Αφηρημένο

Εισαγωγή

αξιολογηθεί η έκφραση της p85 και ρ110α υπομονάδων ΡΙ3Κ σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) δείγματα και η συσχέτιση με την έκφραση του mTOR, και σπούδασε επιπτώσεις της στόχευσης του PI3K /AKT /mTOR μονοπάτι σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

Μέθοδοι

Χρησιμοποιώντας Αυτοματοποιημένο Ποσοτική ανάλυση έχουμε ποσοτικά έκφραση της PI3K υπομονάδων σε δύο ομάδες των 190 και 168 δείγματα NSCLC και συσχετίζεται με την έκφραση mTOR. Μελετήσαμε επιδράσεις των δύο αναστολέων ΡΙ3Κ, LY294002 και NVP-BKM120, μόνο και σε συνδυασμό με ραπαμυκίνη σε 6 κυτταρικές γραμμές NSCLC. Εκτιμήσαμε δραστηριότητα ενός διπλού αναστολέα της PI3K /mTOR, NVP-BEZ235 μόνο και με έναν αναστολέα του EGFR

Αποτελέσματα

p85 και ρ110α τείνουν να συν-εκφράζεται (p & lt? 0.001).? έκφραση ρ85 ήταν υψηλότερη σε αδενοκαρκινώματα από καρκινώματα πλακωδών κυττάρων. υψηλή έκφραση ρ85 που σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο και η κακή επιβίωση. ρ110α έκφραση συσχετίζεται με mTOR (ρ = 0.276). Σε έξι NSCLC κυτταρικές σειρές, η προσθήκη της ραπαμυκίνης προς LY294002 ή NVP-BKM120 ήταν συνεργιστική. Ακόμα και πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης (1 ηΜ) είχε σαν αποτέλεσμα ευαισθητοποίηση σε αναστολείς ΡΙ3Κ. NVP-BEZ235 ήταν ιδιαίτερα ενεργός στις κυτταρικές σειρές NSCLC με IC

’50 στην περιοχή nanomolar και την προκύπτουσα προς τα κάτω ρύθμιση των ρΑΚΤ και pP70S6K. Προσθέτοντας Η erlotinib στο ΚΠΑ-BEZ235 οδήγησε σε συνεργιστική αναστολή της ανάπτυξης.

Συμπεράσματα

Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης PI3K, σε προχωρημένο στάδιο και η επιβίωση στον NSCLC υποδηλώνει ότι θα μπορούσε να είναι ένα πολύτιμο φάρμακο στόχο. Η ταυτόχρονη αναστολή των PI3K και mTOR είναι συνεργιστική

in vitro

, και ένας αναστολέας της διπλής PI3K /mTOR ήταν ιδιαίτερα ενεργός. Προσθέτοντας αναστολή EGFR οδήγησε σε περαιτέρω αναστολή της ανάπτυξης. Στόχευση του PI3K /AKT /mTOR μονοπάτι σε πολλαπλά επίπεδα θα πρέπει να δοκιμάζεται σε κλινικές δοκιμές για NSCLC

Παράθεση:. Zito CR, Jilăveanu LB, Αναγνώστου V, Rimm D, Bepler G, Μάιρα S-M, et al. (2012) Multi-Level στόχευση της φωσφατιδυλινοσιτόλης-3-κινάσης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 7 (2): e31331. doi: 10.1371 /journal.pone.0031331

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Ιουνίου, 2011? Αποδεκτές: 6 Γενάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Φεβ 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από ένα Βραβείο Σταδιοδρομίας Ανάπτυξης της Αμερικανικής Ένωσης για την Έρευνα του Καρκίνου με τον Δρ Chao. Ο Δρ Kluger υποστηρίζεται από το Yale SPORE σε καρκίνο του δέρματος, 1 P50 CA121974 (με τον R. Halaban). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Drs. RIMM και το Camp είναι συν-ιδρυτές, τους μετόχους και τους συμβούλους για μια εταιρεία που ονομάζεται HistoRx που έχει άδεια την τεχνολογία για αυτοματοποιημένης ανάλυσης ιστού που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη. Δρχ. Μάιρα και Hackl είναι εργαζόμενοι της Novartis Εταιρείας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλους PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, περίπου 222.520 νέες περιπτώσεις διαγνώστηκαν και περίπου 157.300 θάνατοι οφείλονται σε καρκίνο του πνεύμονα το 2010 [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα. Οι πιο κοινές ιστολογίες είναι αδενοκαρκίνωμα, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου. Η πλειονότητα των ασθενών με NSCLC διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο, όπου η χημειοθεραπεία μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση και ανακούφιση των συμπτωμάτων. Ωστόσο, συμβατική χημειοθεραπεία δεν παρέχει καμία θεραπεία για προχωρημένο NSCLC και έχει φτάσει σε ένα οροπέδιο σε αποτελεσματικότητα με διάμεση επιβίωση 8-10 μήνες [2]. Η προσθήκη νέων στοχευμένων θεραπειών, όπως η μπεβασιζουμάμπη και cetuximab σε συμβατική χημειοθεραπεία βελτίωσε τη διάμεση επιβίωση περίπου 12 μήνες σε ασθενείς με καλή κατάσταση απόδοσης [3], [4]. Νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις χρειάζονται επειγόντως για αυτή την κοινή ασθένεια.

Η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάση (PI3K) /AKT /mTOR σηματοδότησης επιπτώσεις οδού πολλές πτυχές της κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης [5]. Μεταβολές των συνιστωσών στο ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /μονοπατιού mTOR μπορεί να συμβεί σε πολλά επίπεδα και να οδηγήσει σε συστατική ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού και κακοήθους μετασχηματισμού.

Οι ΡΙ3Κ είναι μια οικογένεια ενζύμων που φωσφορυλιώνουν φωσφατιδυλινοσιτόλη διφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτόλη να τριφωσφορική. Οι ΡΙ3Κ συχνότερα ενεργοποιείται από υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK) σηματοδότησης όπως μέσω EGFR, IGF1-R και HER2 /neu [6] – [9]. Υπάρχουν τρεις κατηγορίες ΡΙ3Κ [10], [11]. Κατηγορία Ι

A ΡΙ3Κ είναι η πιο ευρέως εμπλέκεται τύπου στον καρκίνο και θα αναφέρεται ως «ΡΙ3Κ» στο υπόλοιπο αυτού του χειρογράφου. ΡΙ3Κ είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από ένα ρ85 ρυθμιστικού και μια καταλυτική υπομονάδα ρ110.

φωσφατιδυλινοσιτόλης τριφωσφορική μεσολαβεί στην ενεργοποίηση ΑΚΤ [11]. ΑΚΤ, με τη σειρά του, ενεργοποιεί πολλές κυτταρικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη σύνθεση πρωτεϊνών, κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση συμπεριλαμβανομένων mTOR [11] – [13]. mTOR ρυθμίζει μετάφραση μέσω φωσφορυλίωσης συστατικά του μηχανισμού σύνθεσης πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένων των ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 κινάσες (ρ70

S6K) και πρωτεΐνη δέσμευσης 4Ε (4Ε-ΒΡ). Φωσφορυλίωση 4Ε-BP οδηγεί στην απελευθέρωση του παράγοντα eIF4E έναρξης μετάφρασης η οποία έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν μετασχηματισμό και αντι-αποπτωτικών δραστηριότητες

in vitro

[13], [14]. PTEN αντιστρέφει σηματοδότησης ΡΙ3Κ από αποφωσφορυλίωση φωσφατιδυλινοσιτόλης τριφωσφορική [15].

Στο NSCLC, PI3K /AKT σηματοδότησης /mTOR συχνά απελευθερωμένης οφείλεται σε μεταλλάξεις που επηρεάζουν ένα από τα ανάντη ρυθμιστές της, του υποδοχέα EGFR, και άλλα εξαρτήματα στο εσωτερικό της οδού [16]. συστατικά mTOR μονοπάτι βρέθηκαν να μεταλλαχθεί σε 17 γονίδια και σε περισσότερο από το 30% των όγκων του πνεύμονα 188 αδενοκαρκινώματα στο οποίο διεξήχθη αλληλούχιση exome [16]. Αυξήσεις σε αριθμό αντιγράφων του γονιδίου του

PIK3CA

, το γονίδιο που κωδικοποιεί ρ110α, και οι αλλαγές στη φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (ρΑΚΤ) έκφρασης έχουν περιγραφεί σε προ-κακοήθη βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων και NSCLC [17] – [22]. Ενώ μεταλλάξεις στο

PIK3CA

είναι σχετικώς σπάνια στον καρκίνο του πνεύμονα,

PIK3CA

αντιγραφή κέρδος αριθμός έχει αναφερθεί στο 33,1% των πλακωδών καρκίνου του πνεύμονα και σε 6,2% του καρκίνου του πνεύμονα αδενο σε μία μεγάλη σειρά [ ,,,0],23]. σηματοδότησης ΡΙ3Κ έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβούν βρογχοκυψελιδικού επέκταση των βλαστοκυττάρων ξεκίνησε από ογκογόνους

K-RAS

[24]. συνδέονται Tumor μεταλλάξεις ρ110α είναι ογκογόνοι

in vivo

σε ένα μοντέλο ποντικού NSCLC [25]. Η υπερέκφραση του ρ85 και ρ110 α έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με κακή διαφοροποίηση των πρωτογενών καρκίνων του πνεύμονα σε μία ομάδα που περιελάμβανε 73 περιπτώσεις NSCLC [26]. Η ομάδα μας έχει ήδη μελετήσει την έκφραση του mTOR σε NSCLC ομάδες και βρήκε μια σύνδεση με βελτιωμένη έκβαση [27].

Η αναστολή της PI3K /AKT /mTOR σηματοδότηση μέσω φαρμακολογικές και γενετικές προσεγγίσεις προκαλεί αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε κυτταρικές σειρές ορισμένες NSCLC [17] – [21] και στον πνεύμονα μοντέλα ποντικών του καρκίνου [25], [28]. Ένας αριθμός αναστολέων ΡΙ3Κ είναι διαθέσιμα για προκλινική έρευνα. Παλαιότερες ενώσεις όπως Ι Υ294002 ή wortmannin έχουν δραστικότητα κατά των όγκων σε προκλινικά μοντέλα, αλλά η κακή διαλυτότητα, στενό θεραπευτικό δείκτη και crossover αναστολή τους άλλων κινασών έχουν περιορίσει την κλινική εφαρμογή τους. Νεότερο αναστολείς PI3K έχουν εισέλθει σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση, και η δράση αυτών των παραγόντων θα πρέπει να αξιολογείται σε ασθένειες που απαιτούν νέες προσεγγίσεις, όπως NSCLC.

Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να χαρακτηρίσει την έκφραση της ρ85 και ρ110 υπομονάδες α της κατηγορίας Ι

Μια PI3K σε δύο μεγάλες ομάδες ανεξάρτητων δειγμάτων NSCLC και να αξιολογηθεί η συσχέτιση με τις κλινικές και παθολογικές μεταβλητές συμπεριλαμβανομένων προηγουμένως δημοσιευθεί έκφραση mTOR. Για να αποκτήσετε πιο ακριβή, αντικειμενικά μέτρα έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε μια πρόσφατα ανεπτυγμένη μέθοδο αυτοματοποιημένη, ποσοτική ανάλυση (AQUA) των μικροσυστοιχιών ιστού [29]. Ως περιττή ενεργοποιητές της PI3K /AKT οδό σηματοδότησης και αρνητική ανάδραση βρόγχων [5] περιορίζει την αποτελεσματικότητα των θεραπειών και μόνο παράγοντα, δίπλα σκοπός μας ήταν να μελετήσει τις επιπτώσεις της με στόχο την PI3K /AKT οδό σηματοδότησης σε πολλαπλά επίπεδα σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Βρήκαμε ότι η υψηλότερη έκφραση της ρ85 συσχετίζεται με κακή επιβίωση και προχωρημένο στάδιο. Η έκφραση της ρ110α συσχετίζεται με εκείνη του mTOR. Η ταυτόχρονη αναστολή των PI3K και mTOR οδήγησε σε συνεργιστική καταστολή της ανάπτυξης. Προσθέτοντας αναστολή του EGFR ενισχύεται περαιτέρω τις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις ενός αναστολέα της διπλής PI3K /mTOR.

Υλικά και Μέθοδοι

Ιστός μικροσυστοιχιών (TMA) Κατασκευή

Ένα NSCLC ομάδα λήφθηκε από τον H. Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, FL). Η ομάδα Moffitt Κέντρο Καρκίνου (MTMA) περιέχει πυρήνες από πρωτογενείς όγκους NSCLC των ασθενών που διαγνώστηκαν μεταξύ 1991 και 2001. χρόνου παρακολούθησης κυμάνθηκε μεταξύ 0,8 μήνες και 146,4 μήνα, ο μέσος χρόνος παρακολούθησης 52,3 μήνες. Ηλικία κατά τη διάγνωση κυμαίνονταν 40,8 έως 84,4 (μέση ηλικία 69 ετών). Η ομάδα περιελάμβανε 54,5% άνδρες και 45,5% γυναίκες.

Το Πανεπιστήμιο Yale ομάδα (YTMA) κατασκευάστηκε από, τμήματα ιστού φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη που λαμβάνονται από το Πανεπιστήμιο Yale Τμήμα Παθολογίας Αρχεία. Τα δείγματα αποκόπηκαν μεταξύ 1995 και 2003, με παρακολούθηση εύρος μεταξύ 0,1 μήνες και 182,25 μήνες, και μέσο χρόνο παρακολούθησης 41 μηνών. Ηλικία κατά τη διάγνωση κυμαίνονταν 21 – 90 (μέση ηλικία 65 ετών). Η ομάδα περιλαμβάνονται 51% άντρες και 49% γυναίκες.

TMAs κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [27]. Δύο 0.6 πυρήνες mm ελήφθησαν από διαφορετικές, αντιπροσωπευτικές περιοχές της κάθε πρωτογενούς δείγματος NSCLC και σε απόσταση 0,8 χιλιοστά μεταξύ τους σε γυάλινες πλάκες. σφαιρίδια κυτταρική γραμμή που αποτελείται από SW480, ΗΤ29, Α431, ΜΒ435, MCF7, ΒΤ474, και SKBR3 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι και ενσωματώθηκαν στη συστοιχία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Οι ομάδες για MTMA και YTMA συλλέχθηκαν με την έγκριση των θεσμικών συμβούλια επανεξέταση και έχουν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες εκδόσεις [27], [31].

χρώση ανοσοφθορισμού

διαφάνειες TMA βάφτηκαν για κάθε των δύο δεικτών στόχου, ΡΙ3Κ ρ85 και υπομονάδες ρ110α. Η χρώση πραγματοποιήθηκε για AQUA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] – [31]. Τα πλακίδια επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε Τπδ-ρυθμισμένο αλατούχο που περιέχει 0.3% αλβουμίνη βόειου ορού σε 4 ° C. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται για τις αντίστοιχες επωάσεις ήταν μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου ΡΙ3Κ ρ85, κλώνος 4 /ΡΙ3-κινάσης (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ή ΡΙ3Κ ρ110α κλώνος κουνελιού αντι-ανθρώπινης C73F8 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), σε 1:200 ή 1:50 αραιώσεις, αντίστοιχα. Είτε κατσίκας αντι-ποντικού ή κατσίκας αντι-κουνελιού υπεροξειδάσης αρμορακίας-διακοσμημένα σκελετό πολυμερούς (Envision, Dako Βόρεια Αμερική, Carpinteria, CA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση της πρωτεΐνης στόχου. Για να δημιουργήσετε μια μάσκα όγκου, πλάκες ταυτόχρονα επωάστηκαν είτε με το ποντίκι ή κουνέλι αντι-κυτοκερατίνης σε 1:100. Για την οπτικοποίηση της χρώσης κυτοκερατίνης μια κατσίκα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG συζευγμένο με Alexa 546 (Molecular Probes, Inc.) σε 1:200 χρησιμοποιήθηκε. Ο δείκτης στόχος οπτικοποιήθηκε με Cy5-τυραμιδίου (NED Life Science Products). Καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με παρατείνουν Χρυσό αντιδραστηρίου με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) (Invitrogen).

Αυτόματη Image Acquisition και Ανάλυσης (AQUA)

Εικόνες αναλύθηκαν με τη χρήση αλγορίθμων που έχουν περιγραφεί [29]. Όγκος διακρίνεται από στρωματικά στοιχεία από το σήμα κυτοκερατίνης. Συνένωση κυτοκερατίνης στην κυτταρική επιφάνεια χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό της κυτταρικής μεμβράνης /κυτταροπλασματικό διαμέρισμα εντός της μάσκας του όγκου και DAPI χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει το πυρηνικό διαμέρισμα εντός της μάσκας του όγκου. Στόχοι έγιναν ορατά με Cy5? Αυτό το μήκος κύματος που χρησιμοποιείται για την επισήμανση στόχος διότι είναι έξω από το εύρος του αυτοφθορισμού των ιστών. Πολλαπλές μονοχρωματική, υψηλής ανάλυσης (1.024 × 1.024 pixel, 0,5-μm) ασπρόμαυρες εικόνες ελήφθησαν για κάθε histospot χρησιμοποιώντας το 10 × στόχος του Ολύμπου AX-51 μικροσκόπιο επιφθορισμού με αυτοματοποιημένο στάδιο μικροσκόπιο και ψηφιακή λήψη εικόνας οδηγείται από ένα προσαρμοσμένο πρόγραμμα και macrobased διασυνδέσεις με IPLabs λογισμικού (Scanalytics, Inc.). Εικόνες για κάθε histospot ατομικά αναθεωρηθεί. Δύο εικόνες συλλήφθηκαν για κάθε histospot και για κάθε κανάλι φθορισμού, DAPI, Alexa-546, και Cy5? μία εικόνα στο επίπεδο εστίασης και ένα 8 im κάτω από αυτό. Η διαμερισματοποίηση και ποσοτικοποίηση του σήματος πρωτεΐνη στόχο σε κάθε προκαθορισμένα διαμέρισμα για κάθε histospot διεξήχθη ως εξής. Πρώτον, το σήμα Alexa-546 που αντιπροσωπεύουν κυτοκερατίνης χρώση χρησιμοποιήθηκε για να παράγει ένα επιθηλιακό κύτταρο μάσκα που αποκλείει όλα τα άλλα στρωματικά στοιχεία. Αυτό το σήμα δυαδική περιφραγμένη προκειμένου να προσδιορίσει αν ένα pixel είναι μέσα από τη μάσκα του όγκου (on) ή όχι (εκτός)? όλα τα λευκά pixel να είναι μέρος αυτής της μάσκας και όλα τα μαύρα pixel δεν είναι μέρος αυτού του διαμερίσματος. Ομοίως, η πυρηνική διαμέρισμα ορίζεται ως pixel που επιδεικνύουν χρώση ϋΑΡΙ εντός του επιπέδου της εστίασης και εντός της περιοχής που ορίζεται από τη μάσκα του όγκου. Το DAPI εικόνα είναι επίσης δυαδικοποιημένων να παράγει μια μάσκα όλων των πυρήνων εντός του δείγματος με αφαίρεση έξω επικαλυπτόμενα pixels με την κυτταροπλασματική μάσκα? όλα τα λευκά pixel να είναι μέρος αυτής της μάσκας, ενώ όλα τα μαύρα pixel δεν είναι. Για να εξασφαλιστεί ότι μόνο το σήμα του στόχου από τον όγκο και όχι στα περιβάλλοντα στοιχεία αναλύεται, χρησιμοποιήθηκαν οι αλγόριθμοι RESA /PLACE. Ο αλγόριθμος RESA παρέχει ένα ευέλικτο σύστημα κατωφλίου. Σε γενικές γραμμές, σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ιστούς μπορούν να επιδείξουν αυτοφθορισμό και μερικές φορές ανάλυση μπορεί να δώσει πολλαπλές κορυφές υποβάθρου. Ο αλγόριθμος RESA καθιερώνει την κυρίαρχη κορυφή και στη συνέχεια να θέτει ένα δυαδικό όριο μάσκα σε ελαφρώς υψηλότερο επίπεδο έντασης. RESA εξαλείφει όλες εκτός εστίασης πληροφορίες αφαιρώντας ένα ποσοστό της εικόνας εκτός εστίασης από την εικόνα σε εστίαση, με βάση ένα pixel-by-pixel ανάλυση των δύο εικόνων. Αυτό επιτρέπει τελικά ακριβέστερη εκχώρηση των εικονοστοιχείων της παρακείμενων διαμερισμάτων. Τέλος, χρησιμοποιούμε τον αλγόριθμο μέρος για να εκχωρήσετε σε κάθε pixel της κάθε εικόνας σε ένα συγκεκριμένο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Όλα τα εικονοστοιχεία που δεν μπορεί να εκχωρηθεί με ακρίβεια σε ένα διαμέρισμα με ένα βαθμό εμπιστοσύνης 95%, αποκλείεται τελικά. Επιπλέον, όλα τα εικονοστοιχεία των οποίων οι εντάσεις είναι πολύ παρόμοια με τα πυρηνικά και μεμβράνη διαμερίσματα και ως εκ τούτου δεν μπορεί να αποδοθεί με ακρίβεια εξαιρούνται επίσης. έκφραση ΡΙ3Κ καθορίζεται αυτόματα από τις εικόνες κανάλι Cy5 για να ληφθεί σχετική ένταση πίξελ για το σήμα που εκπέμπεται από το επίπεδο εστίασης. Πρώτον, κάθε pixel εκχωρείται σε ένα υποκυτταρικό διαμέρισμα ή αποκλείεται, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ένα σκορ AQUA για οποιαδήποτε υπο-κυτταρικά διαμερίσματα συνήθως υπολογίζεται ως ο μέσος όρος βαθμολογίας AQUA από καθένα από τα ατομικά εικονοστοιχεία που περιλαμβάνονται στο επιλεγμένο διαμέρισμα? το σήμα στόχου (ρ85 ή ρ110α) από τα εικονοστοιχεία μέσα στο κυτταρόπλασμα κανονικοποιήθηκε προς την περιοχή της μάσκας του όγκου και βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0-255 (το σκορ AQUA). Histospots αποκλείστηκαν αν η μάσκα του όγκου αντιπροσώπευαν λιγότερο από το 5% της συνολικής έκτασης histospot.

Στατιστική Ανάλυση

JMP έκδοση 5.0 του λογισμικού χρησιμοποιήθηκε (SAS Institute, Cary, NC). Η προγνωστική σημασία των παραμέτρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο με επιβίωση χωρίς εξέλιξη και η συνολική επιβίωση σαν τελικό σημείο. αναλύσεις μονοπαραγοντική επιβίωση αποτυπώθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Η συσχέτιση μεταξύ συνεχής βαθμολογίες AQUA και άλλες κλινικές /παθολογικών παραμέτρων εκτιμήθηκε με ανάλυση διακύμανσης. Όλα αναφερθεί p-τιμές βασίζονται σε δοκιμές δύο όψεων σημασία. ANOVA και t-test χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν συνεχείς μετρήσεις.

κυτταρικές σειρές και Δυτική κηλίδες

καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο γραμμή H2170 και κυττάρων αδενοκαρκινώματος γραμμές H1650, HCC2935 και HCC827 ήταν ευγενικά από τους Drs. John Minna και Michael Peyton (Πανεπιστήμιο Νοτιοδυτική). Πλακώδες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος SK-MES-1 και SW900 ελήφθησαν από την American Type Tissue Culture. Τα χαρακτηριστικά της κάθε κυτταρικής σειράς, συμπεριλαμβανομένων κατάστασης μεταλλάξεων του

PIK3CA

,

K-RAS

και

EGFR

παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. Οι κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος H1650, HCC2935 και HCC827 έχουν άγριου τύπου

PIK3CA

και

K-RAS

αλλά μεταλλαγμένο

EGFR

. Όλοι πλακωδών κυττάρων καρκινώματος γραμμές SK-MES-1, H2170 και SW900 έχουν άγριου τύπου

EGFR

και άγριου τύπου

PIK3CA

. SK-MES-1 και H2170 έχουν άγριου τύπου

K-RAS

. SW900 έχει μεταλλαγμένο

K-RAS

. Ήμασταν ενδιαφέρονται για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων της αναστολής ΡΙ3Κ σε αδενοκαρκίνωμα να πλακωδών κυττάρων γραμμές καρκινώματος και τη σύγκριση με το

EGFR

μεταλλαγμένο να

EGFR

κυτταρικές σειρές άγριου τύπου. Όλες οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες (37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα) και αναπτύχθηκαν σε RPMI (Gibco ™, Invitrogen Corp, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% FBS. κυτταρική γραμμή HBE135-E6E7, ένα μη μετασχηματισμένο βρογχοκυψελιδικό κυτταρική γραμμή, αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε κερατινοκύτταρα μέσο ελεύθερο ορού συμπληρωμένο με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου EGF, 0,05 mg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης, 0,005 mg /ml ινσουλίνη και 500 ng /ml υδροκορτιζόνη.

οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων υπολογίστηκαν από το BCA (δικιγχονινικού οξύ) δοκιμασία (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Πρωτεΐνες (50 μg) αραιώθηκαν σε ένα ρυθμιστικό δείγματος [2,5% SDS, 10% γλυκερόλη, 5% β-μερκαπτο-αιθανόλη, 50 mM Tris (ρΗ = 6,8) και 0,1% μπλε βρωμοφαινόλης] και υποβλήθηκε σε δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής (SDS-PAGE). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τυποποιημένες μεθόδους χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντι-ανθρώπινα αντισώματα πρωτογενούς κουνελιού: φωσφορυλιωμένο ΑΚΤ (Ser

473), φωσφορυλιωμένο p70S6K (Thr

389), ΡΙ3Κ ρ110α, φωσφορυλιωμένη S6 Ριβοσωματιακής Πρωτεΐνης (Ser

235 /236), PARP (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ) σε 1:1000 και μονοκλωνικά ποντικού αντι-ανθρώπου ΡΙ3Κ ρ85 ή αντι-κασπάση-2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) σε 1:1000. Ένα μονοκλωνικό ποντικού β-ακτίνης (A2066 ή A5441, SIGMA, 1:200 ή 1:5000 αντίστοιχα) χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος για την τυποποίηση δείγμα φόρτωσης. Η ανίχνευση των πρωτεϊνών έγινε με IgG δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) και ECL (PerkinElmer).

Αντινεοπλασματικοί παράγοντες και την Κυτταρική Βιωσιμότητα Δοκιμασίες

για δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας, 1 × 10

3 κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκα 96 φρεατίων (Βϋ Bioscience) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες σε μια κατά προσέγγιση συρροή 30%. Για τις μελέτες αναστολής του φαρμάκου, NVP-BEZ235 και NVP-BKM120 (Novartis Pharmaceuticals, Basel, Switzerland) και LY294002 (LC Laboratories, Woburn ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία των κυττάρων του πνεύμονα σε διάφορες συγκεντρώσεις. Για τα πειράματα συνδυασμού, ο αναστολέας mTORC1, χρησιμοποιήθηκαν ραπαμυκίνης και erlotinib αναστολέα EGFR (LC Laboratories).

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε στις 72 ώρες με τη χρήση της CellTiter-Glo ™ φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητα Δοκιμασία, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή ( Promega, USA)? Ένας ίσος όγκος του αντιδραστηρίου ΟβΙΙ Titer-Glo ™ προστέθηκε στα φρεάτια και μετά από επώαση 10 λεπτών, η φωταύγεια καταγράφηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός Χ multilabel Victor ™ (Perkin Elmer). Τα IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν από το λογισμικό XLfit (MathIQ έκδοση 2.2.2, ΙϋΒδ).

Synergistic Φαρμάκων Effect Analysis

Η μέθοδος ανάλυσης του δείκτη συνδυασμό Chou και Talalay χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τα αποτελέσματα από συνδυαστική πειράματα ναρκωτικών [32]. NVP-BKM120 και LY294002 χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με τον αναστολέα mTOR, ραπαμυκίνη. NVP-BEZ235 ήταν συνδυάζονται με erlotinib, στα αντίστοιχα ενιαία ναρκωτικών IC

50 ή IC

25 συγκεντρώσεις. Το IC

50 και IC

25 αξίες του κάθε φαρμάκου για πρώτη φορά ελήφθησαν από αναλύσεις βιωσιμότητας ενός μόνο φαρμάκου και στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για να σχεδιάσουν πειράματα του συνδυασμού φαρμάκων. Το επίπεδο του συνεργισμού εκτιμήθηκε σε μία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων φαρμάκου, με επίκεντρο συγκεντρώσεις κάτω ή στο IC

50 για κάθε φάρμακο χωριστά. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν για συνεργιστική, πρόσθετο, ή ανταγωνιστικές δράσεις χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, Missouri, USA). Συνεργική δράση υποδεικνύεται από μία Δείκτη Συνδυασμού (CI) μικρότερη από 0,9, προσθετική δράση από μια CI μεταξύ 0,9 και 1,1, και ανταγωνιστικό αποτέλεσμα με CI μεγαλύτερη από 1.1.

Αποτελέσματα

Έκφραση PI3K p85 και υπομονάδες p110á σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα

για την MTMA, 166 και 190 δείγματα υπέκειτο πλήρως σε σχέση με PI3K p85 και της έκφρασης ρ110α υπομονάδα, αντίστοιχα. ΡΙ3Κ δεν έδειξαν σημαντική πυρηνική χρώση είτε υπομονάδα, και εμείς επομένως αναλύθηκαν μόνο το κυτταροπλασματικό διαμέρισμα. Χρώση μοτίβα εντός της μάσκας όγκου εντός histospot ήταν εξαιρετικά ομοιογενής και για τις δύο υπομονάδες. AQUA σκορ κυμάνθηκε 7,12 έως 127,04 (μέση τιμή, 37,68? Διάμεσος, 33.47) για την υπομονάδα p85, και 5,43 έως 138,56 (μέση τιμή, 24,35? Διάμεσος, 20.26) για την υπομονάδα ρ110α. Ένα παράδειγμα AQUA χρώση histospots για ρ85 και ρ110α έκφραση φαίνεται στο Σχήμα 1 και τον Πίνακα S2. Histospots κρίθηκαν un-ερμηνεύσιμο εάν είχαν ανεπαρκή κύτταρα του όγκου, η απώλεια του ιστού στο σημείο, ή μια αφθονία νεκρωτικό ιστό. Δείγματα με λιγότερο από 5% περιοχή του όγκου ανά σημείο δεν συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση AQUA.

Anti-PI3K συζευγμένο με Cy5 χρησιμοποιείται για τη μέτρηση των επιπέδων PI3K υπομονάδα (κάτω αριστερά τεταρτημόρια, μεγέθυνση × 10). Αντι-κυτοκερατίνης συζευγμένο με Cy3 χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει τα καρκινικά κύτταρα εντός της histospot (άνω δεξιά τεταρτημόρια). Οι τρύπες γεμίζουν για να δημιουργήσετε μια μάσκα όγκου (κάτω δεξιά τεταρτημόριο). DAPI χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει πυρήνες (επάνω αριστερά τεταρτημόρια). Το πυρηνικό διαμέρισμα εντός της μάσκας του όγκου στη συνέχεια αφαιρείται από τη μάσκα για να δημιουργήσει ένα κυτταροπλασματικό διαμέρισμα (δεν φαίνεται). Τα δεξιά πάνελ είναι 40 × μεγεθύνσεις της PI3K p85 και ρ110α υπομονάδα θετική και αρνητική χρώση, αντίστοιχα.

Η

Είμαστε αξιολόγησε τις συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης PI3K υπομονάδας και ιστολογική υπότυπο, με αταίριαστα t-tests. Η έκφραση τόσο του ρ85 και τις υπομονάδες ρ110α ήταν σημαντικά υψηλότερα σε αδενοκαρκινώματα σε σχέση με το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (

P

& lt? 0,0001 για ρ85 και

P

= 0,0356 για ρ110α), όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, πάνελ Α & amp? B.

Σημαντικά υψηλότερη έκφραση υπομονάδας ΡΙ3Κ ρ85 φαίνεται σε όγκους αδενοκαρκίνωμα, στην Moffitt Cancer κοόρτης και του Πανεπιστημίου Yale κοόρτης, αντίστοιχα (Πίνακας Α & amp? C). Σημαντικά υψηλότερη έκφραση ΡΙ3Κ ρ110α υπομονάδας σε όγκους αδενοκαρκίνωμα φαίνεται στην Moffitt Cancer κοόρτης και του Πανεπιστημίου Yale κοόρτης, αντίστοιχα (Πίνακας Β & amp? D). Καμπύλες κατά Kaplan Meier που δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης PI3K υπομονάδας και μειωμένη επιβίωση για ρ85 (Πίνακας Ε), αλλά όχι για ρ110α (Πίνακας F).

Η

Για την επικύρωση της σύνδεσης μεταξύ των υπομονάδων ΡΙ3Κ και αδενοκαρκίνωμα, το YTMA εργαζόταν. Σε αντίθεση με την MTMA οποία ήταν στάδιο πρωτίστως Ι (Α και Β) ο καρκίνος του πνεύμονα (92%), το YTMA περιλαμβάνονται 55 στάδιο% Ι, και 45% σταδίου ΙΙ-IV (17%, 19% και 9% σταδίου II, III , IV αντίστοιχα) καρκίνο του πνεύμονα. Για την PI3K p85 και υπομονάδα ρ110α έκφραση YTMA ήταν ερμηνεύσιμο για 163 και 168 δείγματα, αντίστοιχα. Οι βαθμολογίες AQUA γι ‘αυτή την ομάδα κυμάνθηκε 4,18 έως 120,73 (μέση, 35.31? Διάμεσος, 32.70) για την υπομονάδα p85, και 9,17 – 86,91 (μέση, 38.12? Διάμεσος, 35.17) για την υπομονάδα ρ110α. Αταίριαστα t-test επιβεβαίωσε τα ευρήματα από την MTMA? έκφραση της ρ85 υπομονάδας και υπομονάδας ρ110α ήταν σημαντικά υψηλότερα σε αδενοκαρκινώματα σε σχέση με το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (

P

& lt? 0,0002 για ρ85 και

P

= 0,0266 για ρ110α), όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, πίνακας C & amp? Δ Υψηλή p85 και της έκφρασης ρ110α υπομονάδα συσχετίζονται με προχωρημένο στάδιο της νόσου της νόσου (

P

= 0,0075,

P

= 0.0093, αντίστοιχα), αλλά όχι με την ηλικία και το φύλο (δεν απεικονίζεται).

με Cox μονοπαραγοντική επιβίωση αναλύσεις των συνεχών βαθμολογιών AQUA, βρήκαμε ότι η υψηλή έκφραση p85 συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση (

P

= 0,0198). AQUA παρέχει συνεχή βαθμολογίες εξόδου, αντί για τις κατηγορίες «υψηλό» ή «χαμηλό», όπως προσδιορίζεται από παθολόγους ερμηνεύοντας πρότυπο ανοσοϊστοχημεία. Να απεικονίσει τη σχέση μεταξύ συνεχούς βαθμολογίες PI3K και την επιβίωση, AQUA βαθμολογίες διαχωρίστηκαν μεταξύ τους από τη διάμεση τιμή, αντανακλώντας τη χρήση των συνήθων στατιστικών διαιρέσεων στην απουσία βασικών λόγων για την κατανομή της έκφρασης. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν για την έκφραση υπομονάδας PI3K p85 και την επιβίωση και

P

-τιμές ελήφθησαν με τη μέθοδο log-rank Mantel-Cox. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, πάνελ Ε & amp? F, βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ υψηλή έκφραση p85 και την κακή επιβίωση (

P

= 0,0075). Δεν βρέθηκε κάποια σχέση μεταξύ ρ110α έκφρασης και επιβίωσης.

Στην πολυπαραγοντική ανάλυση έκφρασης p85 δεν διατηρούν ανεξάρτητη προγνωστική αξία της, προφανώς λόγω της σύνδεσής της με την ιστολογική υποτύπου και το στάδιο. Η μόνη μεταβλητή που σχετίζεται με την επιβίωση από πολυπαραγοντική ανάλυση ήταν Σκηνή (

P

= 0.0000). σημειώθηκε καμία τέτοια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ρ110α υπομονάδας και την επιβίωση.

Συνέκφραση της PI3K ρ85 ή p110á με mTOR σε ανθρώπινους όγκους του πνεύμονα

Η συσχέτιση μεταξύ του προηγουμένως δημοσιευθεί έκφραση mTOR [27] και p85 και ρ110α αξιολογήθηκε υπομονάδες της PI3K. Χρησιμοποιώντας το τεστ συσχέτισης τάξης Spearman, έκφραση mTOR συνδέθηκε με ρ110α έκφραση (ρ = 0.276,

σ

= 0,0006), ενώ δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του mTOR και υπομονάδας p85.

In vitro

δραστηριότητα του NVP-BKM120 και LY294002 σε κυτταρικές σειρές πνεύμονα

Λόγω της σχέσης μεταξύ της PI3K και προχωρημένο στάδιο και η κακή επιβίωση, το

in vitro

δράση των αναστολέων ΡΙ3Κ μελετήθηκε σε έξι κυτταρικών γραμμών καρκίνου πνεύμονα ανθρώπου. Δύο αναστολείς ΡΙ3Κ χρησιμοποιήθηκαν? μελετήσαμε NVP-BKM-120, έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ ποιότητα κλινική που αναπτύσσεται από τη Novartis, και LY294002, μία εμπορικά διαθέσιμη ένωση που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη της αναστολής της ΡΙ3Κ στην προκλινική ρύθμιση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε NVP-BKM120 σε συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 0,01 ηΜ έως 8200 ηΜ ή LY294002 σε συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 6,4 ηΜ έως 20.000 ηΜ. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν. Μετά από 72 ώρες επώασης, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε, και το IC

50 υπολογίστηκε για κάθε κυτταρική σειρά, και ο μέσος όρος για τα πειράματα επανάληψης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, το IC

50 για NVP-BKM120 και αναστολή LY294002 κυμαίνονταν από 716 ηΜ έως 1265 ηΜ και 4123 ηΜ έως 11,925 ηΜ, αντίστοιχα.

Η

Για να ελεγχθεί αν η αναστολή της ανάπτυξης την ίδια βιομηχανία από NVP-BKM120 και LY294002 είναι ειδικές ή τουλάχιστον ενισχυμένη σε κακοήθη έναντι φυσιολογικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε ένα αθανατοποιημένη, μη μετασχηματισμένα bronchoaveolar κυτταρική γραμμή, HBE135-E6E7. Αυτά τα κύτταρα που προέρχονται από φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο που λαμβάνονται από έναν άνθρωπο που υποβάλλονται σε λοβεκτομή για το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [33]. NVP-BKM120 και LY294002 είχαν μικρή επίδραση επί των κανονικών bronchoaveolar κύτταρα σε συγκεντρώσεις περίπου 10 και 5 φορές το μέσο IC

50 αυτών των δύο φαρμάκων, αντίστοιχα, σε κύτταρα NSCLC. 13% αναστολή της ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε 10 μΜ ΝΝ-BKM120 αλλά ένα IC

50 δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, και μόλις το 25% αναστολή της ανάπτυξης αποκτήθηκε με 50 μΜ θεραπεία LY294002.

Δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης των φαρμακευτικών στόχων μερικές φορές να προβλέψει την ευαισθησία των ναρκωτικών, μελετήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ του βαθμού ευαισθησίας /ανθεκτικότητας σε NVP-BKM120 και τα επίπεδα LY294002 και PI3K. Έχουμε αξιολόγησε τις δύο υπομονάδες PI3K και συνολικά και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ από ανοσοαποτύπωση. Δεν υπάρχει σαφής συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων προεπεξεργασίας των PI3K (ρ85 ή ρ110α) ή ολική και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ και την ευαισθησία /αντοχή σε NVP-BKM120 ή LY294002 (Σχήμα S1).

Η συνέργεια μεταξύ των PI3K και mTOR αναστολείς

η αντίσταση στην αναστολή της PI3K έχει σημειωθεί σε διάφορες ασθένειες και οφείλεται σε πολλούς μηχανισμούς. Συστατική ενεργοποίηση μονοπατιού PI3K θα μπορούσαν να προκύψουν από την ενεργοποίηση ΑΚΤ από mTOR-C2 ή την ενεργοποίηση του mTOR από τα μέλη του μονοπατιού της ΜΑΡ κινάσης παρά την ειδική αναστολή PI3K ναρκωτικών. Λόγω της συν-έκφραση μεταξύ ρ110α και mTOR παρατηρήθηκαν σε κλινικά δείγματα μας, μελετήσαμε συνέργεια μεταξύ της ραπαμυκίνης mTOR inbitor και NVP-BKM120 και η ραπαμυκίνη και LY294002. Συγκεντρώσεις του 1000 και 500 ηΜ του NVP-BKM120 συνδυάστηκαν με μια σειρά από συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης (1, 10 και 100 ηΜ) σε έξι κυτταρικές γραμμές NSCLC. Συνέργια παρατηρήθηκε σε πέντε από τις έξι κυτταρικές γραμμές σε όλες τις συγκεντρώσεις του NVP-BKM120 με όλες τις τρεις συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης, και στην έκτη κυτταρική γραμμή (H1650), συνέργεια παρατηρήθηκε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις του NVP-BKM120 (Σχήμα 3 και Πίνακες S3 και S4). Στη συνέχεια σπούδασε συνέργεια μεταξύ LY294002 και η ραπαμυκίνη. Συγκεντρώσεις του 5000 και 2500 ηΜ LY294002, συνδυάστηκαν με μια σειρά από συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης (1, 10 και 100 ηΜ) σε έξι πνεύμονα κυτταρικές σειρές. Συνέργια παρατηρήθηκε σε όλες τις έξι κυτταρικές γραμμές σε όλες τις συγκεντρώσεις του LY294002 με όλες τις τρεις συγκεντρώσεις ραπαμυκίνης όπως φαίνεται στον Πίνακα S3. Το Σχήμα 3 δείχνει την συνεργία γραφικά, χρησιμοποιώντας H2170 και SW900 ως παράδειγμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι διαφορές παρατηρήθηκαν σε βιωσιμότητα κατά την προσθήκη 1 ηΜ, 10 ηΜ ή 100 ηΜ rapamcyin ήταν αρκετά παρόμοια.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φθίνουσα νανομοριακές συγκεντρώσεις του αναστολέα ΡΙ3Κ NVP-BKM120 ή LY294002, μόνα ή σε συνδυασμό με 1 ηΜ, 10 ηΜ ή 100 ηΜ ραπαμυκίνης για 72 ώρες και η βιωσιμότητα μετρήθηκε με το κύτταρο δοκιμασία τίτλου Glo. Οι μπάρες δείχνουν βιωσιμότητα ως ποσοστό βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τρία ξεχωριστά πειράματα διεξήχθησαν και κάθε κατάσταση μετρήθηκε σε τρία πανομοιότυπα βοθρία.

Η

Δραστηριότητα ενός διπλού ΡΙ3Κ αναστολέα /mTOR σε κυτταρικές σειρές NSCLC

Δεδομένου συνέργεια παρατηρείται μεταξύ αναστολέων ΡΙ3Κ και ραπαμυκίνη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, ένας αναστολέας διττής ΡΙ3Κ /mTOR που έχει δοθεί σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους σε κλινικές δοκιμές φάσης Ι, NVP-BEZ235, μελετήθηκε. Σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου έξι πνεύμονα οι IC

’50 για την ένωση NVP-BEZ235 ήταν στο εύρος ηΜ ενώ καμία επίδραση παρατηρήθηκε στα κύτταρα HBE135-E6E7, ακόμη και σε συγκεντρώσεις τόσο υψηλές όσο 1000 ηΜ ή είκοσι φορές το μέσο IC

50 παρατηρήθηκαν σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ανάπτυξη NSCLC και επιβίωση διαμεσολαβούμενη από ένα ευρύ φάσμα μοριακών παράγοντες είναι επιλεκτικά ευαίσθητοι σε αναστολή της ΡΙ3Κ με ΝνΡ-BEZ235. Στόχοι του NVP-BEZ235 (ρΑΚΤ, pP70S6K και PS6) προσδιορίστηκαν με ανοσοκηλίδα ανάλυση σε κύτταρα με έως και 24 ώρες έκθεσης στο φάρμακο. Κάθε έκθεση στο φάρμακο πέραν των 24 ωρών οδήγησε σε σημαντική ποσότητα των νεκρών κυττάρων και τα συντρίμμια και θα μείωνε την interpretability.