Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο θανατηφόρα κακοήθεια στον κόσμο, και κάθε χρόνο χιλιάδες άνθρωποι πεθαίνουν από την ασθένεια αυτή. Η έγκαιρη ανίχνευση έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την επιβίωση 5 ετών για αυτόν τον καρκίνο γενικά, ανεξάρτητα από τη θέση εκκίνησης στον πνεύμονα. Για την αντιμετώπιση αυτής της πρόκλησης, έχουμε χρησιμοποιήσει με βάση τα κύτταρα SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) για να επιλέξετε ένα πάνελ των απταμερών ικανά να διακρίνουν τα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα από τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα επιθηλιακά. Αυτά τα απταμερή δεσμεύουν σε φυσιολογικές συνθήκες και σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και συγγένεια προβολής για τους στόχους τους με φαινόμενη Κ

d’s στην κλίμακα nanomolar. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι επιλεγμένες απταμερή έχουν την δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί σε κλινικό περιβάλλον, καθώς και για τη βελτίωση της κατάταξης της μη χειρουργική δειγμάτων, ένα άλλο σημερινή πρόκληση στον καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Jiménez Ε, Sefah Κ, López- Colón D, Van Simaeys Δ, Τσεν HW, Tockman MS, et al. (2012) Παραγωγή του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα DNA απταμερή για τον Καρκίνο Σπουδών. PLoS ONE 7 (10): e46222. doi: 10.1371 /journal.pone.0046222

Επιμέλεια: Muy-Teck Teh, Barts & amp? Το London School of Ιατρικής και Οδοντιατρικής, Πανεπιστήμιο Queen Mary του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 7, Μαΐου, 2012? Αποδεκτές: 28 Αυγούστου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Οκτώβρη 2012

Copyright: © Jiménez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Δημοσίευση το άρθρο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Πανεπιστήμιο της Φλόριντα ανοικτής πρόσβασης Ταμείο Εκδόσεις και από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγούν # 69953, Washington, DC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, εκτιμάται ότι 226.160 νέες περιπτώσεις και 160.340 θάνατοι θα συμβεί το 2012 (για μη-μικροκυτταρικού καρκίνου και των μικρών κυττάρων σε συνδυασμό). Σε σύγκριση με άλλους τύπους καρκίνου, νεοπλάσματα του πνεύμονα είναι ιδιαίτερα ετερογενείς, με όγκους που εμφανίζουν περισσότερους από έναν υποτύπο ως κοινό χαρακτηριστικό [2]. Η συντριπτική πλειοψηφία των νεοπλασμάτων του πνεύμονα είναι καρκινώματα, τα οποία γενικά ταξινομούνται ως είτε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ή μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) με βάση την μορφολογική ανάλυση με χρώση ιστολογικών δειγμάτων [3] – [4]. NSCLC είναι ο πιο κοινός τύπος του πνεύμονα καρκίνου, που περιλαμβάνει το 85% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα? αλλά είναι μια πιο παθητική τύπο καρκίνου. NSCLC αποτελείται από τρεις διαφορετικούς υποτύπους: αδενοκαρκίνωμα (ADC), πλακώδες καρκίνωμα (SCC), και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (LCL). Από την άλλη πλευρά, SCLC είναι λιγότερο συχνή, η οποία περιλαμβάνει 15% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα, αλλά είναι πιο επιθετική. Το κάπνισμα αποτελεί παράγοντα κινδύνου σε μεγάλο βαθμό συνδέεται με τον καρκίνο του πνεύμονα, ειδικά SCC [5] – [10]. αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα συνήθως αναπτύσσεται από τους ασθενείς που δεν έχουν καπνίσει ποτέ, και οι γενετικές αλλαγές συχνά συνδέονται με την έναρξη της.

Δεδομένου ότι οι περισσότεροι άνθρωποι με καρκίνο του πνεύμονα κατά το πρώιμο στάδιο δεν εμφανίζουν συμπτώματα, περισσότερο από το 70% του καρκίνου του πνεύμονα οι περιπτώσεις διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια, για την οποία το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μικρή. Ως εκ τούτου, η έρευνα αποσκοπεί στην έγκαιρη ανίχνευση, η οποία είναι κρίσιμη για τη μείωση της θνησιμότητας και νοσηρότητας, έχει στραφεί προς την ανάπτυξη κατάλληλων απταμερών. Τα απταμερή είναι σύντομες, μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια DNA ή RNA το οποίο είναι πολύ εξειδικευμένα στοιχεία αναγνώρισης στόχου βασίζεται στη μοναδική τρισδιάστατα σχήματα τους [11] – [12]. Ενώ η διαδικασία είναι γνωστή ως SELEX (συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) χρησιμοποιήθηκε αρχικά για την επιλογή απταμερή εναντίον στόχων όπως καθαρισμένες πρωτεΐνες [13] – [14], που βασίζεται σε κύτταρα SELEX έχει γίνει το νεότερο μέθοδος επιλογής απταμερή εναντίον ολόκληρων κυττάρων , ειδικά εκείνοι απταμερή στόχευση πρωτεϊνών επιφανείας υπερεκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα.

Μεταξύ των πολλών πλεονεκτημάτων τους, απταμερή δεν έδειξαν, ή πολύ χαμηλές, ανοσογονικότητα, επιτρέποντας

in vivo μελέτες

τη χρήση αυτών των ιχνηλατών [15] – [18]. Έχουν επίσης δημοφιλές ως εναλλακτικές λύσεις σε αντισώματα, λόγω του χαμηλού κόστους απταμερών ‘(δεν είναι αναγκαία για την παραγωγή ζώων), εύκολη χημική τροποποίηση, και την ικανότητα κυτταρική πρόσληψη. Επιπλέον, επειδή απταμερή είναι μικρά σε μήκος με γενικά 15 έως 100 νουκλεοτίδια (nt), έχουν καλύτερη διείσδυση ιστού σε σύγκριση με αντισώματα. Το 2004, Macugen, ένα αντι-VEGF (αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα) αναστολέα, έγινε το πρώτο απταμερές εγκριθεί από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) για την ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (AMD) [19]. Άλλες απταμερή παραμένουν σε κλινικές δοκιμές [20], και έχουν επιδείξει μεγάλο δυναμικό στον τομέα της βιοϊατρικής, συμπεριλαμβανομένης διαχωρισμού, χορήγησης φαρμάκων και τη μέτρηση του στόχου-ανιχνευτή. Η παρούσα έκθεση περιγράφει τη χρήση των κυττάρων-SELEX για να επιλέξετε μια ομάδα απταμερών ικανό να διακρίνει μεταξύ αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και κανονικό πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Από την ανακάλυψή τους, απταμερή έχουν δημιουργηθεί έναντι διαφορετικών στόχων, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, πεπτιδίων, και τα ζωντανά κύτταρα [21] – [22]. Για την απομόνωση απταμερών ικανά να διαφοροποιούνται κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα από τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα, χρησιμοποιήσαμε το κύτταρο-based στρατηγική SELEX. αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Η23 και HBE 135-Ε6 /Ε7 φυσιολογικά επιθηλιακά πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός και αρνητικός κυτταρικές γραμμές, αντίστοιχα. Μια αρχική ssDNA τυχαία βιβλιοθήκη περιέχει περίπου 10

14 διαφορετικές αλληλουχίες του 80 νουκλεοτίδια (nt) εμπλουτίστηκε με διαδοχική δέσμευσης με τα κύτταρα-στόχους, η έκλουση και η επακόλουθη ενίσχυση με PCR για 18 γύρους. Αυτές οι αλληλουχίες DNA θα μπορούσαν να αναγνωρίσουν πρωτεΐνες μεμβράνης κυτταρικής επιφάνειας H23 οποία είναι ενδεχόμενοι δείκτες για στοχευμένη θεραπεία. Σε προηγούμενους γύρους της διαδικασίας, την επιλογή πάγκο εισήχθη προκειμένου να αρθούν πιθανές αλληλουχίες δέσμευσης κοινή πρωτεϊνών και στις δύο στόχους και τις αρνητικές κυτταρικές σειρές. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιήθηκε κάθε άλλο γύρο το στάδιο της επιλογής. Οι αλληλουχίες πρόσδεσης σε κύτταρα στόχους εκλούσθηκαν και ενισχυμένες με PCR, μετά από το οποίο ανακτήθηκε και χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της διαδικασίας επιλογής με κυτταρομετρία ροής ssDNA. Επειδή οι δεξαμενές ssDNA εμπλουτίστηκαν με αλληλουχίες ειδικές για το στόχο, μια αύξηση στην ένταση φθορισμού παρατηρήθηκε αρχικά στο γύρο 12 (Σχήμα 1Α), υποδεικνύοντας ότι αυτές οι αλληλουχίες έδειξαν καλύτερη σύνδεση στην επιφάνεια των Η23 κυττάρων σε σύγκριση με την αρχική βιβλιοθήκη. Καθώς προχωρούσε η επιλογή, η ένταση φθορισμού των μεταγενέστερων πισίνες αυξήθηκε σταδιακά έως ότου παρατηρήθηκε μια σταθερή κατάσταση στην ένταση φθορισμού σε κύκλους 17 και 18 (Σχήμα 1Β), υποδεικνύοντας ότι η μέγιστη σύνδεση είχε επιτευχθεί. Αντίθετα, ο εμπλουτισμός δεν παρατηρήθηκε όταν οι εμπλουτισμένες δεξαμενές ελέγχθηκαν έναντι των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα επιθηλιακών (Εικόνα 1 D), πράγμα που σημαίνει ότι οι αλληλουχίες που περιέχονται σε αυτές πισίνες ήταν ικανά να διακρίνουν κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα από τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα επιθηλιακά. Ως εκ τούτου, πισίνες 14, επιλέγονται 16 και 18 πρέπει να αλληλουχία ως υποψήφιοι απταμερούς (Σχήμα 1C).

προσδιορισμός των δεξαμενών 11-18 Βιβλιοδεσία με H23 (Α-Β) και πισίνες 15-18 με HBE135 Ε6 /Ε7 (C). Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για την παρακολούθηση της πρόσδεσης των επιλεγμένων πισίνα με Η23 (κύτταρα στόχος) και HBE135 Ε6 /Ε7 (κύτταρα αρνητικά). Η πράσινη καμπύλη αντιπροσωπεύει τη δέσμευση της μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη DNA φόντο. Για H23 κύτταρα, υπήρξε αύξηση της χωρητικότητας των δεξαμενών δέσμευσης όπως προχωρούσε η επιλογή, ενώ υπήρχε μικρή αλλαγή για τα κύτταρα ελέγχου, HBE 135 Ε6 /Ε7. Στοχεύουν Σχήμα 1: Ο σκοπός αυτού του σχήματος είναι να δείξει πώς η διαδικασία κυτταρικής επιλογής εμπλουτίστηκε για H23 κυτταρική γραμμή, αλλά όχι για την κυτταρική σειρά HBE135E6 /Ε7

Η

Η διαδικασία αλληλουχίας ξεκίνησε με την κατασκευή του. η βιβλιοθήκη 454 αλληλούχιση με PCR προσθήκης των 454-ειδικών εκκινητών στα 3′- και 5′-άκρα των εμπλουτισμένων δεξαμενών. Για να προσδιορίσετε την πισίνα για κάθε ακολουθία, ένα μοναδικό κωδικό αναγνώρισης (κωδικός μέση αναγνώρισης, MID) επίσης PCR εισαχθεί στη βιβλιοθήκη 454 αλληλουχίας. Η εισαγωγή των εκκινητών στο εμπλουτισμένο πισίνες επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετά από 454 αλληλούχιση στον πυρήνα UF ICBR, περίπου 7.000 αλληλουχίες ανακτήθηκαν και αναλύθηκαν. Είχαν ομαδοποιούνται βάσει της MID που αντιστοιχεί στην ίδια πισίνα, και εκκινητές αφαιρέθηκαν από ένα πρόγραμμα Perl. Οι αλληλουχίες που περιέχουν μόνο την τυχαία περιοχή στη συνέχεια ευθυγραμμίζονται χρησιμοποιώντας το online πρόγραμμα MAFTT 6.0 [23], και έξι οικογένειες απταμερούς που αντιστοιχούν στις πιο άφθονο σειρές επιλέχθηκαν ως υποψήφιοι απταμερούς. Αυτά συντέθηκαν χημικά, βιοτίνη σημασμένο στο 3′-άκρο, καθαρίστηκε με HPLC, και ποσοτικοποιούνται. Όλα τα απταμερή εμφανίζονται δέσμευση με κύτταρα αδενοκαρκινώματος H23 πνεύμονα, ενώ δεν παρατηρείται σημαντική δέσμευση παρατηρήθηκε με την κυτταρική γραμμή ελέγχου HBE 135 Ε6 /Ε7, φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα (σχήμα 2 και το σχήμα S1). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η επιτυχής αρνητικής επιλογής πραγματοποιήθηκαν και ότι επιλέγεται απταμερή μπορούσε να διακρίνει μεταξύ του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και κανονικό πνεύμονα επιθηλιακών κυττάρων, ένα αποτέλεσμα το οποίο προσδίδει αυτές τις απταμερή με το δυναμικό για χρήση στη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα, την παρακολούθηση προόδου του όγκου και τη θεραπεία, ή άλλες οι σχετικές αιτήσεις.

η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για την δέσμευση του επιλεγμένου απταμερούς EJ4 με Η23 (κυτταρική σειρά-στόχος) και HBE135 Ε6 /Ε7 (αρνητική κυτταρική γραμμή). Η πράσινη καμπύλη αντιπροσωπεύει την πρόσδεση μιας τυχαίας ακολουθίας (βιβλιοθήκη) φόντο. Στόχος Σχήμα 2: Ο στόχος αυτού του σχήματος είναι να δείξει ότι οι υποψήφιες απταμερή είναι πράγματι απταμερή επειδή δεν δεσμεύουν με την θετική κυτταρική σειρά (H23), αλλά δεν συνδέονται με την αρνητική κυτταρική σειρά (HBE135E6 /Ε7)

.

Όλα τα επιλεγμένα απταμερή έδειξαν συνάφειες (φαινόμενη Κ

d’s) προς την κυτταρική γραμμή Η23 στην περιοχή nanomolar (45-250 ηΜ) (Πίνακας 1 και Σχήμα S6) σύνδεση. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι αυτά τα απταμερή θα είναι ευρέως εφαρμόσιμη, καθώς σφικτά δεσμεύονται με στόχο τους. Περαιτέρω μελέτες πραγματοποιήθηκαν για να χαρακτηρίσει τα επιλεγμένα απταμερή. Η δέσμευση δοκιμάστηκε περαιτέρω έναντι κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα, καθώς επίσης και άλλες κυτταρικές σειρές, περιλαμβανομένων των ωοθηκών και του παχέος εντέρου, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Τα απταμερή EJ2, EJ4 και ADE1 εμφανίζεται κάποια αναγνώριση προς τη μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες κυτταρικές σειρές: TOV21G, DLD1 και Η460. Στην περίπτωση DLD1, άνω και κάτω τελεία αδενοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή, ήταν ενδιαφέρον να δούμε κάποια αναγνώριση από τα επιλεγμένα απταμερών, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια πιθανή κοινό στόχο κυτταρικής επιφάνειας είναι παρόν σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές, δεδομένου ότι ανήκουν στην ίδια ιστολογική ομάδα. Σε προηγούμενη μελέτη στο εργαστήριο μας, η πρωτεΐνη-στόχος της Sgc8 απταμερούς καταδείχθηκε ως PTK7 [24], ένα ψευδο-κινάση πρωτεΐνης που υπάρχει στα κύτταρα CEM (η κυτταρική σειρά στόχο για την εν λόγω επιλογή), καθώς και άλλους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών , του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του μαστού και κάποιες κυτταρικές γραμμές λευχαιμίας, υποδεικνύοντας ότι η κοινή πρωτεΐνες μπορούν να υπάρχουν ως αποτέλεσμα του καρκίνου [25] – [26]. Τα απταμερή, EJ4 και ADE1 έδειξε επίσης ιδιαίτερη ειδικότητα προς την κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος πνεύμονα με σημαντική αύξηση στην ένταση φθορισμού σε σχέση με μία τυχαία ακολουθία, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μελέτες για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Η

Ευέλικτη σύνδεση της απταμερών σε διαφορετικές θερμοκρασίες μπορεί να επεκτείνει το ρεπερτόριό τους εφαρμογών. Δεδομένου ότι η επιλογή πραγματοποιήθηκε στους 4 ° C, εκτελέσαμε προσδιορισμούς δέσμευσης στους 25 ° C και 37 ° C (Σχήμα 3 και Σχήμα S2). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 και Σχήμα S3, απταμερή ADE1, ΑϋΕ2, EJ2, EJ5 και EJ7 συντηρημένων σύνδεσης στους 25 ° C και 37 ° C με εντάσεις φθορισμού παρόμοιες με αυτές σε 4 ° C. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε δοκιμασίες διεξάγονται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, όπως εκείνες που εκτιμούν

in vivo

εφαρμογές.

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για επιλεγμένες απταμερές EJ4 με Η23 (κυτταρική σειρά-στόχος) σε φυσιολογική θερμοκρασία ( 37 ° C). Δεσμευτική στους 4 ° C χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Η πράσινη καμπύλη αντιπροσωπεύει την πρόσδεση μιας τυχαίας ακολουθίας (βιβλιοθήκη) φόντο. Στόχος Σχήμα 3: Ο σκοπός αυτού του σχήματος είναι να καταδείξει τη σύνδεση του επιλεγμένου απταμερούς EJ4 στους 25 ° C και φυσιολογική θερμοκρασία, 37 ° C

Η

ανίχνευσης του καρκίνου βασίζεται στην εξέταση των ιστών από βιοψίες. , οι οποίες καθορίζονται υπό χημικές συνθήκες για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της αντιγονικότητας του δείγματα όγκων για μεταγενέστερη χρήση. Μια σημαντική δοκιμασία για τη διάγνωση του καρκίνου είναι ανοσοχρώση, στην οποία πρόσφατα ανατομή ιστοί σταθεροποιούνται πριν από τη θεραπεία με ανιχνευτές, όπως αντισώματα και απταμερή, ειδικά για καρκινικούς δείκτες. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα απταμερή είναι ικανά ιστού επισήμανσης σταθεροποιημένο με φορμαλίνη παραφίνη (FFPE) μετά αποπαραφινώσεως και το αντιγόνο ανάκτηση [27] – [28]. Για να προσδιοριστεί η ικανότητα πρόσδεσης των επιλεγμένων απταμερών υπό τις συνθήκες αυτές, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη πριν από την επώαση με επισημασμένο απταμερή. Όπως ελέγχου για αυτά τα πειράματα, δύο γνωστοί απταμερή για αντίστοιχες δεσμευτικές κυτταρικές σειρές τους λευχαιμίας, Sgc8 και TD05, και χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν ότι η διαδικασία καθορισμού του επιτοκίου δεν παράγει κανένα σήμα φθορισμού. Ως εκ τούτου, οποιαδήποτε φθορισμού ανιχνεύθηκε θα πρέπει να είναι μια ένδειξη της δέσμευσης εκδήλωση μεταξύ των απταμερών και το στόχο της. Όπως φαίνεται στο σχήμα S3, και οι δύο έλεγχοι διατηρούνται αρχική σύνδεση προφίλ τους, υποδεικνύοντας ότι κανένα τεχνητό αύξηση στην ένταση φθορισμού συνέβη ως αποτέλεσμα των συνθηκών στερέωσης. EJ2, EJ5, EJ7, ADE1, και ΑϋΕ2 απταμερή διατηρείται παρόμοια δέσμευση σε ότι εμφανίζονται στους 4 ° C (Σχήμα 4) δείχνουν ότι τα απταμερή μπορούν να δεσμεύονται με τους στόχους τους, ακόμη και κάτω από σταθερές συνθήκες. Αυτά τα αποτελέσματα ισχυρά υποδηλώνουν ότι επιλέγεται απταμερή έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν ως μόρια αναγνώρισης σε κλινικά δείγματα.

δοκιμασίας απταμερών Binding με Η23 (στόχος) κύτταρα προ-σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη. Αριστερή στήλη δείχνει την πρόσδεση των επιλεγμένων απταμερών με μη επεξεργασμένα κύτταρα στους 4 ° C. Δεξιά στήλη δείχνει την σύνδεση των επιλεγμένων απταμερών σταθεροποιημένα κύτταρα. Το πράσινο φως καμπύλη αντιπροσωπεύει την πρόσδεση μιας τυχαίας αλληλουχίας (βιβλιοθήκη) φόντο. Στοχεύουν Σχήμα 4: Ο στόχος αυτού του σχήματος είναι να δείξει την ικανότητα πρόσδεσης του επιλεγμένου απταμερούς EJ4 σε κύτταρα που έχουν καθοριστεί με 10% φορμόλη

Η

Κατά την επιλογή των κυττάρων, αναμένεται ότι απταμερή αλληλεπιδρούν. ειδικά με τις επιφάνειες των κυττάρων στόχων? Αυτή η συμπεριφορά έχει αναφερθεί σε αρκετές μελέτες [29] – [31]. Στο πείραμά μας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο ένζυμα, θρυψίνη και πρωτεϊνάση Κ, για 3 και 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, και μετά επωάστηκαν με απταμερή. Όλα τα επιλεγμένα απταμερή έχασε δέσμευσης μετά από θεραπεία με δύο πρωτεάσες (Σχήμα 5 και το Σχήμα S5 Για όλα τα πειράματα, η ένταση φθορισμού ήταν σημαντικά μειωμένη?. Ωστόσο, το σήμα που αντιστοιχεί σε δοκιμασίες με πρωτεϊνάση μειώθηκε στο παρασκήνιο, υποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη-στόχος απομακρύνθηκε εντελώς . μετά την αγωγή

η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για επιλεγμένες απταμερή μετά τη θεραπεία με πρωτεάσες? μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος (Α) κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη για 3 και 10 λεπτά πριν δέσμευσης με επιλεγμένα απταμερές EJ4 (Β).. κύτταρα κατεργασμένα με πρωτεϊνάση Κ επί 3 και 10 λεπτά πριν δέσμευσης με απταμερές EJ4 στόχος εικόνα 5:. Ο σκοπός αυτού του σχήματος είναι να αποδείξει ότι οι στόχοι των επιλεγμένων απταμερών είναι πρωτεΐνες που υπάρχουν στο κύτταρο επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων (H23).

η

συμπέρασμα

Εν κατακλείδι, έχουμε επιλέξει μια ομάδα απταμερών ικανά να διακρίνουν καρκινώματος του πνεύμονα από τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα επιθηλιακά. Αυτά τα απταμερή εμφανίζουν υψηλή συγγένεια προς την κυτταρική γραμμή H23 με εμφανή K

d ‘

s στην κλίμακα nanomolar, αλλά καμία ανιχνεύσιμη συγγένεια για τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα επιθηλιακά. Τα απταμερή έδειξε επίσης δεσμευτικός κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, καθώς επίσης και μετά από χημική στερέωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορούν να εφαρμοστούν για

in vivo

πειράματα. θεραπεία Πρωτεϊνάση έδειξαν ότι όλα τα απταμερή σε αυτό το πάνελ συνδέονται με πρωτεΐνες στην επιφάνεια του κυττάρου-στόχου. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ευρείες δυνητικές εφαρμογές των επιλεγμένων απταμερών λόγω της εξειδίκευσής τους για καρκινικούς ιστούς, αλλά όχι για τα υγιή κύτταρα. Αυτά τα απταμερή μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως μοριακοί ανιχνευτές σε κλινικά δείγματα, όπως προσφάτως εκχυλίζεται όγκων και διατηρημένα δείγματα ιστολογία.

Υλικά και Μέθοδοι

Βιβλιοθήκη Σχεδιασμός

Οι εκκινητές σχεδιασμού να ικανοποιήσει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: ελάχιστη δομή φουρκέτας, παρόμοια θερμοκρασία τήξης (Τ

m) και ελάχιστη βάση σύζευξης. Οι εκκινητές και μία βιβλιοθήκη 80-mer σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό 3.1 IDT Ολίγο Analyzer [32]. Η προς τα εμπρός εκκινητής σημάνθηκε με (FITC) στο 5′-άκρο, και ο αντίστροφος εκκινητής σημάνθηκε με Βιοτίνη στο 5′-άκρο. Η βιβλιοθήκη αποτελείτο από μια τυχαιοποιημένη περιοχή 44-nt πλευρίζεται στο 5 ‘άκρο από την ΤΗΕ FITC- επισημασμένου εκκινητή και πλαισιώνεται στο 3’-άκρο με τον συμπληρωματικό μη επισημασμένο έλικα του εκκινητή.

Instrumentation και Αντιδραστήρια

Βιβλιοθήκες και εκκινητές συντέθηκαν χρησιμοποιώντας την συσκευή σύνθεσης DNA 3400 (Applied Biosystems). Όλα τα αντιδραστήρια για τη σύνθεση του DNA αγοράστηκαν από Glen Research. αλληλουχίες DNA καθαρίστηκαν με ανάστροφης φάσης HPLC (Varian Prostar χρησιμοποιώντας μία στήλη C18 και ακετονιτρίλιο /τριαιθυλαμμωνίου ως κινητή φάση). PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Biorad Thermocycler, και όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Takara. Η παρακολούθηση της διαδικασίας επιλογής, δοκιμασίες δέσμευσης, και τον προσδιορισμό των σταθερές διάστασης για τα επιλεγμένα απταμερών έγιναν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα ΡΑΟδοαη κυτταρόμετρο (BD Immunocytometry Systems).

Cell Culture και Buffers

Ένα σύνολο οκτώ καθιερωμένες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το έργο, όλα αγοράστηκαν από την American Tissue Culture Collection (ATCC). αδενοκαρκίνωμα H23 (CRL-5800) NSCLC επιλέχθηκε ως θετική κυτταρική γραμμή, ενώ η αρνητική κυτταρική γραμμή επελέγη ήταν HBE135-Ε6 /Ε7 (CRL-2741), φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα. Η κυτταρική γραμμή Η23 διατηρήθηκε σε RPMI-1640 (ATCC) καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS απενεργοποιημένο με θέρμανση) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Η κανονική βρογχικό πνεύμονα κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε κερατίνη Serum-Free Medium συμπληρωμένο με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου EGF, 0,05 mg /mL βόεια εκχύλισμα υπόφυσης (Invitrogen), 0,005 mg /mL ινσουλίνη, και 500 ng /mL υδροκορτιζόνη (Sigma -Aldrich). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Άλλες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται για την δοκιμασία της επιλεκτικότητας ήταν οι Caov3 και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών TOV21G, αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα Α549, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων H520 πνεύμονα, Η460 μεγάλο καρκίνωμα του πνεύμονα, και αδενοκαρκινώματος κόλου DLD1, και όλοι διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές ATCC. Κατά τη διάρκεια της επιλογής, χρησιμοποιήθηκαν δύο ρυθμιστικά διαλύματα: ρυθμιστικό πλύσης (WB) (γλυκόζη 0,45% w /v και MgCl

2 5 mM σε PBS) και Binding Buffer (ΒΒ) (1 mg /mL tRNA και 1 mg /mL BSA σε WB). Όλες οι προηγούμενες αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich.

In vitro

Επιλογής

Επειδή και οι δύο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της επιλογής, αδενοκαρκίνωμα και φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, είναι προσκολλημένα κυτταρικές γραμμές, η επιλογή πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές μονοστοιβάδες. Περίπου 20 nmol του συντεθειμένου βιβλιοθήκη διαλύθηκε σε 700 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Πριν την έναρξη της διαδικασίας, η πισίνα DNA μετουσιώθηκε με θέρμανση στους 95 ° C για πέντε λεπτά, ακολουθούμενο από ταχεία ψύξη σε πάγο. Αυτό ανάγκασε τις αλληλουχίες DNA για να εγκρίνει τις πιο ευνοϊκές δευτερογενείς δομές. Η βιβλιοθήκη DNA επωάστηκε στη συνέχεια με περίπου 3 × 10

6 κύτταρα στόχους (Η23) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσεως προς απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αλληλουχίες. Στη συνέχεια, τα δεσμευμένα αλληλουχίες ανακτήθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στις 14000 rpm για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα.

Το υπερκείμενο που περιέχει τις αλληλουχίες DNA συλλέχθηκε, και η επιλεγμένη πισίνα ήταν ενισχυμένο με PCR χρησιμοποιώντας FITC- και επισημασμένο με βιοτίνη εκκινητές. Στη συνέχεια, η παραγωγή μονόκλωνου DNA (ssDNA) επιτεύχθηκε με επώαση με επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια sepharose, την απόκτηση του βιοτινυλιωμένος κλώνος. επιλογή Counter διεξήχθη μετά την παρατήρηση κάποια εμπλουτισμό με τα κύτταρα-στόχους. Για την επιλογή απταμερών με υψηλή εξειδίκευση και επιλεκτικότητα, η αυστηρότητα των πλύσεων (αριθμός πλύσεων, πλύνετε ώρα, και ο όγκος του ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης) αυξήθηκε σε μετέπειτα γύρους. Ο εμπλουτισμός των ομάδων παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, η αλληλουχία με 454 τεχνολογία, και αναλύθηκαν για τους υποψηφίους απταμερές.

ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση, τον εμπλουτισμό του ssDNA δεσμευμένου αλληλουχίες εντός των δεξαμενών κατά τη διαδικασία επιλογής, καθώς επίσης και για την αξιολόγηση της συνάφειας πρόσδεσης και την ειδικότητα των επιλεγμένων απταμερών. Τα καλλιεργημένα κύτταρα πλύθηκαν με WB πριν και μετά την επώαση με την πισίνα FITC ssDNA ή επιλεγμένες αλληλουχίες DNA. Η ένταση φθορισμού προσδιορίστηκε σε ένα FACScan κυτταρόμετρο (BD Immunocytometry).

454 Sequencing και Ανάλυση

Μετά από 18 γύρους επιλογής, εμπλουτισμένο πισίνες 14, 16, και 18 επιλέχθηκαν για ανάλυση αλληλουχίας. 454-ειδικοί εκκινητές και MID ενισχύθηκαν με PCR και προστίθεται σε κάθε αλληλουχία που περιέχεται σε κάθε δεξαμενή, αποδίδοντας ένα 125-bp προϊόν. Οι αντιδράσεις επιβεβαιώθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα, καθαρίζεται χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού PCR (Qiagen) και υποβάλλεται στην πυρήνα ICBR στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα για ανάλυση.

Περίπου επτά χιλιάδες αλληλουχίες ανακτήθηκαν και αναλύθηκαν. Πρώτον, οι αλληλουχίες ομαδοποιήθηκαν με βάση MID τους για να καθορίσουν την αντίστοιχη εμπλουτισμένο πισίνα. Δεύτερον, εκκινητές και MID απομακρύνθηκαν από το πρόγραμμα Perl για να αφήσει μόνο το τυχαίο τμήμα της αλληλουχίας για ανάλυση ομολογίας με το πρόγραμμα MAFFT 6.0.

Δοκιμασίες Σύνδεσης

Διαφορετικές οικογένειες αλληλουχιών ανακτώνται από πολλαπλές αναλύσεις αλληλουχίας συνετέθησαν, βιοτίνη σημασμένο στο 3′-άκρο, και ελέγχθηκαν ως προς τη δέσμευση με τη θετική και αρνητική κυτταρική σειρά. Επιπλέον, η σύνδεση εκλεκτικότητα του κάθε υποψηφίου προσδιορίστηκε με επώαση ενός διαλύματος απταμερές 250 ηΜ με 4 × 10

5-στόχο ή αντι-κυττάρων για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με WB και επωάστηκαν με σφαιρίδια στρεπταβιδίνης ΡΕ για 20 λεπτά στους 4 ° C. Μετά την πλύση, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 200 μL WB. Ο φθορισμός προσδιορίστηκε με FACScan κυτταρόμετρο μετρώντας 3 × 10

4 γεγονότα. Μια τυχαιοποιημένη αλληλουχία 80-μερές χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Δοκιμασίες Σύνδεσης με καθηλωμένα κύτταρα

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα των απταμερών να δεσμεύονται σε στερεωμένα κύτταρα, ακολουθήθηκαν διαδικασίες παρόμοιες με εκείνες που περιγράφονται παραπάνω , με εξαίρεση την αρχική θεραπεία των κυττάρων. Εν συντομία, προσκολλημένα κύτταρα Η23 αποκολλήθηκαν από το τρυβλίο με επώαση με μη-ενζυματική λύση διαστάσεως κυττάρων, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα φορμαλίνης 10% για 15 λεπτά στους 4 ° C, πλύθηκαν, και αιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης.

εκλεκτικότητα και ειδικότητα δοκιμασίες

Για να προσδιοριστεί η ειδικότητα αυτών των απταμερών, διαφορετικές κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων Caov3, DLD1, Α549, H520, Η460, και TOV21G, χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες πρόσδεσης. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε προκειμένου να επιβεβαιωθεί δέσμευσης. Όλα τα πειράματα ακολούθησε την κυτταρομετρία ροής πειραματική διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω.

Η επίδραση της θερμοκρασίας επί απταμερές δεσμευτικός

Επιλογή διεξήχθη στους 4 ° C.To καθοριστεί εάν η θερμοκρασία θα επηρέαζε τη δέσμευση μεταξύ απταμερούς και τα κύτταρα-στόχους , δοκιμασίες σύνδεσης εκτελέστηκαν σε δύο επιπλέον θερμοκρασίες, 25 ° C και 37 ° C.

Προσδιορισμός της σταθεράς διαστάσεως

Η συγγένεια του απταμερούς και του στόχου του αξιολογήθηκε με δοκιμασία κορεσμού. Ένα δείγμα που περιέχει 5 × 10

5 Η23 κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις απταμερούς μέχρις ότου επετεύχθη κορεσμός. Όλες οι δοκιμασίες πρόσδεσης επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και η μέση ένταση φθορισμού υπολογίστηκε με αφαίρεση της έντασης φθορισμού ενός κωδικοποιημένα αλληλουχίας. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν, και η σταθερά διάστασης (Κ

δ) ελήφθη με τοποθέτηση σε ένα ενιαίο μοντέλο θέση πρόσδεσης κορεσμού χρησιμοποιώντας SigmaPlot 11.2v (Jandel, San Rafael, CA).

πέψης πρωτεάσης

θρυψίνη και πρωτεϊνάση Κ θεραπεία.

Η23 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με 3 mL είτε 0,05% θρυψίνη /0,53 mM EDTA σε ισορροπημένο αλατούχο διάλυμα Hank (HBSS), Cellgro, ή 0,1 mg /mL πρωτεϊνάσης Κ σε PBS στους 37 ° C για 3 και 10 λεπτά. FBS προστέθηκε για την απόσβεση της δραστικότητας πρωτεϊνάσης. Τα κύτταρα πλύθηκαν με WB και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τις δοκιμασίες σύνδεσης που περιγράφονται παραπάνω.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Χαρακτηρισμός των επιλεγμένων απταμερών. Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για τη δέσμευση των απταμερών ADE1, ΑϋΕ2, EJ2, EJ5 και EJ7 με Η23 (κυτταρική σειρά-στόχος) και HBE135 Ε6 /Ε7 (αρνητική κυτταρική γραμμή). Η πράσινη καμπύλη αντιπροσωπεύει τη δέσμευση μιας τυχαίας ακολουθίας (βιβλιοθήκη) παρασκήνιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Απταμερές δεσμευτικός ως φυσιολογικές συνθήκες. Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για την δέσμευση απταμερών ADE1, ΑϋΕ2, EJ4, EJ5 και EJ7 με Η23 (κυτταρική σειρά στόχου) στους 25 ° C και 37 ° C. Σε αυτό το σύνολο πειραμάτων, η δέσμευση στους 4 ° C χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Η πράσινη καμπύλη αντιπροσωπεύει τη δέσμευση μιας τυχαίας ακολουθίας (βιβλιοθήκη) παρασκήνιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

πείραμα ελέγχου για Σταθερής επεξεργασμένα κύτταρα. δοκιμασία του απταμερούς Sgc8 Binding με κύτταρα (Α) CEM (στόχος) και τα κύτταρα (Β) Ramos (έλεγχος) πριν (αριστερά) και μετά (δεξιά) στερέωση, δείχνοντας ότι δεν υπάρχει σήμα τεχνητό φθορισμού παρήχθη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

δοκιμασίες δεσμευτική μετά τη σταθεροποίηση με 10% φορμόλη. δοκιμασία απταμερών Binding με Η23 (στόχος) κύτταρα προ-σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη. Αριστερά στήλες δείχνουν την δέσμευση του απταμερούς ADE1, ΑϋΕ2, EJ2, EJ5 και EJ7 με μη επεξεργασμένα κύτταρα στους 4 ° C. Δεξιά στήλη δείχνει την σύνδεση των ίδιων απταμερών EJ5 με σταθεροποιημένα κύτταρα. Το πράσινο φως καμπύλη αντιπροσωπεύει την σύνδεση του με τυχαία σειρά (βιβλιοθήκη) παρασκήνιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

Δοκιμασίες Σύνδεσης μετά τη θεραπεία πρωτεϊνάση. Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για απταμερή ADE1 και ADE2, EJ5 και EJ7 μετά τη θεραπεία με πρωτεάσες? μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. (Α) και (Γ) Κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη για 3 και 10 λεπτά πριν δέσμευσης με απταμερή ADE1 και ADE2, EJ5, και EJ7 αντίστοιχα. (Γ) και (Δ) Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με πρωτεϊνάση Κ για 3 και 10 λεπτά πριν δέσμευσης με απταμερών αντίστοιχα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S6.

Προφανής Kd για επιλεγμένες απταμερή. Κορεσμός καμπύλες δέσμευσης για επιλεγμένες απταμερών ΑΟΕ1, ΑϋΕ2, EJ2, EJ5 και EJ7. Τα κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις του απταμερούς εις τριπλούν. Η μέση ένταση φθορισμού των μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη αφαιρέθηκε από κάθε αντίστοιχη συγκέντρωση απταμερούς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0046222.s006

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Ο Δρ Tahir Bayrac για χρήσιμες συμβουλές που συνέβαλαν σε αυτή την εργασία, ο Δρ Kathryn Williams για την κριτική εξέταση της του χειρογράφου και τον πυρήνα της αλληλουχίας του DNA, ICBR, στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα για τη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια της 454 αλληλουχίας.