστούς, και miR-126 υπερέκφραση ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων CRC [15]. Guo C et al. Σημειώνεται η απώλεια του miR-126 έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικό ανθρώπινο επιθήλιο του παχέος εντέρου και αποκάλυψε ότι miR-126 ρυθμίζει ΡΙ3Κ σηματοδότησης εν μέρει από ρ85β στόχευση [16]. Ωστόσο, η λειτουργία των miR-126 και την πιθανή οδό σηματοδότησης της στην CRC δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως.

υποδοχείς ινσουλίνης υπόστρωμα-1 (IRS-1) είναι ένα μέλος της οικογένειας των υποστρωμάτων των υποδοχέων της ινσουλίνης, τα οποία κατ ‘αρχάς χαρακτηρίζεται ως τυπικά κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών προσαρμογέα τόσο σε υποδοχέα ινσουλίνης (IR) και η ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα Ι υποδοχέα σηματοδότηση (IGF1R). Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι η IRS-1 παίζει επίσης ρόλο στην προώθηση της μίτωσης και την αντίσταση απόπτωση, κακοήθη μετασχηματισμό και πολλαπλασιασμό [17]. Chang et al. [18] βρήκαν ότι IRS-1 ήταν υπερ-εκφράζεται σε διάφορους τύπους συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του μαστού, λειομυώματα, όγκους Wilms, ραβδομυοσαρκώματα, λιποσαρκώματα, λειομυοσαρκώματα και του φλοιού των επινεφριδίων καρκινωμάτων. Επιπλέον, IRS-1 σχετίζεται με CRC [19] και τα επάνω ρυθμισμένη σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου [20]. Βιοπληροφορικής έδειξε ότι η 3’-UTR του IRS-1 περιέχει μία υποθετική θέση δέσμευσης για miR-126. Ωστόσο, η ρύθμιση του miR-126 στο CRC και η σύνδεσή της με την IRS-1 δεν έχει αναφερθεί ακόμα.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να χαρακτηρίσει τους ρόλους του miR-126 και την πιθανή οδό σηματοδότησης της στην παθογένεση των κυττάρων CRC. Σε μελέτες κέρδος-of-λειτουργίας, βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-126 ρυθμισμένα προς τα κάτω έκφραση IRS-1, καταστέλλεται ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK1 /2, CRC κύτταρα πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, εισβολή, και οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική απόπτωση. Νοκ ντάουν του miR-126 προωθείται αυτές τις διεργασίες στα κύτταρα CRC και up-ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης IRS-1. Με τη χρήση κατασκευάσματα γονιδίου λουσιφεράσης-ρεπόρτερ, εντοπίσαμε IRS-1 ως λειτουργική κατάντη στόχος του miR-126.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές CRC ΗΤ -29, HCT-116, SW480 και SW620 αγοράστηκαν από την τράπεζα κυττάρων του νοσοκομείου όγκου της κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών /βιολογικής ανίχνευσης Κέντρο (Πεκίνο, Κίνα). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco), 100 IU /mL πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

miRNA μιμούνται ή αναστολέα διαμόλυνση

Όλα τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων, 12-φρεατίων, πλάκες 24-φρεατίων, ή 96-φρεατίων σε 90% συρροή και να διατηρούνται σε μια θερμοκοιτίδα στους 37 ° C και 5% CO

2 εν μία νυκτί. MiR-126 μιμούνται, miR-126 αρνητικού μιμούνται τον έλεγχο (NC μιμούνται), miR-126 αναστολέα και αναστολέα miR-126 αρνητικού ελέγχου (αναστολέας NC) αγοράστηκαν από Ribobio (RiboBio, Guangzhou, Κίνα) .Varying ποσά των miR-126 μιμούνται ή NC μιμούνται (RiBoBio) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΤ-29, ενώ miR-126 αναστολέα ή αναστολέα NC (RiBoBio) επιμολύνθηκαν σε HCT-116 κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επώασης για 24 ή 48 ώρες. Ολικό κυτταρικό RNA και πρωτεΐνης συλλέχθηκαν ξεχωριστά και αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Αναγνώριση πιθανών κατάντη στόχοι του miR-126

Για την πρόβλεψη πιθανών στόχων του miR-126, τρεις προγράμματα silico ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη microRNA-στόχο, δηλαδή, στόχοι MicroCosm (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/), Targetscan (http: //www.targetscan .org /), και PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/). Το 3′-UTR του IRS-1 mRNA (REFSEQ NM_005544) έχει ένα υποθετικό miRNA-126 θέση πρόσδεσης.

IRS-1 3′-UTR άγριου τύπου και μεταλλαγμένων κατασκευασμάτων

Για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα miR-126 στην έκφραση της IRS-1, δημιουργήσαμε διπλής λουσιφεράσης κατασκευάσματα ανταποκριτή. Η 3′-UTR του mRNA IRS-1 περιέχει την αλληλουχία δέσμευσης υποτιθέμενη miR-126 συντέθηκαν από Sangon Biotech (Σαγκάη, Κίνα). Τα θραύσματα που αντιστοιχούν σε 1-298 νουκλεοτίδια της 3′-UTR του IRS-1 mRNA (298 bp) στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκαν σε

Xho

Ι και

Δεν

Ι θέσεις κατάντη του λουσιφεράσης Renilla στον φορέα psiCheck-2 (Promega). Για να παραχθεί ένα κατασκεύασμα που περιέχει το miR-126 πρόσδεσης μεταλλαγμένη θέση, αντικαταστήσαμε δύο νουκλεοτίδια που αντιστοιχούν στο 5′-σπορά περιοχή της θέσης σύνδεσης miR-126 στο θραύσμα άγριου τύπου.

άγριου τύπου και μεταλλαγμένου κατασκευάσματα ήσαν ορίζεται ως psi-IRS-1 και psi-mutIRS-1, αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Τα κατασκευάσματα μετασχηματίστηκαν σε κύτταρα ϋΗ5α και το πλασμίδιο DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας TIANpure Midiprep κιτ (Tiangen Biotech, Πεκίνο, Κίνα).

Κατασκευάστε την επιμόλυνση και αναφοράς της λουσιφεράσης δοκιμασία

Για να προσδιοριστεί η συγκεκριμένη επίδραση της miR-126 στην 3′-UTR του IRS-1, το miR-126 μιμούνται και ο psi-IRS-1 κατασκεύασμα λουσιφεράσης (500 ng /φρεάτιο) συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. Renilla και Firefly επίπεδα λουσιφεράσης μετρήθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση του Luciferase Assay System Διπλή Reporter (Promega Corporation, Madison, WI). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε φρεάτια εις τετραπλούν και τα δεδομένα που αντιπροσώπευε το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

απομόνωση του συνολικού RNA

Τα καλλιεργημένα κύτταρα ταχέως μεταφέρθηκαν σε 1,0 ml αντιδραστηρίου ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και το ολικό RNA εκχυλίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης αλυσίδα-αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ο Ενός Σταδίου PrimeScript® miRNA cDNA κιτ σύνθεσης και DRR036A (Takara Bio, Inc., Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκαν για να αντιστρέψει-μεταγράφει την miRNA και mRNA, αντιστοίχως. Για qRT-PCR επί επιμολυσμένων κυττάρων, 500 ng ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA. Στη συνέχεια, 2 μL του cDNA από κάθε δείγμα ενισχύθηκε με πραγματικό χρόνο φθορισμού qPCR, χρησιμοποιώντας SYBR® Προμίγματα Ex Taq ™ II (Perfect Real Time) (Takara Bio, Inc.). Η έκφραση του miR-126 σε κάθε ομάδα υπολογίστηκε σε σχέση με εκείνη της U6B, ένα εκφράζεται παντού μικρά πυρηνικά RNA που χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. Εκφραση βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ομαλοποίηση σε mRNA qPCR. Για miRNA qPCR, ο αντίστροφος εκκινητής ήταν η καθολική αστάρι qPCR για miRNA (Takara Bio, Inc.). Forward miRNA και mRNA εκκινητές συντέθηκαν με Sangon Biotech, και οι αντίστοιχες αλληλουχίες που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Μια συγκριτική μέθοδος κύκλος κατωφλίου χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει κάθε κατάσταση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου. Οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν σε LightCycler® (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). Οι συνθήκες PCR ήταν 30 s στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 5 s στους 95 ° C και 20 s στους 60 ° C. Η 2

– △ Ct (2

– [(Ct του γονιδίου) – (Ct του U6)]). Μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση

Η

κηλίδας Western

κηλίδος Western έγινε σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Εν συντομία, 20 μg πρωτεΐνης ανά δείγμα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλοθειϊκό νάτριο και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντι-ανθρώπινο IRS-1 πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (αραίωση 1:1000? CST), αντι-ανθρώπινη ρ-ΑΚΤ πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (αραίωση 1:500? CST), αντι-ανθρώπινο σύνολο-ΑΚΤ πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (1:500 αραίωση? CST), αντι-ανθρώπινο π-ERK1 /2 πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (1:500 αραίωση? ΚΣΑ), ή αντι-ανθρώπινο συνολικού-ERK1 /2 πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (1:500 αραίωση? CST) τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-κουνελιού IgG σημασμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κατσίκας (1:1000? Beyotime, Jiangsu, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 1 h. Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και ένα ποντίκι αφυδρογονάση αντίσωμα αντι-ανθρώπινου αφυδρογονάση 3-φωσφορικής χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του. Το ολοκλήρωμα της οπτικής πυκνότητας των ζωνών πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Bio-Rad, Hercules, CA).

ανοσοφθορισμού

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο (Santa Cruz Biotechnology). Εν συντομία, HCT-116 κύτταρα σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν σε ακετόνη στους 4 ° C για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν με 10% λευκωματίνη ορού κατσίκας σε RT για 1 ώρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο IRS-1 πρωτογενές αντίσωμα κουνελιού (1:200) (Santa Cruz Biotechnology) ολονυκτίως στους 4 ° C. Μετά το ξέπλυμα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 3 φορές, τα κύτταρα επωάστηκαν με δευτερογενές πολυκλωνικό Cy3-επισημασμένο γίδινο αντι-κουνελιού-594 IgG (1:400) (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing, Κίνα) για 1 h σε RT στο σκοτάδι και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Το αντι-IRS-1 αντίσωμα αντικαταστάθηκε με PBS στο δείγμα αρνητικού ελέγχου. 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη χρησιμοποιήθηκε για αντι-χρώση των πυρήνων (5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου). Η χρώση αξιολογήθηκε και η ένταση του φθορισμού μετρήθηκε σε ένα Leica μετατρέπεται μικροσκόπιο φθορισμού. Εμείς ποσοτικώς η συνολική ένταση φθορισμού Cy3 (όπως φαίνεται στο κόκκινο) ως αναπαράσταση του επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης του IRS-1. Η ένταση της 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη χρώσης (μπλε) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος εξομάλυνση για την προσαρμογή σημάτων φθορισμού μεταξύ των διαφόρων πλακών.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου ανάλυση

κυτταρικού κύκλου πραγματοποιείται με τη χρήση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης Κιτ Ανάλυσης (Beyotime). ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα περίπου 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων, καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, όπως αναφέρεται ανωτέρω, συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μg /mL RNase, χρωματίστηκαν με 20 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι, και μετά αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (FACScan? BD Biosciences, San Diego, CA, USA)

προσδιορισμός απόπτωσης

Η μέτρηση της απόπτωσης διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ισοθειοκυανική αννεξίνη V-φλουορεσκεΐνη (Beyotime). Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, συλλέχθηκαν κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 500 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης V. Στη συνέχεια, 5 μΐ αννεξίνης V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη και 10 μί ιωδιούχου προπιδίου προστέθηκαν στα φρεάτια και τα κύτταρα επωάστηκαν για 5 λεπτά στο σκοτάδι. Τα δείγματα αναλύθηκαν μέσα σε 1 ώρα μετά από χρώση με κυτταρομετρία ροής (FACScan? BD Biosciences). Τα κύτταρα υφίστανται διακρίσεις ως βιώσιμα κύτταρα, νεκρωτικά κύτταρα και αποπτωτικά κύτταρα με τη χρήση του λογισμικού Cell Quest (BD Biosciences)? τότε, συγκρίθηκαν τα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων από κάθε ομάδα. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

3 ανά φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω για 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με 100 μί φρέσκο ​​μέσο συμπληρωμένο με το κύτταρο Μετρώντας Kit-8 αντιδραστήριο (10 μL) σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Η απορρόφηση (Α) του κάθε φρεάτιο διαβάστηκε σε 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (Thermo, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων (% του ελέγχου) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Επιβίωση ποσοστό (%) = (Α

δείγματος – A

κενό) /(Α

ελέγχου – Ένα

κενό), όπου Ένα

δείγμα ήταν η οπτική πυκνότητα του miR-126-μορφομετατραπέντα κύτταρα, A

έλεγχος ήταν η οπτική πυκνότητα του NC-επιμολυσμένα κύτταρα, και το Α

κενό ήταν η οπτική πυκνότητα των φρεατίων χωρίς κύτταρα. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

In vitro transwell μετανάστευση και εισβολή δοκιμασία

Transwell μεμβράνες (πολυκαρβονικό μεμβράνης, διαμέτρου 6,5 mm, που μέγεθος πόρων 8 μm) (Corning Costar, NewYork, USA) επικαλυμμένου χωρίς ή με Matrigel (BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της μετανάστευσης ή εισβολή των κυττάρων in vitro, αντίστοιχα. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ΗΤ-29 ή HCT-116 κύτταρα αποκολλήθηκαν με επεξεργασία με 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Gibco), φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο απαλλαγμένο από ορό. Τα επιμολυσμένα κύτταρα (10 χ 10

4 σε 200 μL ελεύθερο ορού μέσο) επανεμβολιάζονται εντός του άνω θαλάμου. Στη συνέχεια, 600 μΙ μέσου που έχει συμπληρωθεί με 20% ορό εμβρύου μόσχου προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από 48 ώρες επώασης, μη μεταναστεύοντα ή μη εισβάλλοντα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης αφαιρέθηκαν με ένα βαμβάκι. Οι μετανάστευσαν ή εισέβαλαν κύτταρα, τα οποία διείσδυσε στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (Beyotime). Ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν ή εισβάλλουν η μεμβράνη μετρήθηκε από 5 τυχαία επιλεγμένα οπτικά πεδία, με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο στα 200 × μεγέθυνση. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική ανάλυση

Τα πειραματικά αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± τυπικό σφάλμα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με t-test του Student για 2 ομάδες χρησιμοποιώντας SPSS λογισμικού, v13.0 (International Business Machines Corporation).

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση του miR-126 σε κυτταρικές σειρές CRC

Αναλύσαμε το επίπεδο έκφρασης του ΜΙΚ 126 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών CRC με διαφορετικούς βαθμούς της διαφοροποίησης και της μεταστατικής ικανότητας, συμπεριλαμβανομένων ΗΤ-29, ΗΟΤ-116, SW480 και SW620 κυττάρων. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση miR-126 ήταν σχετικά υψηλότερη σε HCT-116 κύτταρα από ό, τι στις άλλες τρεις κυτταρικές γραμμές. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 1 υποδεικνύουν ότι η έκφραση miR-126 μπορεί να σχετίζεται με το βαθμό της CRC κυττάρων διαφοροποίησης και μεταστατική ικανότητα. Με βάση αυτό το μοτίβο έκφρασης, εμείς επιλέξαμε ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα για τις ακόλουθες μελέτες κέρδος-of-λειτουργίας και απώλειας λειτουργίας, αντίστοιχα.

Η έκφραση του miR-126 ήταν σχετικά υψηλότερη σε HCT-116 κύτταρα και χαμηλότερα σε ΗΤ-29, SW620 και SW480 κύτταρα από τα 4 διαφορετικές κυτταρικές σειρές CRC. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

επιλογή των πιθανών κατάντη στόχοι του miR-126

MiR-126 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε CRC [15 ]. Προκειμένου να προσδιοριστούν κατάντη στόχοι του miR-126, χρησιμοποιήσαμε τρεις miRNA προγράμματα πρόβλεψης στόχου, δηλαδή, Στόχοι μικρόκοσμος Targetscan, και PicTar, για τον εντοπισμό πιθανών στόχων. Είναι ενδιαφέρον ότι, IRS-1, η οποία εκφράζεται έντονα σε κύτταρα CRC [21], είναι ένα από τα προβλεπόμενα στόχων του miR-126. Μια υποθετική θέση δέσμευσης miR-126 που περικλείει 6 ταιριάζουν απόλυτα νουκλεοτίδια ορίστηκε στο 3′-UTR του IRS-1 (Σχήμα 2Α).

(Α) Θέση της θέσης στόχου miR-126 στην 3 «-UTR του mRNA IRS-1 προβλέφθηκε από TargetScan. ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε το πρωτότυπο δυαδικού φορέα λουσιφεράσης (psi-φορέα) ή ένα IRS-1 3′-UTR κατασκεύασμα με τον άγριο τύπο miR-126 θέση σύνδεσης (psi-IRS-1) ή το μεταλλαγμένο ΜΙΚ 126 θέση πρόσδεσης (psi-IRS-1-mut). Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla (κανονικοποιημένη σε δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly) μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Β) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla μειώθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον άγριου τύπου IRS-1 3′-UTR κατασκεύασμα (psi-IRS-1) σε σύγκριση με εκείνα επιμολυσμένα με το psi-φορέα (500 ng /φρεάτιο ενός 24 φρεατίων -πλάκα). Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla αποκαταστάθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον μεταλλαγμένο κατασκεύασμα (psi-IRS-1mut). (*

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με εκείνη του psi-φορέα). (Γ) Η συν-επιμόλυνση κυττάρων ΗΤ-29 με 50 ηΜ miR-126 μιμούνται και τα διάφορα κατασκευάσματα λουσιφεράσης ανταποκριτή (500 ng /φρεάτιο) μείωσε το σχετικό δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. (*

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με εκείνη του psi-φορέα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Σε μια προσπάθεια να οριοθετηθούν δυναμικό κατάντη στόχων και την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών του miR-126 κάτω ρύθμιση στην παθογένεση της CRC, επιμολύναμε HT -29 κυττάρων με ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης IRS-1 3′-UTR που περιέχει ένα αγρίου τύπου miR-126 υποθετικές θέσεις σύνδεσης (psi-IRS-1) ή ένα μεταλλαγμένο κατασκεύασμα που φέρει μεταλλάξεις σε miR-126 θέσεις δέσμευσης (psi-mutIRS-1 ). Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης του κατασκευάσματος άγριου τύπου psi-IRS-1 έδειξε 45% μείωση σε σύγκριση με το κατασκεύασμα psi-mutIRS-1 (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενδογενής miR-126 μπορεί να ρυθμίσει την IRS-1 με απευθείας στόχευση 3′-UTR της.

Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων, το miR-126 μιμούνται ήταν συν-επιμολυσμένα με τις κατασκευές δημοσιογράφος παραπάνω λουσιφεράσης σε κύτταρα ΗΤ-29. Το miR-126 μιμούνται μειώνεται δραματικά (& gt? 60%) η δράση της λουσιφεράσης του άγριου τύπου κατασκεύασμα ανταποκριτή IRS-1 3′-UTR psi-IRS-1, ενώ το μιμητικό NC δεν είχε καμία επίδραση στην δραστικότητα λουσιφεράσης σε οποιαδήποτε ομάδα ( Σχήμα 2C).

Ωστόσο, το miR-126 μιμητικό δεν μείωσαν την δραστικότητα λουσιφεράσης του μεταλλαγμένου κατασκεύασμα psi-mutIRS-1 (Σχήμα 2C), υποδεικνύοντας ειδική επίδραση αναγνώρισή του. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν περαιτέρω ότι miR-126 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση της IRS-1 με απ ‘ευθείας στόχευση 3’-UTR της.

Η αλλοίωση της εκφράσεως miR-126 άλλαξε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης IRS-1 αλλά όχι το mRNA IRS-1 επίπεδο

Για να δοκιμαστεί εάν miR-126 ρυθμίζει ενδογενή έκφραση IRS-1, το miR-126 μιμούνται και αναστολέα επιμολύνθηκαν παροδικά σε ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα, αντίστοιχα. αξιολογήθηκαν MiR-126 και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA IRS-1. Σε σύγκριση με το NC μιμούνται, επιμόλυνση με 50 ηΜ του miR-126 μιμούνται σε κύτταρα ΗΤ-29 οδήγησε σε μια περίπου 48-πλάσια αύξηση στο επίπεδο έκφρασης miR-126, όπως ανιχνεύεται από qRT-PCR (Σχήμα 3Α). Παρά το γεγονός ότι υπήρξε μια πτωτική τάση στο επίπεδο έκφρασης του mRNA IRS-1 σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-126 μιμούνται, δεν φθάνουν στατιστική σημασία μεταξύ των δύο ομάδων που εξετάστηκαν (

P

& gt? 0,05) (Εικόνα 3Β) . Ταυτόχρονα, βρήκαμε ότι η επιμόλυνση με 100 ηΜ του αναστολέα miR-126 σε HCT-116 κύτταρα θα μπορούσαν να μειώσουν την ώριμη miR-126 επίπεδο αισθητά (Σχήμα 3C), ενώ το επίπεδο mRNA IRS-1 παρέμεινε αμετάβλητο (Σχήμα 3D) .

(Α, Β) ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-126 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα μιμούνται επί 48 ώρες. Η έκφραση του miR-126 και IRS-1 mRNA στο συνολικό RNA αυτών των κυττάρων ανιχνεύθηκε με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-πολυμεράσης ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης. (C, D) HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ του miR-126 αναστολέα ή αναστολέα αρνητικό μάρτυρα για 48 ώρες. Η έκφραση του miR-126 και IRS-1 mRNA στο συνολικό RNA αυτών των κυττάρων ανιχνεύθηκε με ανάλυση qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με εκείνη του αρνητικού μάρτυρα μιμούνται θεραπεία).

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε αν η έκφραση πρωτεΐνης IRS-1 μεταβλήθηκε σε ΗΤ-29 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-126 μιμούνται ή NC μιμούνται και HCT-116 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-126 αναστολέα ή αναστολέα NC. Η αύξηση των επιπέδων miR-126 επίσης μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης IRS-1, όπως προσδιορίζεται με κηλίδα western (

P

& lt? 0,05) (Σχήματα 4Α, Β), ενώ τα επίπεδα του mRNA παρέμεινε αμετάβλητη (

P

& gt? 0,05) (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, για τη διεξαγωγή απώλειας λειτουργίας πειραμάτων, 100 ηΜ αναστολέα miR-126 διαμολύνθηκε σε HCT-116 κύτταρα και σε σύγκριση με την ομάδα NC. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία μείωση στην miR-126 έκφρασης (Εικόνα 3C) και μια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης IRS-1 (

P

& lt? 0,05). (Σχήματα 4C, D)

(Α ) ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-126 μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο (NC) μιμούνται, και των ολικών πρωτεϊνών από τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση IRS-1, π-ΑΚΤ, σύνολο-ΑΚΤ, ρ-ERK1 /2, σύνολο- ERK1 /2, και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) έκφραση με κηλίδωση Western. (Β) Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν με εκείνα της GAPDH και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρία πειράματα. *, Δείχνει ότι τα επίπεδα έκφρασης των IRS-1, π-ΑΚΤ, και ρ-ERK1 /2 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε miR 126-μιμητικό επιμολυσμένων κυττάρων από εκείνη του αρνητικού μάρτυρα (NC) μιμούνται ομάδα (

P

& lt? 0,05). (C) HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-126 αναστολέα ή αρνητικό έλεγχο (NC) αναστολέα, και οι παραπάνω πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. (Δ) Σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν με εκείνα της GAPDH και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρία πειράματα. *, Δείχνει ότι τα επίπεδα έκφρασης των IRS-1, π-ΑΚΤ, και ρ-ERK1 /2 ήταν σημαντικά αυξημένα στην ομάδα αναστολέα miR-126 σε σύγκριση με την ομάδα αναστολέα NC (

P

& lt? 0,05 ). (Ε) HCT-116 κύτταρα χρωματίστηκαν για IRS-1 με ανοσοφθορισμό. IRS-1 εκφράστηκε στο κυτόπλασμα και τα επίπεδα αυξήθηκαν σημαντικά σε miR-126 κύτταρα αναστολέα-επιμολυσμένα. Κόκκινο, IRS-1? μπλε, 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη πυρηνική χρώση. Εικόνες απεικονίστηκαν στα 630 × μεγέθυνση σε μια Leica μετατραπεί μικροσκόπιο φθορισμού. (F) Η ένταση φθορισμού του IRS-1 σε κάθε ομάδα στη συνέχεια υπολογίστηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με εκείνη του αναστολέα NC)

Η

Μεταβολή των miR-126 έκφραση επηρεάζεται ΑΚΤ και ERK1. /2

ενεργοποίηση

Για την περαιτέρω κατανόηση του μοριακού μηχανισμού του miR-126 στην αναστολή ογκογένεσης, βρήκαμε ότι η IRS-1 είναι ένα δυναμικό νέο άμεσο στόχο του miR-126 με μια θέση πρόσδεσης στην περιοχή του 3′-UTR . IRS-1 μπορεί να προσληφθεί και φωσφορυλιώνεται από την ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα Ι κατά την πρόσδεση στον υποδοχέα του, που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας Ι υποδοχέα, ενεργοποιώντας έτσι κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης όπως ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [22]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης IRS-1 σε ΗΤ-29 κύτταρα επιμολυσμένα με 50 ηΜ miR-126 μιμητικό ανεστάλη σημαντικά (κατά 47%) όπως ανιχνεύεται με ανάλυση κηλίδας Western (Σχήματα 4Α, Β). Σε συμφωνία με την μείωση του επιπέδου IRS-1, υπερ-έκφραση του miR-126 σε κύτταρα ΗΤ-29 ανέστειλε επίσης ρ-ΑΚΤ και τα επίπεδα ρ-ERK1 /2 έκφραση (Σχήματα 4Α, Β). Επιπλέον, η επιμόλυνση των HCT-116 κυττάρων με 100 ηΜ αναστολέα miR-126 θα μπορούσε να ρυθμίζουν IRS-1, π-ΑΚΤ, και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης p-ERK1 /2, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στη συνολική ΑΚΤ και έκφραση ERK1 /2 επίπεδα (Σχήματα 4C, D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-126 ρυθμίζει προς τα κάτω μόρια μέσω στόχευσης IRS-1. Επιπλέον, εκτελέσαμε χρώση ανοσοφθορισμού περαιτέρω επί HCT-116 κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-126. Τα αποτελέσματα χρώσης έδειξαν ότι η πρωτεΐνη IRS-1 σαφώς εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα του HCT-116 κύτταρα (Σχήμα 4Ε). επίπεδο της ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα αναστολέας miR-126 σε σύγκριση με την ομάδα αναστολέα NC (

P

& lt? 0,05). (Σχήμα 4F), η οποία είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με western αποτύπωση

miR-126 που προκαλείται G0 /G1 σύλληψη φάση στα κύτταρα CRC

Εμείς διερευνηθεί κατά πόσον η αντι-πολλαπλασιαστική δράση του miR-126 στο ΗΤ-29 κύτταρα συσχετίζεται με τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 5Α, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν ότι επιμόλυνση με το miR-126 μιμούνται αύξησε τον αριθμό των κυττάρων CRC στην φάση G0 /G1, σε σύγκριση με το μιμητικό NC (

P

& lt? 0,05).

(Α) MiR-126 μιμούνται και NC μιμούνται επιμολυσμένα κύτταρα χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε φάση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο γράφημα πυθμένα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

P

& lt? 0,05). (Β) ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-126 μιμούνται ή αρνητικό μάρτυρα μιμούνται επί 48 ώρες. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (Αννεξίνη V θετική) σε σχέση με το συνολικό μετρούμενο κυτταρικό πληθυσμό φαίνεται στο κάτω δεξί τεταρτημόριο του άνω χωρίσματος. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως φορές μεταβολής σε σχέση με το αντίστοιχο μιμητικό (γραφική παράσταση κάτω) NC. (

P

& gt? 0,05, σε σύγκριση με εκείνη του NC απομίμηση). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

MiR-126 δεν είχε καμία επίδραση επί της απόπτωσης σε κύτταρα CRC

Για να μετρηθεί η επίδραση του miR-126 επί CRC κύτταρα απόπτωσης , η απόπτωση μετρήθηκε στις 48 ώρες μετά miR-126 μιμητικό διαμόλυνση με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό των αννεξίνης V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (+) αποπτωτικών κυττάρων στο ΜΙΚ 126-μιμητικό επιμολυσμένα ομάδα σε σύγκριση με το μιμητικό-επιμολυσμένα ομάδα NC (Σχήμα 5Β,

P

& gt? 0,05 ). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι το miR-126 δεν θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα αντι-αποπτωτικό ρόλο στα κύτταρα CRC.

MiR-126 ανέστειλε CRC κύτταρα πολλαπλασιασμού

MiR-126 έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω στην CRC [23], εμπλέκοντας πιθανός ρόλος του στις βιολογικές ιδιότητες των κυττάρων CRC. Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η λειτουργική σημασία του miR-126 σε CRC ογκογένεση, εξετάσαμε την επίδραση της miR-126 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΗΤ-29 με τη χρήση του Κυττάρου Μετρώντας Kit-8 δοκιμασίας. Παρατηρήσαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-126 κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ-29 στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (

P

& lt? 0,05). (Σχήμα 6Α)

(Α) ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με διάφορες ποσότητες miR-126 μιμούνται ή αρνητικό έλεγχο (NC) μιμούνται και κυτταρικός πολλαπλασιασμός αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8. Το miR-126 μιμούνται έδειξε δοσοεξαρτώμενη αποτελέσματα επί αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες. (*

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με εκείνη του NC απομίμηση). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.