Αφηρημένο

διακίνησης λυσοσώματα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εισβολή του όγκου, ένα σημαντικό γεγονός για την ανάπτυξη της μετάστασης. Προηγούμενες μελέτες από το εργαστήριο μας απέδειξαν ότι η πρόσω (προς τα έξω) μετακίνηση των λυσοσωμάτων στην κυτταρική επιφάνεια σε απόκριση ορισμένων ερέθισμα μικροπεριβάλλον του όγκου, όπως αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) ή όξινο εξωκυττάριο pH (Phe), αυξάνει την έκκριση της καθεψίνης Β και του όγκου κελί εισβολή. Προχωρητική εμπορίας λυσόσωμα εξαρτάται από τη δραστηριότητα του εναλλάκτη νατρίου-πρωτονίου και μπορεί να αντιστραφεί με το φράξιμο αυτών ιόντων αντλίες με τρογλιταζόνη ή EIPA. Δεδομένου ότι αυτά τα φάρμακα δεν μπορεί να προωθηθεί μέσα στην κλινική λόγω τοξικότητας, έχουμε σχεδιάσει μία δοκιμασία υψηλής περιεκτικότητας να ανακαλύψουν φάρμακα που μπλοκάρουν περιφερική διακίνησης λυσοσώματος με στόχο την ταυτοποίηση νέων φαρμάκων που αναστέλλουν εισβολής καρκινικών κυττάρων. Ένα αυτοματοποιημένο σύστημα απεικόνισης υψηλής περιεκτικότητας (Cellomics) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της θέσης των λυσοσωμάτων σε σχέση με τον πυρήνα. Μεταξύ των συνολικά 2210 ναρκωτικών επανάχρηση και φυσικό προϊόν που ελέγχθηκαν, εντοπίστηκαν 18 «χτυπήματα». Μία από τις ενώσεις που προσδιορίζονται ως αναστολέας προχωρητική διακίνησης λυσόσωμα ήταν νικλοζαμίδιο, ένα εμπόριο ανθρώπινο αντι-ελμινθικές φάρμακο. Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι το νικλοζαμίδιο μπλοκαριστεί όξινο ΡΗΕ, HGF, και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) προκληθείσα προχωρητική ανακατανομή λυσόσωμα, έκκριση πρωτεάσης, κινητικότητα, και εισβολή των DU145 ευνουχισμού ανθεκτικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε κλινικά σχετικές συγκεντρώσεις. Σε μια προσπάθεια να προσδιοριστεί ο μηχανισμός με τον οποίο το νικλοζαμίδιο εμπόδισε προχωρητική κίνηση λυσόσωμα, βρήκαμε ότι αυτό το φάρμακο δεν εμφάνισαν σημαντική επίδραση στο επίπεδο της ΑΤΡ, μικροσωληνίσκους ή νημάτια ακτίνης, και είχε ελάχιστη επίδραση επί της ΡΙ3Κ και ΜΑΡΚ. Niclosamide κατέρρευσε intralysosomal ρΗ χωρίς διάρρηξη της μεμβράνης λυσοσώματος, ενώ βαφιλομυκίνης, ένας παράγοντας που παρεμποδίζει λυσόσωμα οξίνιση, βρέθηκε επίσης ότι επάγει JLA στο μοντέλο μας. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το νικλοζαμίδιο προάγει juxtanuclear συσσωμάτωση λυσόσωμα (JLA) μέσω διαφοροποίησης των οδών που εμπλέκονται στην λυσόσωμα οξίνισης. Εν κατακλείδι, έχουμε σχεδιάσει μια επικυρωμένη επαναλήψιμη δοκιμασία υψηλής περιεκτικότητας σε διαλογή φαρμάκων που αναστέλλουν λυσόσωμα διακίνηση και τη μείωση της εισβολής του όγκου και συνοψίζουμε τη δράση ενός από αυτά τα φάρμακα

Παράθεση:. Circu ML, αναχώματα SS, Carroll J, K Kelly, Galiano F, Γκριρ A, et al. (2016) A Novel υψηλής περιεκτικότητας Imaging-οθόνης που βασίζεται Προσδιορίζει την Anti-έλμινθες Niclosamide ως αναστολέας της λυσοσώματα Προχωρητική Εμπορίας και Καρκίνος του προστάτη κυττάρων εισβολή. PLoS ONE 11 (1): e0146931. doi: 10.1371 /journal.pone.0146931

Εκδότης: Sidney Yu, Το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 20 Ιούλη του 2015? Αποδεκτές: 23, Δεκ 2015? Δημοσιεύθηκε: 19 του Γενάρη του 2016

Copyright: © 2016 Circu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την επιχορήγηση από την Pfizer, και τη χρηματοδότηση από το Κέντρο Καρκίνου Feist-Weiller. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων

Συντομογραφίες: ( EGF), επιδερμικού αυξητικού παράγοντα? (HGF), αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων? (Phe), εξωκυττάριο pH? (JLA), Juxtanuclear συνάθροιση λυσόσωμα? (LMP), λυσόσωμα διαπερατότητας της μεμβράνης? (ECM), εξωκυτταρική μήτρα? (RILP), Rab αλληλεπιδρούν λυσοσωμικής πρωτεΐνης? (Tro), τρογλιταζόνη? (EIPA), 5- (Ν-αιθυλο-Ν-ισοπροπυλο) -amiloride? (LAMP1), λυσόσωμα συνδέεται μεμβράνη πρωτεΐνη-1? (ΜΑΡΚ), ενεργοποιείται με μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση

Εισαγωγή

Τα λυσοσώματα είναι πολυλειτουργικό ενδοκυτταρικά οργανίδια που περιέχουν υδρολυτικά ένζυμα που αποδομούν μακρομορίων και κυτταρικών στοιχείων [1]. Λυσοσώματα έγιναν κλασικά πιστεύεται ότι λειτουργούν μόνο στην κυτταρική καθαριότητας, αλλά πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι αυτά τα οργανίδια συμβάλλουν επίσης στην παθολογία πολλών κλινικά σχετικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων των κακοηθειών. Τα λυσοσώματα εμπλέκονται στην ογκογένεση μέσω πολλών διαφορετικών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της απορρύθμισης του αυτοφαγία, παρεκκλίνουσα διακίνηση λυσοσωμική και εξωκυπάρωσης, και την αύξηση της διαπερατότητας της μεμβράνης λυσοσώματα (LMP) [2,3]. Λόγω της μεγάλης ποικιλίας των λυσοσώματος μεσολάβηση λειτουργίες που παίζουν ρόλο στην επιβίωση του όγκου, λυσοσώματα έχουν πρόσφατα κερδίζει την προσοχή ως ένα ελκυστικό στόχο για θεραπευτικά του καρκίνου.

Σχηματισμός των μεταστατικών αποικιών που προκύπτουν από μια επεμβατική πρωτοπαθούς όγκου είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο. Δυστυχώς δεν υπάρχουν διαθέσιμα φάρμακα που αναστέλλουν αυτή τη διαδικασία. Ως εκ τούτου, η αυξημένη κατανόηση της εισβολής είναι επειγόντως αναγκαία προκειμένου να αναπτυχθούν αποτελεσματικές θεραπείες για την πρόληψη της εξέλιξης του όγκου. προηγούμενες μελέτες μας δείχνουν ότι λυσόσωμα διακίνησης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των καρκινικών κυττάρων εισβολής, σύμφωνα με την οποία τα καρκινικά κύτταρα με λυσοσώματα που βρίσκεται κοντά στη μεμβράνη του πλάσματος εκκρίνουν περισσότερες πρωτεάσες και είναι πιο επεμβατική από κύτταρα με λυσοσώματα συγκεντρωμένα στην περιπυρηνική περιοχή [4-7]. Συγκεκριμένα, έχουμε δείξει ότι διάφορα κοινά χαρακτηριστικά του στερεού μικροπεριβάλλον του όγκου, ηπατική αυξητικό παράγοντα (HGF), και όξινα εξωκυτταρικό (Phe) σκανδάλη λυσόσωμα προς τα έξω κίνηση, που συνοδεύεται από αυξημένη έκκριση καθεψίνης Β και εισβολής καρκινικών κυττάρων.

Πράγματι, η καθεψίνη Β είναι μία λυσοσωμική πρωτεάση κυστεΐνης που παίζει ένα ρόλο στον κύκλο εργασιών πρωτεΐνη εντός λυσοσώματα [8]. Σε κακοήθη κύτταρα, η έκφραση της καθεψίνης Β είναι ιδιαίτερα μέχρι ρυθμιζόμενη σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό, και το ένζυμο μπορεί να βρεθεί μέσα σε ακτίνη πλούσια επεμβατική προεξοχές ονομάζονται invadopodia [9,10]. Στοιχεία υποστηρίζουν την ιδέα ότι οι λυσοσωματικές πρωτεάσες, συμπεριλαμβανομένων καθεψίνη Β, εκκρίνεται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, όπου αυτές οι πρωτεάσες συμμετέχουν στην αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), ένα αναγκαίο συμβάν σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή [9,10].

Τα λυσοσώματα κινούνται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων και νημάτια ακτίνης μέσω της σύνδεσης με το μοριακό πρωτεΐνες κινητήρα, συμπεριλαμβανομένων δυνεΐνες, κινεσίνης και μυοσίνης [11-13]. Επιπλέον, αρκετές GTPases συμπεριλαμβανομένων RhoA, Rab7 και Rab27 προσλάβει κινητήρα πρωτεϊνών στα λυσοσώματα, παρέχοντας έτσι την αυστηρή ρύθμιση των λυσοσώματος κινητικότητα σε όλο το κύτταρο [14-16]. Συγκεκριμένα, ο μείον-end-κατευθυνόμενη κίνηση των λυσοσωμάτων κατά μήκος των μικροσωληνίσκων εξαρτάται Rab7 και Rab αλληλεπιδρά λυσοσωματικής πρωτεΐνης (RILP), που προσλαμβάνουν κινητήρες δυνεΐνης στα λυσοσώματα και προωθεί ανάδρομη μεταφορά [12]. Από αυτή την άποψη, αναστέλλοντας προχωρητική διακίνησης λυσόσωμα από υπερέκφραση των αποτελεσμάτων RILP μειωμένα επίπεδα εκκρινόμενης εισβολή καθεψίνης Β και των κυττάρων του όγκου [4]. Είναι ενδιαφέρον, τρογλιταζόνη (Tro) και 5- (Ν-αιθυλ-Ν-ισοπροπυλ) -amiloride (EIPA), αναστολείς εναλλάκτη πρωτόνιο νάτριο, προωθούν ανάδρομη διακίνηση των περιφερικών λυσοσώματα σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, με αποτέλεσμα τη μειωμένη έκκριση της πρωτεάσης και των καρκινικών κυττάρων εισβολής [ ,,,0],4]. EIPA και Tro-μεσολάβηση συσσωμάτωσης juxtanuclear λυσοσώματα (JLA) είναι Rab7 /RILP εξαρτάται.

Ένας άλλος παράγοντας που μπορεί να συμβάλει στην λυσόσωμα διακίνησης είναι ο τύπος κενοτοπικής πρωτονίων-ΑΤΡ αντλίας (V-ΑΤΡ). Αυτό το μεγάλο συγκρότημα ενζυματική μετασχηματίζει την ενέργεια της υδρόλυσης ΑΤΡ στην κίνηση των πρωτονίων κατά μήκος της λυσοσωμικής μεμβράνης. Εκτός από την παραγωγή λυσοσωμικών οξίνιση, V-ΑΤΡάση εμπλέκεται επίσης και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων της φυσαλιδώδους διακίνησης. Πράγματι, η c-υπομονάδα έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με ARF6, ένα μικρό ΟΤΡάσης που κατευθύνει την εμπορία μεμβράνης και κυτταροσκελετικών δυναμική [17]. Σε οστεοκλάστες, ATP6AP1 (α υπομονάδα του V-ΑΤΡάση επίσης γνωστή ως Ac45) αλληλεπιδρά με το μικρό Rab7 ΟΤΡάσης, η οποία ρυθμίζει τη φυσαλιδώδη διακίνηση [18]. Η ισομορφή Α-υπομονάδα είναι επίσης πιστεύεται ότι είναι ζωτικής σημασίας για τη φυσαλιδώδη διακίνησης [19].

Όπως έχει ήδη χαρακτηρίζεται αναστολείς της προχωρητική εμπορίας λυσοσώματος, όπως Tro και EIPA δεν μπορεί να προχωρήσει στην κλινική αρένα [20], που προσπάθησε να εντοπίσει πρόσθετες νέες αναδιαμορφωθεί και φυσικό προϊόν ενώσεις πολλές από τις οποίες βρίσκονται ήδη σε κλινική χρήση για ενδείξεις μη-καρκίνου. Ο στόχος μας ήταν να εντοπίσει νέους αναστολείς της προχωρητική εμπορίας λυσοσώματος με ένα καλό προφίλ ασφάλειας. Αυτό αντιπροσωπεύει μια νέα προσέγγιση στη μεταφραστική έρευνα για τον καρκίνο που θα μπορούσαν δυνητικά να ανακαλύψουν νέες αποτελεσματική αντι-εισβολής και αντι-μεταστατική φάρμακα.

Σε αυτό το χειρόγραφο, παρουσιάζουμε τα αποτελέσματα μιας οθόνης 4 βιβλιοθήκες των ενώσεων, μερικές από τις οποίες είναι ήδη στο εμπόριο για ενδείξεις μη-καρκίνο, χρησιμοποιώντας μια νέα προσέγγιση που συνδυάζει υψηλή περιεκτικότητα σε μικροσκόπιο φθορισμού και ανάλυση εικόνας πολλαπλών παραμέτρων. Εμείς εντοπίστηκαν διάφορα φάρμακα που αναστέλλουν προχωρητική εμπορίας λυσόσωμα, συμπεριλαμβανομένων νικλοσαμίδη. Niclosamide (C13H8Cl2N2O4, ΜΒ 327) είναι ένα FDA-εγκριθεί από του στόματος αντι-ελμινθικές παράγοντα, ευρέως διαθέσιμα εκτός των ΗΠΑ για τη θεραπεία της εντερικής ταινία. Είναι ανέξοδο, γενικά καλά ανεκτό και συνδέονται με λίγες παρενέργειες [21]. Niclosamide ασκεί τοξική δράση της εναντίον helminthes με απόζευξη οξειδωτική φωσφορυλίωση [22,23] και έχει πρόσφατα δειχθεί ότι έχει μια πολλά υποσχόμενη δράση έναντι του καρκίνου. Στην έκθεση αυτή, ερευνήσαμε μηχανισμό νικλοζαμίδιο της δράσης και επίδραση στην έκκριση λυσοσώματα πρωτεάσης, καρκινικό κύτταρο κινητικότητα, και την εισβολή.

Υλικό και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Η ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή DU145 και ανθρώπινου γλοιώματος Α172 κυτταρική γραμμή ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). κύτταρα DU145 διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Mediatech, Corning, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Α172 κυτταρικές γραμμές γλοιώματος διατηρήθηκαν σε Dulbeco Μέσο Eagle Τροποποιημένο (DMEM) (Mediatech) συμπληρωμένο με 10% FBS. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε επωαστή 37 ° C με 5% CO2 και ανακαλλιεργήθηκαν κατά την επίτευξη περισσότερο από 75% συρροή. Ρυθμισμένο RPMI-1640 παρασκευάστηκε από RPMI-1640 σε σκόνη συμπληρωθεί με 10mM NaHCO

3 και 20 mM NaCl και ρυθμίζεται σε pHe 6,4.

Υψηλή οθόνη περιεχόμενο για τους αναστολείς των περιφερειακών λυσοσώματος εμπορίας

DU145 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 4500 κύτταρα ανά φρεάτιο. RPMI ρυθμισμένα μέσα τιτλοδοτούνται σε ρΗ 6.4 έως 6.8 του προστέθηκε σε στήλη 12 μετά το μέσο απομακρύνθηκε και χρησιμεύει ως αρνητικός έλεγχος. Οι ενώσεις που θα προβληθεί προστέθηκαν σε στήλη 2-11 μετά από αραίωση σε χαμηλό ρΗ ρυθμισμένο μέσο σε μια τελική συγκέντρωση 5 μΜ. Οι 4 βιβλιοθήκες ενώσεων που περιλαμβάνονται στην τρέχουσα οθόνη περιλαμβάνει την κλινική Συλλογή ΝΙΗ (450 φάρμακα), Prestwick (1200 φάρμακα), φυτοχημικές (320 φάρμακα) και GreenPharma (240 φάρμακα). 25 μΜ EIPA χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας. Μετά από 16 ώρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη κρύο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 20 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), στη συνέχεια, λυσοσώματα βάφτηκαν με επώαση με το αντίσωμα H4A3 LAMP-1 αραιωμένο σε 1: 200 σε 0,25% BSA και 0,1% σαπωνίνη σε PBS (BSP) για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS 3 φορές και επωάστηκαν για 1 ώρα με Dylight γαϊδάρου αντι-ποντικού αραιωμένο σε 1: 200 σε BSP. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS 3 φορές και επωάστηκαν για 20 λεπτά με ϋΑΡΙ (Sigma-Aldrich) σε αραίωση 1: 1000 σε PBS. DAPI πλύθηκε καλά με PBS και τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε PBS για όλη τη διάρκεια της διαδικασίας διαλογής. Οι πλάκες τοποθετούνται και διαβάζονται σε μια Cellomics Arrayscan (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, ΜΑ) αυτοματοποιημένη απεικονίσεως φθορισμού (Σχήμα 1Α). Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με βάση αντικειμενικά 20Χ σε 2 φθορισμού κανάλια. Συνολικά 15 διαφορετικά πεδία σε κάθε φρεάτιο, και ένα μέγιστο 300 κυττάρων απεικονίστηκαν ανά φρεάτιο. Η biocompartmental αλγόριθμος ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση κάθε κύτταρο με πυρήνα της και να εφαρμόσει μια κυτταροπλασματική μάσκα (δακτύλιος) και τον υπολογισμό του αριθμού των λυσοσώματα μέσα στο δαχτυλίδι. Το δαχτυλίδι ήταν 12 πλάτος pixels, και το εσωτερικό χείλος της ήταν 6 εικονοστοιχεία μακριά από τον πυρήνα. Ο μέσος αριθμός των λυσοσωμάτων μέσα στο καθορισμένο περιοχή δακτυλίου αποκτήθηκε ως «σημαίνουν spot δαχτυλίδι κανάλι καταμέτρηση 3», που αντιπροσωπεύει την κατανομή των λυσοσωμάτων σε σχέση με τον πυρήνα. Όταν λυσοσώματα απομακρυνθούμε από τον πυρήνα και διασπορά σε όλο το κυτταρόπλασμα, τον αριθμό των κηλίδων που αντιπροσωπεύουν λυσοσώματα μέσα κυτταροπλασματικές αυξήσεις μάσκας. Αντίθετα, λυσοσώματα σύμπλεγμα κοντά στον πυρήνα τους αριθμούς σημείο στο εσωτερικό των κυτταροπλασματικών μειώσεις δακτύλιο (Σχήμα 1Β). Ο παράγοντας Ζ ‘της δοκιμασίας προσδιορίστηκε από το IEAP (θετικός έλεγχος) και χαμηλό ρΗ (αρνητικός έλεγχος) [24]. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Μόνο πλάκες με συντελεστή θετική Ζ ‘χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση.

(Α) Η μεθοδολογία της προσέγγισης διαλογής υψηλής περιεκτικότητας Cellomics-based. (Β) χρώση ϋΑΡΙ χρησιμοποιείται από την πλατφόρμα απεικόνισης Cellomics να προσδιορίσει μεμονωμένα κύτταρα. Ένα εικονικό μάσκα τραβιέται από την μηχανή (υποβληθείσα από πράσινο δακτύλιο) με ένα προκαθορισμένο πλάτος και την απόσταση από τον πυρήνα. Ο αριθμός των λυσοσωμάτων εσωτερικό της μάσκας υπολογίζεται από το μηχάνημα (που αντιπροσωπεύεται από το μωβ κηλίδα στο εσωτερικό του δακτυλίου). Με κατεργασία των κυττάρων με όξινα Phe, λυσοσώματα κινηθούν έξω και ο αριθμός των κηλίδων στο εσωτερικό του δακτυλίου αυξάνει. Με την αναστολή κίνηση λυσόσωμα, ο αριθμός των κηλίδων γύρω από τον πυρήνα αυξάνεται ενώ ο αριθμός των κηλίδων στο εσωτερικό μειώνεται μάσκας δακτυλίου. Αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό σχετική κατανομή λυσόσωμα. (Γ) Το λειτουργικό αποτέλεσμα για κάθε ένωση σε σχέση με τον έλεγχο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας «κανονικοποιημένη επί τοις εκατό αναστολή» (ΝΡΙ). Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ενώσεων και του αρνητικού ελέγχου μετρήθηκε με βαθμολογία Ζ. Ένα διάγραμμα διασποράς που αντιπροσωπεύει την ΝΡΙ (Χ-άξονας) και τη βαθμολογία Ζ (Υ-άξονας) κάθε ένωσης σχεδιάζεται. Τα φάρμακα που δίνουν μια βαθμολογία ΝΡΙ άνω του 50% και βαθμολογία Ζ λιγότερο από -4 (κάτω δεξιά τεταρτημόριο, όπως υποδεικνύεται από το κόκκινο βέλος) έχουν οριστεί ως «χτύπησε» ενώσεις.

Η

Αντιδραστήρια και αντισώματα

LY294002, U0126, βαφιλομυκίνη Α και νοκοδαζόλη αγοράστηκαν από την Calbiochem (San Diego, CA) και χρησιμοποιήθηκαν σε 10 μΜ, 10 μΜ, 100 ηΜ και 10 μΜ, αντίστοιχα. Phalloidin 1: 200 αγοράστηκε από την Life Technologies (Grand Island, Νέα Υόρκη). Το αντίσωμα α-τουμπουλίνης, 1: 1000, αγοράστηκε από NeoMarkers (Fremont, CA). αντισώματος LAMP1 (H4A3), 1: 200, αγοράστηκε από την Αναπτυξιακών Μελετών Υβριδώματος τράπεζα στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα. DyLight 594 ή FITC, γάιδαρο αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού αγοράστηκαν από Jackson Immunoresearch (West Grove, ΡΑ). ρΑΚΤ και pMet χρησιμοποιήθηκαν σε 1/1000 και αγοράζονται από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). EIPA (25 μΜ), κυτοχαλασίνη D (1 μΜ), αντίσωμα Rab7 (1: 1000), και χλωροκίνη (50 μΜ) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Δευτερογενής συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού αγοράστηκαν από την GE Healthcare (Pittsburgh, ΡΑ).

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 50-70% συρροή σε γυάλινες καλυπτρίδες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 20 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (1: 200 αραιωμένο σε BSP) για μία ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και πάλι με PBS πριν από την επώαση με φθορισμό δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (1: 200 αραιωμένο σε BSP) για μία ώρα. Για τη χρώση ακτίνης, τα κύτταρα επωάστηκαν με φαλλοϊδίνη αραιωμένο σε 1: 200 σε BSP για 20 λεπτά. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας Slowfade Anti-Fade Χρυσό αντιδραστηρίου με DAPI (Τεχνολογίες Ζωής, Grand Island, Νέα Υόρκη). Εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus UPlanFL 40X /0.75 αντικειμενική και ένα μικροσκόπιο Olympus BX50 με το λογισμικό MetaMorph. Εικόνες συγχωνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Για συνεστιακή εικόνες, χρησιμοποιήθηκαν α /1,4 – 0,6 στόχο πετρελαίου HCX Σχέδιο Apo 63X στο SP5 μικροσκόπιο Leica TCS και το λογισμικό Leica LAS AF.

ακριδίνης πορτοκαλί βαφή

Τα κύτταρα αυξάνονται σε γυάλινες καλυπτρίδες φορτώθηκαν με 10 μg /mL ακριδίνη πορτοκαλί (Sigma Aldrich) για 20 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Μετά από ολονύκτια επώαση με διαφορετικές ενώσεις, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με ψυχρό 4% PFA για 20 λεπτά και στη συνέχεια τα πλακίδια τοποθετημένα με Αντιδραστήριο Slowfade Anti-Fade Χρυσό με ϋΑΡΙ, πριν από την εμφάνιση με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 4500 κύτταρα ανά φρεάτιο και αναπτύχθηκαν για 16 ώρες. Οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων σε φρεάτια εις τριπλούν προσδιορίστηκαν μετά CellTiter-Μπλε

® (Promega, Madison, WI) αντιδραστήριο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε 1/5 αναλογία όγκου, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 1 ώρα, και στη συνέχεια τοποθετείται σε φθορίζον αναγνώστη, όπου ο φθορισμός σε καθορισμένα χρονικό σημείο καταγράφεται στα 560 διέγερση /590 εκπομπή.

ΑΤΡ δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε 4500 κύτταρα ανά φρεάτιο και αναπτύχθηκαν για 16 ώρες. CellTiter-Glo

® αντιδραστήριο (Promega, Madison, WI) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και η πλάκα τοποθετείται σε αναγνώστη φωταύγειας. Η ποσότητα φωταύγειας σε κάθε φρεάτιο είναι ανάλογη προς την ποσότητα του ΑΤΡ.

Western Blot

λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν σε ζέον Laemmli ρυθμιστικό (0.125 Μ Tris-HCl, ρΗ 6,8, 4% SDS, 0.13 mM μπλε βρωμοφαινόλης, 1 Μ σακχαρόζη) αναμιγνύεται με βήτα-μερκαπτοαιθανόλη (σε αναλογία 50: 1). Κυτταρολύματα έτρεξαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10%, μεταφέρθηκαν πάνω σε PVDF (Millipore, Billerica, ΜΑ), αποκλείστηκε σε 10% γάλα σε TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20, ρΗ 7,5) και ανιχνεύθηκαν με κατάλληλα αντισώματα για 16 ώρες. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (1: 5000) για μία ώρα πριν από την ανάπτυξη χρησιμοποιώντας ECL-plus (Pierce, Waltham, ΜΑ). Kodak BioMax XAR φιλμ χρησιμοποιήθηκε για ανίχνευση χημειοφωταύγειας.

Καθεψίνη Β δοκιμασία

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 80% συρροή, οπότε πλήρες μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο ελεύθερο ορού και τις ενδεικνυόμενες συνθήκες. Μετά την επώαση, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κυτταρικά θραύσματα συνελέγησαν με σύντομη φυγοκέντρηση. Τα μέσα στη συνέχεια συμπυκνώθηκε μέσω Amicon συσκευών συγκέντρωση διήθηση 10.000 Daltons (Millipore). Τα δείγματα στη συνέχεια τιτλοδοτήθηκαν σε ρΗ 5,0-5,5 και ενεργό καθεψίνη Β στη συνέχεια ανιχνεύθηκε μέσω ενός δοκιμασία φθορισμογόνου δραστικότητας καθεψίνης Β (Calbiochem, San Diego, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ταυτόχρονα, λύματα κυττάρων εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA σε 4 βαθμούς. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας χρωματομετρική δοκιμασία BCA Pierce (Thermo Fisher Scientific). δραστηριότητα καθεψίνης Β ομαλοποιήθηκε σε συνολικό επίπεδο κυτταρικής πρωτεΐνης από τον υπολογισμό της δραστηριότητας αναλογία καθεψίνης Β πάνω από το επίπεδο της πρωτεΐνης σε κάθε κατάσταση.

λεντοϊών παράδοση shRNA

shRNA κατευθύνεται προς Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCT GACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) παραδόθηκε σε DU145 καρκίνου του προστάτη κυττάρων χρησιμοποιώντας Mission

™ λεντοϊών Μεταγωγή Σωματίδια (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και όπως περιγράφεται προηγουμένως [6,7]. έκφραση shRNA διατηρήθηκε υπό πουρομυκίνη (1.8 μg /mL) επιλογής. Μη Target (ΝΤ) shRNA στόχευση δεν γνωστά γονίδια θηλαστικών χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας (Sigma-Aldrich, shc202V).

Η διαμόλυνση κυττάρων με πλασμίδια που κωδικοποιούν LC3-GFP-mCherry

Η retroviral- με βάση ρΒΑΒΕ-mCherry-EGFP-LC3B πλασμίδιο (πλασμίδιο # 22418) αγοράστηκε από Addgene (Cambridge, ΜΑ). Ο ιός ήταν ψευδοτυποποιημένοι χρησιμοποιώντας τον φορέα συσκευασίας pPAM3 μετά συν-επιμόλυνση εντός κυττάρων ΗΕΚ293Τ και ιικά υπερκείμενα διηθούνται (0,2 micron), δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C. Πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine επιμόλυνσης (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Κινητικότητα και προσδιορισμούς εισβολής (IncuCyte)

96 φρεατίων ImageLock Microplate (Essen Bioscience, Ann Arbor, ΜΙ) επικαλύφθηκαν με τύπου Ι κολλαγόνο (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 90% συρροή. Πανομοιότυπες τραύματα έγιναν σε κάθε καλά με το θεραπευτή και του τραύματος 96 (Έσσεν Bioscience). Τα κύτταρα πλύθηκαν για να απομακρυνθεί επιπλέοντα κύτταρα και υπολείμματα. 20% Matrigel (Corning) τοποθετήθηκε σε φρεάτια που ορίζονται για τις μελέτες εισβολής. συνθήκες Θεραπεία εφαρμόστηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν στην πλατφόρμα απεικόνισης IncuCyte ζουμ (Essen Bioscience) το οποίο διατηρείται στους 37 ° με 5% CO2 και αποκτά τις εικόνες σε πραγματικό χρόνο για την ίδια περιοχή σε κάθε φρεάτιο κάθε 4 ώρες. Μια μάσκα δημιουργήθηκε για να καθορίσει την επούλωση του τραύματος για κάθε φρεάτιο. Σχετική Τραύματος Πυκνότητα (RWD) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή κινητικότητα.

DQ-κολλαγόνου IV αποικοδόμηση δοκιμασία

κύτταρα DU145 αναπτύχθηκαν για 2 ημέρες σε καλυπτρίδες που στρώθηκαν με 100% matrigel (Corning) και DQ-κολλαγόνο IV (Invitrogen Life Technologies, αραιώνεται σε τελική συγκέντρωση 25 μg /mL). Μετά την κατεργασία όλη τη νύκτα με φάρμακο σε παρουσία ή απουσία HGF, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% (w /v) παραφορμαλδεϋδη για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν 2 φορές με PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor 635 φαλλοϊδίνη (ϋίβ Technologies) αραιωμένο 1: 200 σε BSP για 30 λεπτά για τη χρώση τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 2 φορές με PBS και οι καλυπτρίδες τοποθετηθεί. Αποικίες και διασπασμένο DQ-κολλαγόνου IV απεικονίστηκαν σε Leica TCS SP5 λέιζερ σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LAS AF.

Στατιστικά

GraphPad Prism 5.0 και το λογισμικό Microsoft Excel χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση τα στατιστικά στοιχεία. Ένα ή δύο-tailed t test Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει στατιστικές διαφορές. Όλα τα γραφήματα δείχνουν την μέση τιμή και την τυπική απόκλιση (SD). Διαφορές σε ρ & lt? 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. IC

50 από τα φάρμακα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση μη γραμμικής παλινδρόμησης επί GraphPad Prism. διαλογής φαρμάκων διεξήχθη στις 2 επαναλήψεις. παράγοντας στιβαρό Ζ ‘υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το μεσαίο και το μεσαίο απόλυτη απόκλιση του ελέγχου θετικά και αρνητικά της κάθε πλάκας και μόνο πλάκες με θετική αξία επικυρώθηκαν [24-27]. παράγοντας Ζ ‘= 1 – {3 (SDN + SDP) /(Mn-Στ)} [20], όπου Mp, Mn, SDP, Sdn είναι μέση και τυπική απόκλιση του θετικού ελέγχου (EIPA) ή αρνητικό μάρτυρα (οξύ μόνο) . Μέγεθος επίδραση της κάθε ένωσης υπολογίστηκε με χρήση κανονικοποιημένων ποσοστό της αναστολής (ΝΡΙ). ΝΡΙ = (H-xi) /(H-L) του χρόνου 100? όπου H = μέση του αρνητικού μάρτυρα και L = μέση του θετικού ελέγχου και XI της αξίας της αντίστοιχης ένωσης. Στατιστική διαφορά του αποτελέσματος σε σχέση με της ένωσης με τον αρνητικό μάρτυρα υπολογίστηκε με χρήση Z σκορ, το οποίο είναι η αξία της κάθε ένωσης κανονικοποιήθηκε με τον αρνητικό μάρτυρα. Ζ βαθμολογία = (xi-Η /SDN, όπου xi είναι η τιμή της αντίστοιχης ένωσης, H και Sdn είναι η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση του αρνητικού μάρτυρα σε κάθε πλάκα, αντίστοιχα. Μόνο τα ναρκωτικά που δείχνει μια βαθμολογία Ζ κάτω από μείον 4 και NPI άνω του 50% επανεξετάστηκαν για μελλοντικές μελέτες.

Αποτελέσματα

Μια νέα προσέγγιση διαλογής υψηλής περιεκτικότητας απεικόνισης που βασίζονται προσδιορίζει φάρμακα που αναστέλλουν προχωρητική εμπορίας λυσοσώματα

για να εντοπιστούν κλινικά διαθέσιμες ενώσεις που αποτρέπουν όξινες phe-διαμεσολαβούμενη προχωρητική διακίνησης λυσόσωμα, έχουμε αναπτύξει μια υψηλή οθόνη περιεκτικότητα χρησιμοποιώντας την Cellomics Array σάρωσης IV πλατφόρμα απεικόνισης (Σχήμα 1Α). DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. μέσο ελεύθερο ορού χαμηλό ρΗ και ΕΙΡΑ χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα. Ενώσεις από τέσσερις ανεξάρτητες χημικές βιβλιοθήκες εφαρμόστηκαν σε περίπου 5 μΜ συγκέντρωση σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ρΗ 6,4 ελεύθερο ορού RPMI όλη τη νύχτα. τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και λυσοσώματα ταυτοποιήθηκαν με ένα λυσόσωμα συνδέεται μεμβράνη πρωτεΐνη-1 ( LAMP1) αντίσωμα, μια καθιερωμένη δείκτης λυσοσωμικών, ενώ οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με DAPI. Η πλατφόρμα Cellomics Arrayscan χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει τη ανοσοφθορισμού σε κάθε φρεάτιο χρησιμοποιώντας 20χ αντικειμενικό και ένα λογισμικό διαμερισματική ανάλυση διανομή ποσοτικοποιηθεί λυσόσωμα μέσα σε κάθε κύτταρο. διανομής λυσόσωμα προσδιορίστηκε με ανάλυση του αριθμού των LAMP-1 θετικό puncta εντός του καθορισμένου «δαχτυλίδι» περιοχή (Εικόνα 1Β).

Τα κύτταρα με λυσοσώματα εμφάνιση JLA (EIPA αγωγή) είχαν λιγότερες λυσοσώματα μέσα στην περιοχή του δακτυλίου σε σύγκριση σε κύτταρα με λυσοσώματα βρίσκονται διάσπαρτες σε όλο το κυτταρόπλασμα. Οι δοκιμασίες επικυρωθεί από τον υπολογισμό του συντελεστή Ζ », η οποία μετρά την ικανότητα του τεστ να γίνει διάκριση μεταξύ θετικών και αρνητικών μαρτύρων [24]. Το λειτουργικό αποτέλεσμα για κάθε ένωση σε σχέση με τους μάρτυρες υπολογίσθηκε χρησιμοποιώντας μια «κανονικοποιημένη επί τοις εκατό αναστολή» βαθμολογίας (ΝΡΙ). Ισχυρότερη αναστολή της προχωρητική εμπορίας λυσοσώματος προσδίδει μεγαλύτερη αξία NPI. Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς «σημαίνουν spot δαχτυλίδι» μεταξύ της ένωσης και του αρνητικού ελέγχου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση βαθμολογία Ζ (Εικ 1C). Ενώσεις με σκορ ΜΚΙ πάνω από 50% και βαθμολογία Z κάτω από -4 επελέγησαν (κάτω δεξιά τεταρτημόριο, όπως υποδεικνύεται από το κόκκινο βέλος) και επανεξέτασε οπτικά για την εξάλειψη των false positives. Μεταξύ 2210 ενώσεις που δοκιμάστηκαν, δεκαοχτώ ναρκωτικά εντοπίστηκαν ως επιτυχίες και επαληθεύεται από δευτερογενή διαλογή. Πολλές από αυτές τις ενώσεις είναι ήδη γνωστό ότι είναι παράγοντες μικροσωληνίσκων διαταράσσοντας, και προβλέψιμα θα μπλοκάρουν προς τα έξω κίνηση των λυσοσώματα.

Niclosamide, ένα αντι-ελμινθικές παράγοντας, επίσης αναγνωριστεί ως ένα από τα χτυπήματα. Δεδομένου ότι, νικλοζαμίδιο έχει αποδειχθεί ότι έχει αντικαρκινικές επιδράσεις σε γλοιοβλάστωμα [28], μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [29], ορθοκολικό καρκίνο [30], και του καρκίνου του μαστού [31], επιλέξαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω το ρόλο του νικλοζαμίδιο επί λυσόσωμα κίνηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Niclosamide είναι τοξικό σε συγκεντρώσεις 1,0 micromolar

Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε την κυτταρική τοξικότητα του νικλοζαμίδιο προκειμένου να προσδιοριστεί το εύρος των συγκεντρώσεων στις οποίες το φάρμακο αυτό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για πειραματικές μελέτες. Niclosamide εφαρμόστηκε σε DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε διάφορες συγκεντρώσεις πάροδο του χρόνου. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό κυτταρικής με βάση φθορισμό (Σχ S1A). Niclosamide θεραπεία οδήγησε σε μειωμένη πολλαπλασιασμό σε συγκεντρώσεις 0,6 μΜ και πάνω από 24 και 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Η μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων έγινε πιο εμφανής στις 48 ώρες και σε μία δόση 1 μΜ και παραπάνω, όταν παρατηρούμε μια μείωση στα βιώσιμα κύτταρα σε 48 ώρες έναντι 24 ωρών. Η ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) υπολογίστηκε ως 1.01 μΜ (S2 Εικ). Ως εκ τούτου, για το υπόλοιπο των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν, επιλέξαμε μια συγκέντρωση που δεν υπερβαίνει το 1 μΜ και πειράματα που δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες.

Niclosamide αναστέλλει την εμπορία προχωρητική λυσοσώματα στα καρκινικά κύτταρα

για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό νικλοζαμίδιο ως αναστολέας λυσόσωμα διακίνησης, DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με DMSO ή νικλοζαμίδιο και εκτέθηκαν σε όξινο ρΗ 6.4 μέσα ενημέρωσης, 33 ng /ml HGF ή 100 ng /ml EGF επί 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση με ϋΑΡΙ (μπλε), LAMP1 (κόκκινο), και φθαλλοϊδίνη (πράσινο) (σχήμα 2Α). Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DMSO εμφανίζονται προχωρητική διακίνησης λυσοσώματα ως απάντηση σε όξινο Phe, HGF και EGF. Ωστόσο, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με νικλοζαμίδιο δεν υφίστανται προχωρητική διακίνησης λυσοσώματα ως απάντηση σε όξινο Phe, HGF ή EGF? Αντ ‘αυτού, λυσοσώματα παραμένουν συγκεντρωμένα στην περιπυρηνική περιοχή. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα της οθόνης υψηλής περιεκτικότητας σε φάρμακο που εντοπίστηκαν νικλοζαμίδιο ως αναστολέας της λυσοσώματος εμπορίας.

(Α) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με pHe 6,4, 33 ng /mL HGF ή 100 ng /mL ΕΤΠ η παρουσία ή απουσία του 0,5 μΜ νικλοζαμίδιο. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για DAPI (μπλε), ακτίνη (πράσινο), και LAMP-1 (κόκκινο). Κατά τον έλεγχο και EGF ή HGF επεξεργασμένα κύτταρα τα λυσοσώματα βρίσκονται στην περιφέρεια (λευκά βέλη), ενώ στα κύτταρα νικλοζαμίδιο έλαβαν τα λυσοσώματα είναι γύρω από τον πυρήνα (λευκά βέλη). Ράβδοι κλίμακας: 10 μm. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με διάφορες συγκεντρώσεις νικλοζαμίδιο αραιωμένο σε (Β) μέσα ενημέρωσης χαμηλό ρΗ (ρΗ 6,4), (C) μέσου που περιέχει 33 ng /mL HGF, ή (Δ) μέσο που περιέχει 100 ng /ml EGF και διανομή σχετική λυσόσωμα ήταν υπολογίζεται με τη χρήση του συστήματος ξηρής εμφάνισης Cellomics. Ποσοτικοποίηση της θέσης λυσοσώματος εμφανίζεται ως ο μέσος όρος της υπολογίζεται «σημαίνει spot δαχτυλίδι αριθμού καναλιών 3». Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,01) έναντι νικλοζαμίδιο. (Ε) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ Niclosamide την πάροδο του χρόνου και σχετική κατανομή λυσόσωμα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την απεικονιστή Cellomics. Ποσοτικοποίηση της θέσης λυσοσώματος εμφανίζεται ως ο μέσος όρος της υπολογίζεται «σημαίνει spot δαχτυλίδι αριθμού καναλιών 3». Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Μια μελέτη απόκρισης δόσης διεξήχθη για να καθοριστεί η ελάχιστη αποτελεσματική δόση της νικλοζαμίδιο που απαιτούνται για την έναρξη JLA. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις νικλοζαμίδιο για 16 ώρες παρουσία ή απουσία όξινων Phe (Σχήμα 2Β), HGF (Σχήμα 2C), ή EGF (Σχήμα 2D). Τα κύτταρα ανοσοχρώστηκαν για τον εντοπισμό LAMP1 και DAPI χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση πυρήνων. Η σχετική κατανομή λυσόσωμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το Cellomics Imager. Niclosamide μπλοκάρει σημαντικά την ανακατανομή των λυσοσώματα σε μια συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 312 nm μετά από διέγερση με HGF ή EGF, και στα 625 nm μετά από διέγερση με όξινο Phe.

Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί μια ανάλυση χρονική πορεία για τον εντοπισμό το ελάχιστο ποσό του χρόνου που απαιτείται πριν νικλοζαμίδιο ήταν αποτελεσματική στην επαγωγή JLA. κύτταρα DU145 εκτέθηκαν σε νικλοζαμίδιο την πάροδο του χρόνου με την παρουσία όξινων μέσων (ρΗ 6.4). Σχήμα 2Ε δείχνει ότι λυσόσωμα θέσης μεταβλήθηκε σε συντομότερο 2-4 ώρες μετά την έκθεση σε νικλοζαμίδιο, και JLA αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου. Καμία αλλαγή στην λυσόσωμα τοποθέτηση παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα ελέγχου του οχήματος. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το νικλοζαμίδιο μεταβάλλει τη θέση του λυσοσώματος σε μια δόση τόσο χαμηλή όσο 312 ηΜ και το νωρίτερο 2 ώρες.

Niclosamide επαγόμενη JLA δεν συνεπάγεται αναστολή της παραγωγής ΑΤΡ

Προηγούμενη εργασία έχει ενοχοποιηθεί κινεσίνη, μια ΑΤΡάση πρωτεΐνης κινητήρα, σε συν-τέλος-σκηνοθεσία λυσοσώματα κίνηση (προς τα έξω λυσοσωμική κίνηση) [32-34]. Επειδή το νικλοζαμίδιο είναι γνωστό για την ικανότητά του να στοχεύσει την οξειδωτική φωσφορυλίωση των παρασίτων [22,23], επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν νικλοζαμίδιο επαγόμενη JLA οφειλόταν στην εξάντληση του ΑΤΡ, η οποία προκύπτει από ανέστειλαν οξειδωτική φωσφορυλίωση, και, κατά συνέπεια, αλλοίωση της δραστηριότητας του ΑΤΡ καθοδηγούμενου από πρωτεΐνες, όπως κινεσίνης. Κατά συνέπεια, DU145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου ή το νικλοζαμίδιο σε περίοδο 4 ώρα του χρόνου και ενδοκυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ, ένα υποκατάστατο της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία φωταύγειας-based (S1B Εικ). Παρά το γεγονός ότι, ο αντίκτυπος της νικλοζαμίδιο επί λυσοσώματος τοποθέτησης παρατηρείται ήδη 2 ώρες μετά την έκθεση στο φάρμακο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο ΑΤΡ μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία μάρτυρα φορέα ή νικλοζαμίδιο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Yang et al. Cytochalasin Δ, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για αποπολυμερίζουν νημάτια ακτίνης. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για ακτίνη (πράσινο) και DAPI (μπλε). Τα βέλη δείχνουν ότι τα ίδια κυτταρικά συστατικά (νηματοειδή ακτίνη-βέλος, φλοιού actin- κλειστό βέλος, εστιακό adhesion- ανοιχτό βέλος) είναι παρόμοια μεταξύ ελέγχου και νικλοζαμίδιο. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm. Νοκοδαζόλη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για αποπολυμερισμό μικροσωληνίσκων. PI3kinase και ΜΑΡΚ δεν απαιτούνται για την πρόληψη νικλοζαμίδιο όξινα μέσα προς τα έξω που προκαλείται λυσόσωμα κίνηση.

(Α) Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 33 ng /mL HGF σε παρουσία ή απουσία 0,5 μΜ νικλοζαμίδιο πάροδο του χρόνου. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες. (Β) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αναστολέα ΡΙ3Κ, LY294002, ή αναστολέας ΜΑΡΚ, U0126, πριν από την προσθήκη του νικλοζαμίδιο 1 μΜ για 16 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για LAMP-1 και σημαίνουν λυσόσωμα σχετική κατανομή στον πυρήνα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την απεικονιστή Cellomics. Η ποσοτικοποίηση της κατανομής λυσοσώματος παρουσιάζεται ως ο μέσος όρος της σχετικής θέσης στον πυρήνα. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05) σε σχέση με ίδια μεταχείριση σε ελεύθερο ορού. ανάπτυξη Niclosamide μπλοκ προκαλούμενης από παράγοντα κινητικότητα και διεισδυτικότητα ανεξάρτητα από το καθεστώς Rab7.

κύτταρα DU145 NT και Rab7 KD αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και τραυματίες με θεραπευτή καλά τραύματος 96 πριν από την προσθήκη του matrigel στα φρεάτια σχεδιαστεί για εισβολή. Τα κύτταρα αφέθηκαν να (Α) μεταναστεύουν ή (Β) εισβάλουν σε παρουσία 33 ng /mL HGF ή 100 ng /mL EGF, παρουσία ή απουσία 0,3 μΜ νικλοζαμίδιο. Κινητικότητα και εισβολή υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα IncuCyte και το σχετικό ποσοστό πυκνότητα του τραύματος στις 24 ώρες μετά τον τραυματισμό. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.