Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο προσδιορισμός των ευαίσθητων βιοδεικτών για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών είναι υψηλή κλινική σημασία για την έγκαιρη ανίχνευση ή /και την παρακολούθηση της υποτροπής της νόσου. Έχουμε αναπτύξει μια στρατηγική συστηματικής πολλαπλών σταδίων ανακάλυψη βιοδεικτών και επαλήθευσης για τον προσδιορισμό των δεικτών μεθυλίωσης υποψήφιο DNA για το αίμα που βασίζεται ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

χρησιμοποιείται η πλατφόρμα Illumina Infinium για να αναλύσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των 27.578 CpG θέσεων σε 41 όγκους των ωοθηκών. Χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική επιλογή δείκτη που τόνισε την ευαισθησία με την απαίτηση της συνέπειας της μεθυλίωσης σε όλη όγκων, επιτυγχάνοντας παράλληλα την εξειδίκευση αποκλείοντας δείκτες με μεθυλίωση σε λευκοκυττάρων έλεγχο ή DNA ορού. στρατηγική ελέγχου μας αφορούσε τον έλεγχο της ικανότητας των αναγνωρισμένων δεικτών για την παρακολούθηση της επιβάρυνσης της νόσου σε σειριακά συλλέγονται δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών που είχαν υποβληθεί σε χειρουργική εκτομή του όγκου σε σύγκριση με τα επίπεδα του CA-125.

Εντοπίσαμε ένα δείκτη,

IFFO1

μεθυλίωση προαγωγού (IFFO1-Μ), που συχνά μεθυλιωμένη σε όγκους των ωοθηκών και ότι σπανίως ανιχνεύεται στο αίμα των φυσιολογικών μαρτύρων. Όταν δοκιμάστηκε σε 127 σειριακά συλλέχθηκαν οροί από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, IFFO1-Μ έδειξε κινητική μετα-εκτομή συσχετίζεται σημαντικά με CA-125 μετρήσεις στον ορό σε έξι από τους 16 ασθενείς.

Συμπεράσματα /Σημασία

έχουμε εφαρμόσει ένα αποτελεσματικό έλεγχο δείκτη και τη στρατηγική ελέγχου, με στόχο τον εντοπισμό των IFFO1-Μ ως υποψήφια δείκτη με βάση το αίμα για την ακριβή ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών. Τα επίπεδα ορού της IFFO1-M εμφανίζεται κινητική μετα-εκτομή συνάδει με την αντανάκλαση της επιβάρυνσης λόγω ασθενειών. Αναμένουμε ότι IFFO1-Μ και των άλλων υποψήφιων δείκτες που προκύπτουν από αυτό το στάδιο ανάπτυξης δείκτης μπορεί να παρέχει δυνατότητες ανίχνευσης της νόσου που συμπληρώνουν τις υφιστάμενες βιοδείκτες

Παράθεση:. Campan Μ, Moffitt M, Houshdaran S, Shen Η Widschwendter Μ, Daxenbichler G, et al. (2011) Οθόνη Γονιδιώματος-Scale για μεθυλίωσης του DNA-Based Εντοπισμός δείκτες για τον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 6 (12): e28141. doi: 10.1371 /journal.pone.0028141

Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: May 10, 2011? Αποδεκτές: 2 Νοέμ 2011? Δημοσιεύθηκε: 7 Δεκ 2011

Copyright: © 2011 Campan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τον καρκίνο των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας, χορηγούν PPD /USC.06, και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας και το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, χορηγούν R01-CA096958. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. PL είναι σύμβουλος και μέλος της Επιστημονικής Συμβουλευτικής Επιτροπής για Epigenomics AG. Κατέχει εκδοθέντα διπλώματα ευρεσιτεχνίας για την τεχνολογία MethyLight, τα οποία έχουν άδεια να Epigenomics AG. Η εργασία αυτή δεν υποστηρίχθηκε από Epigenomics AG. Epigenomics είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή ή την ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Επιπλέον, PL και MC ονομάζονται ως εφευρέτες σε εκκρεμότητα αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για την τεχνολογία Digital MethyLight. Τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας και η σχέση με Epigenomics δεν μεταβάλλουν την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών. Οι άλλοι συγγραφείς δεν προέκυψε κανένα δυναμικό ανταγωνιστικών συμφερόντων.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία των γυναικολογικών θανάτων από καρκίνο και το πέμπτο κύρια αιτία όλων των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τις γυναίκες. Έχει υπολογιστεί ότι μία γυναίκα στις 72 θα αναπτύξει καρκίνο των ωοθηκών στη διάρκεια της ζωής της στις ΗΠΑ, και ότι μία γυναίκα στις 96 θα πεθάνουν από αυτήν την ασθένεια [1]. Η πενταετής συνολική επιβίωση είναι έντονα στάδιο εξαρτώμενη [2], [3], με ποσοστά 94% για το στάδιο Ι της νόσου και 28% για το στάδιο IV της νόσου [1].

Από τις αρχές στάδιο της νόσου είναι συχνά ασυμπτωματικά, και δεν υπάρχει καμία αποτελεσματική στρατηγική διαλογής, οι περισσότεροι ασθενείς (62%) του παρόντος με προχωρημένου σταδίου (III και IV) ασθένεια, στην οποία ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί σε όλη την περιτοναϊκή κοιλότητα ή άλλα όργανα [1]. Πάνω από το 85% των ασθενών με προχωρημένο υποτροπή της νόσου μετά τη διακοπή της θεραπείας με πρωτογενή, παρά την αρχική καλή απάντηση [4], [5]. Αναμένεται ότι έχει συμβεί αποτελεσματικές μέθοδοι για την ανίχνευση των ασυμπτωματικών καρκίνου των ωοθηκών πριν την εισβολή και τη μετάσταση θα μείωνε σημαντικά το ποσοστό θνησιμότητας για την ασθένεια αυτή. Ευαίσθητες μέθοδοι ανίχνευσης θα μπορούσε επίσης να εφαρμοστεί σε υποτροπή της νόσου μετά την παρακολούθηση εκτομή του όγκου, με ή χωρίς επικουρική χημειοθεραπεία.

Επί του παρόντος, δεν υπάρχει καλό βιοδείκτη ή απεικόνισης προσέγγιση με επαρκή ευαισθησία και ειδικότητα για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών προκλινική [6 ]. Δύο βιοδείκτες με βάση τις πρωτεΐνες, CA-125 και HE4, έχουν κλινικά εγκεκριμένο για τη μέτρηση βάρος της νόσου και για την αξιολόγηση της θεραπείας του καρκίνου των ωοθηκών [7], [8]. Ωστόσο, αυτοί οι δείκτες δεν είναι αυξημένα σε όλους τους όγκους των ωοθηκών και δεν έχουν επαρκή θετική προγνωστική αξία για την αξιολόγηση των κινδύνων βάσει πληθυσμού ή την έγκαιρη διάγνωση. Λαμβάνοντας υπόψη τους περιορισμούς των σημερινών προσεγγίσεων, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικές στρατηγικές για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών προκλινικών αρκετά νωρίς για τη θεραπεία για να είναι επιτυχής. Δεδομένου ότι οι καρκίνοι των ωοθηκών είναι ετερογενείς, με άγνωστες κύτταρα προέλευσης και ελάχιστα κατανοητή παθογένεια [9] ο δείκτης διαδικασίες ανακάλυψη θα πρέπει να βασίζονται σε προσεγγίσεις που βασίζονται στην τεχνολογία υψηλής απόδοσης και όχι σε μηχανιστική με γνώμονα τις στρατηγικές ανακάλυψη δείκτη. Επίσης, δείκτες για καρκίνο των ωοθηκών θα πρέπει να είναι σε θέση να ανιχνεύσει όγκους εκατοντάδες φορές μικρότερη από ό, τι τα κλινικά εμφανής ορώδες καρκίνοι συνήθως χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των επιδόσεων των βιοδεικτών [10].

Επιγενετική βιοδείκτες έχουν πρόσφατα αναδειχθεί ως εναλλακτικές λύσεις για πρωτεϊνικών βιοδεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου [11] – [13], συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων των ωοθηκών [14] – [17]. Η ανώμαλη υπερμεθυλίωση DNA συχνά παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα [18]. Οι ασθενείς με καρκίνο έχουν αυξημένα επίπεδα ελεύθερου DNA που κυκλοφορούν στην κυκλοφορία του αίματος [19]. Καρκίνος που σχετίζεται με παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA, προήλθε εν μέρει τουλάχιστον σε κύτταρα όγκου, μπορεί να ανιχνευθεί στο DNA των ασθενών με καρκίνο [11], [12] ορό ή πλάσμα. Μεθυλιωμένο ϋΝΑ είναι χημικά και βιολογικά σταθερή, εύκολα ανιχνεύσιμη σε πολλούς τύπους σωματικών υγρών και ως εκ τούτου κατάλληλα για ανίχνευση με βάση το αίμα του καρκίνου [11] – [17]. Ωστόσο, ο περιορισμένος αριθμός δεικτών μεθυλίωσης του DNA που διατίθενται σήμερα εφαρμόζεται μόνον σε ένα μικρό κλάσμα των καρκίνων των ωοθηκών [14] και είναι μη ειδικά, ενώ οι τεχνολογίες ανίχνευσης έλλειψη ευαισθησίας, είναι σε μεγάλο βαθμό με βάση γέλη, και είναι μη-ποσοτική [15] – [17]. Οι πρόσφατες εξελίξεις στις τεχνολογίες ανάλυσης μεθυλίωσης του DNA έχουν τη δυνατότητα να αυξήσει τη μεθυλίωση του DNA ανακάλυψη δείκτη απόδοσης μέσω της ταυτόχρονης ανάλυση χιλιάδων γονιδιωματικών τόπων [20], [21] και για να επιτρέψει για εξαιρετικά ευαίσθητη ανίχνευση πολύ μικρών ποσοτήτων μεθυλιωμένου DNA σε ένα ποσοτικό τρόπο [22], [23].

σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια μεγάλης κλίμακας ανακάλυψη συστηματική δείκτη για τους δείκτες μεθυλίωσης του DNA του καρκίνου των ωοθηκών, που δεν υπάρχουν στο αίμα των γυναικών χωρίς καρκίνο των ωοθηκών. Οι δείκτες της μεθυλίωσης του DNA έχουν βρεθεί να έχουν μέτρια κλινική ευαισθησία σε πολλές προηγούμενες αναφορές. Κατά την εξέταση πώς να βελτιώσουν την ευαισθησία των δεικτών μεθυλίωσης του DNA, που αναγνώρισε ότι η κατάσταση μεθυλίωσης των κανονικών ωοθηκών είναι άνευ σημασίας, όσο φυσιολογικό DNA ωοθηκών κανονικά δεν διαρρέει στην κυκλοφορία του αίματος και οι δείκτες είναι αρνητικοί σε υγιείς μάρτυρες. Ως εκ τούτου, τροποποιήσαμε τη στρατηγική ανακάλυψή μας να επικεντρωθεί σε μια άμεση σύγκριση του όγκου έναντι του αίματος, σε αντίθεση με του όγκου εναντίον φυσιολογικό ιστό. Στη διαδικασία επιλογής μας τονίσαμε την ευαισθησία δείκτη ζητώντας συνέπεια της μεθυλίωσης του όγκου, και ειδικότητα δείκτη αποκλείοντας δείκτες με μεθυλίωση σε λευκοκυττάρων έλεγχο ή DNA ορού. Εντοπίσαμε μια πολλά υποσχόμενη δείκτη μεθυλίωση υποψήφιο DNA, IFFO1-Μ, το οποίο δοκιμάσαμε ως βιοδείκτη με βάση το αίμα σε έναν περιορισμένο αριθμό περιπτώσεων και ορών ελέγχου. Να προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία ότι οι υποψήφιες IFFO1-Μ μέτρα δείκτης επιβάρυνσης της νόσου μας στο αίμα, αναλύσαμε τα διαχρονικά πρότυπα των επιπέδων IFFO1-Μ σε σειρά δείγματα αίματος που πριν και μετά την εκτομή του πρωτοπαθούς όγκου, και σε σύγκριση με αυτά με μια επικυρωμένη δείκτης για τη νόσο επιβάρυνσης, CA-125. Αυτό το πλαίσιο-αντικείμενο σύγκρισης επιτρέπει σε κάθε ασθενή για να χρησιμεύσει ως τον έλεγχό της, χωρίς μεταβολή στο γενετικό υπόβαθρο μεταξύ των σειριακών δειγμάτων αίματος. Σε αυτή τη μελέτη, θα υποβάλει έκθεση σχετικά με την ποσοτική ψηφιακή ανάλυση των IFFO1-Μ σε σειριακή δείγματα από εννέα ασθενείς, για ένα σύνολο 127 δειγμάτων αίματος.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την ανθρώπινη θέματα δόγμα του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από το Institutional Review Boards των ινστιτούτων που συμμετέχουν στη μελέτη: Duke University Medical Center (Durham, USA), Keck School of Medicine του Πανεπιστημίου της Νότιας Καλιφόρνιας ( Λος Άντζελες, ΗΠΑ), και το Ίνσμπρουκ Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (Innsbruck, Αυστρία). Υπεγράφη ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη για τη συλλογή των δειγμάτων και την επακόλουθη ανάλυσή τους.

Ασθενείς και τους ελέγχους δειγμάτων συλλογή και επεξεργασία

Τα 41 δείγματα ωοθηκικού όγκου που χρησιμοποιούνται στην Infinium-based φάση ανακάλυψη δείκτης της μελέτης ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση σε δύο ιδρύματα, Duke University Medical Center (30 δείγματα) και το Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας Ιατρικό Κέντρο (11 δείγματα). Όλα τα δείγματα όγκων ελήφθησαν από ασθενείς οι οποίοι υπέβαλαν γραπτές εν επιγνώσει συναίνεση, η οποία εγκρίθηκε από το Institutional Review Boards των αντίστοιχων οργάνων. Ανάμεσα στα δείγματα όγκων που συλλέγονται, υπήρχε μια μικτή (σαφής κυττάρων και ενδομητριοειδές), τρεις σαφείς κυττάρων, τέσσερις βλεννώδες, τέσσερις ενδομητριοειδές, και 32 δείγματα ορώδες επιθηλιακού ωοθηκικού καρκινώματος (Πίνακας S1). ιστοί όγκων ήταν φλας-πάγωσαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να μεταποιηθούν. Περιφερική λευκοκυττάρων του αίματος (PBL) και το πλάσμα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στα στάδια ανακάλυψη και την επαλήθευση λήφθηκαν από 10 υγιείς μετα-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες των οποίων αίματα ήταν εμπορικώς αγοράστηκαν (HemaCare Corporation). Πλάσμα απομονώθηκε από το αίμα συλλέγεται σε σωλήνες που περιέχουν EDTA. Οι σωλήνες περιστράφηκαν για 10 λεπτά στους 300

g

στους 4 ° C. Χωρίς την απομάκρυνση του πλάσματος από το σωλήνα μετά την πρώτη φυγοκέντρηση, εμείς περιστράφηκε τα σωληνάρια για επιπλέον 10 λεπτά σε 1600

g

στους 4 ° C. Το διαχωρισμένο πλάσμα μεταφέρθηκε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου και περιστράφηκε και πάλι στις 16.000

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για χρήση. Η λεπτή περιφερικά λευκοκύτταρα αίματος στρώμα που κατακρημνίσθηκε πάνω από τα ερυθρά αιμοσφαίρια συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να είναι έτοιμο να χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση του DNA.

DNA εκχυλίζεται από ιστούς με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων. DNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα PBL χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp® DNA αίματος (Qiagen), ενώ το ελεύθερο DNA από το πλάσμα και ο ορός εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας την QIAamp® UltraSens Kit Virus (Qiagen). Και στα δύο πειράματα, το DNA εκχυλίζεται ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Τα δείγματα αίματος χρησιμοποιήθηκαν στις διαμήκεις αναλύσεις συλλέχθηκαν από 16 ασθενείς που έλαβαν αγωγή για καρκίνο των ωοθηκών μεταξύ 1992-2000 στο Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας, Innsbruck Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (Innsbruck, Αυστρία) σε συμμόρφωση και έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review Πανεπιστήμιο του Innsbruck. Τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών αυτών παρατίθενται στον Πίνακα S3. Τα πρώτα δείγματα αίματος που αναφέρεται ως βασικής γραμμής δείγματα, ελήφθησαν πριν από τη χειρουργική επέμβαση για έντεκα από τους ασθενείς και αρκετές ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση για πέντε ασθενείς (βλέπε πλήρεις πληροφορίες στον Πίνακα S4). Πρόσθετες αίμα συλλέχθηκε από όλους τους ασθενείς σε κάθε επίσκεψη παρακολούθησης για χρονικές περιόδους που κυμαίνονται 37 με 246 εβδομάδες (Πίνακας S4). Για την απομόνωση του ορού, το αίμα αφέθηκε να πήξει για 1-4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 2000

g

σε RT. Ορός απομονώνεται από το θρόμβο, κατανέμονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες μικροφυγοκέντρησης, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. οροί ελέγχου από οκτώ υγιείς γυναίκες εμπορικά αγοράστηκαν (Innovative Research). Ελεύθερη DNA που κυκλοφορεί απομονώθηκε από τους ασθενείς και τους ελέγχους ορούς χρησιμοποιώντας την QIAamp® UltraSens Kit Virus (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επίπεδα CA-125 προσδιορίστηκαν με ένα ένζυμο ανοσοδοκιμασία μικρο-σωματιδίων (MEIA) χρησιμοποιώντας τον αναλυτή IMX (Abbott Laboratories).

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

Όλα τα δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε τροποποίηση όξινου θειώδους χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA Kit (Zymo Research) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την ανάλυση που βασίζεται Infinium, 1 μα γονιδιωματικού DNA από κάθε δείγμα ήταν όξινο θειώδες μετατρέπεται σε 96 format πλάκας καλά χρησιμοποιώντας το EZ96 μεθυλίωσης DNA kit (Zymo Research). Η ποιότητα και η ποσότητα του όξινου θειώδους-μετατρέπονται DNA, καθώς και η πληρότητα της διθειώδους μετατροπής, αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πάνελ αντιδράσεων ποιοτικού ελέγχου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Μετά τη μετατροπή, το τροποποιημένο DNA εκλούστηκε σε 18 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης που παρέχεται με το κιτ, και 5 μΐ του κάθε δείγματος χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμασία μεθυλίωσης Illumina Infinium DNA όπως ορίζεται από τον κατασκευαστή.

Για ανάλυση MethyLight, 1 μα γονιδιωματικού DNA από κάθε δείγμα όγκου και PBL υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες χρησιμοποιώντας το Zymo EZ μεθυλίωσης DNA kit (Zymo Research). Ομοίως, το κιτ μεθυλίωση Zymo EZ DNA χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή του όξινου θειώδους DNA από δείγματα πλάσματος ή ορών. Σε γενικές γραμμές 1 ml πλάσματος ή ορούς υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε μία στήλη του κιτ Zymo. Μετά τον καθαρισμό, όλα τα δείγματα DNA όξινο θειώδες τροποποιημένα εκλούστηκαν σε 10 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης και περαιτέρω αραιώνεται ως εξής: ο PBL-DNA αραιώθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,5 ng /μl. Το DNA του όγκου αραιώνεται με βάση το όριο του κύκλου (Ct) ενός αντίδραση MethyLight ALU-βάση. Μόνο DNAs με Ct μικρότερη από 21 γι ‘αυτή την ALU-based αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν σε οποιαδήποτε από τις επόμενες αναλύσεις [24]. Το DNA πλάσμα αραιώθηκε έτσι ώστε κάθε 1 μΙ τροποποιημένου DNA αντιπροσωπεύεται 10 μl του αρχικού όγκου του πλάσματος ή ορών που χρησιμοποιήθηκαν. Για κάθε αντίδραση 10 μΐ MethyLight του αραιωμένου όγκου, PBL ή όξινο θειώδες πλάσμα μετατρέπεται DNA χρησιμοποιήθηκαν. Για την ανάλυση Digital MethyLight, ολόκληρη η ποσότητα του DNA που εξάγεται από 1 ml του ορού ήταν μετατραπέντος με όξινο θειώδες, και τα δείγματα αραιώθηκαν έτσι ώστε κάθε 1 μΙ από κάθε δείγμα DNA με όξινο θειώδες μετατρέπεται αντιπροσωπεύεται 1 μl του αρχικού όγκου του ορού που χρησιμοποιείται. Σε κάθε ανάλυση Ψηφιακή MethyLight, χρησιμοποιήθηκε 100 μl του αραιωμένου DNA.

Η ανάλυση Infinium πραγματοποιήθηκε στο κέντρο USC επιγονιδιώματος χρησιμοποιώντας το HumanMethylation27 BeadArray (Illumina). Τα πρωτόκολλα και οι πληροφορίες καθετήρα είναι διαθέσιμα σε www.illumina.com. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Infinium συντάχθηκαν για κάθε τόπο χρησιμοποιώντας λογισμικό Illumina BeadStudio (Illumina) και αναφέρονται ως βήτα τιμές (β) τα οποία είναι τα σκορ μεθυλίωσης του DNA που κυμαίνονται από 0 έως 1 που αντανακλούν την κλασματική επίπεδο μεθυλίωσης DNA ενός μονού θέση CpG [ ,,,0],20]. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης Infinium είναι διαθέσιμο για λήψη στην έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO) αποθετήριο δεδομένων στο National Center for Biotechnology Information (NCBI) με τον αριθμό προσχώρησης GSE26989 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ; acc = GSE26989).

Η ανάλυση προσδιορισμού MethyLight και δεδομένα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [25]. Οι εκκινητές και ανιχνευτές για αυτές τις αναλύσεις που απαριθμούνται στον Πίνακα S2. Η ανάλυση δοκιμασίας και τα δεδομένα Digital MethyLight διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] με τη διαφορά ότι οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε έναν όγκο 10 μΐ αντί των 30 μΐ.

δείκτη επιλογής

Infinium ανιχνευτές που απέτυχαν σε οποιοδήποτε από τα δείγματα εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Επίσης, εξαιρούνται οι ανιχνευτές που συνδέονται με πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων (SNPs), που προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας το NCBI dbSNP χτίζει 126 και 128, ή επαναλαμβανόμενα στοιχεία που προσδιορίζονται από RepeatMasker. Τα δύο δείγματα PBL χρησιμοποιούνται στην ανάλυση έγιναν εις διπλούν στην πλατφόρμα μεθυλίωση Infinium DNA και τη μέση β τιμών για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για το φιλτράρισμα δείκτη. Εμείς εξαλειφθούν τυχόν ανιχνευτές με μια τιμή β μεγαλύτερη ή ίση με 0,2 σε οποιοδήποτε από τα δύο δείγματα κατά μέσο όρο PBL. Εντοπίσαμε το δείγμα όγκου με τη χαμηλότερη αξία μεθυλίωση του DNA (Τ

L) και το δείγμα PBL με την υψηλότερη αξία μεθυλίωση του DNA (PBL

H) για κάθε ιχνηλάτη και υπολογίζεται η διαφορά μεταξύ των τιμών SS αυτών των δύο δείγματα (Τ

L- PBL

H). Οι ανιχνευτές κατατάσσονται με βάση αυτή τη διαφορά, και οι ανιχνευτές για τις οποίες η διαφορά ήταν μικρότερη ή ίση με 0 είχαν εξαλειφθεί.

Επαλήθευση των 15 κορυφαία δείκτες με τη χρήση του Άτλαντα (TCGA) δεδομένα Καρκίνος Γονιδιώματος

Οι τιμές SS από τα 15 κορυφαία δείκτες ανακτήθηκαν από τη δημόσια διαθέσιμο σύνολο δεδομένων μεθυλίωσης DNA για ορώδες καρκίνους των ωοθηκών δημοσιεύτηκε στην πύλη δεδομένων TCGA (htpp: //tcga-data.nci.nih.gov/tcga) . Συγκρίναμε την κατανομή των Infinium δημιουργείται β αξίες αυτών των 15 δεικτών σε όλα τα 41 δείγματα καρκίνου των ωοθηκών ή μόνο των 29 ορώδης ωοθηκών καρκίνους αυτής της μελέτης με εκείνα που λαμβάνονται από 284 ορώδες δείγματα καρκίνου των ωοθηκών στη μελέτη TCGA και ένα σύνολο 10 φυσιολογικούς δείγματα PBL χρησιμοποιώντας dot-διαγράμματα από το Prism λογισμικό GraphPad (GraphPad Software Inc.).

η στατιστική ανάλυση

η ικανότητα της IFFO1-M για να διακρίνουν μεταξύ δειγμάτων περίπτωση και του ελέγχου αξιολογήθηκε με τη γραφική αναπαράσταση η δέκτη καμπύλη λειτουργικών χαρακτηριστικών, η οποία συνδέει την πραγματική θετικό ποσοστό (ευαισθησία) στο ποσοστό ψευδώς θετικών (1-εξειδίκευση) και υπολογίζοντας περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC). Το 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI) της AUC υπολογίστηκε με δείγματα bootstrap 2000, χρησιμοποιώντας το πακέτο proc R [26]. Pearson συντελεστής προϊόν στιγμή συσχέτιση (Pearson του r) υπολογίστηκε για να μετρηθεί ο βαθμός συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA IFFO1-M και τα επίπεδα CA-125 σε καθένα από τα εννέα ασθενείς. Στατιστική δοκιμή κατά την μηδενική υπόθεση ότι r = 0 διεξήχθη και ένα

σ

οριακή τιμή των 0,05 χρησιμοποιήθηκε για να δηλώσει σημασία. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού R 2.13.

Αποτελέσματα

μεθυλίωσης του DNA με βάση το δείκτη αγωγού ανακάλυψη

Έχουμε επινοήσει μια ολοκληρωμένη και συστηματική στρατηγική για τον εντοπισμό και την αξιολόγηση από αίμα σημειωτές μεθυλίωση βασίζεται DNA για τον καρκίνο των ωοθηκών που είναι παρόντες μόνο στο αίμα από άτομα προσβεβλημένα με την ασθένεια. Το Σχήμα 1 απεικονίζει τα βήματα που αναλάβαμε για την επίτευξη αυτού του στόχου. Κάθε ένα από αυτά τα βήματα περιγράφεται με περισσότερες λεπτομέρειες στα επόμενα τμήματα.

Η πλατφόρμα Infinium χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή 27.578 ανιχνευτές που εκπροσωπούν 14.489 ατομικές γονιδιακούς τόπους. Χρησιμοποιήσαμε μια συστηματική προσέγγιση κατά βήματα για την εξάλειψη ανιχνευτές που απέτυχαν σε οποιοδήποτε από τα δείγματα, οι ανιχνευτές που περιείχαν SNPs ή επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, ή ανιχνευτές με μία τιμή βήτα υψηλότερη από 0.2 σε κανένα από τα δείγματα PBL. Τα υπόλοιπα ανιχνευτές ταξινομήθηκαν με βάση την διαφορά μεταξύ τους όγκων και αίματος (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), και εξαλείφθηκαν οι ιχνηλάτες με μεγαλύτερη μεθυλίωσης του DNA σε PBL από ό, τι οποιοδήποτε από τα δείγματα όγκων. Το top 15 από τα υπόλοιπα 517 δείκτες είχαν μεταβεί στην πλατφόρμα MethyLight για περαιτέρω έλεγχο. Όλα τα 15 δείκτες περάσει μια ανεξάρτητη δοκιμή επαλήθευσης πραγματοποιείται σε δημόσια διαθέσιμες TCGA σύνολο δεδομένων καρκίνου των ωοθηκών και επιπλέον δείγματα PBL. Τρεις δείκτες απέτυχε λόγω ζητήματα ασυμβατότητας που σχετίζονται με την πλατφόρμα MethyLight, ενώ άλλα δέκα απέτυχε επειδή μεθυλιωμένο σε κανονικό DNA PBL (3 δείκτες) ή φυσιολογικό πλάσμα (7 δείκτες). Μόνο ένας δείκτης,

IFFO1

, επιλέχθηκε για περαιτέρω έλεγχο σε δείγματα ασθενών με χρήση Digital MethyLight. (Ο αστερίσκος δηλώνει ανιχνευτές που απέτυχε σε οποιοδήποτε από τα δείγματα, καθώς και εκείνες που περιλαμβάνονται SNPs και επαναλάβετε αλληλουχίες).

Η

Διαλογή για και την επιλογή των δεικτών μεθυλίωσης DNA για τον καρκίνο των ωοθηκών

Διενεργήσαμε την πρώτη μεγάλης κλίμακας ανάλυση μεθυλίωσης του DNA των 41 δειγμάτων καρκίνου των ωοθηκών (Πίνακας S1) και δύο δείγματα PBL από τη νόσο χωρίς μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Χρησιμοποιήσαμε το BeadArray μεθυλίωση Infinium DNA που ανακρίνει ταυτόχρονα την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των 27.578 ανιχνευτές που εκτείνονται σε 14.489 μοναδικές γενετικές θέσεις. Αρχίσαμε τη διαδικασία δείκτη επιλογής φιλτράροντας όλα ανιχνευτές που απέτυχε (ανίχνευση τιμή-ρ & gt? 0,05) σε οποιοδήποτε από τα δείγματα, καθώς και ανιχνευτές που περιέχουν πολυμορφισμούς μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) [27], και επαναλάβετε αλληλουχίες (Εικόνα 1. και 2Α). Εμείς επόμενη εξαλειφθούν όλα τα ανιχνευτές με τα επίπεδα μεθυλίωσης υψηλά DNA σε PBL (β & gt? 0.2 σε ένα οποιοδήποτε από τα δείγμα PBL) (Εικ. 1). Τα υπόλοιπα 13.628 ανιχνευτές (8701 μοναδικά γονίδια) κατατάχθηκαν σε φθίνουσα σειρά με βάση έναν αλγόριθμο που υπολογίζει τη διαφορά μεταξύ των λιγότερο μεθυλιωμένων δείγμα των ωοθηκών των όγκων και τον πιο μεθυλιωμένο δείγμα αίματος για κάθε ανιχνευτή (Εικ. 1 και 2Β) (Υλικά και Μέθοδοι ). Τα 554 ανιχνευτές (517 μοναδικά γονίδια) με υψηλότερη μεθυλίωσης του DNA σε οποιονδήποτε από τους όγκους των ωοθηκών σε σύγκριση με τα δύο φυσιολογικά δείγματα αίματος φυλάσσονται για μελλοντική αξιολόγηση (Σχ. 1 και 2C). Είμαστε δίπλα εκτελούνται αναλύσεις επιβεβαίωσης με τα κορυφαία 15-κατετάγη δείκτες (Εικ. 1 και 2D). Η επιλογή των δοκιμών μόνο αυτό περιορισμένο αριθμό δεικτών υποκινήθηκε από το κόστος και τη διαθεσιμότητα του δείγματος των ασθενών περιορισμούς.

Α, οι 12.194 δείκτες που απομένουν μετά την κατάργηση των ανιχνευτών που απέτυχαν σε οποιοδήποτε από τα δείγματα, και οι ανιχνευτές που περιέχουν SNPs ή επαναλαμβανόμενα στοιχεία. Οι δείκτες κατατάσσονται σε μιαν αύξουσα τάξη με βάση τη μέση τιμή β μεθυλίωσης του DNA των δύο δειγμάτων PBL. Β, οι δείκτες 8701 που απομένουν μετά την εξάλειψη των ανιχνευτών με μεθυλίωση του DNA β values≥0.2 σε οποιοδήποτε από τα δύο δείγματα PBL. Ανιχνευτές κατατάσσονται σε φθίνουσα σειρά με βάση τη διαφορά στη μεθυλίωση του DNA μεταξύ του όγκου με τη χαμηλότερη τιμή β (Τ

L) και το δείγμα PBL με την υψηλότερη αξία β (PBL

H). C, τα 517 δείκτες με υψηλότερες τιμές μεθυλίωσης του DNA σε κάθε του όγκου από ό, τι σε οποιοδήποτε από τα δείγματα PBL. Οι δείκτες κατατάσσονται σε φθίνουσα σειρά με βάση τη διαφορά μεταξύ των όγκων και των τιμών μεθυλίωσης PBL DNA. D, οι κορυφαίες 15 δείκτες που είχαν μεταβεί στην πλατφόρμα MethyLight για περαιτέρω έλεγχο.

Η

Ανεξάρτητη αξιολόγηση της αναπαραγωγιμότητας από τα κορυφαία 15 κατετάγη ιθύνοντες

Επειδή ο αριθμός των ωοθηκών δείγματα καρκίνου χρησιμοποιείται στο στάδιο της εξέτασης ήταν σχετικά μικρές, επωφεληθήκαμε από τα δημόσια διαθέσιμα δεδομένα μεθυλίωσης TCGA DNA για ορώδες καρκίνους των ωοθηκών [28] για να επιβεβαιώσετε την απόδοση των 15 κορυφαία δείκτες σε ένα ανεξάρτητο μεγαλύτερο σύνολο δεδομένων. Η ανάλυση αυτή διευκολύνεται από το γεγονός ότι τα δεδομένα TCGA παρήχθησαν χρησιμοποιώντας την ίδια τεχνολογία όπως στη μελέτη μας. Η κατανομή των τιμών βήτα μεθυλίωσης DNA για όλα τα 15 δείκτες σε δύο σύνολα δεδομένων όγκου (παρούσα μελέτη (PS) και TCGA) σε σύγκριση με ένα σύνολο δειγμάτων δέκα υγιών ελέγχου PBL φαίνεται στο Σχήμα 3. Το εύρος των τιμών μεθυλίωσης του DNA σε πειραματική διάταξη μας 41 ορώδες, βλεννώδες, σαφής-κυττάρων, και ενδομητριοειδές καρκίνων των ωοθηκών ήταν παρόμοια με εκείνη των 284 ορώδες δείγματα καρκίνου των ωοθηκών από TCGA, τόσο με όλο και υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σε σχέση με τις δέκα υγιείς ελέγχου δειγμάτων PBL. Τα αποτελέσματα δεν διέφεραν όταν η ανάλυση περιορίστηκε σε 29 από τις 41 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών ορώδης ιστολογία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι Infinium προερχόμενο β τιμών (Υ-άξονας) για την κορυφή 15- κατετάγη δείκτες συγκρίθηκαν στο σύνολο δεδομένων παρούσα μελέτη (PS) (41 καρκίνοι των ωοθηκών των μικτών υποτύπων), το σύνολο των δεδομένων TCGA (284 ορώδες καρκίνους των ωοθηκών) και δέκα φυσιολογικά δείγματα ΡΒΙ. Οι οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές για κάθε ομάδα.

Η

ανάπτυξη δοκιμασιών MethyLight και επαλήθευσης σε δείγματα ελέγχου για τις 15 κορυφαίες δείκτες

επόμενο μεταπηδά τις 15 δείκτες για την πιο ευαίσθητες πλατφόρμες ανίχνευσης που βασίζεται στην PCR μεθυλίωση του DNA, MethyLight και ψηφιακή MethyLight. Σε αντίθεση με ανιχνευτές μεθυλίωση Illumina Infinium DNA, το οποίο προσδιοριστεί η κατάσταση μεθυλίωσης DNA ενός μονού κυτοσίνη, MethyLight που βασίζεται εκκινητές και ανιχνευτής ανακρίνει συγκλίνουσες μεθυλίωσης του DNA αρκετών μεθυλιωμένων κυτοσίνες ταυτόχρονα σε σύντομο γονιδιωματική περιοχή. Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματα MethyLight για ένα συγκεκριμένο γενετικό τόπο μπορεί να διαφέρουν από εκείνες που καταγράφηκαν με έναν ανιχνευτή Illumina Infinium στην ίδια θέση λόγω της παρουσίας των γειτονικών κυτοσίνες και παραλλαγές στην τοποθέτηση εναύσματα /ανιχνευτών. Ήμασταν επιτυχία στην ανάπτυξη αντιδράσεις MethyLight για 12 από τις 15 υποψήφιες δείκτες (Πίνακας S2). Οι αλληλουχίες DNA δίπλα στο Infinium στοχευμένη κυτοσίνες για τρεις από τους 15 δείκτες δεν ήταν κατάλληλες για MethyLight σχεδιασμού (Εικ. 4). Ένα πρόσθετο δείκτη αποβλήθηκε από τον αγωγό, επειδή απέτυχε να ενισχύσει

in vitro

μεθυλιωμένα (M.SssI-θεραπεία) DNA ελέγχου (Εικ. 4). Υποβάλλαμε τα υπόλοιπα 11 δείκτες σε αυστηρή μετρητή οθόνη κατά υπερβολικά ποσά PBL DNA (50 ng) από δύο απαλλαγμένα από ασθένειες μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, να αποκλείουν δείκτες μεθυλίωσης του DNA που θα παρουσίαζε προβλήματα υπόβαθρο για την ευαίσθητη ανίχνευση των δεικτών των ωοθηκών μεθυλίωσης του DNA στο αίμα . Αυτή η οθόνη MethyLight με βάση απέδωσε οκτώ δεικτών με πολύ χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης του DNA στο PBL (κατώτατα όρια κύκλου MethyLight (Ct) μεγαλύτερο από 35 και στα δύο δείγματα).

Τεχνικές ελέγχου για την πλατφόρμα MethyLight (ML) οδήγησε στην εξάλειψη των τεσσάρων δεικτών (διέσχισε γκρι κουτιά) λόγω της σχεδιαστικής ασυμβατότητας, και η αδυναμία ενίσχυσης της

in vitro

μεθυλιωμένο DNA θετικού ελέγχου για τις αντιδράσεις MethyLight (δοκιμή M.SssI). Έντεκα δείκτες δοκιμάστηκαν σε φυσιολογικά δείγματα ΡΒΙ χρήση περίσσειας PBL DNA (50 ng). Μαρκαδόροι με κατώτατο όριο κύκλου (Ct) μεγαλύτερο από 35 (μπλε κουτιά) σε δύο φυσιολογικά δείγματα PBL λήφθηκαν υπόψη και αποκλείστηκαν δείκτες με Ct μικρότερη από 35 (κίτρινα κουτιά). MethyLight αναλύσεις με τιμές Ct & lt? 35 δείχνουν αισθητά ανιχνεύσιμες ποσότητες μετουσιωμένο DNA σε αυτούς τους τόπους. Περαιτέρω δοκιμές σε φυσιολογικά δείγματα πλάσματος ελέγχου (100 μΙ) είχε ως αποτέλεσμα την εξάλειψη των επτά από τα οκτώ υπόλοιπα δείκτες. Ένα υπόλοιπο δείκτη,

IFFO1

, δοκιμάστηκε σε 15 ωοθηκών καρκίνους διαφόρων ιστολογικών υποτύπων. Τα αποτελέσματα MethyLight για τον κανονικό έλεγχο του πλάσματος και τα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών που εκφράζεται ως ποσοστό επί τοις εκατό του μεθυλιωμένος Αναφοράς (PMR). Μπλε κουτιά αντιπροσωπεύουν PMR τιμές μικρότερες από 10, κίτρινα κουτιά δείχνουν τιμές PMR μεταξύ 10 και 50, ενώ κόκκινα κουτιά σημαίνει PMR τιμές υψηλότερες από 50. Οι τύποι των όγκων των ωοθηκών που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση είναι οι εξής: σαφές καρκινώματα (CC), μικτή σαφείς κυττάρων και ενδομητριοειδές (CC /E), ενδομητριοειδές (Ε), βλεννώδες (Μ), και ορώδες (S).

Η

Αυτά τα οκτώ δείκτες στη συνέχεια αξιολογήθηκαν σε συμπυκνωμένη δωρεάν δείγματα DNA πλάσματος από δέκα υγιείς μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, αποδίδοντας μόνο ένα δείκτη,

IFFO1

, με σχεδόν μη ανιχνεύσιμα μεθυλίωσης του DNA σε όλα αυτά τα δείγματα πλάσματος ελέγχου (ΜΑΦ & lt? 5) (Σχ. 4). Στη συνέχεια εξετάσαμε

IFFO1

στις 15 όγκους των ωοθηκών διαφόρων ιστολογικών υπότυπων, 14 εκ των οποίων έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί στην αρχική βαθμίδα διαλογής (πίνακας S1), και βρέθηκε σημαντικά επίπεδα μεθυλίωσης του DNA (PMR & gt? 20) σε όλες τις οι όγκοι που αναλύθηκαν (Εικ. 4). Αυτό είναι σε συμφωνία με την ανάλυση μεθυλίωσης Infinium DNA από τα ίδια δείγματα όγκου (Εικ. 2). Ως εκ τούτου, ο δείκτης αυτός επελέγη για μετέπειτα κλινική επαλήθευση σε μια σειρά από δείγματα ορού που συλλέγονται κατά μήκος από ένα ξεχωριστό σύνολο των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.

IFFO1 γονίδιο DNA υποστηρικτής μεθυλίωση (IFFO1-Μ) απόδοση δείκτη σε δείγματα ορού

Θα αξιολογηθεί πρώτα η απόδοση του δείκτη IFFO1-Μ σε δείγματα ορού που λαμβάνονται από οκτώ υγιείς γυναίκες μεγαλύτερης ηλικίας μάρτυρες και 16 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με προχωρημένο (σταδίου III και IV) της νόσου με τη χρήση του εξαιρετικά ευαίσθητη και ποσοτική Ψηφιακή MethyLight δοκιμασία [23]. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών που περιλαμβάνονται σε αυτή την ανάλυση συνοψίζονται στον Πίνακα S3. Η έξοδος για το Ψηφιακή MethyLight μετρηθεί με βάση τα ατομικά μεθυλιωμένο μόρια DNA. Έχουμε εντοπίσει το δείκτη IFFO1-Μ σε όλα τα δείγματα των ασθενών. Σε αντίθεση, IFFO1-M ανιχνεύθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε μόνο δύο από τα οκτώ δείγματα ελέγχου (Σχ. 5Α). Δέκα από τους ορούς των ασθενών είχε περισσότερες IFFO1-M μεθυλίωσης του DNA από οποιοδήποτε από τα δείγματα θετικού μάρτυρα. Η ανάλυση Δέκτης Λειτουργικά Χαρακτηριστικά (ROC), με εκτιμώμενη περιοχή κάτω από την καμπύλη των 0,95 [95% CI, 0,8359 έως 1] έδειξε ένα καλό δυναμικό διακρίσεις για το δείκτη IFFO1-Μ (Σχ. 5Β). Από τα αποτελέσματα αυτά ενδέχεται να έχουν επηρεαστεί από διαφορές στον τρόπο με τα δείγματα ελέγχου και την περίπτωση συλλέχθηκαν και επεξεργασία συνεχίσαμε τη δοκιμή των IFFO1-Μ σε σειριακά συλλέγονται δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών.

Α, IFFO1-M επίπεδα (που εκφράζεται ως ο αριθμός των IFFO1-M μεθυλιωμένη μόρια ανιχνεύονται σε 1 ml ορού) στα βασικά δείγματα 16 ασθενών και οκτώ κανονικούς ελέγχους προσδιορίστηκαν από την Digital MethyLight. Ο αριθμός των μορίων στον ασθενή # 1 είναι μια προσέγγιση αφού μετράει υψηλότερη από 15 χτυπήματα /96 φρεατίων πλάκα /100 μΐ δοκιμάζεται θα μπορούσε να αντανακλά την παρουσία περισσότερων από ένα μόριο /φρεάτιο. Η ιστολογική υπότυπος των όγκων υποδεικνύεται σε παρένθεση ως εξής: ορώδες (S), βλεννώδες (Μ), και ενδομητριοειδές (Ε). Οι αστερίσκοι δεικνύουν τον ασθενή από τον οποίο δείγματα χρησιμοποιήθηκαν στη μετέπειτα διαμήκη ανάλυση. Β, Δέκτης καμπύλης για IFFO1-M. AUC = περιοχή κάτω από την καμπύλη.

Η

Η επαλήθευση του δείκτη IFFO1-Μ σε μια διαμήκη οθόνη για επαναλαμβανόμενες καρκίνο των ωοθηκών

Δοκιμάσαμε αν IFFO1-Μ δείκτης θα μπορούσε να μετρήσει βάρος νόσου σε σειριακά συλλέγονται δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και σε σύγκριση απόδοση της με εκείνη της CA-125. Αυτό εντός-υποκείμενο σύγκριση εξαλείφει την ανάγκη των δειγμάτων ελέγχου δεδομένου ότι κάθε ασθενής χρησιμεύει ως δικό του έλεγχο της. Συλλέχθηκαν δείγματα ορού γύρω από το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης (δείγματα βασική γραμμή) και κατά την διάρκεια μετέπειτα εξετάσεις παρακολούθησης για 16 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Τα δείγματα γραμμής βάσης από την κάθε μία από αυτές 16 ασθενείς χρησιμοποιήθηκαν στην προηγούμενη ανάλυση (Πίνακας S3). Έντεκα από τα δείγματα βασικής γραμμής συλλέχθηκαν πριν από τη χειρουργική επέμβαση (μέση = 11 +/- 5 ημέρες), ενώ πέντε από αυτά συλλέχθηκαν μετά από τη χειρουργική επέμβαση (μέση = 13 +/- 10 ημέρες) (Πίνακας S4). Κατά μέσο όρο, 15 δείγματα ορού (που κυμαίνονται από 8 έως 23) συλλέχθηκαν σε επισκέψεις παρακολούθησης από καθένα από τους ασθενείς, με μέσο χρόνο παρακολούθησης 92 εβδομάδων (από 37 έως 246 εβδομάδες).