Αφηρημένο

E74 μοιάζει με συντελεστή 5 (Elf5) έχει συσχετισθεί με την καταστολή του όγκου στον καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, ο ρόλος του στον καρκίνο ουροφόρων (UC) είναι τελείως άγνωστη. Ανοσοϊστοχημεία (IHC) και μεθυλίωση ειδική PCR (MSP) έγιναν για να ανιχνεύσει το επίπεδο έκφρασης Elf5 και μεθυλίωση του υποκινητή. Αποτελέσματα έδειξαν ότι χαμηλή έκφραση του Elf5 επί πρωτεΐνης και τα επίπεδα mRNA συσχετίστηκαν με την εξέλιξη του όγκου, πρώιμη υποτροπή και την κακή επιβίωση. In vitro, κάτω ρύθμιση Elf5 μπορεί να αυξήσει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση Elf5 αναγνωρίστηκε ως κύριος μηχανισμός για τη γονιδιακή σιωπή Elf5. Κατά συνέπεια, η αποκατάσταση των Elf5 από λοίμωξη ή απομεθυλίωση θεραπεία αποτελεσματικά αντιστραφεί διαδικασίες EMT. Εν κατακλείδι, εντοπίσαμε Elf5 ως νέο βιοδείκτη της UC σε διάφορα βιολογικά επίπεδα και καθιέρωσε ένα αιτιολογικός σύνδεσμος μεταξύ Elf5 και EMT στο UC

Παράθεση:. Wu Β, Cao Χ, Liang X, Ζανγκ Χ, Ζανγκ W , Sun G, et al. (2015) Επιγενετική κανονισμού της Elf5 συνδέεται με επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση στον Καρκίνο ουροθηλιακά. PLoS ONE 10 (1): e0117510. doi: 10.1371 /journal.pone.0117510

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 1 του Αυγούστου, 2014? Αποδεκτές: 29 Δεκεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 28η Ιανουαρίου 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα μας είναι πράγματι ελήφθησαν από το τρίτο μέρος (Tianjin Institute of Urology), αλλά αυτά είναι διαθέσιμα μόνο κατόπιν αιτήματος λόγω των ηθικών περιορισμών που επιβάλλονται από το δεύτερο Νοσοκομείο της Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Οι αναγνώστες μπορούν να επικοινωνήσουν με Dongwen Wang ([email protected]) για να ζητήσει τα δεδομένα

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Η EMT επηρεάζει κρίσιμα βήματα που σημειώνονται αλλαγές στην κυτταρική προσκόλληση, πολικότητα και μεταναστευτικές από διαμετατρέποντας επιθηλιακών κυττάρων σε κύτταρα με μεσεγχυματικά /κύτταρο (SC) κατάσταση [1 στέλεχος, 2,3]. EMT και αντίστροφη πρόγραμμά του, μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ), ενεργοποιήθηκαν σε καρκινικά κύτταρα και η πρόοδος αυτή επιτρέπει αυτά τα κύτταρα να αποκτήσουν την κυτταρική χαρακτηριστικά που συνδέονται με την υψηλής ποιότητας, εισβολής και της επανάληψης [3,4,5]. Δεδομένης της πολυπλοκότητας και δυναμική φύση της ΕΜΤ, είναι αδύνατον να διατηρηθεί από ένα μόνο μονοπάτι σηματοδότησης. TGF-β, Wnt, Notch, Sonic Hedgehog, EGF και μονοπάτια FGF έχουν αποδειχθεί ότι είναι σημαντικό για διέπουν αυτές τις μεταβάσεις στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου [2,3,6,7]. Πιο πρόσφατα, επιγενετικές τροποποιήσεις όπως μεθυλίωση /απομεθυλίωση έχει επίσης αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην ΕΜΤ [8,9,10]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί σηματοδότησης που επάγει και να διατηρήσει αυτή την μεσεγχυματικά /SC κατάσταση παραμένει ακόμα ασαφής.

Elf5 είναι μέλος του επιθηλίου συγκεκριμένη υποομάδα της μεγάλης E-είκοσι έξι οικογένειας παράγοντα (ETS) της μεταγραφής. Έχει αποδειχθεί ως βασικό μεταγραφικό καθοριστικό παράγοντα της γράμμωσης καρκίνου του μαστού με την καταστολή ευαισθησία οιστρογόνων σε αυλού κύτταρα και την ενίσχυση της βασικής χαρακτηριστικά στα βασικά κύτταρα καρκίνου του μαστού [11]. Πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν Elf5 είναι όχι μόνο ως ρυθμιστής κλειδί κυτταρική γραμμή, αλλά επίσης και ως καταστολέας της ΕΜΤ με την καταστολή της μεταγραφής του Snail2 [12]. Επιπλέον, η γονιδιακή σίγηση Elf5 ενεργοποιείται με δυναμική υπερμεθυλίωση προαγωγού στις διαδικασίες της ανάπτυξης του ανθρώπινου πλακούντα και τον σχηματισμό εμβρυϊκών κυττάρων γενεαλογία [13,14]. Ωστόσο, οι ρόλοι των Elf5 στον καρκίνο ουροφόρων (UC) την ανάπτυξη και την εξέλιξη παραμένουν απροσδιόριστες.

ουροδόχου κύστης UC είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο, με περίπου 386.000 νέες περιπτώσεις το 2008 και εκτιμάται ότι 150.000 θάνατοι [15]. Κατά την πρώτη διάγνωση του UC, σχεδόν το 80% των ασθενών παρουσιάζουν μη-μυϊκή διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC), ενώ τα υπόλοιπα με μυϊκή διεισδυτικές νόσους [16,17]. Από αυτούς τους ασθενείς με NMIBC, το 50% -70% θα έχουν τουλάχιστον ένα υποτροπή σε 5 χρόνια, και περισσότερο από το 20% θα παρουσιάζουν μυ διείσδυση [18] και να προκαλέσει ποσοστό θνησιμότητας μέχρι 50% εντός 2 ετών από τη διάγνωση [19] . Το ζήτημα που σχετίζεται με UC είναι εξαιρετικά απρόβλεπτη δυναμικό τους για την επανεμφάνιση και την εξέλιξη. Ως εκ τούτου, θελήσαμε να καθοριστεί αν επιγενετικές αδρανοποίηση των Elf5 συνδέεται με UC εξέλιξη και στις αρχές της επανάληψης

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση δεοντολογίας, των ασθενών και δείγματα

Cohort 1.:

Ένα σύνολο 182 δειγμάτων κύστης UC παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη σταθερό ελήφθησαν μεταξύ των 275 συνεχόμενους ασθενείς μεταξύ 2004 και 2008 από τα τμήματα παθολογίας της Tianjin Institute of Urology (Πίνακας 1). 10 σύγχρονα σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη φυσιολογικό ουροθήλιο (NU) ελήφθησαν επίσης. Μεταξύ των αναλυθεί ασθενείς, 115 πρωτοβάθμια κύστεις UCS υποβλήθηκαν σε διουρηθρική εκτομή του όγκου της κύστης (TURBT) (

Cohort 1Α

) και οι παρέμειναν 67 ασθενείς υποβλήθηκαν σε ριζική κυστεκτομή (

κοόρτης 1B

). Κανένας από τους ασθενείς πρωτογενούς λάβει προεγχειρητική αντικαρκινική θεραπεία. πληροφοριών Συνέχεια λήφθηκε από τα ιατρικά αρχεία των ασθενών που πληρούσαν τα κριτήρια ένταξης της μελέτης. Εν συντομία, οι ασθενείς που παρουσιάζονται μετά την επέμβαση κάθε 3 μήνες για τα πρώτα 2 χρόνια μετά τη θεραπεία και καθ ‘εξάμηνον στη συνέχεια. Υποτροπή ορίστηκε ως νέα όγκου που παρατηρείται στην κύστη μετά TURBT. Επιβίωσης χωρίς υποτροπή (RFS) υπολογίστηκε ως ο χρόνος από TURBT από την ημερομηνία της υποτροπής. Συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης (DSS) υπολογίστηκε ως ο χρόνος από ριζική κυστεκτομή με την ημερομηνία θανάτου από UC. Η μέση παρακολούθηση ήταν 49,4 μήνες (εύρος 6-90) και 56,4 μήνες (εύρος 6-106) στο

Cohort 1Α

και

κοόρτης 1B

, αντίστοιχα.

Η

Cohort 2:

Μια σειρά από 10 NU και 50 ιστοί UC ελήφθησαν από την αναδρομική καταγραφή της Tianjin Institute of Urology. Αυτοί οι ιστοί φλας-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται στους -80 ° C μεταξύ 2010 και 2013. Δεν υπήρχε επιβεβαίωσε υποτροπής και θανάτου στη μελέτη.

Οι παθολογικές διαγνώσεις και την κλινική-παθολογική παράγοντες των δύο ομάδες ιδρύθηκαν με βάση τη γενική κατευθυντήρια γραμμή για πρωτοπαθή καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όπως ορίζεται από το ΤΝΜ ταξινόμηση 2002 και το 1973 το σύστημα ταξινόμησης του πΟΥ από έμπειρους παθολόγους. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Β ‘Νοσοκομείου Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των δειγμάτων από κάθε ασθενή που εγγράφονται ελήφθη αναλόγως. Όλα τα δείγματα ιστού και ιατρικά δεδομένα ρεκόρ ήταν ανώνυμα πριν από την πρόσβαση και την ανάλυση από τους ερευνητές.

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ουροδόχου κύστης UrotSa, RT112, ΗΤ1376, J82 και Τ24 ήταν αρχικά που λαμβάνεται από την ATCC. Η κυτταρική σειρά EJ ήταν ένα δώρο από τον Dr. Ruifa Han (Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα. Απέκτησε την κυτταρική γραμμή από την ATCC). UrotSa καλλιεργήθηκε σε DMEM (Gibco, Σαγκάη). ΗΤ1376 καλλιεργήθηκε σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο Eagle (ΕΜΕΜ, ATCC). Άλλες κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Shanghai). Όλα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Gibco, Μελβούρνη) και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. λοίμωξη Mycoplasma τακτικά δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας το TM PlasmoTest

(InvivoGen, San Diego, CA). Όταν είναι απαραίτητο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-ΑΖΑ, Invivogen) σύμφωνα με την προηγουμένως προσδιορισθείσα συγκέντρωση για 6 ημέρες επώασης [20,21].

εκχύλιση RNA και ποσοτική RT -PCR

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το GenElute (Sigma-Aldrich, Shanghai) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντιστραφεί η μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Σαγκάη). RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα BioRad iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories) PCR μηχάνημα (Applied Biosystem), χρησιμοποιώντας SYBR Green Master Mix. Τα σύνολα εκκινητών γονιδίου-ειδικό χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 0.2μΜ και οι αλληλουχίες τους παρατίθενται στον Πίνακα S1. Κάθε δείγμα τρέχει και αναλύθηκε εις τριπλούν.

όξινο θειώδες τροποποίηση και MSP

Γονιδιωματικό DNA λήφθηκε από τα δείγματα ιστού με τη χρήση DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το εκχυλισμένο DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες για να μετατρέψει μη μεθυλιωμένη κυτοσίνες σε ουρακίλες πριν μεθυλίωσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-ειδική (MSP) χρησιμοποιώντας EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τροποποιημένου DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές MSP (S1 πίνακα), το οποίο αναγνωρίζεται ειδικά είτε την μη μεθυλιωμένη (μέγεθος προϊόντος 258 bp) ή μεθυλιώνονται (258 bp) αλληλουχία υποκινητή Elf5 μετά όξινου θειώδους μετατροπή. Κανονική DNA από ανθρώπινα vermiformis προσάρτημα υποβλήθηκε σε επεξεργασία in vitro με SSSI μεθυλοτρανσφεράσης (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ) για να δημιουργήσει ένα θετικό έλεγχο για μεθυλιωμένα αλλήλια [22].

IHC χρώση

παραφινώδη ενσωματωμένα τμήματα (4 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν και ενυδατώθηκαν σε ξυλόλιο ακολουθούμενη από βαθμονομημένων αλκοολών σε νερό. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε 0,01 Μ κιτρικό για δύο φορές 10 λεπτά σε ένα φούρνο μικροκυμάτων που ακολουθείται από μια 60-λεπτη κρυώσει. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με διάφορα πρωτογενή αντισώματα ακολουθούμενη από Envision-plus σημασμένο πολυμερές συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανιού και χρώση παρακολούθηση DAB (χρυσός γέφυρα Τζόνγκσαν, Πεκίνο). Στη συνέχεια, διαφάνειες Ακολούθησε χρώση και αφυδατωμένα για την προβολή και την απεικόνιση. Αντισώματα ήταν:. Αντι-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-Ε-καδερίνης (Abcam, Cambridge, ΜΑ), αντι-Ν-καντερίνης (Abcam), αντι-βιμεντίνης (Abcam)

Η βαθμολόγηση των IHC χρώση

βαθμολογίας Elf5: Το σύνολο του τμήματος αξιολογήθηκε από δύο αντίστοιχους παρατηρητές να αγνοούν τα κλινικά δεδομένα. Τα καρκινικά κύτταρα προσδιορίστηκαν θετικά όταν ένα ευδιάκριτο κηλίδωση ανιχνεύθηκε στον πυρήνα. NU ιστοί συμπεριλήφθηκαν να είναι ως εσωτερικοί έλεγχοι. Ποσοστό χρώση θετικού κυττάρου βαθμολογήθηκε ως 1% έως 100% με διάστημα 5%. Υπολογίζονται ποσοστά ήταν στρογγυλοποιείται στο πλησιέστερο γρανάζια. Η τιμή αποκοπής του 10% καθορίστηκε αυθαίρετα, και ορίστηκαν σύμφωνα με την τιμή αυτή, δύο ομάδες (χαμηλής και υψηλής χρώση Elf5)

βιμεντίνης και βαθμολογία E-cadherin:. Επιλέχθηκαν πέντε τυχαία πεδία χαμηλής μεγέθυνσης , τότε η αναλογία των θετικών περιοχής προσδιορίστηκε με πρόγραμμα ImageJ. Cut-off τιμές προσδιορίστηκαν από τη διάμεση τιμή, σύμφωνα με το οποίο, δύο ομάδες (χαμηλή και υψηλή έκφραση) έχουν εκχωρηθεί.

Μοριακή κλωνοποίηση και ιογενή λοίμωξη

Τα πλασμίδια pLEX (Open Biosystems) περιέχει συμπληρωματικές ΟΝΑ για GFP έλεγχο και Elf5 παρήχθησαν με συνήθεις τεχνικές μοριακής κλωνοποίησης. Το ΗΑ-tagged WT Elf5 cDNAs υποκλωνοποιήθηκε από τον φορέα pCMV-HA να πλασμιδίων pLEX χρησιμοποιώντας BamH1-Not1 ένζυμα περιορισμού. Lentivirus παραγωγή διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Ιικά μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη.

siRNA knockdown

Για knockdown πειράματα, siRNA που στοχεύει το γονίδιο Elf5 (5′-AGCCCTGAGATACTACTATAA-3 ‘, αριθμός καταλόγου GS2001) και siRNA αρνητικού ελέγχου αγοράστηκαν από την Qiagen. Στη συνέχεια, επιμολύνσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

ανοσοαποτύπωσης

Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται με RIPA ρυθμιστικό λύσης. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 10% Bis-Tris Gel, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, ανιχνεύθηκαν με HRP-συνδεδεμένη δευτερογενή αντισώματα (GE Healthcare), και οπτικοποιήθηκε με αντιδραστήριο ECL (Thermo Scientific). Αντισώματα ήταν: αντι-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-Ε-καδερίνης (Abcam, Cambridge, ΜΑ), αντι-Ν-καντερίνης (Abcam), αντι-βιμεντίνης (Abcam), αντι-σαλιγκάρι ( Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), αντι-ZEB1 (Abcam).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Ενδείκνυται κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε μια πυκνότητα 5.000 ανά φρεάτιο σε μέσο που περιέχει 10% FBS. Στο υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο, το μέσο απομακρύνθηκε και χωρίς ορό μέσο που περιέχει 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζόλιο προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε (ΜΤΤ? Sigma? 0,5 ​​mg /mL) Λοιπόν. Τέσσερις ώρες μετά την επώαση στους 37 ° C, κυτταρική φορμαζάνης προϊόντα διαλύθηκαν με όξινα ισοπροπανόλη, και η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με φασματοφωτομετρία (Beckman Du640B). Έξι αναπαράγουν φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε δείγμα σε κάθε χρονικό σημείο.

δοκιμασίες Μετανάστευση

Είκοσι πέντε χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν σε κυτταρική καλλιέργεια 24 φρεατίων ένθετα με πόρους 8 mm (BD Falcon). Μετά από 24-48 ώρες, τα κύτταρα επί της άνω επιφανείας των φίλτρων αφαιρέθηκαν με ένα βαμβάκι. Για απεικόνιση, τα κύτταρα στις κάτω επιφάνειες φίλτρο σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με μπλε τολουϊδίνης. Ολόκληρα πεδία των φίλτρων μετρήθηκαν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μετανάστευσαν κυττάρων ανά πεδίο

Σφαίρα δοκιμασία

Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως με τροποποιήσεις [24]:. 1000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλή πλάκες πρόσφυσης (Costar) εντός μέσου MEGM που περιέχει 10% αντικατάσταση ορού (νοκ-άουτ) συμπληρωμένο με 1 χ ΜΕΜ μη-απαραίτητο αμινοξύ (Gibco), 20 ng /ml EGF (R &? D Systems), 10 ng /ml bFGF (R &? D Systems ) και Β27 (Gibco).

Στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SE εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η μονόδρομη ANOVA και Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκαν για να αναλυθούν οι διαφορές μεταξύ των /μεταξύ των ομάδων, αντίστοιχα. SPSS (V.19, IBM, USA) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί σήμερα.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

έκφραση Elf5 mRNA είναι μειωμένη σε καρκίνο ουροφόρων ανθρώπινης κύστης

Σχετικά επίπεδα Elf5 στον ιστό του όγκου από 50 ασθενείς UC προσδιορίστηκαν με qRT-PCR που εκτείνονται σε 90 bp, κανονικοποιημένη από GAPDH, και συγκρίθηκαν με τη διάμεση τιμή των 10 φυσιολογικά δείγματα ελέγχου ιστού (Σχ. 1α). Σχετική έκφραση Elf5 σε φυσιολογικούς ιστούς ήταν μεταβλητή μέσα σε μία κλίμακα από 0,39 να 10.56-πλάσια του διάμεσου επίπεδα. δείγματα όγκου έδειξαν μια μείωση στα επίπεδα Elf5 μέσα σε μία κλίμακα από 0,03 έως 2.02 Σχέση τιμής απόδοσης φορές σε σύγκριση με τον ίδιο έλεγχο όπως φυσιολογικούς ιστούς, με ένα μέσο όρο 0,40 φορές χαμηλότερη έκφραση (Σχ. 1α). Για να προσδιορίσετε αν το επίπεδο Elf5 έδειξε κάποια σημαντική διαφορά μεταξύ των διαφόρων σταδίων του όγκου, η πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση Elf5 υπολογίστηκε. Ενδιάμεσο μείωση του Elf5 mRNA ανιχνεύθηκε σε NMIBC και χαμηλού κινδύνου UC, ενώ ιδιαίτερα σημαντική απώλεια της έκφρασης mRNA Elf5 παρατηρήθηκε σε επεμβατικές (pT2-4,

P

& lt?. 0.01, Σχήμα 1β) και υψηλού κινδύνου UC (υψηλής ποιότητας pTa, της ΚΑΚ και της εισβολής UC,

P

& lt?. 0.01, Σχήμα 1γ), σε σύγκριση με NMIBC και UC χαμηλού κινδύνου (χαμηλής ποιότητας pTA), αντίστοιχα. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, μειωμένος Elf5 έκφραση φαίνεται να είναι ένα σημαντικό γεγονός στην ανάπτυξη και την εξέλιξη UC.

α, η έκφραση mRNA Elf5 διερευνάται σε 50 UC και 10 δείγματα ιστού NU με πραγματικού χρόνου PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). β και γ, Χρηματοκιβώτιο οικόπεδα επιδεικνύουν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται Elf5 mRNA τόσο επεμβατική (pT2-4) και υψηλού κινδύνου UCS (Hg-r). Οριζόντιες γραμμές: ομαδοποιούνται διαμέσους. Κουτιά: 25-75% τεταρτημόρια. Κάθετες γραμμές: ελάχιστη και μέγιστη? NS: μη σημαντική, *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01. UC (Lw-r) χαμηλού κινδύνου: χαμηλής ποιότητας pTa? Hg-r UC: Υψηλής ποιότητας pTa, ΚΑΚ και επεμβατική UC. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι από δύο ή τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Elf5 πρωτεΐνη μειώνεται σε ουροθηλιακά Καρκίνος και συνδέονται με την εξέλιξη του όγκου

Στη συνέχεια, ανοσοϊστοχημεία αναλύσεις ανθρώπινα δείγματα NU και UC διεξήχθησαν να ελέγξει αν η έκφραση Elf5 μειώθηκε στο UC σε επίπεδο πρωτεΐνης. χρώση IHC ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας ποσοστό των θετικών χρώση πυρήνα. Σύμφωνα με τα στοιχεία του mRNA, βρήκαμε Elf5 πρωτεΐνης βάφονται στα περισσότερα φυσιολογικά ουροφόρων επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. 2α). Αντίθετα, η έκφραση Elf5 ήταν εμφανώς μειωμένη σε ιστούς UC (Σχ. 2β) και σχεδόν πλήρως χαθεί στο επεμβατικές όγκους (Σχ. 2c). Στη συνέχεια, η έκφραση Elf5 ποσοτικοποιήθηκε σύμφωνα με τα στάδια του όγκου. Έντονη χρώση Elf5 επιδείχθηκε σε δείγματα NU με μέση τιμή 34.10 ± 10.21 θετικούς ρυθμούς, ενώ μέτρια και αδύναμη χρώση Elf5 παρατηρήθηκαν σε pTa (19.36 ± 1.77,

P

& lt? 0,05) και επεμβατική UCS (11.03 ± 2.56,

P

& lt?. 0.01, Σχήμα 2d), αντίστοιχα. Αυτό πρότεινε ότι Elf5 σίγηση μπορεί να συμβάλει στην UC εισβολής. Αξιολογήσαμε περαιτέρω την προγνωστική αξία της Elf5 σε δύο κλινικές βάσεις δεδομένων (

Cohort 1Α και 1Β Cohort

) του UC από μονοπαραγοντική ανάλυση Kaplan-Meier. Cohort 1Α αποτελείται από ασθενή με NMIBC, οι οποίοι έλαβαν θεραπεία TURBT. Οι ασθενείς από την ομάδα αυτή είναι σπάνια αντιμέτωποι με το θάνατο, αλλά πάντα υποτροπή της νόσου, οπότε η RFS χρησιμοποιήθηκε. Βρήκαμε ότι οι ασθενείς με υψηλή Elf5 έκφραση τείνουν να έχουν καλύτερη RFS (HR = 0,34,

P

= 0.001, Σχ. 2e). Σε αντίθεση, οι ασθενείς από την ομάδα 1Β τείνουν να είναι αντιμέτωποι με το θάνατο, έτσι επιλέχτηκε το DSS. Αποτέλεσμα αποκάλυψε επίσης σημαντική τάση προς ευνοϊκή πρόγνωση για Elf5-υψηλής ασθενείς (HR = 0,49,

P

= 0.04, Σχήμα 2στ.). Σε addtion, αποτελέσματα με βάση cut-offs του 5% και 15% διεξήχθησαν επίσης (S1 Εικ.). Οι ίδιες τάσεις με παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν, αν και ένας μη-σημαντικά υψηλότερη DSS ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με έκφραση Elf5 περισσότερο από 15%. Συνολικά, τα κλινικά δεδομένα μας υποστηρίζουν την υποτιθέμενη ρόλο που Elf5 μπορεί να λειτουργήσει για να αντιταχθεί εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

α, Εκπρόσωπος ισχυρή χρώση Elf5 IHC στα επιθηλιακά κύτταρα του NU (85%). Κλίμακα μπαρ, 100mm. β, Εκπρόσωπος μέτρια χρώση Elf5 σε μη επεμβατικές όγκους pTa (30%). γ, Εκπρόσωπος ασθενή χρώση σε επεμβατικές NU (& lt? 5%). d, Box διάγραμμα δείχνει χρώση Elf5 IHC σε NU (n = 10), ΡΤΑ-1 (n = 146) και επεμβατική UCS (n = 36). Οριζόντιες γραμμές: ομαδοποιούνται διαμέσους. Κουτιά: 25-75% τεταρτημόρια. Κάθετες γραμμές: ελάχιστη και μέγιστη? *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01. e, Kaplan-Meier καμπύλες επιβίωσης χωρίς υποτροπή (RFS) ανάλογα με το επίπεδο χρώσης Elf5 στην πρωτοβάθμια NMIBC αντιμετωπίζονται από TURBT. f, Kaplan-Meier καμπύλες της νόσου ειδικά επιβίωσης (DSS) ανάλογα με το επίπεδο χρώσης Elf5 σε ασθενείς UC μετά από ριζική κυστεκτομή.

Η

Elf5 νοκ ντάουν στα κύτταρα ΗΤ1376 επιθηλιακά-όπως επάγει EMT

Προηγούμενα στοιχεία έχει αποκαλύψει ένα μηχανισμό Elf5 αναστολής ΕΜΤ στον καρκίνο του μαστού [12]. Για να διερευνηθεί εάν Elf5 μπορεί επίσης ρυθμίζει EMT στο πλαίσιο της UC, ελέγξαμε Elf5 πρότυπα έκφρασης σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών ουροθηλιακό. Σημαντικά χαμηλό επίπεδο Elf5 παρατηρήθηκε σε κυτταρικές σειρές που χαρακτηρίζονται από τους δείκτες μεσεγχυματικών (EJ και Τ24), μεσεγχυματικά κύτταρα που μοιάζουν, υποδηλώνοντας μια πιθανή ανασταλτική ρόλο της Elf5 σε ΕΜΤ (Εικ. 3α). Σε επιθηλιακά-όπως UrotSa, RT112 και τα κύτταρα ΗΤ1376 (προσδιορίζονται από την υψηλή έκφραση των επιθηλιακών δεικτών), υψηλό επίπεδο έκφρασης Elf5 καταδείχθηκε (Σχ. 3α). Για να ελέγξετε την πιθανή σχέση μεταξύ Elf5 και EMT, σύντομης παρεμβολής RNAs (siRNAs) χρησιμοποιήθηκαν για να χτυπήσει κάτω Elf5 στα κύτταρα ΗΤ1376 επιθηλιακά-όπως. Σε αντίθεση με τις επιθηλιακά νησί σχηματισμού, γονικά κύτταρα, τα κύτταρα siRNA επεξεργασμένα αποτελείτο από εμπρός προς τα πίσω πολωμένο, απλά κύτταρα (Σχ. 3β). Παρόμοια με προηγουμένως αναφερθείσες ΕΜΤ κυττάρων [6,12], κύτταρα siRNA κατεργασμένα εκφράζεται μείωση Ε-καδερίνης και αύξηση της Ν-καδερίνης, βιμεντίνη καθώς και ΕΜΤ-προώθηση παραγόντων μεταγραφής (π.χ.. Σαλιγκάρι και ZEB1) (Σχ. 3γ) .

α, οι Elf5 και EMT δείκτες ανιχνεύονται με ανάλυση κηλίδος Western σε ουροθηλιακό κυτταρικές σειρές. β, Bright-φάσης μικροσκόπιο: κύτταρα Τ24 μεταγωγή με κύτταρα φορέα ή ΗΑ-Elf5 και ΗΤ1376 αντιμετωπίζεται με έλεγχο ή Elf5 siRNA. c, αναλύσεις Western blot Elf5 και EMT σημειωτές σε κύτταρα Τ24 κύτταρα σε μεταγωγή με τον φορέα ή ΗΑ-Elf5 και ΗΤ1376 σε επεξεργασία με έλεγχο ή Elf5 siRNA. δ και ε, δοκιμασία Σφαίρα (n = 6) και δοκιμασία Μετανάστευση (n = 3): φωτεινή φάση εικόνες μικροσκοπίας και ποσοτικοποίηση της γονικής Τ24, Τ24-φορέα, Τ24-Elf5, και γονικής ΗΤ1376, καθώς και τον έλεγχο και την Elf5-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ1376. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM, **

P

& lt? 0.01.f και g, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM. Έξι φρεάτια επαναληπτικές έγιναν για κάθε δείγμα σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Η σφαίρα δοκιμασία μετρά ανεξάρτητη από προσκόλληση πολλαπλασιασμό σε κλωνική πυκνότητα in vitro έχει συσχετιστεί με την παρουσία του επιθηλίου-μεσεγχύματος κατάσταση [6]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε τις δυνατότητες σχηματισμού σφαίρας των κυττάρων ΗΤ1376 να μετρήσει την ιδιότητά τους ως EMT. Σε σχέση με τα κύτταρα γονικού και ελέγχου siRNA (siRNA Ctrl), σίγηση του Elf5 ήταν 3-φορές εμπλουτισμένα σε κύτταρα σχηματισμού σφαίρας (Σχ. 3d). Για να δοκιμάσετε ένα άλλο λειτουργικό χαρακτηριστικό του κράτους μεσεγχυματικών, πραγματοποιήσαμε in vitro επεμβατικές δοκιμασίες. Elf5-knockdown κύτταρα ήταν πιο επεμβατική (18-φορές σε σύγκριση με τη γονική και τον έλεγχο των κυττάρων, το Σχ. 3e). Περαιτέρω, δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας με ΜΤΤ επιβεβαίωσαν ότι η επίδραση του Elf5 σιωπή στην ικανότητα σχηματισμού σφαίρας και ικανότητα εισβολής δεν είναι συνέπεια της αύξησης του αριθμού των κυττάρων (Σχ. 3f και 3g). Μαζί, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι Elf5 είναι ένας αναστολέας της EMT σε κύτταρα UC.

Elf5 προωθεί ΚΟΑ στο T24 μεσεγχυματικών κυττάρων που μοιάζουν με

Εν τω μεταξύ, η σχέση μεταξύ Elf5 και EMT επιβεβαιώθηκε με σταθερή υπερέκφραση του Elf5 σε κύτταρα Τ24 μεσεγχυματικά-όπως, τα οποία δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα ενδογενή Elf5 (Σχ. 3α). Βρήκαμε Elf5 υπερέκφραση αυξημένη αποτελεσματικά το σχηματισμό των επιθηλιακών νησιού στα κύτταρα Τ24 (Σχ. 3β). Επιπλέον, η υπερέκφραση Elf5 μείωσε το επίπεδο έκφρασης αρκετών δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων, όπως Ν-καδερίνης και βιμεντίνη, και αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης (Εικ. 3c). Επιπλέον, η μειωμένη ΕΜΤ σχετίζονται παράγοντες μεταγραφής επίσης ανιχνεύθηκαν σε Elf5-υπερεκφράζεται κύτταρα Τ24 (Σχ. 3c). Λειτουργικά, 5-πλάσια ικανότητες σχηματισμού σφαίρας και 4-φορές διεισδυτικότητα μειώθηκαν μετά από σταθερή εκτελεστεί-έκφραση της Elf5 σε κύτταρα Τ24 συγκρίνουν με κενό πλασμίδιο ομάδα (Σχ. 3δ και 3ε). Elf5 επαγόμενη ΜΕΤ επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε κύτταρα PC3, ένα μεσεγχυματικό-όπως ο καρκίνος του προστάτη κυτταρική γραμμή με ισχυρή διεισδυτικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι Elf5 είναι ένας εφαρμοστής της ΚΟΑ στα κύτταρα UC.

Elf5 συνδέεται με E-cadherin και την έκφραση βιμεντίνης στον ανθρώπινο UC

Για να επιβεβαιώσετε την in vitro κρίνοντας ότι η Elf5 είναι ένας αναστολέας της EMT και εφαρμοστής της ΚΟΑ στα κύτταρα UC, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης των Elf5, E-cadherin και βιμεντίνης από την IHC στο

Cohort 1

δείγματα ασθενούς (Εικ. 4α). Χαμηλή έκφραση του Elf5 (π.χ., περίπτωση 2) ​​ανιχνεύεται σε 56,6% (103 από 182) των δειγμάτων και σημαντική συσχέτιση με χαμηλή έκφραση Ε-καδερίνης (

P

& lt? 0,05) και έκφραση υψηλής βιμεντίνης (

P

& lt? 0.05, Σχήμα 4β).. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η Elf5 είναι αντιστρόφως συνδέονται με φαινότυπο μεσεγχυματικά σε ασθενείς με UC.

Α και Β, IHC χρώση E-cadherin και βιμεντίνης σε αντιπροσωπευτικές περιπτώσεις με υψηλό (περίπτωση 1) και η χαμηλή δείγμα Elf5 έκφραση ( περίπτωση 2). Κλίμακα μπαρ, 100mm. β, η ανάλυση συσχέτισης των Elf5 και EMT Σημάδια E-cadherin /βιμεντίνη.

Η

υπερμεθυλίωση προαγωγού Elf5 συσχετίζεται αντίστροφα με την έκφραση Elf5 mRNA σε ανθρώπινο UC

Μετά την έκφραση απώλεια Elf5 στην ανθρώπινη UC ιστούς αναγνωρίζεται, έχουμε ακόμη να πάει για την αναζήτηση των πιθανών λόγων. Πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι πλακούντα Elf5 έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω με κύησης αύξηση της ηλικίας, και επιγενετική ρύθμιση αποδείχθηκε να είναι ως «φύλακα» [13]. Στη συνέχεια ελέγχονται αν η κατάσταση δραστηριότητα των Elf5 στην ανθρώπινη UC επίσης επιγενετικώς ελέγχεται από μεθυλίωσης του DNA του. Πρώτον, σχεδιάσαμε εκκινητές για MSP χρησιμοποιώντας MethPrimer [25]. MSP για αλληλουχία του υποκινητή Elf5 μεταξύ -1000 bp και τη θέση έναρξης μεταγραφής έδειξε μόνο ένα μεθυλίωσης σε 10 δείγματα NU (1/10, Σχ. 5α). Στη συνέχεια, αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή Elf5 σε δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης (

κοόρτης 2

, n = 50) (Σχ. 5α), και βρήκε μια συχνότητα μεθυλίωση του 72% (36/50). Για να προσδιορίσετε αν η μεθυλίωση Elf5 υποστηρικτής συμβάλλει στην απώλεια έκφρασης Elf5 στο UC, που συσχετίζονται επίπεδο μεθυλίωσης και της έκφρασης mRNA σε ασθενείς από

Cohort 2

. Όπως στο Σχ. 1α, 10 NU ιστούς χρησίμευσε ως έλεγχος και μεσαίο ρυθμό έκφρασή τους ορίστηκε σε απόλυτη τιμή 1,0. Σε σύγκριση με αυτούς τους ιστούς NU, μη μεθυλιωμένα UC έδειξαν μια σχεδόν ίση Elf5 έκφρασης χωρίς να λαμβάνεται υπόψη το στάδιο του όγκου ή ποιότητας (διάμεσος: 0.80,

P

= 0.08, Σχήμα 5β.). Σε αντίθεση, μετουσιωμένο ιστούς όγκων έδειξε μια σημαντική απώλεια της έκφρασης Elf5 mRNA (διάμεσος: 0.33,

P

& lt? 0.01, Σχήμα 5β.). Αυτή η συσχέτιση μεταξύ της απώλειας της έκφρασης Elf5 mRNA και μεθυλίωση υποστηρικτής Elf5 προτείνει παρεκκλίνουσα Elf5 μεθυλίωση φαίνεται να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για τη γονιδιακή σίγηση Elf5 στο UC.

α, τα αποτελέσματα Εκπρόσωπος MSP της μεθυλίωσης υποκινητή Elf5 σε NU, PTA και επεμβατική δείγματα UC ιστών, καθώς και σε θετικούς και αρνητικούς ελέγχους. U και Μ αντιπροσωπεύουν μη μεθυλιωμένου και μεθυλιωμένου DNA. Διθειώδους-μετατρέπονται μη μεθυλιωμένα γονιδιωματική, polymethylated γονιδιωματικό DNA και μη-πρότυπο χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες. β, έκφραση Elf5 mRNA με πραγματικού χρόνου PCR διερευνάται σύμφωνα με Elf5 κατάσταση μεθυλίωσης προαγωγό σε 10 NU και 50 δείγματα ιστού UC. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. γ, Χρηματοκιβώτιο διάγραμμα δείχνει την απώλεια της έκφρασης Elf5 mRNA σε ασθενείς με μετουσιωμένο υποκινητή Elf5. Οριζόντιες γραμμές: ομαδοποιούνται διαμέσους. Κουτιά: 25-75% τεταρτημόρια. Κάθετες γραμμές: ελάχιστο και το μέγιστο. **

P

& lt? 0.01.

Η

Στόχευση μεθυλίωση υποστηρικτής οδηγεί στην έκφραση Elf5 σε κυτταρικές σειρές UC

Ανάδοχος μεθυλίωση κράτη σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MSP. Τα μεσεγχυματικά-όπως κυτταρικές σειρές UC T24 και EJ αποκάλυψε υπερμεθυλίωση σε περιοχές υποκινητών τους, ενώ υπομεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε χαμηλό-επεμβατική κύτταρα ΗΤ1376 (Εικ. 6α). Μετρήσαμε το επίπεδο της έκφρασης mRNA χρησιμοποιώντας Elf5 δοκιμασία RT-PCR. Κάτι τέτοιο αποκάλυψε υψηλότερες εκφράσεις Elf5 mRNA σε μεθυλιωμένος κυτταρικές σειρές (Σχ. 6β). Για να επιβεβαιωθεί η σχέση μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης υποκινητή και την έκφραση Elf5, αντιμετωπίσαμε αυτές τις κυτταρικές σειρές UC ΗΤ1376, J82, EJ και Τ24 με 5 μΜ απομεθυλιωτικής παράγοντα 5-ΑΖΑ. έκφραση Elf5 mRNA ήταν σημαντικά αποκαταστάθηκε μετά από αγωγή 5-ΑΖΑ εκτός του ότι ήταν σε υπο-μεθυλιωμένα ΗΤ1376 (Εικ. 6β). Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης Elf5 επίσης αντιστρέφεται με απομεθυλίωση σε κυτταρικές σειρές T24 και EJ (Εικ. 6c και 6d).

α, τα αποτελέσματα Αντιπροσωπευτικά MSP που απεικονίζει την κατάσταση μεθυλίωσης Elf5 υποκινητή του ουροθηλιακό κυτταρικές σειρές. β, ανάλυση Ποσοτική RT-PCR η έκφραση του mRNA σε Elf5 γονικές κυτταρικές σειρές UC και 5-ΑΖΑ-αγωγή ΗΤ1376, J82, EJ και Τ24. NS: μη σημαντική, *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01. c και d, αναλύσεις Western blot δεικτών Elf5 και EMT σε EJ και κυττάρων Τ24 σε επεξεργασία με ή χωρίς 5-ΑΖΑ. e και f, δοκιμασία Μετανάστευση: ποσοτικοποίηση των Τ24 καθώς και EJ σε επεξεργασία με ή χωρίς 5-ΑΖΑ, n = 3. g και h, Σφαίρα δοκιμασία: ποσοτικοποίηση, η = 6. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM, **

P

& lt? 0.01.

Η

Για να προσδιορίσετε αν το πρόσφατα εξέφρασε την πρωτεΐνη Elf5 είναι λειτουργική, κατασκευαστές EMT και EMT που σχετίζονται με παράγοντες μεταγραφής αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση καθώς και δοκιμασίες εισβολή και σχηματισμό σφαίρας. Βρήκαμε επιθηλιακών κυττάρων δείκτη αυξήθηκε και μεσεγχυματικών κυττάρων δεικτών μειώθηκε μετά από αγωγή 5-ΑΖΑ σε δύο μεσεγχυματικά-όπως κυτταρικές σειρές UC (Εικ. 6c και 6d). Μετά από 6 ημέρες προεπεξεργασίας, 5-ΑΖΑ μειωθεί 2,4 φορές και 2,7-φορές διεισδυτικότητα σε κύτταρα Τ24 και EJ, αντίστοιχα (Εικ. 6e και 6f). Για τον σχηματισμό σφαίρας, 5-ΑΖΑ εισαχθεί αντίστοιχα 3,2-φορές και 4,7-φορές μείωση σε κύτταρα Τ24 και EJ (Εικ. 6 g και 6Η). Είναι λογικό να συμπεράνουμε ότι η υπερμεθυλίωση προαγωγού συμβάλλει στην απώλεια της έκφρασης Elf5 σε κυτταρικές σειρές UC.

Συζήτηση

Τρεις σημαντικές παρατηρήσεις παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Κατ ‘αρχάς, Elf5 είναι ένας προγνωστικός παράγοντας σε ασθενείς με UC. Δείξαμε ότι η έκφραση Elf5 σχετίστηκε αρνητικά με το βαθμό του όγκου και το στάδιο. Η πρώιμη υποτροπή και συγκεκριμένες νόσους θάνατος παρατηρήθηκαν επίσης σε ασθενείς με χαμηλή έκφραση του Elf5.

In vitro

, χαμηλή Elf5 έκφραση συνδέεται με υψηλά διεισδυτικότητα, το οποίο μπορεί να μειωθεί αποτελεσματικά από την υπερβολική έκφραση Elf5 επίτηδες. Δεύτερον, τα αποτελέσματα από την IHC χρώση των δειγμάτων UC αποκάλυψε μια αρνητική σχέση μεταξύ του μεταγραφικού παράγοντα Elf5 και EMT, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της κυτταρικής χαρακτηριστικά που συνδέονται με την υψηλής ποιότητας, εισβολής και της επανάληψης. Επιπλέον, η παρατήρηση αυτή καταδείχθηκε σε κυτταρικές σειρές με τεχνητή ρύθμιση της έκφρασης Elf5. Τρίτον, το γονίδιο Elf5 είναι υπερμεθυλιωμένο σε καρκινικά κύτταρα, έτσι ώστε επέκταση του διαμερίσματος μεσεγχυματικών και την επακόλουθη SCs επάγεται και να στηρίζεται.

Σε αντίθεση με το ποντίκι, το ανθρώπινο γονίδιο Elf5 φιλοξενεί τέσσερα είδη μεταγραφής παραλλαγών με δύο εναλλακτικές έναρξης μεταγραφής sites, μια που προσδιορίζει με ορθόλογα θέση έναρξης του γονιδίου ποντικού και δημιουργεί την ισομορφή Elf5-2b, ενώ το άλλο που καλύπτεται στο ιντρόνιο του Elf5-2b παράγει μια μεγαλύτερη παραλλαγή Elf5-2a. Μια άλλη παραλλαγή απομαγνητοφώνηση συγκολλημένα ισομορφή του Elf5-2b με το ETS συναίνεση μοτίβο διατήρησε στερούνται των κωδικοποίησης εξώνια 3 και 4 (SAM /Αιχμηρά τομέα), μια εκτεταμένη περιοχή στη σηματοδότηση και πυρηνικών πρωτεϊνών [13]. Σε πρόσφατη μελέτη, η παραλλαγή Elf5-2b διακρίθηκε ως μια σημαντική μορφή Elf5 εκφράζεται σε ανθρώπινα, έτσι ώστε αυτή η ισομορφή επιλέχθηκε στη μελέτη μας, καθώς και σε ένα άλλο χαρτί, στην οποία Elf5 αποδείχθηκε ότι είναι ένας αναστολέας της ΕΜΤ στον καρκίνο του μαστού [12].

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής Elf5 είναι ένα φύλακα καταγωγή μεταξύ των εμβρυϊκών και τροφοβλάστη διαμερίσματα καταγωγή, καθώς και μεταξύ των βασικών και αυλού των επιθηλιακών κυττάρων [14,26]. Εδώ, δείχνουμε ότι λειτουργεί μεθυλίωσης του DNA ως φραγμός του ΕΜΤ σε κύτταρα UC. Ο υποκινητής Elf5 είναι πλούσια σε CpG, αλλά δεν πληρούν τα κριτήρια του νησιού CpG (https://cpgislands.usc.edu). Λεπτομερής χαρακτηρισμός του προφίλ μεθυλίωσης υποκινητή Elf5 με ανάλυση όξινου θειώδους αλληλούχιση απεκάλυψε ότι η συντριπτική πλειοψηφία των υπολειμμάτων CpG στην περιοχή ανάντη 1-kb μεθυλιώθηκαν σε κύτταρα με απώλεια της έκφρασης Elf5 [14,26]. Έτσι, εκκινητές απαιτητικούς αλληλουχία εντός αυτής της περιοχής σχεδιάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Σε επιπλέον ανάλυση των δεδομένων, βρήκαμε ότι η απώλεια της έκφρασης Elf5 δεν περιοριζόταν μόνο σε ασθενείς με υπερμεθυλίωση προαγωγού στην γονιδιακή Elf5. Είναι προφανές από τα δεδομένα ότι η μεθυλίωση προαγωγού δεν είναι ο μόνος καθοριστικός παράγοντας της έκφρασης Elf5 σε κύτταρα UC. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ορμόνη ως αποτελεσματικό ερεθίσματα που μπορεί να επάγει την έκφραση Elf5 σε αυλού των επιθηλιακών κυττάρων, αν και παραμένει να αποκαλυφθούν [27,28] μηχανισμοί που διέπουν αυτά τα αποτελέσματα. Επιπλέον, ορισμένοι μεταγραφικοί καταστολείς όπως υποδοχέα οιστρογόνου (ER) μπορεί να καταστείλει την έκφραση Elf5 απουσία μεθυλίωσης υποκινητή, επειδή βρήκαμε ότι Elf5 είναι δεσπόζει εκφράζεται σε ER αρνητικά αυλού των επιθηλιακών κυττάρων [29], και μια πιθανή θέση σύνδεσης DNA για ER έχει έχουν εντοπιστεί κοντά στο γονίδιο Elf5 [30].

Κλινικά, το ενοχλητικό πρόβλημα σε σχέση με NMIBC είναι το απρόβλεπτο της υποτροπής και εξέλιξης σε μυ διεισδυτικής νόσου, γι ‘αυτό είναι απαραίτητο να αναζητήσουμε αποτελεσματικές προγνωστικούς βιοδείκτες για τους ασθενείς σε υψηλού κινδύνου.