Αφηρημένο

Ιστορικό

Αυτή τη στιγμή η χημειοθεραπεία περιορίζεται κυρίως σε γενοτοξική φαρμάκων τα οποία συνδέονται με σοβαρές παρενέργειες λόγω της μη-επιλεκτική στόχευση του φυσιολογικού ιστού. Φυσικά προϊόντα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των περισσότερων χημειοθεραπευτικών παραγόντων, με 74,8% του συνόλου των διαθέσιμων χημειοθεραπείας που προέρχονται από φυσικά προϊόντα.

Στόχος

Για την επιστημονική αξιολόγηση και επικύρωση της αντικαρκινικής δυναμικό της ένα αιθανολικό εκχύλισμα του καρπού του Long πιπέρι (PLX), ένα φυτό του

Piperaceae

οικογένεια που έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιατρική, ειδικά Αγιουρβέδα και διερευνηθεί η αντικαρκινική μηχανισμός δράσης της PLX κατά των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά & amp? Μέθοδοι

Μετά την κατεργασία με αιθανολικό εκχύλισμα μακρύ πιπέρι, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου? επαγωγή απόπτωσης παρατηρήθηκε μετά από πυρηνική χρώση Hoechst, η δέσμευση αννεξίνης V της εξωτερικεύονται φωσφατιδυλο σερίνη και αντίθεσης φάσης μικροσκόπιο. Εικόνα που βασίζεται κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της επίδρασης της μακράς εκχύλισμα πιπεριού για την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου και τη διάχυση του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης εξής τετραμεθυλροδαμίνη ή 5,5,6,6′-τετραχλωρο-1,1 ‘, 3, χρώση χλωριούχο 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine (JC-1). Αξιολόγηση της PLX

in-vivo

διεξήχθη χρησιμοποιώντας Balb /C ποντίκια (τοξικότητα) και CD-1 ηυ /ηυ ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς (αποτελεσματικότητα). HPLC ανάλυση επέτρεψε τον εντοπισμό ορισμένων πρωτογενών ενώσεων που υπάρχουν μέσα σε μακροπρόθεσμη εκχυλίσματος πιπεριού μας.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ένα αιθανολικό εκχύλισμα καιρό πιπέρι προκαλεί επιλεκτικά κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα, χωρίς να επηρεάζεται η μη -cancerous κύτταρα, με στόχο την μιτοχόνδρια, που οδηγούν στην απαγωγή του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης και αύξηση της παραγωγής ROS. Απαλλαγή των μελών του ΟΕΕ και ενδονουκλεάση G από απομονωμένα μιτοχόνδρια επιβεβαιώνει την μιτοχόνδρια ως πιθανός στόχος της μακράς πιπέρι. Η αποτελεσματικότητα της PLX σε

in-vivo μελέτες

υποδηλώνει ότι η στοματική χορήγηση είναι σε θέση να σταματήσει την ανάπτυξη των όγκων καρκίνου του παχέος εντέρου σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς, χωρίς σχετική τοξικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την εν δυνάμει ασφαλή και μη τοξικά εναλλακτική λύση που είναι μακρύς εκχύλισμα πιπεριού για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Ovadje P, Ma D, Tremblay P, Ρόμα Α, Steckle Μ, Guerrero J-A, et al. (2014) Αξιολόγηση της Αποτελεσματικότητας & amp? Βιοχημικός μηχανισμός της επαγωγής κυτταρικού θανάτου με

Piper longum

Απόσπασμα επιλεκτικά σε

In-Vitro

και

In-Vivo

Μοντέλα από ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 9 (11): e113250. doi: 10.1371 /journal.pone.0113250

Συντάκτης: Stephanie Filleur, Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2014? Αποδεκτές: 21 Οκτ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 Νοέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Ovadje et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται με τη μορφή γραφημάτων και πινάκων, τα οποία μπορεί να βρεθεί στο χειρόγραφο

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Windsor & amp? Essex County Ίδρυμα Cancer Centre από Seeds4Hope Grant (URL: https://windsorcancerfoundation.org/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συν-συγγραφέας Siyaram Pandey είναι ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου. Ωστόσο, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Η συνεχιζόμενη αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του σηματοδοτεί την ανάγκη για περαιτέρω έρευνα σε πιο αποτελεσματικές και λιγότερο τοξικές εναλλακτικές λύσεις για τις τρέχουσες θεραπείες. Μόνο στον Καναδά, εκτιμάται ότι θα προκύψουν 267.700 νέες περιπτώσεις καρκίνου, με 76.020 θανάτους που συμβαίνουν το 2012 και μόνο. Τα παγκόσμια στατιστικά στοιχεία είναι ακόμη πιο δύσκολη, με 12,7 εκατομμύρια κρούσματα καρκίνου και 7,6 εκατομμύρια θάνατοι από καρκίνο που προκύπτουν κατά το 2008 [1], [2]. Τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων αποκαλύψει τη δυσκολία που στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα επιλεκτικά. Τα καρκινικά κύτταρα είναι διαβόητη για τη διατήρηση πολλαπλασιαστική σηματοδότηση, αποφεύγοντας καταστολή της ανάπτυξης, ενεργοποιώντας την εισβολή και τη μετάσταση και αντιστέκονται κυτταρικό θάνατο, μεταξύ άλλων [3] χαρακτηριστικά. Αυτά τα χαρακτηριστικά θέτουν διάφορες προκλήσεις στην ανάπτυξη επιτυχημένων αντικαρκινικών θεραπειών. Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να αποφύγουν εκδηλώσεις κυτταρικό θάνατο ήταν το κέντρο της προσοχής πολλών ερευνών, με έμφαση επικεντρώνεται στην στοχοθέτηση των διαφόρων ευάλωτες πτυχές των καρκινικών κυττάρων να προκαλέσουν διάφορες μορφές του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (ΣΑΠ) σε καρκινικά κύτταρα, χωρίς συνδεδεμένες τοξικότητες σε μη-καρκινικά κύτταρα.

η απόπτωση (ΣΑΠ τύπου Ι) έχει μελετηθεί για δεκαετίες, η κατανόηση των οποίων θα ενισχύσει την πιθανή ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών του καρκίνου. Αυτή είναι μια μορφή κυτταρικού θανάτου που απαιτείται για την τακτική ανάπτυξη των κυττάρων και την ομοιόσταση, καθώς και ένα μηχανισμό άμυνας για να απαλλαγούμε από τα κατεστραμμένα κύτταρα? κύτταρα που υφίστανται απόπτωση επενδύσει ενέργειας στη δική τους κατάρρευση, έτσι ώστε να μην γίνει μια ενόχληση [2]. Τα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν την απόπτωση, προκειμένου να προσδώσει πρόσθετο πλεονέκτημα ανάπτυξη και τη διατήρηση, ως εκ τούτου, τις τρέχουσες αντικαρκινικές θεραπείες προσπαθούν να εκμεταλλευτούν τα διάφορα τρωτά σημεία των καρκινικών κυττάρων προκειμένου να προκαλέσει την ενεργοποίηση της απόπτωσης μέσω είτε εξωγενή ή ενδογενή οδών [4], [5]. Οι προκλήσεις που αντιμετωπίζει μερικές από τις διαθέσιμες θεραπείες καρκίνου είναι ικανότητές τους να επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα με διέγερση γονιδιωματική βλάβη του DNA. Αν και αυτό είναι αρχικά αποτελεσματικές, καθώς στοχεύουν ταχέως διαιρούμενα κύτταρα [6], είναι συνήθως συνοδεύονται από σοβαρές παρενέργειες που προκαλούνται από τη μη επιλεκτική στόχευση των φυσιολογικών μη καρκινικών κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει την ανάγκη για άλλα μη κοινούς στόχους για την επαγωγή απόπτωσης χωρίς τις σχετικές τοξικότητες.

Φυσικά προϊόντα για την υγεία (πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου) έχουν δείξει μεγάλη υπόσχεση στον τομέα της έρευνας για τον καρκίνο. Τα τελευταία 70 χρόνια έχουν εισαχθεί διάφορα φυσικά προϊόντα ως πηγή πολλών φαρμάκων στη θεραπεία του καρκίνου. Περίπου το 75% των εγκεκριμένων αντικαρκινικών θεραπειών έχουν προέλθει από φυσικά προϊόντα, μια αναμενόμενη στατιστική θεωρώντας ότι περισσότερο από το 80% του αναπτυσσόμενου παγκόσμιου πληθυσμού εξαρτάται από τα φυσικά προϊόντα για τη θεραπεία [7]. Φυτικά προϊόντα ειδικά περιέχουν πολλές βιοδραστικά χημικά που είναι σε θέση να παίξει συγκεκριμένους ρόλους στη θεραπεία των διαφόρων ασθενειών. Λαμβάνοντας υπόψη τα πολύπλοκα μίγματα και φαρμακολογικές ιδιότητες του πολλά φυσικά προϊόντα, είναι δύσκολο να καθοριστεί ένα συγκεκριμένο στόχο και το μηχανισμό δράσης πολλών πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου. Με των NHP επιταχύνεται, ιδίως στον τομέα της έρευνας για τον καρκίνο, υπάρχει πολλές νέες μελέτες σχετικά με την μηχανιστική αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια του των NHP ως δυνητικών αντικαρκινικών παραγόντων [8].

Long πιπέρι, από την οικογένεια Piperaceae, έχει χρησιμοποιηθεί για αιώνες για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Αρκετά είδη καιρό πιπεριού έχουν εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένων των

Piper longum

(το εκχύλισμα του οποίου χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη),

Piper betle

,

Piper retrofactum

, εκχυλίσματα εκ των οποίων έχουν χρησιμοποιηθεί για χρόνια για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Ένας μακρύς κατάλογος των χρήσεων και τα οφέλη που σχετίζονται με εκχυλίσματα διαφόρων

Piper spp

, με αναφορές που δείχνουν την αποτελεσματικότητά τους ως καλό χωνευτικό παράγοντες και τον πόνο και φλεγμονώδη κατασταλτικά [9]. Ωστόσο, υπάρχουν λίγα σε καμία επιστημονική επικύρωση, μόνο ανεπίσημα στοιχεία, για τα οφέλη που συνδέονται με τη χρήση της μακράς εκχυλίσματα πιπεριού. Υπάρχουν επιστημονικές μελέτες έχουν διεξαχθεί σε διάφορες ενώσεις που υπάρχουν σε εκχυλίσματα μακρύ πιπέρι, συμπεριλαμβανομένων piperines, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει πολλές ενζυματικές φάρμακο αντιδράσεις βιο-μετασχηματισμό και παίζει συγκεκριμένους ρόλους στη μεταβολική ενεργοποίηση των καρκινογόνων και μιτοχονδριακή παραγωγή ενέργειας [10] – [13], καθώς και διάφορα πιπεριδίνη αλκαλοειδή, με μυκητοκτόνο δράση [9], [14]. Ορισμένες από αυτές τις ενώσεις έχουν δείξει ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητα [15], υποδηλώνοντας ότι Long εκχυλίσματα πιπεριού θα μπορούσε να αποτελέσει ένα νέο NHP, με καλύτερη επιλεκτική αποτελεσματικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων.

Σε αυτή τη μελέτη, εξετάζουμε την αποτελεσματικότητα ενός αιθανολικού εκχυλίσματος του Long φρούτων πιπέρι (PLX) έναντι διαφόρων καρκινικών κυττάρων, καθώς και προσπάθεια για τη διαλεύκανση του μηχανισμού δράσης, μετά τη θεραπεία. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι PLX μείωσε την βιωσιμότητα των διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων σε μία δόση και εξαρτάται από τον χρόνο τρόπο, όπου παρατηρήθηκε επαγωγή απόπτωσης, μετά μιτοχονδριακή στόχευση και την απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών παραγόντων. Λόγω των χαμηλών δόσεων PLX που απαιτείται για να διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, θα ήταν εύκολο να βρούμε το θεραπευτικό παράθυρο αυτού του εκχυλίσματος. Η επαγωγή της απόπτωσης βρέθηκε να είναι κασπάσης-ανεξάρτητος, αν και υπήρχε ενεργοποίηση τόσο της εξωγενών και ενδογενών οδών και την παραγωγή των ROS δεν ήταν απαραίτητη για το μηχανισμό της επαγωγής κυτταρικού θανάτου από PLX. Το συγκρότημα Polychemical εκχύλισμα του καρπού της μακράς φυτό πιπέρι, ως φυσικό προϊόν για την υγεία με πρωτοφανή αντικαρκινική δράση, παρέχει έναν τρόπο για να στοχεύσετε πολλαπλές ευπάθειες των καρκινικών κυττάρων. Ακόμη και στην παρουσία ορισμένων αναστολέων, PLX ήταν αποτελεσματικό στην επαγωγή της απόπτωσης που υποδηλώνει την πιθανή εφαρμογή των αναπτυσσόμενων PLX ως ασφαλής και αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι μελέτες σε ζώα εκτελέστηκαν σύμφωνα με στο πρωτόκολλο της επιτροπής φροντίδα των ζώων που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Windsor Επιτροπή φροντίδας ζώων? Αυτό το πρωτόκολλο και σχέδιο εγκρίθηκε από την επιτροπή φροντίδα των ζώων – Αριθμός Πρωτοκόλλου:. AUPP 10-17), σύμφωνα με το Καναδικό Συμβούλιο Φροντίδας των Ζώων (CCAC) κατευθυντήριες γραμμές

Cell Culture

Η κακοήθους μελανώματος κυτταρική γραμμή G-361, ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές ΗΤ-29 και HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA Cat Νο CRL-1687, CCL-218 & amp?. CCL-247, αντίστοιχα) καλλιεργήθηκαν με Medium 5a του McCoy (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ΟΝ, Canada) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και 40 mg /ml γενταμυκίνη (Gibco, BRL, VWR). Η κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος ωοθήκης OVCAR-3 (American Type Culture Collection, Cat. Νο ΗΤΒ-161) καλλιεργήθηκε σε RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Καναδά, Mississauga, ΟΝ, Canada) συμπληρωμένο με 0.01 mg /mL βόεια ινσουλίνη, 20% (ν /ν) εμβρυϊκό ορό βοοειδούς (FBS) πρότυπο (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) και 10 mg /mL γενταμυκίνη. Η παγκρεατική κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος BxPC-3 (American Type Culture Collection, Cat. Νο CRL-1424) καλλιεργήθηκε σε RPMI-1640 μέσο, ​​συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) πρότυπο και 40 mg /mL γενταμυκίνη. Κανονική προερχόμενο κόλον βλεννογόνο NCM460 κυτταρική γραμμή (INCELL Corporation, LLC., San Antonio, ΤΧ, USA) αναπτύχθηκε σε μέσο M3Base INCELL του (INCELL Corporation, LLC., Νο Cat. M300A500) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και 10 mg /mL γενταμυκίνη.

Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης των 37 ° C και 5% CO2. Επιπλέον, όλα τα κύτταρα πέρασαν για ≤6 μήνες.

Long Πιπεριά Εξόρυξη

ώριμα και αποξηραμένα φρούτα Ινδικό καιρό πιπέρι ελήφθησαν από Ποιότητας Φυσικά τρόφιμα περιορίζεται, στο Τορόντο του Οντάριο. Το φυτικό υλικό αλέσθηκε και εκχυλίσθηκε σε άνυδρη αιθανόλη (100%) σε αναλογία 1:10 (1 g φυτικού υλικού σε 10 ml αιθανόλης). Η εκχύλιση διεξήχθη όλη τη νύχτα σε έναν αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το εκχύλισμα διήλθε μέσω ενός φίλτρου P8 χοντρό, που ακολουθείται από ένα φίλτρο 0.45 μm. Ο διαλύτης εξατμίστηκε χρησιμοποιώντας περιστροφικού εξατμιστή στους 40 ° C και ανασυστάθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (Me

2SO) σε τελική συγκέντρωση απόθεμα 450 mg /ml.

Κυττάρων Θεραπεία

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 60-70% συρροή πριν θεραπεία με Long Πιπεριά εκχυλίσματα (PLX), Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC) (Sigma-Aldrich Καναδά, Νο Cat. A7250), και ο αναστολέας κασπάσης ευρέως φάσματος, Z-VAD-FMK (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) στις ενδεικνυόμενες δόσεις και διάρκειες. NAC διαλύθηκε σε αποστειρωμένο νερό. Z-VAD-FMK διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (Me

2SO). PLX εκχυλίζεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως, ανασυστάθηκε σε Μένα

2SO. Πριν από τη θεραπεία, ένα αραιό συγκέντρωση εργασίας των 10 mg /ml σε PBS παρασκευάσθηκε. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 mg /ml για να ληφθούν τελικές συγκεντρώσεις που αναφέρονται στην ενότητα αποτελέσματα.

Η αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του Long Πιπέρι Απόσπασμα (PLX) σε καρκινικά κύτταρα

WST-1 Δοκιμασία για Βιωσιμότητας κυττάρων.

για να εκτιμηθεί η επίδραση της PLX σε καρκινικά κύτταρα, ένα υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου (WST-1) με βάση χρωματομετρική δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ, USA ), για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων ως συνάρτηση του κυτταρικού μεταβολισμού. Ίδιος αριθμός κυττάρων σπάρθηκαν πάνω σε 96-κυψελίδων διάφανου πυθμένα πλάκες καλλιέργειας ιστού στη συνέχεια κατεργάζεται με τους υποδεικνυόμενους θεραπείες στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις και διάρκειες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα επωάστηκαν με το αντιδραστήριο WST-1 για 4 ώρες στους 37 ° C με 5% CO2. Το αντιδραστήριο WST-1 διασπάται προς φορμαζάνη από κυτταρικά ένζυμα σε ενεργά μεταβολίζουν κύτταρα. Το προϊόν φορμαζάνης προσδιορίσθηκε ποσοτικά με τη λήψη μετρήσεων της απορρόφησης στα 450 nm σε ένα Wallac Victor

3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ΟΝ, Canada). Κυτταρική βιωσιμότητα ως μέτρο της μεταβολικής δραστικότητας εκφράζονται ως ποσοστά των ομάδων ελέγχου διαλύτη.

πυρηνική χρώση.

Μετά την θεραπεία, οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με 10 μΜ χρωστική Hoechst 33342 ( Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ή 1 mg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Sigma Aldrich, Mississauga, ΟΝ. Canada), για την παρακολούθηση της πυρηνικής μορφολογίας για επαγωγή απόπτωσης σε καθορισμένους χρονικά σημεία και συνολική κυτταρικό θάνατο. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ βαφή Hoechst και 1 mg /ml ΡΙ για 10 λεπτά και μικρογραφίες λήφθηκαν με μια Leica DM IRB ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Wetzlar, Γερμανία) στα 400 × μεγέθυνση. Image-based κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το ποσό του κυτταρικού θανάτου που συμβαίνουν με χρώση ΡΙ.

Annexin V Δοκιμασία Σύνδεσης.

Για να επιβεβαιώσετε την επαγωγή της απόπτωσης, η δέσμευση αννεξίνης V σε φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερικεύεται στην εξωτερική κυτταρική επιφάνεια, αξιολογήθηκε. Μετά τη θεραπεία με PLX, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν και επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αννεξίνης V (10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, ρΗ 7,6) με Annexin V AlexaFluor-488 (1:50) (Invitrogen, Καναδάς, Cat Νο δέσμευσης . A13201) για 15 λεπτά. Στα τελευταία 10 λεπτά επώασης, 10 μΜ Hoechst και ιωδιούχο 1 mg /ml προπιδίου προστέθηκαν στο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου και επωάζονται για τις τελικές 10 λεπτά στο σκοτάδι. Οι μικροφωτογραφίες ελήφθησαν σε 400 χ μεγέθυνση σε ένα Leica DM IRB ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Wetzlar, Germany) και εικόνας με βάση κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του ποσοστού του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (αννεξίνη V θετικά κύτταρα) που συμβαίνουν μετά την αγωγή.

ΤΟΥΝΕΛ χρώσης για να ανιχνεύσει βλάβες στο DNA και Ποσοτικοποίηση απόπτωση.

Μετά τη θεραπεία PLX, ΗΤ-29 κύτταρα σημάνθηκαν με το Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης dUTP nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας. Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Molecular Probes, Eugene, OR), με σκοπό την ανίχνευση της βλάβης του DNA. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PLX ή VP-16 (ως θετικός έλεγχος) σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και χρονικά σημεία και αναλύθηκαν για τον κατακερματισμό του DNA. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με αιώρηση τους σε 70% (ν /ν) αιθανόλη και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C επί μία νύκτα. Το δείγμα στη συνέχεια επωάζεται με ένα διάλυμα σήμανσης DNA (ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης 10 μL, 0.75 μL TdT ένζυμο, 8 μί BrdUTP, 31.25 μι dH2O) για 1 ώρα στους 25 ° C. Κάθε δείγμα εκτέθηκε σε ένα διάλυμα αντισώματος (5 μL Alexa Fluor 488 σημασμένο αντι-BrdU αντίσωμα και διάλυμα έκπλυσης 95 μί). Τα κύτταρα επωάστηκαν με το διάλυμα αντισώματος για 20 λεπτά και θετικά κύτταρα TUNEL ποσοτικοποιήθηκαν με κυτταρομετρία εικόνα με βάση.

Ολικού Κυττάρου ROS Γενιάς.

Μετά από θεραπεία με PLX, τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin διοξική H

2DCFDA (Catalog Νο D6883, Sigma Aldrich, Mississauga ON. Καναδάς) για 45 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και πράσινο φθορισμό παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα TALI εικόνας με βάση κυτταρόμετρο (Invitrogen, Canada). NAC χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η εξάρτηση της PLX για την παραγωγή και τη βιωσιμότητα των ROS.

Αξιολόγηση της λειτουργίας μιτοχονδριακού Μετά PLX Θεραπεία

τετραμεθυλοροδαμίνης μεθυλεστέρας (TMRM) Χρώση.

Για την παρακολούθηση δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ), τετραμεθυλοροδαμίνη μεθυλεστέρα (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ΟΝ, Canada) ή 5,5,6,6′-τετραχλωρο-1,1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine χλωρίδιο ( JC-1) (Invitrogen, Canada) χρησιμοποιήθηκαν. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις των θεραπειών στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, και επωάστηκαν με 200 ηΜ TMRM για 45 λεπτά στους 37 ° C. Μικρογραφίες ελήφθησαν σε 400 χ μεγέθυνση σε ένα Leica DM IRB ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Wetzlar, Germany). Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με μικροσκοπία φθορισμού, κυτταρομετρία εικόνα με βάση χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το κόκκινο φθορισμό. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και μετά την αγωγή, τα κύτταρα επωάστηκαν με TMRM για 45 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και τοποθετήθηκαν σε TALI διαφάνειες. Red φθορισμός ελήφθη χρησιμοποιώντας TALI εικόνας με βάση κυτταρόμετρο (Invitrogen, Canada).

μιτοχονδριακού Απομόνωση για να αξιολογηθεί μιτοχονδριακή στόχευση.

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν μία φορά σε ψυχρό PBS, επαναιωρήθηκαν σε κρύο υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM μαννιτόλη, 70 mM σακχαρόζη, 10 μΜ Leu-pep και pep-Α, 100 μΜ PMSF), και με το χέρι ομογενοποιείται. Το ομογενοποιημένο διάλυμα κυττάρου φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C και το μιτοχονδριακό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ψυχρό ρυθμιστικό αντίδρασης (2,5 mM μηλικό, 10 mM ηλεκτρικό, 10 μΜ Leu-pep και Pep-Α, 100 μΜ PMSF εντός PBS). Τα απομονωμένα μιτοχόνδρια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PLX στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και επωάστηκαν για 2 ώρες σε κρύο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης. Η ομάδα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαλύτη (αιθανόλη). Μετά ωρών επώαση 2 με εκχύλισμα, μιτοχονδριακή δείγματα περιδινήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το προκύπτον υπερκείμενο υγρό και μιτοχονδριακή σφαιριδίων (επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό αντίδρασης) υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western Blot για την αξιολόγηση προς μιτοχονδριακή απελευθέρωση /κατακράτηση του προ-αποπτωτικών παραγόντων.

Western Blot Αναλύσεις.

Protein δείγματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και δεσμεύτηκαν με 5% w /v TBST γάλα (Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα Tween-20) για 1 ώρα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 ° C με ένα αντι-ενδονουκλεάση G αντίσωμα (EndoG) (1:1000) έθεσε σε κουνέλια (Abcam, Cat. Νο ab9647, Cambridge, MA, USA), αντι-ηλεκτρικό αφυδρογονάση υπομονάδα Α ( SDHA) αντίσωμα (1:1000) έθεσε σε ποντίκια (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-59687, Paso Robles, Καλιφόρνια, ΗΠΑ), ή ένα αντι-απόπτωση παράγοντα επαγωγής (ΟΕΕ) αντίσωμα που αναπτύχθηκε σε κουνέλια (1:1000) (Abcam, Cat. No. ab1998, Cambridge, MA, USA). Μετά την αρχική επώαση αντίσωμα, η μεμβράνη πλύθηκε μία φορά για 15 λεπτά και δύο φορές για 5 λεπτά σε TBST. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ένα αντι-ποντικού ή χρένο δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:2000) (Abcam, ab6728, ab6802, Cambridge, MA, USA) που ακολουθείται από τρεις εκπλύσεις 5 λεπτών σε TBST. αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ΟΝ, Canada) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση ζώνες πρωτεΐνης και ανάλυση πυκνομετρίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

In-Vivo

Αξιολόγηση της Long Πιπεριά Εκχύλισμα

αξιολόγηση της τοξικότητας.

ηλικίας έξι εβδομάδων ποντικοί Balb /C αποκτήθηκαν από Charles River Laboratories και στεγάζεται σε σταθερές εργαστηριακές συνθήκες ενός σκότους /12-ώρες φως, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των ζώων περιγράφονται στο Πανεπιστήμιο του Windsor Έρευνα Ηθικής διοικητικό συμβούλιο-AUPP 10-17). Μετά εγκλιματισμό, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες (3 ζώα /ελέγχου (χωρίς θεραπεία), 3 ζώα /ελέγχου καθετηριασμό (θεραπεία όχημα) και 4 ζώα /ομάδα θεραπείας). Το μη επεξεργασμένο ομάδα ελέγχου δόθηκε απλό φιλτραρισμένο νερό, ενώ η δεύτερη και η τρίτη ομάδα δόθηκε 50 mg /kg /ημέρα του οχήματος (Me

2SO) ή PLX, αντίστοιχα, για 75 ημέρες. Κατά την περίοδο της μελέτης, η τοξικότητα μετρήθηκε με ζύγιση ποντίκια δύο φορές την εβδομάδα και τα ούρα συλλέχθηκαν για ανάλυση ούρων πρωτεΐνη με δείκτη στάθμης ούρα και δοκιμασίες Bradford. Μετά την διάρκεια της μελέτης, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα όργανά τους (συκώτια, νεφρά και οι καρδιές) ελήφθησαν για ανοσοϊστοχημική και τοξικολογική ανάλυση από τον Dr. Brooke στο Πανεπιστήμιο του Guelph.

Αποτελεσματικότητα του PLX σε ξενομοσχεύματος όγκου Μοντέλα Ανοσοκατεσταλμένοι ποντίκια.

ηλικίας έξι εβδομάδων αρσενικούς CD-1 ηυ /ηυ ελήφθησαν από την Charles River Laboratories και στεγάζεται σε σταθερές εργαστηριακές συνθήκες ενός σκότους /12-ώρες φως, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφονται στο ζώο το Πανεπιστήμιο του Windsor Έρευνα Ηθικής διοικητικό συμβούλιο-AUPP 10-17). Μετά εγκλιματισμό, τα ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως στο δεξιό και αριστερό οπίσθια πλευρά με ένα καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικό εναιώρημα (σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών) σε συγκέντρωση 2 * 10

6 κύτταρα /ποντικό (ΗΤ-29, ρ53

– /-, στο αριστερό πλευρό και HCT116, ρ53

+ /+, στη δεξιά πλευρά). Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν (περίπου μια εβδομάδα), μετά την οποία τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες θεραπείας των 4 ποντικών ανά ομάδα, μία ομάδα ελέγχου, μία ομάδα ελέγχου καθετηριασμό δεδομένη απλό διηθείται αποστειρωμένο νερό, καθώς και καθετηριασμού σχήμα του οχήματος (5 μι Me

2SO σε PBS) δύο φορές την εβδομάδα. Η τελική ομάδα έλαβε φιλτραρισμένο νερό συμπληρωμένο με μακρά εκχύλισμα πιπεριού σε μια συγκέντρωση των 100 μg /mL, καθώς και καθετηριασμό αγωγή του εκχυλίσματος μακράς πιπεριάς (εκχύλισμα 5 μι σε PBS), δύο φορές την εβδομάδα, που αντιστοιχεί σε 50 mg /kg /ημέρα . Οι όγκοι αξιολογήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα μετρώντας το μήκος, το πλάτος και το ύψος, χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πάχος και τον όγκο του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο π /6 * μήκος * πλάτος. Τα ποντίκια εκτιμήθηκαν επίσης για την οποιαδήποτε απώλεια βάρους κάθε δεύτερη ημέρα για τη διάρκεια της μελέτης, η οποία διήρκεσε 75 ημέρες, μετά την οποία τα ζώα θανατώθηκαν και λήφθηκαν όργανα και ιστούς (ήπαρ, τα νεφρά, την καρδιά και όγκους) και αποθηκεύονται σε 10 % φορμαλδεΰδη για ανοσοϊστοχημική και τοξικολογική ανάλυση

αιματοξυλίνη & amp.? Ηωσίνη (Η & amp? Ε). Χρώση

όργανα ποντίκια μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλδεΰδη, μετά την οποία είχαν υποβλήθηκαν σε κρυοτομή σε 10 μm τμήματα και τοποθετείται σε ένα SuperFrost /Plus μικροσκόπιο διαφάνειες (Fisherbrand, Fisher Scientific). Τμήματα των οργάνων βάφτηκαν σύμφωνα με ένα τυποποιημένο Η &? πρωτόκολλο Ε [16].

φυτοχημικές Ανάλυση της Long Πιπέρι Απόσπασμα από HPLC

HPLC ανάλυση της μακράς πιπέρι ακατέργαστο εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστήμιο της Οτάβα στο εργαστήριο Άρνασον. Συνολικά πέντε γνωστών piperamides αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν με το ακάθαρτο εκχύλισμα μακρύ πιπέρι. Τα πρότυπα και τα εκχυλίσματα piperamide αναλύθηκαν σε Luna C18-5u-250 χ 4.6 mm στήλη στους 45 ° C με ρυθμό ροής 1.0 κ.εκ. /λεπτό με μια κινητή φάση που αποτελείται από H

2O και μεθανόλη όπως περιγράφεται στον Πίνακα 1 . προφίλ Χρωματογράφημα χρησιμοποιήθηκαν για να ανιχνεύσουν τις οποιεσδήποτε διαφορές ανάμεσα σε ένα πρότυπο δείγμα γνωστής piperamides στα ακατέργαστα καιρό εκχυλίσματα πιπεριού.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες φορές . Εκπρόσωπος εικόνες φθορισμού έδειξαν, ανάλογα με την περίπτωση. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism 6.0 288 λογισμικού. Ο μέσος όρος και το τυπικό σφάλμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν για τα δεδομένα ποσοτικού προσδιορισμού. T-test του Student και δύο-way ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση

Αποτελέσματα

αιθανολικό εκχύλισμα Long Πιπέρι (PLX) Αποτελεσματικά και επιλεκτικά μειώνει τη βιωσιμότητα των & amp.? Επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα σε μία δόση & amp? Ώρα εξαρτώμενο τρόπο

Το πρώτο βήμα στην κατανόηση της επίδρασης της μακράς εκχύλισμα πιπεριού σε αυτή τη μελέτη ήταν να αξιολογήσει την επίδραση της PLX για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων. Μετά τη θεραπεία με αυξανόμενη συγκέντρωση PLX στην αύξηση χρονικά σημεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου, το οποίο παίρνει μεταβολίζεται σε ένα κόκκινο προϊόν φορμαζάνης από βιώσιμα κύτταρα με ενεργό μεταβολισμό. Αυτό το προϊόν μπορεί στη συνέχεια να ποσοτικοποιηθεί με φασματομετρία απορρόφησης. Παρατηρήσαμε την αποτελεσματικότητα του αργού PLX στη μείωση της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων κόλου (HCT116), του παγκρέατος (BxPC-3), τον καρκίνο των ωοθηκών (OVCAR-3) και κύτταρα μελανώματος. Αυτή η επίδραση ήταν δόση και το χρόνο εξαρτώμενο (Σχήμα 1). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η αντικαρκινική δράση της PLX, θέλαμε να αξιολογηθεί ο ρόλος του στην κυτταρικό θάνατο και την επιλεκτικότητα της προς τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι PLX είναι ικανή να διεγείρει εκλεκτικά τον κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα (παχέος εντέρου, του παγκρέατος και της λευχαιμίας) σε μία δόση και εξαρτάται από τον χρόνο τρόπο, όπως χαρακτηρίζεται από την αύξηση σε ιωδιούχο προπίδιο θετικά κύτταρα σε καρκινικά κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με PLX (Σχήμα 2) . Επιπλέον, αυτή η επίδραση ήταν επιλεκτικό, όπως φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα κόλου παρέμειναν ανεπηρέαστα από αυτή τη θεραπεία, στις ίδιες συγκεντρώσεις και χρονικά σημεία (Σχήμα 2Β). Τα αποτελέσματα αυτά ποσοτικά χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία εικόνα με βάση για να προσδιοριστεί το ποσοστό κυττάρων που υφίστανται απόπτωση και το συνολικό κυτταρικό θάνατο. Παρατηρήσαμε μια αύξηση 30-40% στην αννεξίνη V θετικά κύτταρα, μετά από θεραπεία PLX και ένα 80-100% ΡΙ θετικών αύξηση στα ίδια δείγματα κυττάρων, επιβεβαιώνοντας την επαγωγή της απόπτωσης, μετά από νέκρωση σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 3).

Colon (HCT116), των ωοθηκών (OVCAR-3), του παγκρέατος (BxPC-3) του καρκίνου και μελανώματος (G-361) κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα ακατέργαστο αιθανολικό εκχύλισμα καιρό πιπέρι (PLX), μετά από την οποία επωάστηκαν με βαφή WST-βιωσιμότητας 1 κύτταρο για 4 ώρες. Η απορροφητικότητα διαβάστηκε σε 450 nm και εκφράστηκε ως ποσοστό επί τοις εκατό του ελέγχου. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από τετραπλούν από 3 ανεξάρτητα πειράματα. ** Ρ & lt?. 0.0001

Η

(Α) Μετά τη θεραπεία της ανθρώπινης παγκρεατικής (BxPc-3) και καρκίνου του Τ κυττάρου λευχαιμίας κυττάρων με PLX, σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αξιολογούνται για την επαγωγή κυτταρικού θανάτου με εικόνα με βάση κυτταρομετρία. (Β) Παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (ΗΤ-29) και τα επιθηλιακά κύτταρα φυσιολογικό κόλον (NCM460). μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου όπως χαρακτηρίζεται από την παρουσία ιωδιούχου προπιδίου θετικά κύτταρα. Εικόνες ελήφθησαν σε 400 χ μεγέθυνση σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Κλίμακα ράβδου = 15 μm.

Η

Εικόνα-Based κυτταρομετρία χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση αποπτωτική επαγωγή (% αννεξίνης V θετική), που ακολουθείται από νέκρωση (% ΡΙ θετική) σε Ε6-1 και ΗΤ-29 κυττάρων μετά από θεραπείας PLX. Η έλλειψη αννεξίνης V ή χρώση ΡΙ χρησιμοποιηθεί ως ένδειξη των ζωντανών κυττάρων μετά από θεραπεία (% αννεξίνης V /ΡΙ αρνητικά κύτταρα) (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0.003, *** Ρ & lt? 0,0001). (Ε) Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επαγωγή της απόπτωσης.

Η

DNA κατακερματισμός είναι ένα βασικό βιοχημικό χαρακτηριστικό της απόπτωσης. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή την επαγωγή της απόπτωσης, την επισήμανση TUNEL για την ανίχνευση κατάτμηση του DNA χρησιμοποιήθηκε. Η ποσοτικοποίηση αποτελέσματα από την εικόνα που βασίζεται δείχνουν κυτταρομετρίας την αποτελεσματικότητα της PLX στην επαγωγή της απόπτωσης, μετά τον κατακερματισμό του DNA σε ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. VP16, ένας γνωστός χημειοθεραπευτικός παράγοντας με DNA καταστροφικές ικανότητες, χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος (Σχήμα 4).

επισήμανση TUNEL χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του κατακερματισμού του DNA. Μετά PLX και VP16 (ως θετικός έλεγχος για βλάβες του DNA) κατεργασία, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με διάλυμα χρώσης DNA και ποσοτικοποιείται με κυτταρομετρία εικόνα με βάση. Τα επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τον έλεγχο δείγμα χωρίς θεραπεία κυττάρων. (**** Ρ & lt? 0,0001).

Η

Επιπλέον, επαγωγή απόπτωσης σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, μελάνωμα (G-361) κύτταρα, των ωοθηκών και του παχέος εντέρου (ΗΤ-29), επιβεβαιώθηκε με Annexin -V δοκιμασία σύνδεσης. Αυτή η διέγερση απόπτωσης επιβεβαιώθηκε να είναι επιλεκτική για καρκινικά κύτταρα, όπως τα φυσιολογικά κύτταρα του παχέος εντέρου (NCM460) παρέμεινε ανεπηρέαστη από κατεργασία PLX. Αυτό υποδεικνύεται από πυρηνική συμπύκνωση, μορφολογία κυττάρων και εξωτερίκευση του φωσφατιδυλοσερίνη στην εξωτερική φυλλάδιο της κυτταρικής μεμβράνης, όπως υποδεικνύεται από χρώση Hoechst, εικόνες αντίθεσης φάσης και δεσμευτική βαφής αννεξίνης V, αντιστοίχως (Σχήμα 5Α και Β). Η επιλεκτικότητα PLX σε καρκινικά κύτταρα επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με την δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας WST-1 που έδειξαν ότι η PLX ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματικό σε τέτοιες χαμηλές δόσεις, ένα θεραπευτικό παράθυρο παρατηρήθηκε εύκολα (Σχήμα 5C). Θεραπεία της ΗΤ-29 με 0.20 mg /ml μείωσαν αποτελεσματικά την βιωσιμότητα κατά 90% περίπου, ενώ τα κύτταρα NCM460 παρέμεινε στο 100% βιωσιμότητα στην ίδια δόση. Αυτό υποδεικνύει ότι PLX μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικές σε πολύ χαμηλές δόσεις, μειώνοντας περαιτέρω τις πιθανότητες τοξικότητα που σχετίζεται με τη θεραπεία

Μετά την θεραπεία με PLX, κύτταρα (καρκίνος των ωοθηκών?. OVCAR-3, μελάνωμα? G-361 και Κανονική κύτταρα Colon Επιθήλια (NCM460) βάφτηκαν με Hoechst για να χαρακτηρίσει την πυρηνική μορφολογία και Annexin-V για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων (Α) και την κυτταρική μορφολογία με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Β)?. οι εικόνες ελήφθησαν στα 400 × μεγέθυνση σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού ράβδος κλίμακας = 15 μm. (Γ) Μετά την αγωγή PLX, ΗΤ-29 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα και μη καρκινικά κύτταρα NCM460 επωάστηκαν με βαφή WST-1 κυτταρικής βιωσιμότητας για 4 ώρες και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm και εκφράστηκε ως ποσοστό επί τοις εκατό του μάρτυρα . οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων ** Ρ & lt?.. 0.0001

η

PLX Προκαλεί κασπάση-ανεξάρτητη απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου

οι κασπάσες είναι κυστεΐνη ασπαρτικό πρωτεάσες οι οποίες παίζουν κυρίαρχο ρόλο ως πρωτεάσες θάνατος [17]. Οι ρόλοι τους σε διάφορες διαδικασίες κυτταρικού θανάτου παραμένει αμφιλεγόμενη, όπως ενεργοποίηση ή αναστολή τους θα μπορούσε να είναι απαραίτητη για την εξέλιξη της αναστολής των οδών κυτταρικού θανάτου [18], [19]. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος των κασπασών στη μελέτη μας, μετά από θεραπεία με 0,10 mg /ml PLX, σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, BxPc-3 κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για να ληφθεί προϊόν λύσης κυττάρου. Το κυτταρόλυμα επωάστηκε με υποστρώματα κασπάσης, ειδικές για κάθε κασπάση (3, 8 και 9) και επωάζεται για μία ώρα. Οι ενδείξεις φθορισμού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας φασματόμετρο φθορισμού. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η PLX είναι ικανό να ενεργοποιεί και τις δύο οδούς (εξωγενών και ενδογενών απόπτωση) σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Αυτό παρατηρήθηκε ως ταχεία ενεργοποίηση των κασπασών-3, 8 και 9 παρατηρήθηκαν ήδη από μία ώρα, μετά την αγωγή (Σχήμα 6Α).

Μετά από θεραπεία με 0,10 mg /ml PLX, σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, BxPc -3 κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για να ληφθεί προϊόν λύσης κυττάρου.