Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι ένα από τα πιο θανατηφόρα των καρκίνων του ανθρώπου, λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης της, καθώς και την έντονη αντίσταση της να είναι διαθέσιμα σήμερα θεραπευτικά μέσα. Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών ως προς το γιατί PDAC είναι ανθεκτικοί στο DNA επιβλαβείς κυτταροτοξικά χημειοθεραπεία και ακτινοβολία, πραγματοποιήσαμε μια παγκόσμια ανάκριση της ανταπόκρισης βλάβη του DNA των PDAC. Θεωρούμε ότι PDAC κύτταρα γενικά τρέφουν υψηλά επίπεδα αυθόρμητης βλάβη του DNA. Αναστολή της μη ομόλογες End Joining (NHEJ) επισκευή είτε φαρμακολογικά είτε με RNAi οδήγησε σε περαιτέρω συσσώρευση της βλάβης του DNA, η αναστολή της ανάπτυξης, και, τελικά, την απόπτωση, ακόμη και εν απουσία παράγοντες βλάβης εξωγενές DNA. Σε απάντηση σε ακτινοβολία, PDAC κύτταρα βασίζονται στην οδό ΝΗΕΙ να επισκευάσει γρήγορα DNA διαλείμματα διπλό σκέλος. Μηχανιστικά, όταν NHEJ παρεμποδίζεται υπάρχει μια αντισταθμιστική αύξηση σε ομόλογο ανασυνδυασμό (HR). Παρά το γεγονός αυτό προς τα πάνω ρύθμιση του ΥΕ, εξακολουθεί να υφίσταται βλάβες στο DNA και τα κύτταρα είναι πολύ πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την ενσωμάτωση της αναστολής ΝΗΕΙ σε PDAC θεραπευτικές προσεγγίσεις, είτε μόνη της, είτε σε συνδυασμό με DNA βλάπτει θεραπείες, όπως η ακτινοβολία

Παράθεση:. Li YH, Wang Χ, Παν Y, Lee DH, Chowdhury D, Kimmelman AC (2012) Αναστολή της μη ομόλογο λήξης Ενώνουμε Επισκευή μειώνει παγκρέατος ανάπτυξη του καρκίνου και βελτιώνει την απόκριση του ακτινοβολία. PLoS ONE 7 (6): e39588. doi: 10.1371 /journal.pone.0039588

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 16η, Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 25 Μαΐου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. ACK είναι υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου Grant R01CA157490, Βραβείο Kimmel Μελετητής, και το Βραβείο AACR-PanCAN Career Development. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. ACK είναι σύμβουλος για Forma Θεραπευτικής και για Dainippon Pharma. Έχει λάβει χρηματοδότηση της έρευνας από Karyopharm θεραπευτική για μια άσχετη έργου και έχει λάβει μιλώντας αμοιβή από την Pfizer. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) παραμένει η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], και χαρακτηρίζεται από μια έντονη αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ιονίζουσα ακτινοβολία (IR). Εξαιτίας αυτού, η πλειοψηφία των ασθενών θα υποκύψει στην ασθένεια τους σε λιγότερο από ένα έτος και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις σαφώς απαιτείται. Genomic αστάθεια είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου [2] και σύμφωνα με την παρούσα εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι παγκρέατος εμφανίζουν εξαιρετικά υψηλά επίπεδα του γονιδιακού αλλοιώσεις [3]. Επιπλέον, παγκρεατικό καρκίνοι είναι βαθύτατα ανθεκτικά σε θεραπείες βλάπτει DNA όπως κυτταροτοξικά χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία [4]. Ωστόσο, η βιολογική σημασία της γονιδιωματικής αστάθειας σε αυτή τη νόσο και πώς αυτό μπορεί να επηρεάσει την απόκριση σε DNA βλάπτουν θεραπείες είναι σχετικά ανεξερεύνητη.

Διπλής έλικος διαλείμματα (DSBs), που προκαλείται από την ακτινοβολία ή άλλους παράγοντες βλάβης DNA, πιστεύεται να είναι οι πιο επικίνδυνες βλάβες του DNA που απειλούν την κυτταρική επιβίωση. Σε απάντηση σε ιονίζουσα ακτινοβολία, οι DSBs ανιχνεύονται από το MRE11-Rad50-Nbs1 συγκρότημα (MRN) όσο και για συγκροτήματα /Ku80 Ku70 που ενεργοποιούν γρήγορα αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαχθεί (ATM) και DNA-PK αντίστοιχα [5]. Η ενεργοποίηση αυτών των κινασών επάγει μια σειρά κυτταρικών γεγονότων συμπεριλαμβανομένων φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την έναρξη της διαδικασίας επιδιόρθωσης του DNA. Ιστόνης H2AX, ένα σημαντικό υπόστρωμα της ΑΤΜ και DNA-PK, είναι φωσφορυλιωμένη στην σερίνη 139 (που αναφέρεται ως γH2AX), η οποία αποτελεί εστίες στον ιστότοπό ΟΕΔ που σχετίζονται με άλλους παράγοντες επισκευής [6].

Υπάρχουν

Δύο μεγάλες πορείες για την επισκευή DSBs ομόλογους ανασυνδυασμού (HR) και μη ομόλογου άκρου συναρμογής (NHEJ) [7], [8]. HR-κατευθυνόμενη επισκευή απαιτεί ομόλογο χρωμόσωμα ή αδελφών χρωματίδων ως πρότυπο για την επιδιόρθωση του DNA με υψηλή πιστότητα, και ως εκ τούτου εμφανίζεται κυρίως σε S- και G2- φάσεις του κυτταρικού κύκλου, όταν το πρότυπο είναι διαθέσιμο. Σε αντίθεση με την ΥΕ, ΝΗΕΙ επισκευές ΟΕΔ με σύνδεση των δύο DNA άκρα μετά τη λήξη του DNA επεξεργασία. Το τέλος επεξεργασίας οδηγεί συχνά σε απώλεια των νουκλεοτιδίων και καθιστά NHEJ επιρρεπής σε λάθη [9]. NHEJ είναι ενεργή σε όλη του κυτταρικού κύκλου. Ως εκ τούτου, το στάδιο του κυτταρικού κύκλου και η φύση των άκρων του DNA είναι δύο καθοριστικούς παράγοντες των επιλογών επισκευή μεταξύ HR και NHEJ [7], [10]. Επιπλέον, το ίδιο το DNA-ΡΚ δραστικότητα έχει εμπλακεί στην αναστολή της HR [11], [12]. Σημαντικά, τα καρκινικά κύτταρα συχνά παρουσιάζουν ανωμαλίες στην απόκριση βλάβης DNA και ελαττώματα στην επιδιόρθωση του DNA η οποία μπορεί να συσχετίζονται με αλλοιωμένη έκφραση πρωτεϊνών επισκευής. Για παράδειγμα, υψηλότερη έκφραση των πρωτεϊνών NHEJ, ϋΝΑ-ΡΚ και Κυ70 /80 έχει αναφερθεί σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές [13], [14], [15], [16] Ωστόσο, η απόκριση βλάβη του DNA και την επιδιόρθωση του DNA σε PDAC κυττάρων παραμένει σχετικά ανεξερεύνητη.

Εδώ ερευνήσαμε τη σημασία της επιδιόρθωσης του DNA σε PDAC βιολογία και να βρει ότι τα κύτταρα PDAC λιμάνι αυξημένα επίπεδα της βασικής βλάβης του DNA. Η αναστολή της NHEJ αποτέλεσμα αυξημένη βλάβη του DNA και τελικά μειωμένο πολλαπλασιασμό. Σε απάντηση στην αναστολή ΝΗΕΙ, HR ρυθμίζεται προς τα πάνω, αλλά τα κύτταρα είναι σε θέση να επισκευάσει βλάβη του DNA αποτελεσματικά σε απάντηση στην ακτινοβολία. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη ευαισθησία ακτινοβολίας, όπως αποδεικνύεται από μειωμένη κλωνογόνο επιβίωση. Τα δεδομένα μας εμπλέκουν αναστολή ΝΗΕΙ ως πιθανή θεραπευτική προσέγγιση στην PDAC.

Αποτελέσματα

βλάβη Βασικό DNA σε PDAC

Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε γιατί PDAC είναι βαθύτατα ανθεκτικά στο DNA βλάπτουν θεραπείες, όπως η κυτταροτοξική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, αναλάβαμε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε την απόκριση βλάβη του DNA και την επιδιόρθωση του DNA σε αυτούς τους όγκους. Ως αρχικό βήμα, τα βασικά επίπεδα της βλάβης του DNA εξετάσθηκαν σε μια συλλογή από 18 κυτταρικές γραμμές PDAC καθώς και ένα μη-μετασχηματισμένο αθανατοποιημένη ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρική γραμμή πόρου (HPDE) [17] ως έλεγχος. έγινε ανάλυση Western blot για γH2AX, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για βλάβες του DNA, ιδιαίτερα διπλή διάσπαση της έλικας του DNA (DSBs) [18], [19]. Εντυπωσιακά, περισσότερο από το ήμισυ των κυτταρικών σειρών PDAC έδειξαν αυξημένα επίπεδα γH2AX (Σχήμα 1Α και 1Β) σε σύγκριση με HPDE. Για να επιβεβαιωθεί ότι τα αυξημένα επίπεδα της γH2AX δεν ήταν απλώς λόγω των αυξημένων επιπέδων της ολικής ιστονών, μπορούμε να ομαλοποιούνται τα επίπεδα γH2AX προς το σύνολο Η2ΑΧ σε επιλεγμένες γραμμές κυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και έδειξαν ότι αυτές οι γραμμές συνέχισαν να έχουν αυξημένα γH2AX σύγκριση με HPDE κύτταρα. Ως περαιτέρω απόδειξη της αυξημένης βλάβης του DNA σε PDAC, γH2AX ανοσοφθορισμός σε αντιπροσωπευτικές κυτταρικές σειρές PDAC. Οι αναλύσεις αυτές ήταν σε μεγάλο βαθμό σύμφωνη με τις δυτικές δεδομένα κηλίδα, με εστίες στις γραμμές PDAC συνήθως υψηλότερο από το HPDE (σχήμα 1Γ και 1Δ). Για να μετρηθεί άμεσα βλάβες στο DNA, δοκιμασίες ουδέτερο κομήτη διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η ποσότητα του δίκλωνα σπασίματα υπό βασικές συνθήκες. Και πάλι σύμφωνα με τα στοιχεία γH2AX, τέσσερις από τις πέντε κυτταρικές σειρές PDAC δοκιμάστηκαν επέδειξαν στατιστικά υψηλότερη στιγμές ουρά από εκείνο στο HPDE (Σχήμα 1 Ε), υποδεικνύοντας αυξημένη DSBs. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα PDAC συχνά έχουν αυξημένα επίπεδα βασικής της βλάβης του DNA που μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση μιας απόκρισης βλάβης του DNA. Ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της γH2AX σε HPDE και 18 κυτταρικές γραμμές PDAC. Δείγματα από 8988T και PANC1 ακτινοβολήθηκε σε 4Gy χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι και ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα έγιναν τουλάχιστον τρεις φορές. (Β) Ποσοτικοποίηση της έκφρασης γH2AX με πυκνομετρία ομαλοποιήθηκε με ακτίνη έκφρασης και παρουσιάζονται ως σχέση με HPDE. Τα δεδομένα φαίνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα με ράβδους σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. (Γ) ανοσοφθορισμού για βασικοκυτταρικό γH2AX εστιών σε τρεις αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές (HPDE, 8988T και HPAC). Πράσινο: γH2AX? Μπλε: DAPI (πυρήνα). μπαρ κλίμακα ισούται με 10 μm. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε (D) και παρουσιάζονται ως ποσοστό των κυττάρων με πάνω από 5 εστιών. Τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση από τρία ξεχωριστά πειράματα. (Ε) Ουδέτερη κομήτη δοκιμασία διεξήχθη για να αξιολογηθεί άμεσα DNA θραύσεων διπλής έλικος και τα δεδομένα εκφράζονται ως στιγμή ουρά (Tail στιγμή = μήκος ουράς ×% του DNA στην ουρά). Για όλους τους πίνακες, οι αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε σύγκριση με HPDE με t-test (p ≤ 0,05).

Η

οδούς αποκατάστασης του DNA σε PDAC

Οι δύο κύριες οδούς επιδιόρθωσης του DNA για τη διπλή επισκευή διάλειμμα σκέλος είναι ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) και μη-ομόλογο τέλος που ενώνει την επισκευή. επισκευή ΥΕ απαιτεί ένα ομόλογο χρωμόσωμα ή μια αδελφή χρωματιδικές ως πρότυπο και λαμβάνει χώρα κυρίως στο S ή G2 φάση του κυτταρικού κύκλου για την επισκευή ακριβώς κατεστραμμένο DNA [7]. NHEJ, ωστόσο, επισκευές DNA με απευθείας σύνδεση του DNA τελειώνει μετά τέλος επεξεργασίας που συχνά εισάγει απώλεια των νουκλεοτιδίων και καθιστά NHEJ επιρρεπής σε λάθη [9]. Λαμβάνοντας υπόψη τα αυξημένα βασικά επίπεδα της βλάβης του DNA σε PDAC, εκτιμήσαμε την ικανότητα των κυττάρων αυτών για HR και NHEJ. Για να μετρηθεί η σχετική ποσότητα του HR, εκτελέσαμε ανοσοφθορισμού για Rad51, μια κρίσιμη πρωτεΐνη HR η οποία συνδέεται με προεξοχές μονόκλωνο DNA και καταλύει τη διαδικασία της ανταλλαγής κλώνου DNA. Ο σχηματισμός της Rad51 εστιών είναι ένα ευαίσθητο και ειδικό δείκτη του HR [20], [21]. Τα βασικά επίπεδα του Rad51 εστιών ήταν χαμηλές σε κύτταρα 8988T PDAC καθώς επίσης και σε κύτταρα HPDE (Σχήμα 2Α). Ενώ HPDE κύτταρα έδειξαν μία σημαντική αύξηση σε Rad51 εστίες με αυξανόμενες δόσεις ακτινοβολίας, τα κύτταρα 8988T παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερη αύξηση των εστιών, ακόμη και στους 5 Gy ακτινοβολίας (Σχήμα 2Α). Λαμβάνοντας υπόψη τα ελάχιστα επίπεδα HR δει σε αυτό το PDAC γραμμή, έχουμε σκεφτεί ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να βασιστεί κυρίως στην ΝΗΕΙ για επισκευή. Για να αξιολογηθεί NHEJ, χρησιμοποιήσαμε ένα καλά χαρακτηρισμένο δοκιμασία λουσιφεράσης που βασίζεται πλασμίδιο επισκευή [22], [23]. Εν συντομία, ένα πλασμίδιο κομμένο λουσιφεράσης (pGL2) επιμολύνεται σε κύτταρα και επισκευής μέσω NHEJ μετράται με σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης. Και οι δύο γραμμές 8988T και PANC1 PDAC αποδεικνύει ότι διαθέτει επάρκεια στην ΝΗΕΙ όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 2Β.

(Α) ΥΕ ως απάντηση σε αυξανόμενες δόσεις της ακτινοβολίας (0, 2, και 5 Gy) μετρήθηκε από τον σχηματισμό Rad51 εστίες και εξέφρασε ως μέσος όρος εστιών ανά κύτταρο. Οι εστίες αυξημένη σε κύτταρα HPDE με αυξανόμενες δόσεις ακτινοβολίας, ενώ μόνο άλλαξε ελάχιστα σε κύτταρα 8988T. Τα δεδομένα είναι από δύο ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με επανάληψη καλυπτρίδες με μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Οι αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά με το t-test (p ≤ 0,05). Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται παρακάτω. (Β) NHEJ μετρήθηκε με μία δοκιμασία πλασμίδιο επισκευή λουσιφεράσης. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται για αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και στη συνέχεια να άκοπα λουσιφεράσης. Τόσο PANC1 και τα κύτταρα 8988T δείχνουν αισθητή την επισκευή NHEJ. Νοκ ντάουν της Ku80 μειώθηκε αισθητά ΝΗΕΙ στα κύτταρα PANC1. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

DNA-PK απαιτείται για PDAC ανάπτυξη

Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις επισκευής DSB, είμαστε δίπλα ρώτησε αν κύτταρα PDAC βασίζονται σε NHEJ για κανονική πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη. Έχουμε επικεντρώθηκε στην αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ, η οποία αποτελείται από ετεροδιμερούς πρωτεΐνης Κιι70 /Κυ80 και την καταλυτική υπομονάδα, DNAPKcs, και είναι απαραίτητη για NHEJ [24]. Χρησιμοποιώντας Τα siRNAs, εμείς κατασταλεί η έκφραση των ρυθμιστικών υπομονάδων των ΟΝΑ-ΡΚ, Κυ70 και Κυ80 σε κύτταρα 8988T. Τόσο Τα siRNAs παρήγαγε μια ισχυρή μείωση της έκφρασης του Κυ70 ή Κυ80 σε κύτταρα 8988T, το οποίο ανιχνεύθηκε με qRT-PCR για Κιι70 και Κυ80 και με κηλίδα western για Κιι70 (Σχήμα 3Α). Η εξάντληση των Κιι70 ή Κυ80 ανέστειλε σημαντικά την αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη από 8988T όπως αξιολογήθηκε με softagar προσδιορισμούς, όπως επίσης και ο πολλαπλασιασμός με δοκιμασία καμπύλη ανάπτυξης (Σχήμα 3Β και 3C). Καταστολή της Κιι70 ή Κυ80 μείωσε επίσης το ποσοστό αύξησης των δύο επιπλέον κυτταρικών σειρών PDAC, HupT3 και BxPC3 (Σχήμα 3C). Σε αντίθεση με PDAC, εξάντληση των Κυ70 ή Κυ80 σε HPDE, MCF7 (μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του μαστού) ή Η460 (μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του πνεύμονα) έδειξε περισσότερο μέτρια αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι PDAC κύτταρα απαιτούν Κυ70, Κυ80 για την ανάπτυξη. Για να αναλυθεί περαιτέρω η απαίτηση της NHEJ να διατηρηθεί η ανάπτυξη PDAC, ένα φαρμακολογικό αναστολέα ϋΝΑ-ΡΚ, NU7026 [25], [26], χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί η εμπλοκή του ΟΝΑ-ΡΚ σε ανάπτυξη PDAC. θεραπεία NU7026 μείωσε σημαντικά την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων PDAC, ενώ η αύξηση των Η460 και MCF7 δεν επηρεάστηκε ακόμα και στις υψηλότερες δόσεις (20 μΜ) (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, προσδιορίσαμε τις ευαισθησίες της συλλογής των PDAC γραμμές για NU7026 με τον προσδιορισμό των IC50s (Σχήμα 4C). Περισσότερο από το ήμισυ των γραμμών ήταν ευαίσθητοι στην αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ. NU7026 μειώθηκε επίσης κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων 8988T PDAC (Σχήμα 4Β). Μαζί, τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα κύτταρα PDAC βασίζονται σε NHEJ αποκατάστασης του DNA για την ανάπτυξη υπό βασικές συνθήκες.

(Α) Καταστολή Κυ70 ή Κυ80 έκφραση σε κύτταρα 8988T με Τα siRNAs που ανιχνεύεται από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (αριστερά) και Western blot (δεξιά). (Β) Άνω πίνακα: αντιπροσωπευτικό εικόνες από μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας των κυττάρων 8988T μολυνθεί είτε με έλεγχο shRNA να GFP ή δύο διαφορετικές Τα siRNAs να Ku70 ή Κυ80 αντίστοιχα. Κάτω πίνακας: ποσοτικοποίηση της μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας των κυττάρων 8988T σε σχέση με shGFP μολυσμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι μέσοι όροι από τρία ανεξάρτητα πειράματα και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Δύο αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα:

P

& lt? 0.01 με t-test δοκιμασίες καμπύλη (C) Ανάπτυξη διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η επίδραση της αναστολής της ΝΗΕΙ από Ku70 και Κυ80 νοκ ντάουν στην ανάπτυξη PDAC. Σημειώστε την ισχυρή καταστολή της ανάπτυξης σε κυτταρικές σειρές PDAC (8988T, HupT3, BxPC3) και μόνο μέτρια αποτελέσματα σε άλλες κυτταρικές σειρές (MCF7, Η460 και HPDE).

Η

(Α) Soft δοκιμασίες άγαρ σε 8988T κύτταρα PDAC και κυτταρικές γραμμές όγκου του άλλους ιστολογικούς (Η460 και MCF7) με αυξανόμενες δόσεις του αναστολέα NU7026 DNA-PK αποδεικνύει την εξαρτώμενη από τη δόση αναστολή της ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε PDAC κύτταρα αλλά μόνο ελάχιστες επιδράσεις σε άλλες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Οι αστερίσκοι δείχνουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά με το t-test (p ≤ 0,05). (Β) Κλωνογόνος επιβίωση των κυττάρων 8988T σε επεξεργασία με NU7026 παρουσίαζαν μειωμένη κλωνογόνο ανάπτυξη. (Γ) IC50s σε NU7026 σε μεγαλύτερο πάνελ κυτταρικών γραμμών PDAC δείχνουν η πλειοψηφία είναι ευαίσθητοι στην αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ. Οι ράβδοι σφάλματος παριστάνουν τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (D) NU7026 θεραπεία του 8988T κυττάρων που επάγεται βλάβη του DNA και την απόπτωση μετρήθηκε με γH2AX και διασπασμένη κασπάση 3, αντίστοιχα. κύτταρα 8988T υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NU7026 ή DMSO σαν ένας έλεγχος για μία ημέρα ή επτά ημέρες ακολουθούμενη από ανάλυση Western blot. Αυξημένη βλάβη στο DNA παρατηρήθηκε κατά την πρώιμη (Ημέρα 1) χρονικό σημείο με την αύξηση της ζημίας και, τελικά, την απόπτωση δει την ημέρα 7. (Ε) κύτταρα HPDE σε σύγκριση δείχνουν μια μικρή αύξηση στην έκφραση γH2AX, αλλά πολύ περιορισμένη αύξηση διασπασμένης κασπάσης-3.

Μια πιθανή έκβαση, όταν υποστεί βλάβη του DNA έχει μείνει επιδιορθώθηκε είναι ότι τα κύτταρα θα υποστούν τελικά απόπτωση [27], [28]. Για την αξιολόγηση των κυτταρικών συνέπειες της αναστολής DNA-ΡΚ σε κύτταρα PDAC, εξετάσαμε δείκτες της βλάβης του DNA και απόπτωση μετά από σύντομη (1 ημέρα) ή μακράς διάρκειας (7 ημέρες) αγωγή με NU7026. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι η αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ για μία ημέρα προκάλεσε επιπλέον βλάβη του DNA αναλύθηκε με γH2AX. Ωστόσο, στο επταήμερα χρονικό σημείο, αυξημένη σχάση έκφραση κασπάσης-3 έγινε εμφανής υποδεικνύοντας ότι η απόπτωση μπορεί να είναι αυξημένα σε NU7026 κύτταρα επεξεργασμένα αλλά όχι σε DMSO επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4D). Αντίθετα, η θεραπεία των κυττάρων με HPDE NU7026 έδειξαν αυξημένη γH2AX με πολύ ελάχιστο διασπασμένη κασπάση 3 έκφρασης (Σχήμα 4Ε). Έτσι, η αναστολή του μονοπατιού NHEJ οδηγεί σε περαιτέρω συσσώρευση ϋδΒδ, ενεργοποίηση σημείου ελέγχου και, τελικά, την απόπτωση σε PDAC κύτταρα.

επισκευής DSB σε PDAC μετά IR εξαρτάται από το DNA-PK

Για την περαιτέρω διερευνήσει την απόκριση των κυττάρων PDAC σε βλάβη του DNA, μετρήσαμε την κινητική επισκευή των τριών κυτταρικών γραμμών PDAC εξής IR με παρακολούθηση γH2AX εστίες σε 30 λεπτά, 2, 6 και 12 ώρες μετά από IR με κλινικώς δόση 2Gy. γH2AX εστίες κορυφώθηκε σε περίπου 30 λεπτά μετά IR. Στις 12 ώρες μετά IR, ο αριθμός των εστιών γH2AX στις τρεις PDAC κύτταρα επιστρέφονται στο βασικό επίπεδο. Βρήκαμε επίσης ότι η επισκευή των τριών PDAC κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά εξασθενημένη με αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ, υποδεικνύοντας ότι η επισκευή του DSBs στα κύτταρα PDAC εξαρτάται NHEJ (Σχήμα 5Α) πολύ. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της DNA-PK είχε μόνο μια ελάχιστη επίδραση στην επισκευή των κυττάρων HPDE (Σχήμα 5Α). Είμαστε δίπλα εξέτασε τον τρόπο επιδιόρθωσης HR επηρεάστηκε από την αναστολή της NHEJ. Όπως φαίνεται στο παρελθόν, HR ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα 8988T, ακόμη και μετά IR σε σύγκριση με HPDE. Ωστόσο, HR αυξήθηκε σημαντικά με την παρουσία του στα κύτταρα NU7026 8988T μετά IR (Σχήμα 5Β). Παρά την προφανή αντισταθμιστική αύξηση του HR σε κύτταρα 8988T όπου αναστέλλεται NHEJ, ο αριθμός των εστιών γH2AX παραμένει υψηλή (Σχήμα 5Α), υποδεικνύοντας ότι αυτό δεν είναι ακόμα επαρκής για την πλήρη επισκευή.

(Α) κινητική Επισκευή τρία PDAC κυτταρικές γραμμές (8988T, PANC1 και BxPC3) μετρήθηκαν με χρώση γH2AX σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την ακτινοβολία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως εστίες αριθμός ανά κύτταρο, κανονικοποιημένη προς το χρονικό σημείο 30 λεπτών όταν σχηματισμός εστιών ήταν μέγιστη. Κάθε κυτταρική γραμμή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NU7026 (20 μΜ) ή DMSO. Σε κάθε γραμμή είναι η ανάλυση των εστιών καθυστέρησε σημαντικά με τη θεραπεία NU7026. Παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν σε κύτταρα HPDE (δεξί πάνελ). Σημειώστε ότι η NU7026 δεν εξασθενίζουν ανάλυση εστίες στα κύτταρα αυτά. (Β) HR αυξάνεται ως αντισταθμιστικό απάντηση σε αναστολή NHEJ σε PDAC κύτταρα. σχηματισμός Rad51 εστιών είναι σημαντικά αυξημένη όταν δραστικότητα ϋΝΑ-ΡΚ αναστέλλεται από NU7026. Αριστερό πλαίσιο: Rad51 εστίες σε πράσινο και πυρήνα με μπλε χρώμα φαίνεται με χρώση DAPI. Δεξιό πλαίσιο: ποσοτικοποίηση των εστιών ανά κύτταρο στις υποδεικνυόμενες συνθήκες. Τα δεδομένα φαίνεται από δύο ανεξάρτητα πειράματα με μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις από την μέση τιμή.

Η

αναστολή ΝΗΕΙ ευαισθητοποιεί PDAC σε IR

Η αναστολή της ΝΗΕΙ αυξάνει βλάβες στο DNA που οδηγεί σε μειωμένη ανάπτυξη και την απόπτωση σε PDAC κύτταρα, καθώς και τα αποτελέσματα στην παρατεταμένη παρουσία DNA εστιών βλάβης μετά την ακτινοβολία. Ως εκ τούτου, η αναστολή NHEJ θα αναμενόταν να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της ακτινοβολίας. Τόσο 8988T και κυττάρων PANC1 έδειξαν αυξημένη ευαισθησία σε IR, όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με NU7026 όπως φαίνεται από μειωμένη κλωνογόνο επιβίωση (Σχήμα 6Α). Ομοίως, 8988T και PANC1 κυττάρων με Κυ70 ή Κυ80 knockdown ήταν επίσης περισσότερο ευαίσθητα σε IR (Σχήμα 6Β). Σε συμφωνία με την μειωμένη επιβίωση κλωνογονική των κυττάρων, μία αυξημένη κλάσμα των κυττάρων 8988T συνελήφθησαν στη G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NU7026 και IR (71,88% έναντι 27,26% στην ακτινοβολημένα ελέγχου) σε σύγκριση με μάρτυρα έλαβαν ή ακτινοβολημένα κύτταρα (Σχήμα 6C).

(Α) Αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ με NU7026 radiosensitizes 8988T και PANC1. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων εις τριπλούν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή NU7026 στα 20 μΜ την επόμενη μέρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε IR μετά από ολονύκτια κατεργασία με DMSO ή NU7026. Μετά από 9 ημέρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν οι αποικίες. Το κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ικανότητα επίστρωσης. (Β) Καταστολή Ku70 ή Ku80 radiosensitized κυτταρικές σειρές PDAC, 8988T και PANC1. 8988T ή PANC1 κύτταρα μολύνθηκαν με shKu70 ή shKu80 και shGFP χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως στο (Α). (Γ) διανομή Τυπικές κυτταρικού κύκλου των 8988T σε υποδεικνύεται θεραπείες. κύτταρα 8988T υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NU7026 ή DMSO για δύο ημέρες ακολουθούμενη από IR σε 2Gy και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο 24 ώρες αργότερα. κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και εμφανίζεται είναι το αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα.

Η

Συζήτηση

παγκρέατος καρκίνων είναι βαθιά ανθεκτικά σε τρέχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που λειτουργούν μέσω επαγωγής βλάβες στο DNA όπως διάφορα κυτταροτοξικά χημειοθεραπείες και ακτινοβολία. Έτσι, η κατανόηση της απόκρισης αυτών των όγκων σε βλάβη του DNA μπορεί να παρέχει βασικές θεραπευτικές ιδέες. Η εργασία μας δείχνει ότι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές έχουν συχνά αυξημένα επίπεδα της βασικής βλάβης του DNA με την απουσία εξωγενών βλαπτικούς παράγοντες. Ενώ η ακριβής αιτιολογία της αυξημένης βλάβης βασικοκυτταρικό DNA δεν είναι γνωστή, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η σταθερή γενωμική αστάθεια ότι αυτοί οι όγκοι υπομένουν [3] μπορεί να είναι εν μέρει υπεύθυνη. Για παράδειγμα, κατά τη διαδικασία του γενωμικού ενίσχυσης, κύκλοι θραύση σύντηξης-γέφυρα συμβαίνουν οι οποίες οδηγούν στο σχηματισμό συνεχούς παροδικής DSBs [29]. Αυτά και άλλα γονιδιωματική γεγονότα δει συχνά σε PDAC, όπως χρωμοσωμικές μεταθέσεις, μπορεί να προωθήσει μια σταθερή κατάσταση της βλάβης του DNA.

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν επίσης ότι ΝΗΕΙ είναι η κύρια οδός υπεύθυνη για την επισκευή DSB σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, όπως η αναστολή της ΝΗΕΙ καταργεί την κινητική ταχεία επισκευή. Μαζί, τα στοιχεία θα πρότεινα ένα σενάριο όπου οι όγκοι αυτοί έχουν αναπτύξει μια εξάρτηση από ΝΗΕΙ να επιβιώσουν συνεχή γενωμική αστάθεια και η συνακόλουθη βλάβη του DNA που ακολουθεί. Η επιλογή των DSB οδού επιδιόρθωσης και η σχέση μεταξύ HR και NHEJ παρουσιάζουν μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον και ενώ οι ακριβείς μοριακές βάσεις επιλογής οδού γίνεται η επεξεργασία, είναι πιθανό ότι τουλάχιστον ένα μέρος της επιλογής επισκευή υπαγορεύεται από τον κύκλο κυττάρου , ως HR μπορεί να λειτουργήσει μόνο σε S /G2 /M [7]. Δείχνουμε ότι HR είναι αρκετά χαμηλή σε PDAC κύτταρα, ακόμη και σε απόκριση σε IR. Ωστόσο, υπάρχει μια αντισταθμιστική αύξηση του ανθρώπινου δυναμικού, όταν ΝΗΕΙ αναστέλλεται, αλλά είναι ανεπαρκής για να αποτρέψει γενοτοξική επίπεδα βλάβης του DNA.

Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας είναι επίσης σύμφωνη με τις πρόσφατες θεραπευτικές προσεγγίσεις στο BRCA1 και 2 όγκους μεταλλαγμένου χρησιμοποιώντας αναστολείς PARP. Αυτό το «συνθετικό θνησιμότητα», όπου οι όγκοι με μία μόνο οδό επιδιόρθωσης του DNA όπως HR βλάπτεται είναι ευαίσθητοι στην αναστολή μίας οδού δεύτερου επισκευή (π.χ. BER), έχει λάβει μεγάλη προσοχή [30], [31], [32]. Σύμφωνα με την έννοια της αναστολής της μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA ως θεραπευτική προσέγγιση, PDAC δείχνουν ευαισθησία σε αναστολείς NHEJ. Μία πιθανή εξήγηση είναι ότι η αυξημένη βασική βλάβη του DNA χρησιμεύει για να συντρίψει την επισκευή DSB καθιστώντας τα ευαίσθητα σε αναστολή της NHEJ ή άλλες οδούς επιδιόρθωσης του DNA.

Τέλος, η αναστολή της NHEJ δείχνει μια ισχυρή συνέργεια με ακτινοβολία. Αυτό δεν είναι απροσδόκητο από μια μηχανιστική άποψη, αλλά μπορεί να έχει κλινικές επιπτώσεις στη θεραπεία της νόσου. Ενώ μακρινό ασθένεια είναι μια σημαντική αιτία θνησιμότητας στον καρκίνο του παγκρέατος, τα τελευταία στοιχεία δείχνουν ότι όσο το 30% PDAC θάνατοι αποδίδονται άμεσα στις τοπικές εξέλιξη [33]. Δυστυχώς, η χειρουργική επέμβαση δεν είναι δυνατή για την πλειοψηφία των ασθενών αυτών και η μόνη άλλη διαθέσιμη τοπική θεραπεία, ακτινοβολία, είναι αναποτελεσματική στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, ακόμα και όταν συνδυάζεται με χημειοθεραπεία [34]. Ως εκ τούτου, η αύξηση της ευαισθησίας αυτών των όγκων στην ακτινοβολία θα μπορούσε να έχει μετασχηματιστική επίδραση σε αυτόν τον πληθυσμό ασθενών. Πράγματι, η ανάπτυξη αναστολέων με τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DNA πραγματοποιούνται γρήγορα και πολλοί κινούνται στην κλινική ως συστατικά της θεραπείας του καρκίνου [35]. Οι μηχανιστικές γνώσεις που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, παρέχει μια συναρπαστική μοριακή λογική να εξερευνήσετε την ανάπτυξη αυτών των παραγόντων για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου ελήφθησαν από την American Type Culture Collection ή τη Συλλογή γερμανική μικροοργανισμών και κυτταρικών Καλλιεργειών. κύτταρα HPDE ελήφθησαν από M.S. Τσάο. [17]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε είτε ϋΜΕΜ ή RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό μόσχου κοσμική, αντιβιοτικά και γλουταμίνη. κύτταρα HPDE καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων (KSF) μέσο χωρίς ορό συμπληρωμένο με εκχύλισμα βόειας υπόφυσης και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Gibco). NU7026 (Sigma) χρησιμοποιήθηκε σε 20 μΜ εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά.

Real-time PCR

Το RNA απομονώθηκε με ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), ϋΝάση και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας MMLV High Απόδοση ανάστροφης μεταγραφάσης (Epicentri) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ανίχνευσης SYBR Green (Applied Biosystems) σε ένα Bio-Rad Chromo4 Thermocycler. PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε στους 95 ° C για 2 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec, 55 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 sec. Τέλος μια καμπύλη τήξης παράχθηκε από 55 ° C έως 95 ° C, διαβάσει κάθε 0.5 ° C. Οι εκκινητές ήταν ως εξής:. Ku70, μπροστά 5′-AGTCATATTACAAAACCGAGGGC -3 ‘και αντίστροφη 5′-CCTTGGAGGCATCAACCAAAAA -3′ Ku80 μπροστά 5’-CCTTTCTGGTGGGGATCAGTA -3 ‘και αντίστροφη 5′-ACCTGGTTGGATTTTGCTTTCAA -3’

IC50 δοκιμασία

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαδοχική αραίωση του NU7026 την επόμενη ημέρα για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό κυττάρων Titer-Glow (Promega, G7570) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η IC50 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σιγμοειδές μοντέλο χρησιμοποιώντας BioDataFit 1.

shRNA επιμόλυνση

πλασμίδια pLKO.1 περιέχει ακολουθία shRNA για Ku70 και Κυ80 ελήφθησαν από το RNAi Consortium (ακολουθίες διαθέσιμο κατόπιν αιτήματος). Lentivirus περιέχουν Κιι70, Κυ80 και ελέγχου GFP Τα siRNAs παρήχθησαν σε κύτταρα πακεταρίσματος ΗΕΚ293Τ και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα σε παρουσία 8 μg /ml polybrene (Sigma H9268). Κατά επιλογή πουρομυκίνης για 2-3 ημέρες, τα κύτταρα επιστρέφονται στο κανονικό μέσο για πειράματα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό περιέχουν shGFP, shKu70 και shKu80 σπάρθηκαν εις τριπλούν σε 24- φρεατίων σε 2500-5000 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και χρωματίζονται με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες κατά την ημέρα όπως υποδεικνύεται. Dye εκχυλίζεται με 10% οξικό οξύ και ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε μετρώντας OD στα 595 nm. Σχετική πολλαπλασιασμός υπολογίστηκε με κανονικοποίηση προς την ημέρα 0.

δοκιμασία μαλακού άγαρ

2 mL μέσου που περιέχει 1% αγαρόζη (Nobel Agar, BD 214230) τοποθετήθηκε σε πλάκες 6-φρεατίων ως κάτω στρώμα . 2 ml κυτταρικού εναιωρήματος με 5000 κύτταρα σε μέσο που περιέχει 0,5% αγαρόζη τοποθετήθηκε στην κορυφή του στερεοποιηθεί κάτω στρώμα. Μετά από 9-14 ημέρες, οι αποικίες βάφτηκαν με ιώδες ρ-ιωδονιτροτετραζολίου (Sigma, 18377), μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν. Εάν χρειάζεται, NU7026 προστέθηκε τόσο στο κάτω μέρος και την κορυφή άγαρ πριν τοποθετηθούν στα τρυβλία. 200 μL των αναστολέων μέσου που περιέχει προστέθηκε στην κορυφή κάθε 3 ημέρες. Για τα πειράματα RNAi, τα κύτταρα σπάρθηκαν δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση.

κλωνογονιδιακή επιβίωση δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 6-φρεατίων σε 100 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο ανάπτυξης, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το NU7026 επόμενη μέρα, και ακτινοβολείται στους 2, 4 και 6 Gy. Μετά από 10-14 ημέρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 80% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,2% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν οι αποικίες. Το κλάσμα που επιβίωσαν υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την αποτελεσματικότητα επιμετάλλωσης.

Ουδέτερη προσδιορισμοί κομήτη

Ουδέτερη προσδιορισμοί κομήτη διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Trevigen). Εν συντομία, τα κύτταρα σε συνδυασμό με αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξης (αρ. Καταλόγου 4250-050-02), και στη συνέχεια τοποθετείται σε CometSlide (αρ. Καταλόγου 4250-200-03). Μετά τη λύση των κυττάρων (αρ. Καταλόγου 4250-050-01) και εκτύλιξη του DNA, τα κύτταρα ηλεκτροφορήθηκαν επί 40 λεπτά σε 21 βολτ σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ. Πλάκες μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη, βάφονται με SYBR και εικόνες που λαμβάνονται από AutoComet μηχάνημα (TriTek Corp). Minimal εκατό τυχαία επιλεγμένα κύτταρα από κάθε δείγμα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CometScore (https://autocomet.com). βλάβη στο DNA προσδιορίστηκε με ροπή ουρά (το μήκος της ουράς πολλαπλασιάζεται με το ποσοστό του DNA στην ουρά).

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, μετρήθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 2Χ δϋδ . Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τη Δυτική: ακτίνης (Sigma, A2066), γH2AX (Millipore, 05-636), Ku-70 κατσίκας (Santa Cruz, sc-1487), φωσφο-Chk1 (S345) (κυτταρική σηματοδότηση, # 2348) , και Διασπασμένη κασπάση 3 (Asp175) (κυτταρική σηματοδότηση, # 9664).

χρώση ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες ή διαφάνειες μικροσκοπία 8 φρεατίων σταθεροποιήθηκαν για 20 λεπτά με 4% παραφορμαλδεΰδη και διαπερατά κατά 0,1% Triton Χ-100 για 3 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε 4 βαθμούς με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι γH2AX (Millipore, 05-636), ή Rad51 (Santa Cruz, sc-8349, Η-92) ακολουθούμενη από κατσίκα αντι-ποντικού IgG-FITC (Santa Cruz, 1 :300) ή κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-FITC (Santa Cruz, 1:300). εικόνες κυττάρων ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Zeiss χρησιμοποιώντας ένα 63x αντικειμενική και αναλύθηκαν για εστίες /πυρήνα.

In vitro πλασμίδιο pGL2 -Με ΝΗΕΙ δοκιμασία

πλασμίδιο pGL2-ελέγχου (Promega) ήταν εντελώς γραμμικός με ο HindIII ενδονουκλεάση περιορισμού και το γραμμικοποιημένο DNA εκχυλίζεται από πήκτωμα αγαρόζης με το κιτ εκχύλισης πηκτής (Invitrogen). Κυκλικό πλασμίδιο και ευθυγραμμισμένο DNA στη συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν με PRT-RL πλασμιδίου σε κύτταρα με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668). Τα επιμολυσμένα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για ενεργότητα λουσιφεράσης με διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega). Η πυγολαμπίδα σήμα κανονικοποιήθηκε με εκείνο του Renila που χρησίμευσε ως αναφορά την επιμόλυνση. Η συνολική χωρητικότητα NHEJ υπολογίστηκε με δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας από κύτταρα επιμολυσμένα με HindIII-χωνεμένο DNA σε σχέση με εκείνη του άθικτου πλασμιδίου.

Η κυτταρομετρία ροής

δοκιμασία

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, κατεργάζεται με NU7026 την επόμενη μέρα για 48 ώρες, και ακτινοβολείται στους 2 Gy και σταθεροποιήθηκαν μετά από 24 ώρες με παγωμένη αιθανόλη 70% σε PBS για όλη τη νύχτα. Μετά από φυγοκέντρηση, τα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε PBS, χρωματίστηκαν με διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου για 30 λεπτά και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACS Calibur BD) στο σκοτάδι.