Αφηρημένο

Η υπερέκφραση της ριβονουκλεοτιδικής υπομονάδα αναγωγάσης Μ2 (RRM2), που συμμετέχουν στην δεοξυριβονουκλεοτίδιο σύνθεσης, οδηγεί την χημειοαντίσταση του καρκίνου του παγκρέατος σε ανάλογα νουκλεοσιδίου (π.χ., γεμσιταβίνη). Ενώ φίμωση RRM2 με συνθετικά μέσα έχει δείξει υπόσχεση για τη μείωση χημειοαντίσταση, με στόχο την ενδογενή μόρια, ιδιαίτερα microRNAs (miRNAs), για να προωθήσει χημειοθεραπευτικά αποτελέσματα έχει ελάχιστα διερευνηθεί. Με βάση την υπολογιστική προβλέψεις, υποθέσαμε ότι η

ας-7

ογκοκατασταλτικό miRNAs θα αναστείλει RRM2 μεσολάβηση γεμσιταβίνη χημειοαντίσταση στον καρκίνο του παγκρέατος. Μειωμένη έκφραση της πλειοψηφίας των

ας-7

miRNAs με μια αντίστροφη σχέση με την έκφραση RRM2 ταυτοποιήθηκε σε εγγενώς γεμσιταβίνης ανθεκτικά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Η άμεση σύνδεση του

ας-7

miRNAs στο 3 ‘UTR του μεταγραφές RRM2 προσδιορίζονται μετα-μεταγραφική ρύθμιση RRM2 επηρεάζουν γεμσιταβίνης χημειοευαισθησίας. Περιέργως, η υπερέκφραση του ανθρώπινου πρόδρομο

ας-7

miRNAs οδήγησε σε διαφορική έκφραση RRM2 και απαντήσεις χημειοευαισθησία σε μια κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική γραμμή, ΜΙΑ PaCa-2. Ελαττωματικά επεξεργασία των

ας-7α

πρόδρομες ουσίες για να ωριμάσει μορφές, εν μέρει, εξηγεί τις διαφορές που παρατηρούνται με το

ας-7α

εκφραστική αποτελέσματα. Συνέπεια, οι αναλογίες των ώριμων προδρόμων ουσιών

ας-7α

προοδευτικά μειώνεται γεμσιταβίνη ευαίσθητα L3.6pl και κυτταρικές σειρές Capan-1 που προκαλείται για να αποκτήσουν αντίσταση γεμσιταβίνη. Εκτός γνωστό ρυθμιστές του

ας-7

βιογένεση (π.χ., LIN-28), μικρή φουρκέτα διαλογή βιβλιοθήκης RNA εντοπίστηκαν αρκετές νέες πρωτεΐνες δέσμευσης, συμπεριλαμβανομένου του SET ογκοπρωτεΐνη, να διαφορικά επιπτώσεις

RNA ας-7

βιογένεση και τηςχημειοευαισθησίας σε γεμσιταβίνη ευαίσθητα έναντι ανθεκτικών παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω, LIN-28 και SET νοκ ντάουν στα κύτταρα οδήγησε σε βαθιές μειώσεις σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αποικιών σχηματισμό ικανότητες. Τέλος, ελαττωματική επεξεργασία των

ας-7α

πρόδρομες ουσίες με μια θετική συσχέτιση με RRM2 υπερέκφραση εντοπίστηκε στο παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) σε ιστούς που λαμβάνονται από ασθενή. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν μια περίπλοκη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της RRM2 και χημειοευαισθησία από

ας-7α

και ότι ο χειρισμός των ρυθμιστικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην

ας-7α

μεταγραφή /επεξεργασία μπορεί να παρέχει ένα μηχανισμό για τη βελτίωση της χημειοθεραπευτικά ή /και την ανάπτυξη του όγκου αντιδράσεις ελέγχου για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Bhutia YD, Hung ΝΔ, Krentz Μ, Patel D, Lovin D, Manoharan R, et al. (2013) Διαφορικές Επεξεργασία

ας-7

ένα Πρόδρομοι Επιρροές RRM2 Έκφραση και χημειοευαισθησία σε καρκίνο του παγκρέατος: Ο ρόλος του LIN-28 και SET ογκοπρωτείνης. PLoS ONE 8 (1): e53436. doi: 10.1371 /journal.pone.0053436

Επιμέλεια: Guillermo Velasco, Πανεπιστήμιο Complutense, Ισπανία

Ελήφθη: 14η Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 28 του Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιανουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Bhutia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το NCI-5-P50-CA128613-σπορίων (RG), NCI-1R03CA161832-01 (RG), Γεωργία Καρκίνος Συνασπισμός-Γεωργίας Research Alliance (RG), και από το Τμήμα Φαρμακευτικής και Βιοϊατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο της Γεωργίας , Αθήνα, GA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αναγωγάση ριβονουκλεοτιδίου (RR) είναι ένα περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό που καταλύει την αναγωγή των ριβονουκλεοτιδίων σε δεοξυριβονουκλεοτίδια κατά τη σύνθεση DNA. Είναι υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό στερεών όγκων συμπεριλαμβανομένων των παγκρεατικών [1]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι RR δρα ως θετικός καθοριστικός για πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση, καθώς και την ανάπτυξη του χημειοαντίσταση σε νουκλεοσιδικά ανάλογα χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος (π.χ., γεμσιταβίνη, καπεσιταβίνη, 5-φθοριοουρακίλη) [2] – [6]. δραστηριότητα RR ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου κατά κύριο λόγο από την μεταγραφική ενεργοποίηση μιας από μη ταυτόσημες υπομονάδες του, που ονομάζεται RRM2 [7], [8]. έκφραση RRM2 έχει αποδειχθεί ότι επάγεται σε χημειοθεραπεία κύτταρα με γονιδιακή ενίσχυση, μεταγραφική ενεργοποίηση, και ίσως και άλλα αγνώστων μηχανισμών [5], [9]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η εξωγενής χειρισμοί της έκφρασης RRM2 με siRNA ή αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια βελτιώσει χημειοευαισθησία σε καρκίνο του παγκρέατος [10], [11].

Αν και προς τα κάτω ρύθμιση των RRM2 με συνθετικά μέσα (π.χ., siRNA) έχει δείξει δυναμικό στην μειώνοντας την ανάπτυξη του όγκου και gemcitabine χημειοαντίσταση, οι δυνατότητες χειρισμού ενδογενών μορίων να βελτιώσει τις απαντήσεις gemcitabine και ίσως βελτίωση θεραπευτικά αποτελέσματα στον καρκίνο του παγκρέατος έχουν ποτέ διερευνηθεί. Τα microRNAs (miRNAs), ενδογενώς-εκφράζεται ~ 22-nt μεγάλη RNAs ικανή μετα-μεταγραφικά αποσιώπηση του γονιδίου-στόχου εκφράσεις, προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα σε αυτό το θέμα. Για παράδειγμα, ο μεγάλος αριθμός των miRNAs στο ανθρώπινο γονιδίωμα και ποικίλες τους στόχους [12] επιτρέπουν την επιλογή του miRNA (ες), όχι μόνο για τη βελτίωση της χημειοευαισθητοποίηση αλλά να επίσης ευνοϊκά να επηρεάσει ρυθμιστικά δίκτυα πολλών γονιδίων που εμπλέκονται σε πτυχές όπως η ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, καρκινικά βλαστικά κυτταρική επιβίωση, κτλ [13], [14]. Περαιτέρω, επειδή miRNAs συχνά μειωτικά σε καρκίνους [15], [16], αποκατάσταση έκφρασή τους είναι πιθανόν να διευκολύνει συνεργική αποκρίσεις ανάπτυξης-ελέγχου με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Επιπλέον, η επέκταση της κατανόησης της γονιδιακής ρύθμισης miRNA θα προσφέρει ευκαιρίες για το χειρισμό της έκφρασης τους με μικρά μόρια χωρίς την πολυπλοκότητα των συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων παράδοσης μέσα στους όγκους.

Στην αναζήτηση για την υποτιθέμενη miRNA αναστολείς της RRM2 από υπολογιστική miRNA αλγόριθμους πρόβλεψης στόχου , βρήκαμε το

ας-7

οικογένεια των ογκοκατασταλτικών miRNAs να έχουν έναν αγώνα σπόρων για ζευγάρωμα βάσεων με το 3 ‘UTR του RRM2 (εκατοστημόριο βαθμολογία πλαίσιο: 94? TargetScanHuman 5.1). Σταθερά, προηγούμενες μελέτες έχουν ενοχοποιηθεί για μια αιτιώδη σχέση μεταξύ

ας-7

και RRM2, προσδιορίζοντας αρνητική ρύθμιση των πολλών

ας-7

μέλη της οικογένειας σε RRM2-υπερεκφράζουν, γεμσιταβίνη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος ή μείωση στην έκφραση RRM2 μετά

ας-7

υπερέκφραση [17], [18]. Περαιτέρω, η υπερέκφραση του

ας-7

βρέθηκε να αυξάνει την ραδιοευαισθητοποίηση των παγκρεατικών κυττάρων όγκου [19], ενώ η αναστολή της RRM2 ταυτοποιήθηκε για την ευαισθητοποίηση του παγκρέατος να υπεριώδους ακτινοβολίας [20], [21]. Πρόσφατα, η αναγκαστική έκφραση του

ας-7

miRNAs αποδείχθηκε ότι αναστέλλει παγκρεατικού πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων

in vitro

αλλά όχι την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία του συμπλόκου λειτουργικών διακλαδώσεις [22]. Ως εκ τούτου, να μελετήσει τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης μεταξύ

ας-7

και RRM2 και να διερευνηθεί περαιτέρω η δυνατότητα αξιοποίησης

ας-7

για παγκρέατος θεραπευτική του καρκίνου, επιδιώξαμε να προσδιορίσει τις άμεσες επιπτώσεις του ανθρώπινα

ας-7

οικογένεια σε RRM2 μεσολάβηση εγγενή γεμσιταβίνη αντίσταση. Εδώ αναφέρουμε ένα περίπλοκο ρύθμιση της έκφρασης RRM2 και γεμσιταμπίνη χημειοευαισθητοποίηση από

ας

-7

ένα

πρόδρομων ουσιών και να προσδιορίσουν ότι η μεταγραφική /μηχανήματα επεξεργασίας miRNA που εμπλέκονται στην ώριμη

ας-7α

βιογένεση είναι πιθανό να λειτουργήσει ως σημαντικός παράγοντας κατά την εξέταση

ας

7α-based θεραπευτικά για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Tumor RNA και ιστοί

Το συνολικό RNA από 10 ιστούς PDAC και 2 κανονικές παγκρέατος ιστοί προέρχονται από Asterand (Detroit, MI). Η δημογραφική και κλινικές πληροφορίες που είναι διαθέσιμες με τα δείγματα RNA παρουσιάζονται στο

Πίνακας S1

. Έξι PDAC δείγματα ιστού μαζί με τα συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ιστοί που προμηθεύονται από το Εθνικό Disease Research Interchange (Philadelphia, ΡΑ) [23]. NDRI λαμβάνει γραπτές συγκαταθέσεις από τις πηγές. Η προμήθεια και η χρήση αυτών των ανθρώπινων ιστών για την έρευνα αυτή έγινε σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο της Γεωργίας Διοικητικού κριτική Θεσμική. Το Διοικητικό Συμβούλιο έχει αποφασίσει ότι η χρήση ανθρώπινων βιολογικών ιστών σε αυτή την έρευνα δεν πληροί τα κριτήρια για την έρευνα σε ανθρώπους ανά 45 CFR 46.102, και ως εκ τούτου δεν απαιτεί ανθρώπινο υποκείμενο έγκριση από το Διοικητικό Συμβούλιο.

Αντιδραστήρια

γεμσιταβίνη ελήφθη από ChemieTek (Indianapolis, ΙΝ). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) ήταν από ΡΑΑ Laboratories, Inc. (Ontario, Canada). 4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), ιωδιούχου προπίδιο, αιθυλενο δις γλυκόλη (2-αμινοαιθυλο αιθέρα) τετραοξικού οξέος (EGTA), φθοριούχο φαινυλμεθανοσουλφονυλ (PMSF), Ν-αιθυλ μηλεϊμιδίου (ΝΕΜ), ορθοβαναδικό νάτριο (Na

2VO

4), και ιωδοακεταμίδιο ελήφθησαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Το αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης δικιγχονινικού οξέος (BCA) και υπόστρωμα West Pico χημειοφωταύγειας ήταν από την Pierce Chemical (Rockford, IL). Φθορισμού αντι-fade αντιδραστήριο στερέωσης και Vybrant DyeCycle πράσινο λήφθηκαν από Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasticware για κυτταρική καλλιέργεια ελήφθη από Corning (Corning, ΝΥ). Όλα τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας αγοράσθηκαν από τη Mediatech (Manassas, VA) εκτός από την ανθρώπινη κερατινοκυττάρων βασικού μέσου που προμηθεύονται από την Molecular Probes.

Αντισώματα

Το αντι-ανθρώπινο αίγας πολυκλωνικό RRM1 (Τ- 16), RRM2 (Ε-16), dCK (L-19), hCNT3 (C-15), και SET /I2PP2A αντισώματα καθώς και το () αντίσωμα 4B10 μονοκλωνικό ποντικού hnRNP-Α1 (Ε-15) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Οι λεπτομέρειες της hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2, και β-ακτίνη αντισώματα περιγράφηκαν νωρίτερα [23], [24]. Το αντι-ανθρώπινο πολυκλωνικό κουνελιού CDA (ab56053) και KHSRP αντισώματα αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ελήφθησαν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Το αντι-ανθρώπινο πολυκλωνικό κουνελιού LIN-28 αντίσωμα λήφθηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ).

Κατασκευάσματα

RRM2 cDNA χωρίς την περιοχή 3 ‘UTR δομήθηκε από RRM2 truclone (RRM2 (NM_001165931) Ανθρώπινη cDNA κλώνος? ID προϊόντος: SC326997? ΟηΟεηε, MD) χρησιμοποιώντας μεθόδους που βασίζονται στην PCR. Το κατασκεύασμα pmiRGLO-G-FUD αρχικά ελήφθη από την Promega (Madison, WI) και τροποποιείται για να περιέχει GFP συγχωνευμένο με το γονίδιο της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας, καθιστώντας έτσι μια διπλή δοκιμασία ανταποκριτή. Ο υποκινητής αφαιρέθηκε επίσης και ανταλλάσσονται για τον υποκινητή CMV. Ως ρεπόρτερ για τη μεταποίηση, κατασκευές που περιείχε περίπου 50 ζεύγη βάσεων ανάντη και κατάντη του

ας-7α-1

(pmirGLO-GFP /Luc-προ

ας-7α-1

) και

ας-7b

(pmiR-Glo-GFP /Luc-προ

ας-7b

) microRNAs έγιναν και κλωνοποιήθηκε κατάντι του GFP-Luc 3 ‘UTR. Όταν θα διεκπεραιώνονται σωστά, η διάσπαση του microRNA αποσταθεροποιεί το GFP /Luc mRNA οδηγεί σε μείωση και στις δύο πρωτεΐνες.

Cell Culture, ανοσοϊστοχημείας, ΜΤΤ κυτταροτοξικότητας, κυτταρομετρίας ροής, Colony Σχηματισμός, και Real-time PCR Αναλύσεις

Αυτές οι διαδικασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές για RRM2 (Hs00357251_g1) ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA).

miRNA Detection

Σύνολο απομόνωση RNA και σύνθεση cDNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το

mir

Βάνα miRNA Kit απομόνωση και η TaqMan® microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Σχετική ποσοτικοποίηση μεταγράφων RNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. Επικυρωμένη εκκινητών TaqMan και ανιχνευτές για

ας-7α

(hsa000377),

ας-7b

(hsa002619),

ας-7c

(hsa000379),

γράμ- 7δ

(hsa002283),

ας-7ε

(hsa002406),

ας-7f

(hsa000382),

ας-7g

(hsa002282),

ας-7θ

(hsa002221), ιδιωτικού

ας-7α-1

(Hs03302533_pri), ιδιωτικού

ας-7α-2

(Hs03302539_pri) και ιδιωτικού

ας-7α-3

(Hs03302546_pri) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems χρησιμοποιήθηκαν.

Δημιουργία γεμσιταβίνη ανθεκτικών παγκρέατος κύτταρα όγκου

τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (5-20 ηΜ) της γεμσιταβίνης για 5-6 εβδομάδες ανά συγκέντρωση.

Western blotting

ανάλυση κηλίδωσης Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24], εκτός από τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM φθοριούχο νάτριο, 10 mM ΝΕΜ, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM ιωδοακεταμίδιο, 0.5% Triton-X 100, και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Mannheim, Germany). Το ρΗ του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης διατηρήθηκε σε 7,4. Μετά την αξιολόγηση περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη με την BCA Protein κιτ δοκιμασίας, 50 μg /λωρίδα φορτώθηκαν και διαχωρίζεται ηλεκτροφορητικά σε 10% δωδεκυλοθειικό νάτριο πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) πηκτώματα και μεταφέρθηκαν σε 150 V για 1 ώρα ή 20 V επί μία νύκτα σε ένα φθοριούχο πολυβινυλιδίνιο ( PVDF) (Millipore, Billerica, ΜΑ). Αντισώματα έναντι των ένζυμα μεταβολισμού (RRM1, RRM2, dCK, CDA) και νουκλεοσιδικά μεταφορείς (hCNT1, hCNT3, ENT1, ENT2) [24] χρησιμοποιήθηκαν σε 1:500-1000 αραιώσεις. Πυκνομετρικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Δημιουργία ΜΙΑ PaCa-2 Σταθερή κύτταρα που υπερεκφράζουν Προ

ας-7

Μέλη

FIV-ας-7 κατασκευές (

ας-7α-2

,

ας-7α-3

,

ας-7b

,

ας-7c

,

γράμ- 7ε

,

ας-7f-1

,

ας-7f-2

,

ας-7g

, και

ας-7i

) χρησιμοποιήθηκαν από GeneCopoeia (Rockville, MD) και HIV-ας-7 κατασκευές (ας-7α-1 και αφήστε-7δ) από το Σύστημα Βιοεπιστημών (Mountain View, CA). Λεντοϊών κύτταρα συσκευασίας (293Ta? GeneCopoeia) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1.3 με 1.5 × 10

6 σε 10 cm δίσκους που περιείχαν 10 ml από DMEM συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS. Τα κύτταρα αφέθηκαν να φθάσουν 70-80% συρροή κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης των προαναφερθέντων κατασκευάσματα. Ιογενείς λοιμώξεις διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2.5 μg του κλώνου DNA έκφρασης και 5 μΐ (0.5 μg /μl) του μίγματος Lenti-Pac FIV /HIV αραιώθηκαν σε 200 μΙ Ορίί-ΜΕΜ (Invitrogen). Σε ένα χωριστό σωλήνα, 15 μΙ EndoFectin Lenti επίσης αραιωμένο σε 200 μΙ Ορίί-ΜΕΜ. Το αραιωμένο αντιδραστήριο EndoFectin Lenti Στη συνέχεια προστέθηκε στάγδην στο διάλυμα του DNA και στροβιλίστηκε. Το μίγμα στη συνέχεια επωάστηκε για 10-25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να επιτραπεί το σύμπλοκο DNA-Endofectin να σχηματίσουν. Το σύμπλοκο DNA-Endofectin Lenti άμεσα προστέθηκε σε κάθε δίσκο κυττάρων 293Ta. Οι δίσκοι ήπια περιδίνηση για να διανείμει το σύμπλοκο και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ μετά από 24 ώρες, και φακοϊούς συλλέχθηκαν και διηθείται στους 24-48 h μετά την επιμόλυνση. Για την μεταγωγή των συσκευασμένων λεντοϊού κλώνων έκφρασης, τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 εμβολιάστηκαν σε 10 cm δίσκους 24 ώρες πριν από την ιογενή λοίμωξη. Είχαν συνέχεια μολύνθηκαν με 3 mL του ιικού εναιωρήματος σε διάλυμα με 8 μg /mL πολυβρενίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C μετά την οποία συμπληρώθηκαν με φρέσκο ​​μέσο. Μετά από μία περίοδο ανάπτυξης 24 h, οι καλλιέργειες μολύνθηκαν με Zeocin ανθεκτικά γονίδια (pMIF-eGFP-Zeo) επιλέχθηκαν με 400 μg /ml Zeocin (Invitrogen), και εκείνων που έχουν μολυνθεί με πουρομυκίνη-ανθεκτικό γονίδια (pEZX-MR04) επιλέχθηκαν με 10 μg /ml πουρομυκίνη.

shRNA προσυμπτωματικό έλεγχο για Υποθετικά RNA Επεξεργασίας Πρωτεΐνες

96 shRNA κατασκευάζει από το Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Huntsville, AL) ελήφθησαν από την Genome Sciences πόρων στο Vanderbilt Πανεπιστήμιο. Η κυτταρική συσκευασίας βραδέος ιού γραμμή (Phoenix) σπάρθηκε με πυκνότητα 1 × 10

6 σε 6 cm δίσκους που περιέχουν 5 ml ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης με τα κατασκευάσματα shRNA. Ιογενείς λοιμώξεις διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg του κλώνου DNA έκφραση, 0.75 μ§ του φορέα συσκευασίας (pCMV~DR7.74psPAX2) και 0,3 μg του φορέα περιβλήματος (pMD2.G) αναμίχθηκαν και προστέθηκαν σε ένα σωλήνα που περιέχει 200 ​​μΙ Ορίί-ΜΕΜ ( Invitrogen) και 6 μΐ Fugene 6 (Roche). Το μίγμα στη συνέχεια επωάστηκε για 25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μετά το οποίο προστέθηκε απευθείας σε κάθε τρυβλίο των κυττάρων Φοίνιξ. Οι δίσκοι ήπια περιδίνηση για να διανείμει το σύμπλοκο και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ μετά από 24 ώρες, και φακοϊούς συλλέχθηκαν και διηθείται στους 24-48 h μετά την επιμόλυνση. Για την μεταγωγή των συσκευασμένων λεντοϊού κλώνων έκφρασης, ΜΙΑ PaCa-2 και L3.6pl κύτταρα σπάρθηκαν σε συστάδες 6 φρεατίων 24 ώρες πριν από την ιογενή λοίμωξη. Είχαν συνέχεια μολύνθηκαν με 1 mL του ιικού εναιωρήματος σε διάλυμα με 4 μg /mL πολυβρενίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C μετά την οποία συμπληρώθηκαν με φρέσκο ​​μέσο. Μετά από μία περίοδο ανάπτυξης 24 h, τα κύτταρα επιλέγονται με 0.5 και 0.1 μg /mL πουρομυκίνης για ΜΙΑ PaCa-2 και L3.6pl, αντίστοιχα. Αρκετοί σταθεροί κλώνοι σαρώθηκαν με μικροσκόπιο για GFP συνέκφραση.

Target

In Vitro

Reporter Assay

Για δοκιμασίες σύνδεσης λουσιφεράσης, τα κύτταρα 293Ta σπάρθηκαν σε ένα σύμπλεγμα 24 φρεατίων ( 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και μετάγονται με διάφορα ας 7-προδρόμων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μεταφοράς γονιδίων βραδέος ιού (όπως περιγράφεται προηγουμένως). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα αναπληρώνονται με φρέσκα μέσα και επιμολύνθηκαν με 1 μg του ελέγχου ή RRM2 3 ‘διάνυσμα UTR στόχου (ID: HmiT053958? GeneCopoeia), 100 μΐ Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) και 3 μΙ διαμόλυνση FuGeneHD αντιδραστήριο (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τριάντα έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν με τη διαδικασία της παθητικής λύσης και ο χειρισμός όπως περιγράφεται στην Dual-Luciferase Assay Kit (Promega). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 rpm για 30 s, και η δοκιμασία λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκε με το διαυγές υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε μια μαύρη πλάκα μικροτίτλου 96-φρεατίων (Greiner Βίο-One, Monroe, NC). Είκοσι μΐ κυτταρολύματος αναμίχθηκαν με 100 μΙ διαλύματος LARII για να ξεκινήσει η αντίδραση, και 100 μΐ Διακοπή και Glo αντιδραστήριο χρησιμοποιήθηκε για τη σβέση ταυτοχρόνως λουσιφεράσης και να αρχίσει η αντίδραση της Renilla. Λουσιφεράσης και η φωταύγεια Renilla ποσοτικοποιήθηκαν στα 100 nm, και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD.

Στατιστική Ανάλυση

t test του Student χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό σημαντικών διαφορών, και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά,

σ

& lt? 0,05,

σ

& lt? 0,01, και

σ

& lt? 0.001 σε σύγκριση με συνθήκες ελέγχου εκπροσωπήθηκαν από ένα, δύο, και τρεις αστερίσκους, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

RRM2 και

ας-7

είναι αντιστρόφως εκφράζεται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Επαληθεύσαμε πρώτη έκφραση RRM2 στον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές που είχαν χαρακτηριστεί νωρίτερα ως εγγενώς γεμσιταβίνη-ευαίσθητα ή ανθεκτικών [23]. qRT-PCR (

Εικ. 1Α

) και κηλίδωση Western (

Εικ. 1Β

) αναλύσεις έδειξαν σημαντικά υψηλότερο RRM2 mRNA (2-3 φορές) και πρωτεΐνες (5-6 φορές) εκφράσεις, αντίστοιχα, σε 2 από τις 3 γεμσιταβίνης-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν (μΙΑ PaCa-2 και PANC-1) όπως κρίθηκε από τις συγκρίσεις με ένα φυσιολογικό ανθρώπινο παγκρεατικό κυτταρική γραμμή πόρου επιθηλιακά (HPDE). Αντιστρόφως, συγκρίσιμη εκφράσεις RRM2 ταυτοποιήθηκαν μεταξύ των περισσότερων gemcitabine ευαίσθητη κυτταρικές γραμμές (L3.6pl και Capan-1) και HPDE (

Σχ. 1Α-Β

). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μία υπερέκφραση RRM2 είναι πιθανό να παίζει ένα ρόλο στην γεμσιταβίνη χημειοαντίσταση στην πλειονότητα των παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, αν όχι καθόλου.

έκφραση Α,

RRM2 mRNA σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές σε σχέση με την έκφραση που προσδιορίζονται στο HPDE.

Στήλες,

σημαίνουν του τριπλούν?

μπαρ,

SD. n = 3.

B,

κηλίδωση Western ανάλυση RRM2 (-45 kDa) και β-ακτίνης (45 kDa) σε κυτταρικά λύματα του HPDE και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σύνολο.

C,

Έκφραση

γράμ- 7

μέλη της οικογένειας σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές σε σχέση με την έκφραση σε HPDE.

Στήλες

, σημαίνουν του τριπλούν?

μπαρ

, SD. n = 3? *

P

& lt? 0,05.

D,

RRM2 αποτελεί άμεσο στόχο του

ας-7

. 293TA και ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα μολυσμένα με ιούς για την έκφραση των πρόδρομων ουσιών των

ας-7α-1

,

ας-7α-2

,

ας-7α-3

,

ας-7b

, και miR-214 (

αρνητικού ελέγχου

) και στη συνέχεια επιμολύνονται με RRM2 «κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης 3 UTR. δραστηριότητες λουσιφεράσης μετράται 36 ώρες μετά την επιμόλυνση (κανονικοποιημένη σε σχέση με την δραστηριότητα της Renilla) απεικονίσθηκαν.

Στήλες

, σημαίνουν του τριπλούν?

μπαρ

, SD. n = 3. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01

Η

Για να εκτιμηθεί η

ας-7

τον έλεγχο της έκφρασης RRM2, μπορούμε στη συνέχεια προφίλ τις προαναφερθείσες κυτταρικές σειρές για την σχετική έκφραση όλων

ας-7

μέλη της οικογένειας από qRT-PCR. Είναι ενδιαφέρον, σημαντικά χαμηλότερη εκφράσεις των περισσότερων από το

ας-7

miRNAs παρατηρήθηκαν μόνο σε κυτταρικές σειρές με σχετικά μεγαλύτερη έκφραση RRM2. ΜΙΑ PaCa-2 παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του

ας-7α

,

ας-7b

,

ας-7c

,

ας-7ε

,

ας-7f

, και

ας-7g

, PANC-1 έδειξαν μειωμένη έκφραση του

ας-7b

,

ας-7c

,

ας -7d

,

ας-7g

,

ας-7Η

, και

ας-7i

, και BxPC-3 παρουσίασαν μειωμένη έκφραση του

γράμ- 7β

,

ας-7c

,

ας-7η

,

ας-7f

, και

ας-7θ

(

Εικ . 1C

). Καμία μόνο λίγες

ας

-7 μέλη είχαν μειωθεί σημαντικά εκφράσεις στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές που εκφράζουν παρόμοια επίπεδα RRM2 πρωτεΐνης όπως HPDE (δηλαδή, L3.6pl: κανένας? AsPC-1:

ας -7c

? Capan-1:

ας-7c

,

ας-7f

) (

Σχήμα 1C

).. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν μια αντίστροφη σχέση μεταξύ RRM2 και

ας-7

έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Στη συνέχεια δοκίμασε την άμεση αλληλεπίδραση του

ας-7

με RRM2 με επιμόλυνση ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης-έκφραση συντηγμένο με το 3 ‘UTR του RRM2 σε 293Ta (ATCC-CRL-9078) [23] και μΙΑ PaCa-2 παροδικά υπερεκφράζουν

ας-7

μέλη. Ενώ όλα

ας-7

μέλη μειώθηκαν σημαντικά την έκφραση λουσιφεράσης σε κύτταρα 239Ta, πολλοί

γράμ-

7 μέλη έφερε μια σημαντική μείωση της έκφρασης λουσιφεράσης σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, καθώς και (

Εικ. 1D

), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απευθείας σύνδεση του

ας-7

στο RRM2 3 ‘UTR προκαλεί RRM2 καταστολή. Τέλος, δεδομένου ότι

ας-7

υπερέκφραση αυξάνει την G2 /M κλάσμα ινοβλαστών [25] και η έκφραση RRM2 είναι ειδική για τα κύτταρα δ-φάσης, αξιολογήσαμε το ρόλο του

ας-7

σε μειώνοντας έκφραση RRM2 μειώνοντας την αναλογία του ΜΙΑ PaCa-2 σε S-φάση. Υπό αυτές τις συνθήκες, ωστόσο, δεν εξέχοντα μειώσεις σε κύτταρα S-φάσης παρατηρήθηκαν σε οποιοδήποτε από τα προ-

ας-7 που υπερεκφράζουν

ΜΙΑ PaCa-2 (

Εικ. S1

). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά πιθανόν υποδηλώνουν ότι

ας-7

μέλη μπορούν ενδογενώς αναστέλλει την έκφραση RRM2 με άμεση μετα-μεταγραφική καταστολή σε ΜΙΑ PaCa-2.

Ανθρώπινο

ας-7

Οι πρόδρομοι διαφορικά Τροποποίηση RRM2 Έκφραση και γεμσιταβίνη Χημειοευαισθητοποίηση σε μΙΑ PaCa-2

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να δημιουργήσει σταθερούς κλώνους της MIA PaCa-2 που υπερεκφράζουν ένα από τα δέκα του ανθρώπου

ας-7

πρόδρομες ουσίες [27 ] για να μελετήσει τις επιπτώσεις τους στην πρωτεΐνη RRM2 και τηςχημειοευαισθησίας. Επιλέξαμε το PaCa-2 κυτταρική γραμμή ΜΙΑ για αυτές τις έρευνες επειδή εμφανίζει χαμηλή ευαισθησία σε γεμσιταβίνη, ειδικά σε υπο-συρρέουσες συνθήκες, αλλά εκφράζει υψηλά επίπεδα RRM2 (

σχ. 1Β

) [23]. Επιπλέον, ΜΙΑ PaCa-2 αντιπροσωπεύει ένα ελάχιστα διαφοροποιημένο μοντέλο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές [23] και

ας-7

παίζει κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση. ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζει σταθερά προ

ας-7α-1

, προ

ας-7a-

2, προ

ας-7α-3

, προ-

ας-7b

, προ

ας-7η

, προ

ας-7ε

, προ

ας-7f-1,

προ-

ας-7f-2

, και προ

ας-7i

δημιουργήθηκαν επιτυχώς από λεντοϊού μεταφορά γονιδίων? Ωστόσο, επανειλημμένες προσπάθειες να σταθερά μεταγόμενο προ

ας-7c

και προ

ας-7g

απέτυχε λόγω της έλλειψης των αποικιών που επιβιώνουν. Είναι ενδιαφέρον, ανάλυση Western κηλίδωσης έδειξαν σημαντικές μειώσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης RRM2 μόνο ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζει σταθερά προ

του- επιτρέψτε-7α-3

, προ

του- επιτρέψτε-7ε

, προ

του- επιτρέψτε-7f-1

, και προ

του- επιτρέψτε-7i

αλλά μόνο ελάχιστα στα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζει προ

του- επιτρέψτε-7b

, προ

του- επιτρέψτε -7d

, και προ

του- επιτρέψτε-7-f-2

κύτταρα (

Εικ. 2Α

). Παραδόξως, το επίπεδο της RRM2 πρωτεΐνης αυξήθηκαν σε ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζει προ

ας-7α-1

(

Εικ. 2Α

). Ανοσοκυτταροχημική ανάλυση αυτών των σταθερών κλώνων για έκφραση RRM2 [26] επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα αυτά (

Εικ. 2Β

). Τα δεδομένα αυτά προσδιορίζουν ότι RRM2 εκφραστική αποτελέσματα διαφέρουν σημαντικά με την υπερέκφραση των συγκεκριμένων προ

ας-7

υποτύπους σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Μια

, κηλίδωση Western ανάλυση των RRM2 (-45 kDa) και β-ακτίνης (45 kDa) σε κυτταρικά λύματα από ΜΙΑ PaCa-2 υπερεκφράζουν προδρόμους

7 ας-

μέλη της οικογένειας σύνολο. Αναλογίες RRM2 σε β-ακτίνη εντάσεις ζωνών (κανονικοποιημένη για τον έλεγχο) από τρία πειράματα υποδεικνύονται (

κορυφή

). Οι αστερίσκοι δείχνουν σημαντική μείωση (

σ

& lt? 0,05) στα επίπεδα RRM2 σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Β

, ανίχνευση Ανοσοκυτοχημική της RRM2 σε εκθετικά αυξανόμενη ΜΙΑ PaCa-2 που υπερεκφράζουν προ

ας-7

μέλη της οικογένειας. Αρχική μεγέθυνση, x20.

C

, κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 που υπερεκφράζουν σταθερά προ

ας-7

μέλη της οικογένειας (

κόκκινο

) ή μόνο με φορέα (

μπλε

) ήταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (0,1 ηΜ έως 100 μΜ), και επί τοις εκατό αναστολή κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ.

σημεία

, σημαίνουν του τριπλούν?

μπαρ

, SE. n = 3. Γεμσιταβίνη IC

50 εκτιμήσεις που αναφέρονται (

παρένθεση

).

Η

Δεδομένου ότι οι περισσότεροι

ας-7

μέλη [27] φάνηκε να επηρεάσει αρνητικά έκφραση RRM2, θα διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον προ

ας-7

θα μπορούσε να αυξήσει χημειοευαισθησία της MIA PaCa-2 σε γεμσιταβίνη. Είναι ενδιαφέρον, σημαντικές μειώσεις στις γεμσιταμπίνη κυτταροτοξικά IC

50 εκτιμήσεις εντοπίστηκαν σε όλα σχεδόν τα προ

ας-7

εκφράζοντα ΜΙΑ PaCa-2 σταθεροί κλώνοι δημιουργούνται με μόνη εξαίρεση την προ

γράμ- 7α-1

των οποίων η εισαγωγή έφερε καμία διαφορά (

Σχ. 2Γ

). Για να ελέγξετε εάν το

ας-7

μεσολάβηση αύξηση γεμσιταμπίνη κυτταροτοξικότητα διευκολύνθηκε από την καταστολή RRM2, υπερεκφράσαμε RRM2 cDNA με ή χωρίς τα 3 ‘UTR σε ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζει προ

ας-7α-3

. Τα αποτελέσματά μας που προσδιορίζονται κάτω gemcitabine κυτταροτοξικότητα IC

50 σε κύτταρα που εκφράζουν RRM2 με το 3 ‘UTR (69.34 ± 3.4 ηΜ) σε σύγκριση με εκείνους χωρίς την 3’ UTR (383,4 ± 20,3 ηΜ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μείωση του RRM2 πρωτεΐνη ως αποτέλεσμα της προ-

ας-7a-3

υπερέκφραση διευκολύνθηκε από μετα-μεταγραφική καταστολή του RRM2, αν και RRM2-ανεξάρτητους μηχανισμούς είναι πιθανό να παίζουν κυρίαρχο ρόλο σε άλλες προ

ας-7

κύτταρα που υπερεκφράζουν (π.χ., προ

ας-7f-2

).

ελαττωματικά Επεξεργασία προ

ας-7a- 1

σε ΜΙΑ PaCa-2

Παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιείται προ

ας-7

μέλη για την παραγωγή όλων των σταθερών ΜΙΑ PaCa-2 κλώνους, λειτουργικής παρεμβολής RNA αναμενόταν να διαμεσολαβείται από το ώριμη

ας-7

miRNAs που δημιουργούνται μετά από μια σειρά ενδοκυτταρικών γεγονότων επεξεργασίας του RNA. Λόγω των διαφορών στην έκφραση RRM2 και γεμσιταμπίνη χημειοευαισθητοποίηση κατά την υπερέκφραση της προ

του- επιτρέψτε-7

μέλη, έχουμε την υποψία ότι ορισμένες από αυτές τις πρόδρομες ουσίες απέτυχε να μεταποιήσει σε ώριμα

ας-7

μορφές σε ΜΙΑ PaCa -2. Ως εκ τούτου, έχουμε ποσοτικά σχετική ώριμη

ας-7

επίπεδα από qRT-PCR σε διάφορα προ

ας-7-

εκφράζουν ΜΙΑ PaCa-2 κλώνους και τα συνέκριναν με τα mock-μετάγονται ΜΙΑ PaCa- 2. Είναι ενδιαφέρον, σημαντικές αυξήσεις (μέσοι όροι κυμαίνονται από 2-5 φορές) σε ώριμη

ας-7

μορφές εντοπίστηκαν σε όλες τις προ

ας-7

κύτταρα που υπερεκφράζουν δοκιμάζεται, εκτός από την προ-

ας-7-α-1

κύτταρα που υπερεκφράζουν τα οποία δεν παρουσιάζουν καμία μεταβολή στις ώριμες

ας-7α

επίπεδα (

Εικ. 3Α

).

Μια

, Σχετική έκφραση των ώριμων μορφών

ας-7

σε ΜΙΑ PaCa-2 που εκφράζει σταθερά προ

ας-7

μέλη της οικογένειας.

Στήλες,

σημαίνουν του τριπλούν?

μπαρ,

SD. n = 3.

Β,

Σχετική έκφραση του προδρόμου (

συμπληρώθηκε μπαρ

?

δεξιά άξονα

) και ωριμάζουν (

ανοιχτό μπαρ

?

αριστερό άξονα

)

ας-7

μορφές σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν παροδικά

ας-7α πρόδρομοι

.

Στήλες,

σημαίνουν του τριπλούν?

μπαρ,

SD. n = 3.

C,

Σχηματική αναπαράσταση των δομών της προ

ας-7α-1

και προ

ας-7α-3

. Ακολουθίες των ώριμων και των επιβατών

ας-7a είναι

σκέλη εντός των πρόδρομων ουσιών εγκλωβιστούμε σε συνεχείς ή διακεκομμένες γραμμές, αντίστοιχα.

D,

Έλλειψη πλήρη διάσπαση της προ

ας-7α-1

-ΟΡΡ mRNA σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2. ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2 επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με pmirGLO-G-Fud (έλεγχος), pmirGLO-GFP-προ

ας-7α-1

, ή προ-pmirGLO-GFP-προ

ας -7b

κατασκευάζει, και ο φθορισμός GFP συνελήφθη. Αρχική μεγέθυνση, x20. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Από το ελαττωματικό μηχανήματα επεξεργασίας miRNA θα μπορούσε να ρυθμίζει προς τα κάτω ώριμη miRNAs [16], μπορούμε επόμενο διερευνηθεί αν ένα τέτοιο ελάττωμα πλήττει ιδιαίτερα

ας-7α

βιογένεση στον καρκίνο του παγκρέατος. Δεδομένου ότι δεν τήρησε την υπερέκφραση σε ώριμες

ας-7α

σε ΜΙΑ PaCa-2 (

Εικ. 3Α

), επιλέξαμε να ερευνήσει, με λεπτομέρεια, την έκφραση /μεταποίησης και των τριών

ας-7α

πρόδρομες μορφές (προ

ας-7α-1

, προ

ας-7α-2

, και προ

ας-7a- 3

) που προέρχονται από τρία διαφορετικά γονίδια (χρωμοσωμικές θέσεις 9q22.32, 11q24.1 και 22q13.31, αντίστοιχα) [27]. Χρησιμοποιώντας qRT-PCR και εκκινητές που είτε πλαισιώνουν ολόκληρη τη δομή στελέχους-βρόχου (που ανιχνεύουν πρόδρομοι των miRNAs) ή την ώριμη αλληλουχία (η οποία ανιχνεύει ώριμο miRNA), έχουμε ποσοτικά τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των τριών

ας-7α

πρόδρομοι καθώς και ώριμη

ας-7α

σε διάφορα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα παροδικά υπερεκφράζουν προ

ας-7α-1

, προ

ας-7α-2

, ή προ -.

ας-7α-3

Η

Αν και πρόδρομες μορφές ήταν άκρως εκφράζεται σε όλες τις τρεις περιπτώσεις (3-38 φορές αύξηση), ωριμάζουν

ας-7α

ήταν μόνο αυξάνονταν σταθερά στα προ

ας-7α-3

εκφράζοντα κύτταρα, αλλά όχι σε εκείνους που εκφράζουν προ

ας-7α-1

(L3.6pl, ΜΙΑ PaCa-2) (

Εικ. 3Β

). Κύτταρα που εκφράζουν προ

ας-7α-2

έδειξαν ενδιάμεσα επίπεδα (

Εικ. 3Β

).