Αφηρημένο

Ιστορικό

το Cub και σούσι Πολλαπλές Domains 1 (CSMD1) γονίδιο, που βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 8, κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι των οποίων η λειτουργία είναι προς το παρόν άγνωστη. έκφραση CSMD1 συχνά χάνεται σε πολλές επιθηλιακών καρκίνων. Ο στόχος μας ήταν να χαρακτηρίζουν τις σχέσεις μεταξύ των CSMD1 σωματικές μεταλλάξεις, αλληλόμορφο ανισορροπία, μεθυλίωση του DNA, και τα κλινικά χαρακτηριστικά σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Εμείς αλληλουχία η CSMD1 περιοχές κωδικοποίησης σε 54 όγκους παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα 454FLX Pyrosequencing να ανακρίνει 72 αμπλικόνια που καλύπτουν ολόκληρη την αλληλουχία κωδικοποίησης. Χρησιμοποιήσαμε ετερόζυγο αναλογίες αλληλόμορφο SNP σε πολλαπλές θέσεις CSMD1 να καθορίσει την ισορροπία αλληλομόρφων και συνάγουν απώλεια ετεροζυγωτίας. Τέλος, πραγματοποιήσαμε μεθυλίωσης-ειδική PCR σε 76 όγκους του παχέος να καθορίσουν την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA για CSMD1 και γνωστών στόχων μεθυλίωση ALX4, RUNX3, NEUROG1 και CDKN2A.

Αποτελέσματα

Χρησιμοποιώντας 454FLX αλληλουχίας και την επιβεβαίωση με προσδιορισμό της αλληλουχίας Sanger, 16 CSMD1 σωματικές μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε 6 από τους 54 ορθοκολικούς όγκους (11%). Η nonsynonymous να συνώνυμη αναλογία μετάλλαξη των 16 σωματικών μεταλλάξεων ήταν 15:01, μία αναλογία σημαντικά υψηλότερη από την αναμενόμενη αναλογία 2:01 (p = 0.014). Αυτή η αναλογία δείχνει μια παρουσία θετικής επιλογής για μεταλλάξεις στην αλληλουχία πρωτεΐνης CSMD1. CSMD1 αλληλικές ανισορροπία ήταν παρούσα σε 19 από 37 ενημερωτικού περιπτώσεις (56%). Ασθενείς με αλληλομόρφων ανισορροπία και μεταλλάξεις CSMD1 ήταν σημαντικά νεότεροι (μέσος όρος ηλικίας 41 ετών) από εκείνες χωρίς σωματικές μεταλλάξεις (μέση ηλικία, 68 ετών). Η πλειονότητα των όγκων μεθυλιώθηκαν σε μία ή περισσότερες θέσεις CpG μέσα στην αλληλουχία κωδικοποίησης CSMD1, και CSMD1 μεθυλίωση συσχετίζεται σημαντικά με δύο γνωστούς στόχους μεθυλίωσης ALX4 και RUNX3. C: G & gt? T:. Αντικαταστάσεις Α σημαντικά υπερεκπροσωπούνται (47%), γεγονός που υποδηλώνει εκτεταμένη μεθυλίωση της κυτοσίνης προδιαθέτουν για σωματικές μεταλλάξεις

Συμπεράσματα

Βαθιά αλληλουχίας αμπλικονίου και μεθυλίωσης-ειδική PCR αποκαλύπτουν ότι CSMD1 αλλαγές μπορούν να συσχετιστούν με τις προηγούμενες κλινική εικόνα σε όγκους παχέος εντέρου, έτσι εμπλέκοντας περαιτέρω CSMD1 ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο

Παράθεση:. Shull AY, Clendenning ML, Ghoshal-Gupta S, Farrell CL, Vangapandu HV, Dudas L, et al . (2013) Σωματικές μεταλλάξεις, αλληλόμορφων Απώλεια και μεθυλίωσης του DNA του Cub και Σούσι Πολλαπλές Domains 1 (CSMD1) Gene Αποκαλύπτει Σύνδεσης με πρώιμη ηλικία κατά τη διάγνωση στο ορθοκολικό καρκίνο ασθενείς. PLoS ONE 8 (3): e58731. doi: 10.1371 /journal.pone.0058731

Επιμέλεια: Nathan A. Ellis, του Πανεπιστημίου του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Νοέμβρη, 2012? Αποδεκτές: 5 Φεβ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 7 Μαρτίου του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Υποστήριξη για το πρόγραμμα αυτό παρέχονται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 7R21CA127683. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου με περίπου 1 εκατομμύριο ετήσια περιπτώσεις σε όλο τον κόσμο [1]. Αυτή η σύνθετη διαταραχή χαρακτηρίζεται συνήθως από μια πληθώρα σωματικών μεταλλάξεων [2]. Ωστόσο, κάθε όγκος έχει το δικό του μοναδικό μεταλλάξεων τοπίο της [3], και οι υποκείμενοι μηχανισμοί που οδηγούν σε αυτό το ποικιλόμορφο τοπίο είναι ελάχιστα κατανοητή. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις στο αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC), Kirsten ras (KRAS), και φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσης γονίδια (PIK3CA) είναι πολύ συχνές σε καρκίνους του παχέος εντέρου [4]. Είναι πιθανό ότι ο σωστός συνδυασμός των μεταλλάξεων θα μπορούσε να δώσει ένα συγκεκριμένο κλώνο κυττάρων ένα πολλαπλασιαστικό πλεονέκτημα. Οι μεταλλάξεις που προκαλούν ή συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου που συνήθως αναφέρονται ως οδηγοί, ενώ οι μεταλλάξεις που δεν προσφέρουν επιλεκτικό πλεονέκτημα που συνήθως αναφέρονται ως επιβάτες [5], [6], [7]. Η πλειοψηφία των σωματικών μεταλλάξεων που συσσωρεύονται σε όγκους είναι σιωπηλοί επιβάτες [8], [9], ενώ μικρά υποσύνολα των μεταλλάξεων είναι πραγματικοί οδηγοί [10], [11]. Με την παραδοχή ότι όλοι οι σιωπηλοί (συνώνυμο) μεταλλάξεις είναι επιβάτες, το ποσοστό φόντο σωματικών μεταλλάξεων σε καρκίνους του παχέος εντέρου έχει προσεγγιστεί να είναι 1 μετάλλαξη ανά μεγαβάση [12]. Γονίδια που είναι πιο συχνά μεταλλάσσεται από το προβλεπόμενο ποσοστό υπόβαθρο μπορεί να είναι οι οδηγοί της νεοπλασματικής ανάπτυξης. Με την παραδοχή ότι όλοι οι σιωπηλές μεταλλάξεις είναι οι επιβάτες και ότι οι μη σιωπηλές (nonsynonymous) μεταλλάξεις μπορεί να είναι είτε οδηγοί ή επιβάτες, η συνολική αναλογία των nonsynonymous να συνώνυμες (NS /S) μεταλλάξεις σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο μπορεί να παρέχει πρόσθετες αποδείξεις ως προς το αν αυτό το γονίδιο είναι κάτω από θετική ή αρνητική επιλογή για αλλαγές στην αλληλουχία αμινοξέων. Γονίδια που συσσωρεύουν μεταλλάξεις, όμως δεν έχουν καμία επιλεκτική πίεση, έχουν μια αναμενόμενη nonsynonymous να συνώνυμο αναλογία (NS /S) περίπου 2:01. Αυτή η αναμενόμενη αναλογία βασίζεται στις δύο πρώτες θέσεις νουκλεοτιδίων στο κωδικόνιο υπαγορεύει το κωδικοποιημένο αμινοξύ και το τρίτο «ταλάντευση» θέση επιτρέποντας κωδικονίου πλεονασμό. Αυτή η μηχανιστική ρύθμιση του γενετικού κώδικα δημιουργεί διπλάσιο πολλές ευκαιρίες για ένα δεδομένο μόνο νουκλεοτίδιο υποκατάσταση για να αλλάξει την αλληλουχία αμινοξέων, καθώς υπάρχουν ευκαιρίες για να υποκαταστήσουν ένα νουκλεοτίδιο ακόμη διατηρούν την αλληλουχία αμινοξέων. Γονίδια με υπερεκπροσώπηση των μη συνώνυμες μεταλλάξεις έχουν αναλογία NS /S που είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερο από το αναμενόμενο 2:01 και μπορεί με βεβαιότητα να θεωρηθεί ότι είναι υπό θετική επιλεκτική πίεση για να αλλάξει την αλληλουχία αμινοξέων κατά τη διαδικασία της εξέλιξης του όγκου [ ,,,0],13]. Ως εκ τούτου, μια υψηλή αναλογία NS /S σωματικών μεταλλάξεων μπορεί να παρέχει στατιστικά στοιχεία για το κατά πόσον ένα μεταλλαγμένο γονίδιο είναι ένας οδηγός της εξέλιξης του όγκου [3], [5].

Το Cub και σούσι Πολλαπλές Domains 1 (CSMD1) γονίδιο είναι ένα νέο γονίδιο καταστολής όγκων υποψήφιο που βρίσκεται στο ρ βραχίονα του χρωμοσώματος 8 (2792875 … 4852328). CSMD1 συχνά φαίνεται να διαγραφεί [14], [15], [16], μεταλλαγμένη [2], [10], [17], ή μεθυλιωμένα [14], [18] σε πολλούς καρκίνους. Στην πραγματικότητα, η έκφραση CSMD1 συχνά χάνεται στον καρκίνο του μαστού [19], ενώ CSMD1 χάνει την ισορροπία αλληλόμορφων σε πλακώδη καρκινώματα κεφαλής και του τραχήλου κυττάρων (HNSCC) και καρκίνους του πνεύμονα [20]. . CSMD1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι μεθυλιωμένα στο HNSCC κυτταρικές σειρές [21]

Το πρώτο εξόνιο του CSMD1 φιλοξενεί μια μεθυλιωμένη CpG νησίδα (χρωμοσώματος 8: 4848969 με 4852635) [21], μια αλληλουχία πλούσια σε C: G ζεύγη βάσεων που περιέχονται σε CpG ή CpHpG περιβάλλοντα [22]. Το ΚΚΕ νησί Methylator φαινότυπο (CIMP) [23] περιγράφει ένα υποσύνολο των όγκων παχέος εντέρου που παρουσιάζουν υψηλή συχνότητα μεθυλίωσης των συγκεκριμένων νησιών CpG. Οι όγκοι αυτοί CIMP έχουν διακριτές κλινικές, παθολογικές, και μοριακές υπογραφές, όπως εγγύς θέση του όγκου, η κακή διαφοροποίηση, και την αστάθεια μικροδορυφορικού. Σημαντική κλινική συσχετίσεις με CIMP έχουν επίσης παρατηρηθεί σε όγκους του μαστού και του εγκεφάλου [24] δείχνει ότι το φαινόμενο δεν είναι μόνο ειδικό ιστό. Δεν είναι ακόμη σαφές εάν η κατάσταση CIMP προκαλεί ή απλώς συνδέεται με αυτές τις φαινοτύπους. Η μεθυλίωση συγκεκριμένων γονιδίων CIMP μόνο χαλαρά συσχετίζεται με την καταστολή της έκφρασης του γονιδίου? Ως εκ τούτου, και άλλοι μηχανισμοί που επηρεάζουν την κλινική συμπεριφορά των όγκων CIMP μπορεί να είναι σημαντική. Βλαστικής σειράς νουκλεοτιδίων αντικαταστάσεις που αφορούν C: G & gt? T: είναι μεταβάσεις πιστεύεται ότι καταλύεται από μεθυλίωση της κυτοσίνης [25]. Αυτές οι υποκαταστάσεις οδηγούν σε ένα γονιδίωμα σε επίπεδο υποεκπροσώπηση δινουκλεοτιδίων CpG σε σύγκριση με αυτό που αναμένεται μόνο από την τύχη. Γονιδιώματος μεθυλίωση έχει έτσι επηρεάζεται η εξέλιξη της αλληλουχίας του γονιδιώματος και την πολυμορφία του τοπίου των περισσότερων σπονδυλωτών. Με παρόμοιο σκεπτικό, είναι πιθανό ότι CIMP κατάσταση των καρκινικών κυττάρων ή προ-καρκινικές προδρόμων τους (βλαστικά κύτταρα) μπορεί να προδιαθέτουν μεθυλιωμένη γονίδια να συσσωρεύονται C: G & gt? Τ: α. Σωματικές μεταλλάξεις

Σωματικές μεταλλάξεις σε όγκους μπορεί παρέχει ιστορικά στοιχεία για CSMD1 αποσιώπηση με μεθυλίωση στον καρκίνο προγονικά κύτταρα. Colon βλαστοκύτταρα που βρίσκεται στη βάση των κρυπτών μπορεί να είναι οι πρωταρχικοί στόχοι για κακοήθη εξαλλαγή [26], [27]. Μεταλλάξεις που προέρχονται από βλαστικά κύτταρα [28], [29], [30], [31] έχουν την ευκαιρία να επιμένουν αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα για τη συσσώρευση των συνεργαζόμενων ογκογόνων μεταλλάξεων. Αν και επιγενετική αποσιώπηση του CSMD1 μπορεί να συνεισφέρει στον κακοήθη μετασχηματισμένο φαινότυπο, [32], [33], [34], [35], [36], [37], σωματικές μεταλλάξεις που συσσωρεύονται ως αποτέλεσμα της μεθυλίωσης μπορεί επίσης να συμβάλει στην κακοήθεια από άγνωστους μηχανισμούς. Με την εξέταση πολλαπλές μεθόδους των μεταβολών CSMD1 (μετάλλαξη, μεθυλίωση, και την απώλεια αλληλόμορφο), παρατηρήσαμε σημαντικές συσχετίσεις της απώλειας CSMD1 της λειτουργίας με πρώιμη ηλικία κατά τη διάγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Η συσχέτιση μεταξύ της απώλειας CSMD1 της λειτουργίας και την κλινική παρουσίαση μπορεί να βοηθήσει παρέχουν πληροφορίες για την νεοπλασματική ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Επιλογή του όγκου και Απομόνωση DNA

Δε- προσδιορίζονται χειρουργικά δείγματα ελήφθησαν από τη Νότια Καρολίνα Biorepository Σύστημα (Palmetto Υγείας, Richland? Palmetto Υγείας, Προδρόμου, και Lexington Regional Medical Center, Λέξινγκτον, Νότια Καρολίνα). Η μελέτη αυτή διεξήχθη με την έγκριση του Διοικητικού Συμβουλίου Institutional Review του Palmetto Υγείας, Lexington Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Νότιας Καρολίνας και της Γεωργίας Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου, καθώς και όλες οι γραπτές συγκαταθέσεις των ασθενών ελήφθησαν πριν από την μελέτη. De-εντοπίστηκαν κλινικά δεδομένα ελήφθησαν από τον όγκο-μητρώου, και το εγχειρίδιο επιμέλεια των αρχείων παθολογίας διεξήχθη από την τράπεζα ιστών του προσωπικού.

Εμείς επιλέξαμε 54 μικροδορυφόρων σταθερό όγκους παχέος εντέρου για τη μελέτη αυτή. Όλα τα χειρουργικά δείγματα ήταν φρέσκα-κατεψυγμένα, ενσωματωμένα σε βέλτιστη ένωση θερμοκρασίας κοπής (Sakura Finetek, Torrence, CA), και χωρισμένο. Τα δείγματα κόπηκαν σε φέτες πάχους 10 μm και στερεώνεται πάνω Sigma σιλανίου-prep ä διαφάνειες. Τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 75%, 95% και 100% αιθανόλη και το ξυλόλιο. Οι φέτες από την αρχή και το τέλος κάθε δείγμα ιστού βάφτηκαν με διαλύματα για να ληφθούν ειδικά τα όρια των ιστών του όγκου της Mayer Αιματοξυλίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και Ηωσίνη (Harleco, Lawrence, KS). Όλα τα στοιχεία δείγμα ασθενούς που παρέχονται στον Πίνακα 1.

Η

Εκχυλίσεις του όγκου και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα από τις φέτες του ιστού εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνική micro-ανατομή αναπτύχθηκε στο εργαστήριο μας. Όγκου και φυσιολογικών κυττάρων ταυτοποιήθηκαν για μικρο-ανατομή με τη χρήση των δύο έτοιμων Η &? Διαφάνειες Ε. Ένας παθολόγος συμμετείχε στη διαδικασία αναγνώρισης του όγκου και φυσιολογικών ιστών. Tumor επιθήλιο μικροτομή από τα τμήματα για να ληφθούν περίπου 100 μg του DNA. Το γονιδιωματικό DNA κατόπιν απομονώθηκε χρησιμοποιώντας DNAdvance kit (Agencourt, Beverly, ΜΑ).

Ποσοτικοποίηση των Γονιδιωματικό DNA

Η ποσοτικοποίηση του απομονωμένου γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε με μία πρότυπη καμπύλη από μια γνωστή συγκέντρωση του ανθρώπινου DNA και σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για Long διανθίζονται Nuclear Element (LINE) αλληλουχιών [58]. Οι εκκινητές αποτελούνταν από μια γραμμή (F) Εμπρός – AAAGCCGCTCAACTACATGG και μια γραμμή (R) Αντιστροφή – CTCTATTTCCTTCAGTTCTGCTC (Integrated DNA Technologies, Coralville, ΙΑ). Ποσοτικοποίηση του DNA παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας 6,25 μΙ iTaq SYBR πράσινο SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA), 1.25 μΐ 2 μΜ LINE F, 1.25 μΐ 2 μΜ LINE R, 2,5 μΙ PCR νερό (Invitrogen, Carlsbad, CA), και 1.25 μΐ εκμαγείου DNA. Η ενίσχυση του DNA διενεργήθηκε μέσω θερμικού κύκλου με τη θερμική iCycler MyIQ (Bio-Rad, Hercules, CA) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρωτόκολλο: μετουσίωση στους 95 ° C για 1 λεπτό? 60 κύκλους στους 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 62 ° C για 45 sec, και 62 ° C για 5 λεπτά. Οι τελικές συγκεντρώσεις πρότυπο του όγκου και φυσιολογικό DNA ήταν 3 ng /μl.

Έλεγχος για αστάθεια μικροδορυφόρου σε όγκους

Η ανίχνευση των όγκων ανεπάρκεια αναντιστοιχία επισκευή έγινε μέσω της ενίσχυσης του τόπου μικροδορυφόρων, έτσι ώστε οι όγκοι δείχνει φαινότυπο hypermutator θα μπορούσε να αποκλειστεί. Όλες οι όγκοι αρχικά προ-διαλογή για μικροδορυφορική αστάθεια (MSI) χρησιμοποιώντας εκκινητές BAT26, και εκείνοι με αστάθεια αποκλείστηκαν. Στη συνέχεια, οι όγκοι με σωματικές μεταλλάξεις στο CSMD1 αναλύθηκαν με τρεις επιπλέον θέσεις NCI MSI: BAT25, D2S123 και D17S250 εκκινητές. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα S1 στο File S1 (Integrated DNA Technologies, Coralville, ΙΑ). Κανένας από τους όγκους έδειξαν αστάθεια στον τόπο BAT26, και μόνο ένα δείγμα (Tumor ID 587) έδειξαν μέτρια αστάθεια μικροδορυφόρου σε BAT25 τόπο. Τα PCR αμπλικόνια δημιουργήθηκαν με το ακόλουθο πρωτόκολλο: PCR μάστερ μιξ παρασκευάσθηκε με τη χρήση 5 μΙ ρυθμιστικού ΚΑΠΑ 5χ HiFi (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), 0.75 μΐ 10 mM dNTPs, 3.00 μΐ εκκινητών (τελική συγκέντρωση 2,5 μΜ), 0.50 μΙ ΚΑΠΑ HiFi HotStart πολυμεράσης (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), 1.00 μΐ 10Χ SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA), 8,75 μΙ PCR Νερό (Invitrogen, Carlsbad, CA), και 1 μΙ προτύπου DNA σε 3 ng /μl. Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε σε MyIQ Θερμική iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρωτόκολλο: 1 κύκλος των 95 ° C για 2 λεπτά? 3 κύκλους 63 ° C για 15 sec και 72 ° C για 15 δευτερόλεπτα? 3 κύκλους 98 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 15 δευτερόλεπτα? 3 κύκλους 98 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 57 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 15 δευτερόλεπτα? 49 κύκλοι των 98 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 15 δευτερόλεπτα? 1 κύκλος 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 80 κύκλοι των 55 ° C για 30 sec. Τα προϊόντα PCR διέτρεξαν επί 10% πηκτών ΤΒΕ-ουρίας (Bio-Rad, California, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό Άλφα Imager και Ποσότητα One ™ (Άλφα Innotech, San Leandro, CA).

Προετοιμασία Αμπλικόνια για αλληλουχίας

Τα εξώνια για CSMD1 και KRAS γονίδια εντοπίστηκαν με τη σειρά προβολής στην ιστοσελίδα NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer) . Οι εκκινητές PCR σχεδιάστηκαν για τα 71 εξώνια των CSMD1 και για 2 κοινές μεταλλάξεις hotspot στο γονίδιο KRAS (εξόνιο 2, κωδικόνιο 12 και 13) με τη χρήση του λογισμικού ανοικτού κώδικα Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input .htm?. (Πίνακας S1 στο αρχείο S1) KRAS ήταν αλληλουχία μόνο στα hotspots μετάλλαξη οφείλεται σε δείγμα περιορισμών Forward και ακολουθίες ετικέτα, 454Α και 454Β, αντίστοιχα, προστέθηκαν στις εκκινητές όπως περιγράφεται στον οδηγό για την αμπλικονίου αλληλουχίας αντιστραφεί (454. Life Sciences, Branford CT). αμπλικόνια PCR για 454 αλληλούχιση δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας 7,5 μΙ ρυθμιστικού ΚΑΠΑ 5χ HiFi (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), 1,125 μΙ 10mM dNTPs, 2.25 μΐ εκκινητών (τελική συγκέντρωση 2,5 μΜ), 0,75 μΙ ΚΑΠΑ HiFi HotStart πολυμεράσης (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), και 1 μΐ μήτρας DNA στο 5ng /μl θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα MyIQ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA) και το ακόλουθο πρωτόκολλο touchdown:. Ένας κύκλος, 95 ° C για 2 λεπτά? 3 κύκλους των 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 64 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 sec? 3 κύκλους των 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 61 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 3 κύκλοι των 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 50 κύκλοι των 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 57 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 sec. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 3% και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Άλφα Imager και Ποσότητα Ένα λογισμικό ™ (Άλφα Innotech, San Leandro, CA). Αμπλικόνια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια SPRI Ampure (Agencourt, Beverly, ΜΑ) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

αλληλουχίας με 454FLX Πλατφόρμα

ποσοτικοποιήθηκαν Οι SPRI-Ampure χάντρα καθαρίζεται PCR προϊόντα (CSMD1 και KRAS) χρησιμοποιώντας την Δοκιμασία quanti-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) και Fluoroskan Ascent FL

(

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ). Τα αμπλικόνια ενισχύθηκαν με γαλάκτωμα PCR χρησιμοποιώντας το emPCR Kite ΙΙ και ΙΙΙ (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) και αμφίδρομα αλληλουχία για το GS FLX sequencer 454 γονιδιώματος (Πανεπιστήμιο της Νότιας Καρολίνα Περιβαλλοντική Γονιδιωματική Πυρήνας Διευκόλυνσης, Columbia, SC). Αμπλικόνια από κάθε ένα από τα 54 όγκων, καθώς και 2 ζεύγη κανονικά δείγματα, αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία σε ένα μέσο βάθος 1800 φορές με πάνω από το 90% των αμπλικονίων που αντιπροσωπεύεται από μεγαλύτερη από 300 ακολουθία διαβάζει ανά δείγμα. Πάνω από 500.000 ατομικών αλληλουχίας διαβάζει ελήφθησαν από τα αμπλικόνια.

Variant Ανάλυση Ανίχνευση

Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας 454FLX διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με την αλληλουχία αναφοράς από το NCBI (hg19 Build 37) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Γονιδιωματική CLC λογισμικού Πάγκος εργασίας 4 (CLC Bio, Aarhus, Δανία). Αναλύσαμε τα δεδομένα αλληλουχίας μας προέρχονται από όγκους παχέος εντέρου και να συνδυαστούν φυσιολογικά δείγματα, χρησιμοποιώντας την παραλλαγή εργαλείο ανίχνευσης Πιθανοθεωρητικές που παρέχονται από την Genomics Workbench. Μεταλλάξεις φαίνεται στο συμπληρωματικό φυσιολογικό ιστό, τη βάση δεδομένων dbSNP, ή Γενώματα Έργου 1000 θεωρήθηκαν βλαστικής σειράς μεταλλάξεων. Οι υπόλοιπες μεταλλάξεις θεωρήθηκαν ως πιθανή σωματικές μεταλλάξεις. κλήσεις μετάλλαξη μας έγιναν υπό ισχυρή και αυστηρά κριτήρια αλληλουχίας που θέτει η CLC Workbench Genomics με μια κλήση πιθανότητα 100 για να διαγράψει οποιαδήποτε ψευδή παρατηρήσεις μετάλλαξη. Τυχόν ομοιοπολυμερείς εξαιρέθηκαν επίσης από την ανάλυση των δεδομένων μας. Αποκλείσαμε επίσης ανακαλύψει την εισαγωγή /διαγραφή (INDEL) παραλλαγές από τη μελέτη μας, δεδομένου ότι 454FLX αλληλουχίας δεν είναι ευαίσθητη στην ανίχνευση INDEL του.

σωματική μετάλλαξη Επικύρωση μέσω Sanger αλληλουχίας

Sanger αλληλουχίας της υψηλής συγκέντρωσης παραλλαγές διεξήχθη με σκοπό να επιβεβαιώσει τις σωματικές μεταλλάξεις που προσδιορίζονται από την ανάλυση ανίχνευσης παραλλαγής. Beckman Coulter /Agencourt Γονιδιωματική Υπηρεσίες (Beverly, ΜΑ) και τα βασικά γονιδιωματικής εγκατάσταση στο Georgia Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου πραγματοποιήθηκε την αλληλουχία Sanger, χρησιμοποιώντας τα ίδια 454Α και Β ετικέτες περιγράφηκε προηγουμένως με την αλληλούχιση 454FLX. Τα PCR αμπλικόνια δημιουργήθηκαν με το ακόλουθο πρωτόκολλο: PCR μάστερ μιξ παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας 7 μλ PCR νερό (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 μΐ 2Χ ΚΑΠΑ SYBR (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), 2 μΐ μείγματος Primer ( τελική συγκέντρωση 2.5 μΜ), και 1 μΐ μήτρας DNA σε 3 ng /μl. Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε με το ακόλουθο πρωτόκολλο: 1 κύκλος των 98 ° C για 2 λεπτά? 3 κύκλους 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 63 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 3 κύκλους 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 3 κύκλους 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 57 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 49 κύκλοι των 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 1 κύκλος των 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 80 κύκλοι των 55 ° C για 80 κύκλους. Sanger χρωματογραφήματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CLC Workbench Genomics 4. Αφού επικυρωθεί από αλληλουχίας Sanger, οι σωματικές μεταλλάξεις CSMD1 καταγράφηκαν και κατατεθεί στη Βάση Δεδομένων Leiden Open Παραλλαγή (LOVD) (Πανεπιστήμιο Leiden Ιατρικό Κέντρο, Κάτω Χώρες).

Τα αλληλόμορφα Δοκιμές υπόλοιπο από 454FLX CSMD1 Ακολουθίες

Χρησιμοποιήσαμε τη διαδοχική Πιθανότητα Ratio Test (SPRT) για την ανίχνευση στατιστικά σημαντική αλληλομόρφων ανισορροπίες στα δείγματα των όγκων [39], [40]. Η SPRT σχεδιάστηκε για να δοκιμάσει δύο ανταγωνιστικές υπόθεση, χρησιμοποιώντας τις παρατηρήσεις διαδοχικά δεδουλευμένων την πάροδο του χρόνου κατά προκαθορισμένα άνω και κάτω όρια των δεδομένων [59]. Υπόθεση 1 είναι ότι τα αλληλόμορφα είναι ισορροπημένα, έτσι ώστε τα αναμενόμενα αλληλικές αναλογίες στο ενημερωτικό loci θα πρέπει να είναι 50%. Υπόθεση 2 είναι ότι ένα από τα δύο αλληλόμορφα που υπάρχουν στο φυσιολογικό δείγμα είναι εντελώς απούσα στον όγκο, έτσι ώστε η αναμενόμενη κυρίαρχη αλληλόμορφες αναλογία στο ενημερωτικό loci πρέπει να είναι 100% για δείγματα όγκων αμόλυντες με φυσιολογικό DNA. Σε περιπτώσεις που υποβάλλονται σε LOH όπου το DNA του όγκου είναι μολυσμένο με έως και 50% κανονικό DNA, η αναμενόμενη κυρίαρχη αναλογία αλληλική είναι 66,7%. Η εμπιστοσύνη διάστημα καμπύλες κατασκευάστηκαν για να προσδιορίσει σωστά ισορροπημένη και ασύμμετρες αλληλόμορφα σε όλο το εύρος των συνολικών μετρήσεων αλληλόμορφου που παρατηρείται στα δεδομένα 454FLX, επιτρέποντας έως και 50% μόλυνση του όγκου με κανονικό DNA. Η ανώτερη καμπύλη καθορίζει το όριο για αλληλομόρφων ανισορροπία, ενώ η κατώτερη καμπύλη καθορίζει το όριο για την ισορροπία αλληλομόρφων. Αν αλληλόμορφο αναλογία ενός όγκου υπερβαίνει το άνω όριο ο όγκος είχε χαρακτηριστεί ως μη ισορροπημένη. Αντίθετα, αν η αναλογία αλληλόμορφο είναι μικρότερο από το κάτω όριο καμπύλη, ο όγκος είχε ταξινομηθεί ως ισορροπημένη. Εάν η παρατηρούμενη αναλογία αλληλόμορφο έλαβε χώρα μεταξύ των δύο καμπυλών, τα δείγματα ταξινομήθηκαν ως απροσδιόριστη. Σε όλες τις περιπτώσεις, δύο ή περισσότερες ενημερωτικές αλληλόμορφα έπρεπε να είναι εκτός ισορροπίας για να καλέσετε έναν όγκο ανισόρροπη.

CSMD1 mRNA ανάλυση της έκφρασης σε HCT116 WT και HCT116 DNMT1 /DNMT3B DKO

Έκφραση

της CSMD1 mRNA προσδιορίστηκε με διεξαγωγή ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου για HCT116 WT και HCT116 DNMT1 /3Β ϋΚΟ cDNA. HCT116 WT και DNMT1 /3Β ϋΚΟ cDNA δημιουργήθηκε με πρώτα την απομόνωση του mRNA από κάθε χρήση Dynabeads κιτ απομόνωσης mRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα PCR αμπλικόνια δημιουργήθηκαν με το ακόλουθο πρωτόκολλο: PCR μάστερ μιξ παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας 3 μΙ PCR νερό (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 μΙ 2Χ ΚΑΠΑ SYBR (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), 2 μΐ μείγματος Primer (τελική συγκέντρωση 2.5 μΜ), και 5 μΐ προτύπου cDNA. Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε με το ακόλουθο πρωτόκολλο: 1 κύκλος των 98 ° C για 2 λεπτά? 3 κύκλους 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 64 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 3 κύκλους 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 61 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 3 κύκλους 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 40 κύκλοι 98 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 57 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 70 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 1 κύκλος των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 80 κύκλοι της κλίσης touchdown που ξεκινούν από 95 ° C και μείωση κατά -5 ° C σε κάθε κύκλο.

Ανάλυση μεθυλίωσης χρησιμοποιώντας ειδικούς μεθυλίωσης /υψηλής ανάλυσης PCR Melt Curve Ανάλυση

καθαρισμένο DNA από όγκους και κυττάρων ελέγχου ορίων από τη Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter Genomics, Beverly, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διακόσια νανογραμμάρια γονιδιωματικού DNA τροποποιήθηκε από το όξινο θειώδες EZ DNA μεθυλίωση – Χρυσή Kit (Zymo Research), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. HCT116 και ο διπλός knockout HCT116-DNMT1 /3Β (ϋΚΟ) DNA [43] χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες για την κατάσταση μεθυλίωσης όλων των γονιδίων που εξετάστηκαν. CSMD1 μεθυλιώνεται και δεν εκφράζεται στα κύτταρα άγριου τύπου HCT-116. Σε αντίθεση, CSMD1 είναι μη μεθυλιωμένο και εκφράζεται στα κύτταρα ϋΚΟ [60]. CSMD1 γονίδιο μεθυλίωσης αυτή αμφισβητήθηκε στο 3 θέσεις και ονομάστηκαν CSMD1-1 (CHR8: 4852196000000-4852032000000 εκατομμύρια), CSMD1-3 (4.851.450 έως 4.851.301) και CSMD1-5 (4.851.422 έως 4.851.291). Οι μεθυλίωσης ειδικοί εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα S2 σε S1 αρχείου. Κάθε όγκου δημιουργείται ένα αυθεντικό προϊόν είτε με μετουσιωμένο αστάρια ή με μη μεθυλιωμένα αστάρια, αλλά ποτέ και τα δύο. Περιπτώσεις όπου κανένα προϊόν παρατηρήθηκε είτε με ζεύγος εναρκτήρα θεωρήθηκαν uninformative. Τα αποτελέσματα της μεθυλίωσης των όγκων φαίνεται στον πίνακα S3 στο S1 αρχείου.

Η μεθυλίωση PCR ειδική /υψηλής ανάλυσης λιώσει Curve Ανάλυση υλοποιήθηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που περιγράφηκε προηγουμένως [61]. Η αντίδραση PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας 3-6 ng διθειώδους τροποποιημένου DNA σε συνολικό όγκο 20 μΐ, που περιέχει 12.5 μΐ 2Χ ΚΑΠΑ SYBR FAST qPCR Master Mix (ΚΑΠΑ Biosystems Woburn, ΜΑ), (για την ανάλυση γονιδιωματικών θέση 3.265.577 ΚΑΠΑ HRM γρήγορα kit PCR χρησιμοποιήθηκε)? και 2,5 pmol εκκινητών [62]. Οι συνθήκες ποδηλασίας αντίδρασης ήταν 94 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους των 30 sec στους 94 ° C, Gene-ειδική Ανόπτηση θερμοκρασίας για 30 δευτερόλεπτα, επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και ένα παράθυρο συλλογής δεδομένων σε 76- 77 ° C για 30 sec. Οι καμπύλες σύνδεσης παρήχθησαν για όλα τα προϊόντα, και η παρουσία ή απουσία των αυθεντικών προϊόντων προσδιορίστηκε με σύγκριση προς θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα MyIQ ενιαίο χρώμα Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad).

Στατιστική Ανάλυση

διωνυμική πιθανότητα χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της σημαντικότητας μεταξύ nonsynonymous να συνώνυμο σωματικές μεταλλάξεις του CSMD1 σε παχέος ασθενείς. Σύγκριση μέση ηλικία διάγνωσης ή την κλινική παρουσίαση για τα γενετικώς ισορροπημένη και ασύμμετρες ασθενείς με σωματικές μεταλλάξεις έγιναν από το Mann-Whitney U. Spearman Rank Correlation χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις σχέσεις μεταξύ μεθυλιωμένων τόπους.

Αποτελέσματα

Συχνότητες και χαρακτήρας των σωματικών μεταλλάξεων

Το γονίδιο CSMD1 εκτείνεται 2.05 MB γονιδιακού DNA για την π βραχίονα του χρωμοσώματος 8. το τμήμα αλληλουχία κωδικοποίησης του γονιδίου είναι 11740 νουκλεοτίδια (0,0234 Mb ανά γονιδίωμα διπλοειδή). Εμείς αλληλουχία συνολικά 54 όγκους παχέος εντέρου ισοδυναμεί με 1.26 MB της CSMD1 CDS DNA. Εντοπίσαμε και Sanger-επαλήθευσε 16 σωματικές μεταλλάξεις σε 6 από τους 54 ορθοκολικούς όγκους (11%) (Πίνακας 2). Στη συνέχεια υπολογίζεται μια σωματική ρυθμός μετάλλαξης 11.90 μεταλλάξεων /MB, ένα ποσοστό που είναι αισθητά υψηλότερες από τις τιμές φόντο μετάλλαξη του γονιδιώματος σε επίπεδο των καρκίνων του παχέος εντέρου μικροδορυφόρων σταθερά [3], [38].

Η

οι σωματικές μεταλλάξεις ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη για nonsynonymous αλλαγές σε σύγκριση με το συνώνυμο αλλαγές. Για το Sanger επιβεβαίωσε παραλλαγές, εντοπίσαμε 15 nonsynonymous (NS) μεταλλάξεις και 1 συνώνυμες (S) μετάλλαξη, για μια αναλογία NS /S 15:01. Η πιθανότητα αυτού του πολλά (ή περισσότερα) nonsynonymous μεταλλάξεις που συμβαίνουν κατά τύχη από μόνη της είναι 0.014, με το επιχείρημα ενάντια στην υπόθεση ότι CSMD1 είναι ένα γονίδιο επιβάτη επηρεάζεται από μια φαινότυπο μεταλλάκτη. Η πιο πιθανή εξήγηση είναι ότι οι μεταλλάξεις nonsynonymous επιλέγονται για κατά την διάρκεια του παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ο όγκος 517 είχαν 10 σωματικές μεταλλάξεις να CSMD1, εννέα από τα οποία ήταν nonsynonymous. Η πιθανότητα αυτού του πολλά nonsynonymous μεταλλάξεις που συμβαίνουν και μόνο κατά τύχη είναι 0,1. Η εναλλακτική υπόθεση είναι ότι η επιλεκτική πίεση οδήγησε τη συσσώρευση πολλαπλών nonsynonymous παραλλαγές CSMD1 εντός του ίδιου όγκου, ενδεχομένως διαμένουν σε ξεχωριστά υποκλώνους. Οι διαφορετικές υποομάδες των συχνοτήτων μετάλλαξης σε CSMD1 υπαινίσσονται αυτήν την πεποίθηση ότι οι πολλαπλές μεταλλάξεις CSMD1 προέκυψαν από ξεχωριστά υποκλώνους με τον ίδιο πληθυσμό όγκου (Σχήμα 1).

Δέκα CSMD1 σωματική μετάλλαξη βρέθηκε σε Tumor 517. Ωστόσο, αυτά ειδικότερα μεταλλάξεις συμβαίνουν σε διάφορες υποομάδες των συγκεντρώσεων, υποδεικνύοντας ότι κάθε υποσύνολο μπορεί να έχουν προκύψει από έναν ανεξάρτητο κλώνο εντός του πληθυσμού του όγκου.

η

από την εξέλιξη του αδενοκαρκινώματος μπορεί να οδηγηθεί από μεταλλάξεις στο ογκογονίδιο KRAS, αναλύσαμε οι δυναμικές ζώνες μετάλλαξη στα κωδικόνια 12 και 13 του εξονίου 2, χρησιμοποιώντας Sanger αλληλούχισης των προϊόντων PCR. KRAS hotspot σωματικές μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν σε 21 από τους 54 όγκους παχέος εντέρου (~39%). Τρεις όγκοι που περιέχονται σωματικές μεταλλάξεις και στα δύο CSMD1 και KRAS, με δύο από τις τρεις όγκους που εμφανίζει υψηλότερη CSMD1 μεταλλαγμένο αλληλόμορφο συχνότητα από ό, τι το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο KRAS (Πίνακας 1). Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι οι σωματικές μεταλλάξεις CSMD1 είναι προγενέστερες KRAS σωματικές μεταλλάξεις, οι οποίες πιστεύεται ότι εμφανίζονται νωρίς κατά τη διάρκεια του παχέος εξέλιξης του όγκου. Ένας όγκος είχε συγκεντρώσεις αλληλόμορφο μετάλλαξη CSMD1 που ήταν λιγότερο από τη συγκέντρωση μεταλλαγμένο αλληλόμορφο γονίδιο KRAS, ίσως δείχνει ότι οι μεταλλάξεις CSMD1 σε αυτή του όγκου σημειώθηκαν μετά τις μεταλλάξεις KRAS. Ακόμα, ο κλώνος που φέρει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο CSMD1 επεκταθεί αρκετά για να επιτρέψει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο CSMD1 που πρόκειται να ανιχνευθεί, αποδεικνύοντας ότι αυτή η επέκταση δεν οδηγήθηκε από το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο KRAS. Προκειμένου να καθορίσει σωστά τα χρονοδιαγράμματα για CSMD1 και KRAS μεταλλάξεις, θα απαιτηθεί carful ανάλυση της αλληλουχίας των πρώιμων βλαβών, όπως αδενώματα. Παρ ‘όλα αυτά, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι CSMD1 nonsynonymous μεταλλάξεις παρέχουν καρκινικά κύτταρα με ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα, το οποίο λειτουργεί ανεξάρτητα από το πλεονέκτημα που παρέχεται από μεταλλάξεις KRAS.

όγκους παχέος εντέρου με CSMD1 ΑΕ και σωματικά μεταλλάξεις Εμφάνιση πρώιμες κλινικές Παρουσίαση

από τις 54 όγκων αλληλουχία, Τριάντα επτά είχαν δύο ή περισσότερες θέσεις που ήταν ετερόζυγα για παραλλαγές βλαστική και ως εκ τούτου θα μπορούσε να αξιολογηθεί για CSMD1 αλληλομόρφων ανισορροπία από το Test Διαδοχική Λόγος Πιθανοτήτων [39], [40]. Πενήντα ένα τοις εκατό (19/37) των ορθοκολικών όγκων ήταν μη ισορροπημένη σε δύο ή περισσότερες γειτονικές θέσεις CSMD1 (Σχήμα 2, Πίνακας 1), υποδεικνύοντας ότι η απώλεια της ετεροζυγωτίας CSMD1 μπορούσε να έχει συμβεί σε αυτούς τους όγκους. Αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική, η μέση ηλικία διάγνωσης για τους ασθενείς με αλληλική CSMD1 ανισορροπία ήταν νεότεροι από εκείνους με ισορροπημένο αλληλόμορφα (60 χρόνων vs. 69 χρόνια, Mann-Whitney p = 0,052). Η μέση ηλικία κατά τη διάγνωση των ασθενών με CSMD1 σωματικές μεταλλάξεις ήταν επίσης νεότερος από ό, τι για εκείνους που δεν έχουν σωματικές μεταλλάξεις (58 χρόνια έναντι 66 χρόνια), αν και η διαφορά αυτή δεν ήταν επίσης στατιστικά σημαντική. Απώλεια ετεροζυγωτίας είναι ένας μηχανισμός που συνεργάζεται με σωματική μετάλλαξη για αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς με τόσο ισορροπημένη και μεταλλαγμένα αλληλόμορφα CSMD1 ήταν σημαντικά νεότεροι σε ηλικία διάγνωσης (41 ετών) από ό, τι οι ασθενείς με ισορροπημένο και άγριου τύπου CSMD1 (68 χρόνια, Mann-Whitney p = 0,0077). Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες μας [17], δεν παρατηρήσαμε μια σημαντική σχέση μεταξύ CSMD1 σωματικών κατάσταση μετάλλαξης και το στάδιο του όγκου σε αυτή τη σειρά των δειγμάτων. Παρ ‘όλα αυτά, τα στατιστικά στοιχεία σχετικά με την κλινική εικόνα συμπίπτει με τις πρόσφατες μελέτες που διεξήχθησαν από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA). Με βάση μια ανάλυση Kaplan-Meier επιβίωσης, τα δεδομένα αλληλουχίας TCGA αποκάλυψε ότι οι ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου CSMD1 μεταβολές έχουν σημαντικά μικρότερη πιθανότητα επιβίωσης από ό, τι οι ασθενείς χωρίς CSMD1 αλλοιώσεις (δοκιμασία log-rank p = 0,000565) [41]. Με τέτοιες ενδείξεις, ο προσδιορισμός των CSMD1 αλλαγές έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες σε παχέος πρόγνωση του καρκίνου.

Το άνω φράγμα καμπύλη φαίνεται στο γράφημα δείχνει το 95% όριο CI της CSMD1 τόπους που χαρακτηρίζονται ως μη ισορροπημένη, ενώ το κάτω όριο καμπύλη δείχνει το 95% όριο CI της CSMD1 τόπους που χαρακτηρίζονται ως ισορροπημένη. Όγκοι με δύο ή περισσότερες συνεχόμενες θέσεις που είχαν ισορροπημένη ταξινομήθηκαν ως έχοντες απώλεια υποστεί ετεροζυγωτίας. Τόποι που έπεσε μεταξύ των δύο ορίων κρίθηκαν καθοριστικά για τον χαρακτηρισμό αλληλομόρφων. Ορισμένοι τόποι στην CSMD1 απέδειξε αλληλομόρφων ισορροπία, αν διέμεναν σε όγκους που ήταν ισορροπημένη για CSMD1. Αυτό το αποτέλεσμα υπαινίσσεται σε χρωμοσωμικές διαλείμματα που συμβαίνουν μέσα στην αλληλουχία του γονιδίου CSMD1, κατάντη του εξεταζόμενου τόπους

Η

Υπέρβαση CG & gt?. ΤΑ Μεταλλάξεις και CSMD1 μεθυλίωση

αλληλουχίας exome του παχέος εντέρου έχει αποκάλυψε ότι αρκετοί όγκοι που έχουν παγκόσμιο πλεόνασμα CG & gt? TA σωματικές μεταλλάξεις [2], [3]. Παρατηρήσαμε 7 από 15 (46,7%) CSMD1 σωματικές μεταλλάξεις ήταν CG & gt? TA μεταβάσεις (Πίνακας 2). Αυτή η κατηγορία μετάλλαξη προκύπτει από μη ενζυματική απαμίνωση της 5′-μεθυλοκυτοσίνη για την παραγωγή θυμιδίνης. Πίνακας S2. Πίνακας S3.