Αφηρημένο

Οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTK), σε απάντηση προς συνδετήρες παράγοντα ανάπτυξή τους, φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν κατάντη σήματα σημαντικό για την φυσιολογική ανάπτυξη και την παθολογική μετασχηματισμού. Αυξημένη έκφραση, η ενεργοποίηση μεταλλάξεων και συντήξεις αναδιάταξη των RTKs οδηγήσει σε καρκίνο, φλεγμονή, πόνο, νευροεκφυλιστικές ασθένειες, και άλλες διαταραχές. Η ενεργοποίηση ή υπερ-έκφραση του ALK, ROS1, TRK (Α, Β, και C), και RET σχετίζονται με ογκογόνο φαινοτύπους των αντίστοιχων ιστών τους, που τους καθιστά ελκυστικές θεραπευτικοί στόχοι. Μελέτες συστοιχία cDNA Cancer αποδεικνύεται υπερ-έκφραση του TRK-Α και ROS1 σε μία ποικιλία καρκίνων, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες κανονικές τους ελέγχους των ιστών τους. Συνθέσαμε μια βιβλιοθήκη μικρών μορίων τα οποία αναστέλλουν τις ανωτέρω αναφερθείσες RTKs με picomolar έως νανομοριακή δραστικότητα. Ο μόλυβδος μόριο GTx-186 ανέστειλε RTK-εξαρτώμενη καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη όγκου.

In vitro

και

in vivo

ανάπτυξη του TRK-Α-εξαρτώμενη IMR-32 κύτταρα νευροβλαστώματος και ROS1 υπερεκφράζουν ΝΙΗ3Τ3 κύτταρα ανεστάλησαν από GTx-186. GTx-186 επίσης ανέστειλε φλεγμονώδη σήματα που προκαλούνται από ΝΡκΒ, ΑΡ-1, και TRK-Α και ισχυρά μειωμένη ατοπική δερματίτιδα και ασκός αέρος φλεγμονή σε ποντίκια και αρουραίους. Επιπλέον, GTx-186 ανέστειλε αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση ALK και ALK ανάπτυξη που εξαρτάται από καρκινικό κύτταρο. Συλλογικά, ο αναστολέας RTK ΘΤχ-186 έχει ένα μοναδικό προφίλ κινάσης με δυνατότητες για τη θεραπεία του καρκίνου, της φλεγμονής και νευροπαθητικού πόνου

Παράθεση:. Narayanan R, Yepuru Μ, Coss CC, Wu Ζ, Bauler MN, Barrett CM , et al. (2013) Ανακάλυψη και Προκλινικά χαρακτηρισμός νέων μικρού μορίου TRK και Αναστολείς ROS1 τυροσίνης κινάσης για τη θεραπεία του καρκίνου και φλεγμονής. PLoS ONE 8 (12): e83380. doi: 10.1371 /journal.pone.0083380

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 2 Νοεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 26, Δεκ του 2013

Copyright: © 2013 Narayanan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. RN, ΜΟΥ, CCC, ZW, MB, CMB, MLM, YW, JK, LS, YH, DDM και JTD είναι υπάλληλοι της ΘΤχ και έχουν ΘΤχ προαίρεσης αγοράς μετοχών. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η κινάση της τυροσίνης του υποδοχέα (RTK) αποτελείται από 58 διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν πολλά κυτταρικές λειτουργίες που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [1]. Αυξημένη έκφραση, ενεργοποίηση μεταλλάξεων, αναδιατάξεις σύντηξη, ή συνενεργοποίησης αυτών πρωτο-ογκογονίδια προώθηση ογκογόνο μετασχηματισμό των αντίστοιχων ιστών τους [2], [3]. Λόγω λειτουργική σημασία τους, RTKs έχουν εξελιχθεί ως θεραπευτικοί στόχοι για την αγωγή του καρκίνου, φλεγμονής, πόνου, νευροεκφυλιστικές ασθένειες, και άλλοι [4]. προσπάθειες για την ανάπτυξη Discovery μικρού μορίου αναστολείς ή αντισώματα των RTKs έχουν εκθετικά αυξηθεί τα τελευταία 10-15 χρόνια. Από την ανακάλυψη της BCR-Abl αναδιάταξη και αναστολέα imatinib του, άλλους αναστολείς RTK, όπως crizotinib (αναστολέας ALK), afatinib (αναστολέας EGFR), και lenvatinib (αναστολέας VEGFR), έχουν αναπτυχθεί για ογκολογικές ενδείξεις [5] – [7 ].

τροπομυοσίνη σχετίζονται κινάσης (TRK) είναι μια οικογένεια τριών RTKs (TRK-α, TRK-Β, και TRK-C) που ρυθμίζει διάφορες οδούς σηματοδότησης που είναι σημαντικές για την επιβίωση και τη διαφοροποίηση των νευρώνων [8 ], [9]. Εκτός από την κρίσιμη λειτουργία τους σε νευρώνες, αυτοί και τους συνδέτες τους (νευρικό αυξητικό παράγοντα (NGF), τον εγκέφαλο αυξητικός παράγοντας (BDNF), νευροτροφίνες και, αντίστοιχα) είναι σημαντικά για μη νευρωνικών ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση. Αυξημένη έκφραση και ενεργοποίηση του TRK-Α παρατηρούνται σε νευροβλάστωμα, καρκίνο του μαστού, η ψωρίαση, και νευροπαθητικού πόνου, για να αναφέρουμε μερικά ασθενειών που προκύπτουν από TRK-δυσλειτουργία [10] – [12]. Αν και ογκογόνο συντήξεις TRK-Α δεν έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα, η υπερέκφραση του είναι επαρκής για να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των κυττάρων. Ενώ NGF αντισώματα είναι σε κλινικές δοκιμές για τον πόνο, K252a, η μόνη μικρό μόριο αναστολέα TRK-A στην κλινική, είναι επί του παρόντος υπό αξιολόγηση για τη θεραπεία της ψωρίασης [13], [14].

ROS1 είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο που ανήκει στο ίδιο φυλογενετικό κλάδο ως TRK-Α [15]. Σε αντίθεση με TRK-A, η ενεργοποίηση του ROS1 συμβαίνει συνήθως όταν συγχωνεύεται σε ογκογόνους συνεργάτες σύντηξης όπως συντήκονται σε γλοιοβλάστωμα (ΣΧ) και διαλυμένης ουσίας οικογένεια φορέας 34 στέλεχος 2 (SLC34A2) [2], [16]. ROS1 έχει αποδειχθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε γλοιοβλάστωμα, χολαγγειοκαρκίνωμα, καρκίνο του πνεύμονα, και άλλοι [17] – [19]. Αυξημένη έκφραση του ROS1 σε διάφορους καρκίνους έχει ωθήσει την ανάπτυξη των εκλεκτικών αναστολέων. Crizotinib, που αναπτύχθηκε για αλκ- θετικό καρκίνο του πνεύμονα, αναστέλλει επίσης ROS1 και είναι σε μία κλινική δοκιμή για ROS1- θετικό καρκίνο του πνεύμονα.

Η εκλεκτική πίεση που εφαρμόζεται από τη συνεχή RTK αποτελέσματα αναστολή στην εμφάνιση των διαφόρων κλωνικοί πληθυσμοί του καρκίνου κύτταρα με επίκτητη αντίσταση και συχνά επιτάχυνση της διάδοσης [20], [21]. μηχανισμών διαφυγής χρησιμοποιούνται από τα καρκινικά κύτταρα για να ξεπεραστεί η αναστολή RTK περιλαμβάνουν μεταλλάξεις, ογκογόνο σύντηξη, και η ενεργοποίηση των δευτερογενών κινασών και οδών σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη αναστολέων δεύτερης και τρίτης γενιάς RTK είναι επιτακτική ανάγκη για τη θεραπεία των ανθεκτικών φαινοτύπων που θα προκύψουν αναπόφευκτα από τη θεραπεία πρώτης γενιάς. Ανάπτυξη αναστολέων με διακριτά φαρμακοφόρους και μοναδική κινάσης ανασταλτική προφίλ θα παρέχουν τις απαραίτητες στρατηγικές εναλλακτική για να ξεπεράσει την αντίσταση.

Υπάρχουν μερικές μελέτες που δείχνουν ROS1 ή TRK-Α υπερέκφραση σε καρκίνους, αλλά μεμονωμένα ή σε συνδυασμό έκφραση ROS1 και TRK- Α σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων ήταν μέχρι τώρα κακώς χαρακτηρίζεται. Χρησιμοποιώντας 381 δείγματα cDNA από 22 καρκίνους, δείχνουμε υπερ-έκφραση του TRK-Α και ROS1 σε καρκίνους που δεν είχαν περιγραφεί προηγουμένως. TRK-Α υπερεκφράζεται σε 100% της φαιοχρωμοκύττωμα και την πλειονότητα των άλλων δειγμάτων καρκίνο αναλύθηκαν. ΘΤχ-186, ένα μυθιστόρημα αναστολέας RTK με μοναδικό κινάσης ανασταλτική προφίλ, αναστέλλει την οικογένεια TRK, ROS1, ALK, και RET κινάσες σε picomolar με χαμηλή νανομοριακή IC

50 τιμές. GTx-186 αναστέλλεται αποτελεσματικά καρκίνων οδηγείται από TRK-Α και η έκφραση ROS1 και ήταν επίσης εξαιρετικές στην αντιμετώπιση φλεγμονωδών νόσων όπως η δερματίτιδα.

In vitro

μελέτες έδειξαν ότι GTx-186 αναστέλλει επίσης νευροπαθητικό πόνο σηματοδότηση που διαμεσολαβείται από TRK-ένας συνδέτης, ο NGF, καθιστώντας GTx-186 ένα πολύτιμο εργαλείο για την οπλοστάσιο για την καταπολέμηση του καρκίνου, της φλεγμονής και του πόνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Όλα τα αντισώματα που αγοράζονται από τη Cell Signaling (Danvers, ΜΑ). αντιδραστήρια Realtime PCR και TaqMan εκκινητές και ανιχνευτές ελήφθησαν από την Life Technologies (Carlsbad, CA). Η κυτοκίνη αρουραίος array-2 λήφθηκε από Ray Biotech (Norcross, GA). Του καρκίνου σειρά cDNA έρευνα (CSRT 103) ήταν από ΟηΟεηε (Rockville, MD). Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη NGF 2.5 ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ) και δεξαμεθαζόνη ελήφθη από LKT Labs (St. Paul, ΜΝ). παράγοντα νέκρωσης όγκων α (TNF-α) και λιποπολυσακχαρίτη (LPS) προμηθεύτηκε από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). έλαιο Croton, καραγενάνη, και οξική μυριστική φορβόλη (ΡΜΑ) λήφθηκαν από Sigma (St. Louis, ΜΟ). Ινδομεθακίνη ήταν από την Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). TNF-α κιτ ELISA είχε αγοραστεί από την Thermo Scientific (Norcross, GA). GTx-186 (S-ισομερές) και crizotinib (ρακεμικό) συντέθηκαν με GTx χημικούς και χαρακτηρίστηκαν με πρότυπες αναλυτικές τεχνικές. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού.

Δοκιμασίας Κινάσης Δραστηριότητα

Ενώσεις προς δοκιμή διαλύθηκαν σε 100% DMSO σε μία κλίμακα συγκεντρώσεων από 10

-8 έως 10

-3 Μ, στη συνέχεια αραιώνεται με δοκιμασία κινάσης Ρυθμιστικό (50 mM HEPES, ρΗ 7.5, 1 mM EGTA, 10 mM MgCl

2, 0,01% Tween-20, και 2 mM DTT, προστίθεται φρέσκο) για να 4Χ την τελική συγκέντρωση. Η τελική καμπύλη περιλαμβάνονται 11 συγκεντρώσεις (10

-11 έως 10

-5 Μ). Οι συγκεντρώσεις κινάσης (Invitrogen) και ΑΤΡ (Sigma) που είναι αναγκαία για τη βέλτιστη δραστικότητα προσδιορίσθηκαν σε ξεχωριστά πειράματα (Πίνακας S1). Η συγκέντρωση της κινάσης που κατέληξαν σε μέγιστη δραστικότητα και η συγκέντρωση του ΑΤΡ η οποία έδειξε 50% της μέγιστης διέγερσης (ΕΚ

50) επιλέχθηκαν για πειράματα αναστολέα ενζύμου.

κινάσης δοκιμασίες διεξήχθησαν σε τελικό όγκο 10 μl σε πλάκες 384-φρεατίων, με 2,5 μΙ της ένωσης δοκιμής σε τριπλούν σε κάθε συγκέντρωση, 2.5 μΐ κινάσης, και 5 μΐ ΑΤΡ και υποστρώματος πεπτιδίου (LANCE®

Ultra

U

φως

™ πολυ-GT, PerkinElmer) μίγμα. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT), στο σκοτάδι, για 30-120 λεπτά. Μετά την επώαση, οι αντιδράσεις σταμάτησαν με την προσθήκη 40 mM EDTA σε ρυθμιστικό 1Χ LANCE® (PerkinElmer) (5 μΐ), και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. LANCE® Eu-W1024 αντι-φωσφοτυροσίνης αντίσωμα PT66 (5 μΐ) σε ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ LANCE® προστέθηκε στα φρεάτια σε τελική συγκέντρωση 1,25 ηΜ και επωάστηκε για 1 h σε RT. Η σχετική ποσότητα του φωσφορυλιωμένου υποστρώματος μετρήθηκε με VICTOR ™ Multilabel Plate Reader χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο LANCE ™ για ανάλυση χρόνου μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού. Η συγκέντρωση της ένωσης δοκιμής που απαιτείται για να μειωθεί το σήμα φθορισμού (665 nm) κατά 50% (

50 IC) αξία, προσδιορίστηκε με μη-γραμμική παλινδρόμηση με Sigma Plot® και το πρότυπο τεσσάρων παραμέτρων λογιστική καμπύλη.

Cell Culture

IMR-32 και ΝΙΗ3Τ3 ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται. Οι κυτταρικές σειρές που επικυρώνονται από τον πάροχο καλλιεργήθηκαν για λιγότερο από 6 μήνες μετά την ανάνηψη στο εργαστήριο. Για τα πειράματα γονιδιακής έκφρασης παράγοντα-επαγόμενης ανάπτυξης, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 10000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσο συμπληρωμένο με 1% FBS απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα (csFBS). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 1% csFBS για 3 ημέρες για να μειωθεί βασική μεταγραφή με μέσο άλλαξε την ημέρα 1 και πριν από την αγωγή την ημέρα 3. Κυττάρων επιμετάλλωσης και ανάπτυξη συνθήκες για όλες τις άλλες πειράματα είναι όπως περιγράφονται στις λεζάντες σχήμα.

Η γραμμή λεμφώματος U-937 (ATCC Manassas νΑ) και αναπλαστικό μεγάλες γραμμές κυττάρων λεμφώματος SUDHL-1 και Κ-299 (DSMZ, Braunschweig, Germany) διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 100 U /mL του πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. κύτταρα Kelly (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία) αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 και 10% FBS.

BaF

3 κύτταρα ελήφθησαν από DSMZ (Braunschweig, Γερμανία) και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10 % ορό εμβρύου μόσχου, 10 ng /μL ιντερλευκίνη-3 (R &? D Systems Minneapolis, ΜΝ) και 100 U /mL πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. BaF

3 σταθερές κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη, και διάλυμα θειικού /mL G418 500 μg (Mediatech).

Κλωνοποίηση και Stable κυτταρική Γραμμή Δημιουργία

Όλα τα κατασκευάσματα πλασμιδίου αλληλουχήθηκαν για να εξασφαλίσει την πιστότητα. FIG-ROS1 (S) [17], συντίθεται με Genscript (Piscataway, NJ), κλωνοποιήθηκε σε φορέα pCMV6 και στη συνέχεια υπο-κλωνοποιείται εντός Plenti U6 φορέα PGK-puro. Σταθερές κυτταρικές γραμμές ΝΙΗ3Τ3 παρήχθησαν με λεντοϊού μόλυνση Plenti U6 PGK-puro-FIG-ROS1 (S) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Η σύντηξη ΝΡΜ-ΑΙΚ ελήφθη από cDNA ενισχύθηκε από κύτταρα Κ299 και κλωνοποιήθηκε σε pCR3.1 (Life Technologies Carlsbad, CA) με EcoRI. EML-4ALK συντέθηκε με Genscript από αλληλουχία αναφοράς AB274722 που αντιπροσωπεύει το Ε13: Α20 σύντηξης και επίσης κλωνοποιήθηκε σε pCR3.1 με EcoRI. Εισάγετε τον προσανατολισμό και πιστότητα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του DNA.

Απομόνωση RNA και Gene Expression

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Κύτταρα-to-Ct και σε πραγματικό χρόνο PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές για την ΑΒΙ 7900 (Life Technologies). Πειράματα συστοιχία cDNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές για την PCR μηχανή ΑΒΙ 7900.

Western Blotting

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκε όπως περιγράφεται στις λεζάντες σχήμα. εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και τα εκχυλίσματα έτρεξαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE σε ένα πήκτωμα βαθμίδωσης 4-20% και ανοσοστυπώθηκαν για τις υποδεικνυόμενες πρωτεΐνες.

Δοκιμασία Ανάπτυξης και Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Τα προσκολλημένα κύτταρα ήταν επιστρώθηκαν στα 10,000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε αντίστοιχο θρεπτικό μέσο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται στα σχήματα και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση σουλφοροδαμίνης Β (SRB) αντιδραστήριο και η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 535 nm. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και αγωγή για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, και η διανομή σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

Μετανάστευση Δοκιμασία

δοκιμασία μετανάστευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κιτ δοκιμασίας μετανάστευσης πλατύπους (Fisher Scientific) . Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και τα ένθετα απομακρύνθηκαν 24 ώρες μετά την σπορά. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται στις εικόνες και απεικόνιση 12 ώρες μετά τη θεραπεία.

κυτοκίνης Array

συστοιχίες κυτοκίνης ελήφθησαν από Ray Biotech (Norcross, GA) και συστοιχίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, συστοιχίες επωάστηκαν όλη τη νύκτα με ίσο όγκο εκκριμάτων θύλακα αέρα, πλύθηκαν, και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα πριν από την ανάπτυξη χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια.

ρ ALK-Ποσοτικοποίηση

Κ-299 κύτταρα ELISA υποβλήθηκαν σε αγωγή με crizotinib ή ΘΤχ-186 για έξι ώρες. Τα κυτταρολύματα μετά απομονώθηκαν και η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κυττάρων ρυθμιστικού λύσης (Cell Signaling) που περιέχει Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Roche Diagnostics), PMSF (Sigma Aldrich), και Αναστολείς Φωσφατάσης Cocktail (Sigma Aldrich). ρ-ALK ELISAs (Cell Signaling Technology Beverly, ΜΑ) διεξήχθησαν επί κυτταρολύματα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 0,01 μg /μΙ πρωτεΐνης.

Πειράματα σε ζώα

Όλα τα ζωικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Τενεσί Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης. Ποντίκια και αρουραίοι που λαμβάνονται από την Harlan (Indianapolis, ΙΝ) στεγάσθηκαν με πέντε ή τρία ζώα ανά κλουβί, αντίστοιχα, και είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και εμπορικές τροφή τρωκτικών (Harlan Teklad 22/5 τρωκτικό δίαιτα – 8640). Κατά τη διάρκεια της μελέτης, τα ζώα διατηρήθηκαν σε ένα 12 ωρών φωτός: σκότους

Tumor Πειράματα ξενομοσχεύματος

Ξενομοσχεύματος πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].. Εν συντομία, ένα μίγμα από κύτταρα αιωρούνται σε 0,0375 mL RPMI + 10% FBS και 0,0625 mL Matrigel εγχύθηκαν υποδορίως σε οπίσθιο πλευρό αριστερά κάθε ποντικού. Μόλις ο όγκος του όγκου έφθασε 100-200 mm

3, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν και έλαβαν θεραπεία (GTx-186 διαλύθηκε σε 81% PEG-300 + 18% στείρο διπλά απιονισμένο νερό + 0,6% 12 Ν υδροχλωρικό οξύ? Crizotinib διαλύθηκε σε 10% DMSO + 90% PEG-300), όπως αναφέρεται στα σχήματα. Ο όγκος του όγκου και το σωματικό βάρος μετρήθηκαν όπως υποδεικνύεται στα σχήματα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο * πλάτος μήκος * πλάτος * 0,5236.

κροτονέλαιο προκαλούμενη δερματίτιδα

C57BL /6 ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή δύο φορές σε 16 ώρες και 2 ώρες πριν την εφαρμογή του ακετόνη ή κροτονελαίου (20 μΙ 10% κροτωνέλαιο σε ακετόνη σε κάθε εσωτερικό αυτί) [24]. Έξι ώρες μετά την εφαρμογή του κρότωνα πετρέλαιο, τα ζώα θανατώθηκαν, και τις διατρήσεις του αυτιού ζυγίστηκαν και αποθηκεύτηκαν σε RNA αργότερα για απομόνωση RNA.

Μοντέλο Air θήκη Φλεγμονή

αέρα εγχύθηκε στα πλευρά του Sprague Dawley αρουραίους τέσσερα ημέρες (20 mL) και δύο ημέρες (10 mL) πριν από την ένεση καρραγενάνης (1 ml 2% καρραγενάνης) στο σακκουλάκι [25]. Έξι ώρες μετά τη χορήγηση καρραγενάνης, τα ζώα θυσιάστηκαν, 5 mL φυσιολογικού ορού εγχύθηκε εντός του θύλακα, εκκρίματα θύλακα συλλέχθηκαν και ο αριθμός των λευκοκυττάρων και μακροφάγων διεισδύσει μέσα στο θύλακα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism.

Αποτελέσματα

TRK-Α και ROS1 πάνω-εκφράζεται σε πολλαπλές καρκίνοι

Απομονωμένα μελέτες έχουν εντοπίσει το υπερ-έκφραση, είτε TRK-Α ή ROS1 σε νευροβλάστωμα [26], ο καρκίνος του πνεύμονα [2], γλοιοβλάστωμα [16], και χολαγγειοκαρκίνωμα [17]. Δεδομένου ότι και οι δύο αυτές κινάσες είναι πρωτο-ογκογονίδια, εμείς εικάζουν ότι οι πληροφορίες για συνδυασμένη έκφραση θα μπορούσε να βοηθήσει να προβλέψουμε προσθετική ή συνεργιστική αύξηση του αντίστοιχου καρκίνου. Για να προσδιοριστεί η TRK-Α και πρότυπο έκφρασης ROS1, ιστός σάρωση συστοιχίες cDNA που περιέχει 381 δείγματα cDNA από 22 καρκίνους και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών χρησιμοποιήθηκαν (Εικόνα 1). Καρκίνοι του επινεφριδίου (7/10 δείγματα καρκίνου του εκφράζεται TRK-Α), του παγκρέατος (5/17 TRK-Α), ωοθήκη (7/20 TRK-Α), του οισοφάγου (9/20 TRK-Α και ROS1), ουροδόχου κύστης ( 6/22 TRK-Α), και το ενδομήτριο (9/17 ROS1) που εκφράζεται αυξημένα επίπεδα TRK-Α και /ή ROS1, σε σύγκριση με αντίστοιχες φυσιολογικά δείγματα. Είναι ενδιαφέρον ότι, το 100% της φαιοχρωμοκύττωμα, ένας νευρο-ενδοκρινή επινεφριδίων καρκίνου με συμπαθητικού νευρικού συστήματος καταγωγή, τα δείγματα υπερ-εκφράζεται TRK-Α μεταξύ 50-1000 φορές, σε σύγκριση με την κανονική επινεφριδίων ιστούς. Προηγούμενες εκθέσεις έχουν δείξει ότι το φαιοχρωμοκύττωμα κυτταρική γραμμή, PC12, εξέφρασε το υψηλότερο επίπεδο των TRK-Α μεταξύ των πολυάριθμων

in vitro

κυψελοειδή συστήματα που εξετάστηκαν, επιβεβαιώνοντας τα ευρήματα αυτά [27]. Δείγματα από καρκίνους της ουροδόχου κύστης (3 δείγματα) και του οισοφάγου (4 δείγματα) εκφράζεται τόσο TRK-Α και ROS1, η οποία θα μπορούσε δυνητικά να οδηγήσει σε προσθετική ή συνεργιστική πολλαπλασιασμού. Καρκίνοι του προστάτη, του μαστού και άλλοι απέτυχαν να εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα είτε των κινασών. Δεδομένου ότι αυτά τα αποτελέσματα είναι από ένα μικρό υποσύνολο των δειγμάτων, αυτά πρέπει να επικυρώνονται με επιπλέον δείγματα.

Η έκφραση του TRK-Α και ROS1 ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικό χρόνο PCR σε cDNA από 381 δείγματα από 22 διαφορετικές μορφές καρκίνου και αντίστοιχο κανονικό ιστούς. TRK-Α και η έκφραση ROS1 ομαλοποιήθηκαν με ακτίνη και εκπροσωπήθηκαν ως φορές διαφορά από την κανονική μη καρκινικά δείγματα με τη μέθοδο ddCt. Μέσος όρος των κανονικών δειγμάτων που λαμβάνονται για τον υπολογισμό ddCt. Ad.C-επινεφριδίων καρκίνο? Κανονική-cDNA από μη-καρκινικούς ιστούς. Οι αριθμοί κάτω από δείγματα δείχνουν φυσιολογικά δείγματα.

Η

In vitro χαρακτηρισμός της ΘΤχ-186

GTx186 είναι ένα ιμιδαζο [4,5-f] παράγωγο ισοϊνδολίου σχέση με προηγουμένως αποκαλυφθείσα μυθιστόρημα RTKI ΘΤχ -134 [28]. Για να αυξήσουν την ογκολογία, φλεγμονώδεις, και αλγαισθητική ρόλους των TRK-Α και ROS1 κινάσες τυροσίνης, χτίσαμε μια βιβλιοθήκη μικρών μορίων που αναστέλλει επιλεκτικά τις κινάσες στην φυλογενετικό κλάδο που περιέχει TRK-Α και ROS1. GTx-186 επιλεκτικά ανέστειλε TRK-Α, TRK-Β, TRK-C, ROS1, ALK, και φωσφορυλίωση RET μεσολάβηση με IC

50 τιμές στο picomolar έως χαμηλή κλίμακα nanomolar (Πίνακας 1). Από την άλλη πλευρά, GTx-186 ανέστειλε IGF-1 R και η φωσφορυλίωση του EGFR μεσολάβηση σε πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις (μεγαλύτερες από 100-1000 ηΜ), υποδεικνύοντας την επιλεκτικότητα της προς μόνο ένα υποσύνολο κινασών. Από ALK και έκφραση RET σε φυσιολογικούς ιστούς είναι ελάχιστη και τα ζώα νοκ-άουτ έχουν ασήμαντη φαινοτύπους [29], [30], διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με αυτές τις δύο κινάσες είναι μικρού ενδιαφέροντος που επιτρέπουν ΘΤχ-186 για τη θεραπεία ασθενειών TRK-Α και ROS1-εξαρτώμενη, με ελάχιστος κίνδυνος ανεπιθύμητων επιπτώσεων.

Η

ΘΤχ-186 Αναστέλλει TRK-Α-εξαρτώμενο IMR-32 νευροβλαστώματος κυττάρων και Ανάπτυξης ξενομοσχεύματος

Δεδομένου ότι τα κύτταρα IMR-32 νευροβλαστώματος εκφράζουν ισομορφές TRK και εξαρτώνται επί TRK-Α για την ανάπτυξή τους [31], χρησιμοποιήσαμε αυτή τη γραμμή ως μοντέλο για τη μελέτη των επιπτώσεων της GTx-186 σε TRK-Α φωσφορυλίωση και την ανάπτυξη, και οι δύο

in vitro

και

in vivo

. Η εξαιρετικά ισχυρός GTx-186 ανέστειλε ΝΟΡ-επαγόμενη φωσφορυλίωση του ρ42 /44 ΜΑΡΚ, μια κινάση προς τα κάτω του TRK-Α που διαμεσολαβεί πολλαπλασιασμό και φλεγμονή σε απόκριση προς NGF [32], σε μια συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 10 ηΜ (Σχήμα 2Α). Από την άλλη πλευρά, μια 10-φορές λιγότερο ισχυρό ανάλογο ανέστειλε NGF επαγόμενη ρ42 /44 ΜΑΡΚ φωσφορυλίωση μόνο σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 100 ηΜ. Στη συνέχεια, IMR-32 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις GTx-186 για να καθορίσει την επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων μετά από 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, GTx-186 ανέστειλε δοσοεξαρτώμενο την ανάπτυξη των IMR-32 κυττάρων με ένα IC

50 τιμή περίπου 100 ηΜ. GTx-186 επίσης παρεμπόδισε πλήρως NGF-εξαρτώμενη μετανάστευση των IMR-32 κύτταρα (Σχήμα 2C), υποδεικνύοντας ότι η αναστολή ΤΡΚ-A είναι τόσο αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-επεμβατική. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες, GTx-186 δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων SH-SY5Y, μια κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος που στερούνται TRK-Α [26].

A. GTx-186 αναστέλλει την NGF επαγόμενη ERK (/44 ρ42 ΜΑΡΚ) φωσφορυλίωση. IMR-32 κύτταρα νευροβλαστώματος στερήθηκαν τον ορό για 2 ημέρες, προ-επεξεργασία για 2 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις GTx-186 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 200 ng /ml NGF για 30 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και κηλίδα Western εκτελούνται για φωσφο-ΕΚΚ και ολικής ERK. Β GTx-186 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των IMR-32 κύτταρα. IMR-32 κύτταρα επιστρώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ενδεικνυόμενη συγκέντρωση GTx-186 για 3 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με σουλφοροδαμίνη Β (SRB) και η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 535 nm. Γ GTx-186 αναστέλλει τη μετανάστευση των IMR-32 κύτταρα. IMR-32 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα δοκιμασία μετανάστευσης πλατύπους και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, NGF, ή συνδυασμός των NGF και GTx-186. Εικόνες συνελήφθησαν υπό το φως μικροσκόπιο 12 ώρες μετά τη θεραπεία. D-G. GTx-186 αναστέλλει IMR-32 νευροβλαστώματος ανάπτυξη ξενομοσχεύματος. IMR-32 κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς (10 εκατομμύρια κύτταρα /ποντικό). Μόλις όγκοι έφτασαν 100-200 mm

3, τα ζώα (n = 8) τυχαιοποιήθηκαν και έλαβαν καθημερινά με όχημα ή 20 mg /kg /ημέρα ί.ν. ΘΤχ-186. Ο όγκος του όγκου (D) και το σωματικό βάρος (F) μετρήθηκαν καθημερινά για 4 ημέρες. Τα ζώα θανατώθηκαν, οι όγκοι ζυγίστηκαν (Ε), αποθηκεύονται σε φορμόλη, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία TUNEL (G-Αριθμός TUNEL θετικών κυττάρων (αριστερό πάνελ) και η ένταση της χρώσης TUNEL (δεξί πάνελ)). Οι τιμές εκφράζονται ως Μέσος ± S.E. NGF-Nerve Growth Factor? Ανοίξτε το μπαρ είναι υπό αγωγή με όχημα και γεμάτο μπαρ είναι ΘΤχ-186-κατεργασμένα δείγματα. * -statistically Σημαντικό σε p & lt? 0,05? ** – Στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt? 0,01

Η

Για να αποδειχθεί ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της ΘΤχ-186 είναι επαναλήψιμα

in vivo

σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου, IMR-32. κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς και τα ζώα που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με όχημα ή GTx-186 ενδοφλεβίως. Λόγω της ταχείας πολλαπλασιαστικής και εξαιρετικά διεισδυτική φύση των IMR-32 κύτταρα, οι όγκοι αυξήθηκαν από 200 mm

3 έως 2000 mm

3 εντός 4 ημερών. GTx-186 μείωσε αποτελεσματικά και σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 2Δ), αρχής γενομένης από την ημέρα 1 μέχρι το τέλος της μελέτης, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη από 80% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Οι επιδράσεις αυτές προκαλούνται χωρίς ορατά τοξικά αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένων τυχόν αλλαγές στο σωματικό βάρος (Σχήμα 2F). GTx-186 επίσης μείωσε σημαντικά το βάρος του όγκου (Σχήμα 2Ε) κατά περισσότερο από 50% σε σύγκριση με τα ζώα υπό αγωγή με όχημα. Για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός για αυτή την επίδραση κατά των όγκων, ιστοί φορμαλίνης σταθερό όγκων ανοσοϊστοχημικά χρωματίστηκαν για TUNEL και αξιολογήθηκαν ο αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων και TUNEL ένταση χρώσης. GTx-186 αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων κατά περισσότερο από δύο φορές σε σύγκριση με τα ζώα υπό αγωγή με όχημα, όπως φαίνεται και από τα δύο τον αριθμό των TUNEL θετικών κυττάρων και η ένταση TUNEL χρώση (Σχήμα 2G). Οι επιδράσεις αυτές προκαλούνται με μια σταθερή κατάσταση συγκέντρωσης περίπου 50 nM ΘΤχ-186, το οποίο είναι συγκρίσιμο με

in vitro

IC

50 τιμές.

ΘΤχ-186 κοκάίνης- αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις in vitro

TRK-Α και το πρόσδεμά του NGF είναι μεσολαβητές φλεγμονωδών ασθενειών, όπως η δερματίτιδα, ψωρίαση, και αρθρίτιδα. NGF εκφράζεται σε μακροφάγα και

in vitro

, NGF επάγει σύνθεση ΤΝΡ-α και συνεργεί με ιντερφερόνη-γ για να αυξηθεί η έκφραση των φλεγμονωδών κυτοκινών [33]. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να αντιστραφούν με αναστολείς TRK-A. Επιπλέον, ο NGF και TRK-Α έχουν εμπλακεί σε μία ποικιλία φλεγμονωδών και αλλεργικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων του άσθματος και των πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων χημειοταξία [34]. Για να κατανοήσουμε την επίδραση του GTx-186 σε φλεγμονή που προκαλείται από διάφορες κυτοκίνες και παράγοντες ανάπτυξης, τα κύτταρα PC12 προ-αγωγή με GTx-186 ή δεξαμεθαζόνη και στη συνέχεια κατεργάζεται με ΡΜΑ ή NGF να επάγει την έκφραση των φλεγμονωδών κυτοκινών. Ενώ GTx-186 ανέστειλε αποτελεσματικά την έκφραση της ΜΜΡ-3-, ένα μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας, που προκαλείται τόσο από ΡΜΑ και NGF, δεξαμεθαζόνη ανέστειλε το ΜΜΡ-3 έκφραση που προκαλείται μόνο από το ΡΜΑ, αλλά όχι από NGF (Σχήμα 3Α). Αυτό αποδεικνύει ότι ο NGF και ΡΜΑ διαμεσολαβεί για την φλεγμονή μέσω διαφορετικών οδών, και γλυκοκορτικοειδή, όπως η δεξαμεθαζόνη, είναι αποτελεσματικές μόνο σε μη-NGF-μεσολαβούμενη φλεγμονή. Για τον προσδιορισμό ευρύτερο αντι-φλεγμονώδεις επιδράσεις του GTx-186, αν υπάρχουν, IMR 32-κυττάρων (Σχήμα 3Β), φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ? Σχήμα 3C), LADMAC μακροφάγα (Σχήμα 3D), και RAW 264.7 μακροφάγα ποντικού (Σχήμα 3Ε) προ-αγωγή με GTx-186, και φλεγμονωδών κυτοκινών που επάγεται από NGF, TNF-α, ή LPS. GTx-186 ανέστειλε αποτελεσματικά σημαντικές φλεγμονώδεις μεσολαβητές όπως cFos, IL-8, και IL-1β με δραστικότητα συγκρίσιμη με τα αποτελέσματά της στη δραστηριότητα κινάσης.

Τα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό για 2 ημέρες, προ-επεξεργασμένα με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του GTx-186 για 30 λεπτά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξητικούς παράγοντες ή κυτοκίνες για 12-16 ώρες. RNA εκχυλίστηκε, cDNA που συντίθεται, και η έκφραση φλεγμονωδών γονιδίων μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Taqman εκκινητή και ανιχνευτές. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Οι τιμές εκφράζονται ως Μέσος ± S.E. Dex-δεξαμεθαζόνη? PMA-οξική μυριστική φορβόλη? NGF-Nerve Growth Factor? ΤΝΡ-α-Παράγοντα Νέκρωσης Όγκου? LPS-λιποπολυσακχαρίτη? ΜΜΡ3-Matrix Metalloproeinase 3? IL-8-ιντερλευκίνης 8? κύτταρα PC-12-Φαιοχρωμοκύττωμα? κύτταρα IMR-32-νευροβλάστωμα? ΝΗΕΚ-Normal ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα? LADMAC-μακροφάγων /μονοκύτταρα? RAW-264.7-Mouse μακροφάγων κυττάρων.

Η

ΘΤχ-186 Αναστέλλει Κρότωνα πετρελαίου που προκαλείται από ατοπική δερματίτιδα σε ποντίκια

Από TRK-Α έχει ενοχοποιηθεί για την ψωρίαση [12] και δερματίτιδα [ ,,,0],35] και GTx-186 ανέστειλε IL-8, ένα από τα κρίσιμα κυτοκίνες που μεσολαβούν δερματικής φλεγμονής [36] (Σχήμα 3C), αξιολογήσαμε GTx-186 σε ένα μοντέλο έλαιο Croton της ατοπικής δερματίτιδας. έλαιο Croton αυξάνει ερύθημα, το βάρος του αυτιού, και αγγειακή διαρροή, ένα φαινότυπο παρόμοιο με ατοπική δερματίτιδα [37]. Εφαρμογή κροτονελαίου αυξημένο οίδημα και το βάρος των αυτιών, τα οποία δόση εξαρτώμενο μειώνεται κατά GTx-186 (Σχήμα 4Α). RNA από διατρήσεις αυτί απομονώθηκαν και έκφραση διαφόρων γονιδίων στα φλεγμονώδη μονοπάτια μετρήθηκε (Σχήμα 4Β). πετρελαίου Κρότωνα αύξησε την έκφραση όλων των μετρούμενων φλεγμονώδη γονίδια οδού, συμπεριλαμβανομένων των NGF, η οποία ήταν όλα σημαντικά αναστέλλεται από ΘΤχ-186 και δεξαμεθαζόνη.

Α. C57BL /6 ποντίκια (20-25 gms? Η = 3) χορηγήθηκαν δυο φορές με την υποδεικνυόμενη δόση GTx-186 (sc) ή δεξαμεθαζόνη (sc), 16 ώρες και 2 ώρες πριν από την εφαρμογή του κροτονελαίου (20 μΐ 10 % Κρότωνα πετρελαίου σε ακετόνη σε κάθε εσωτερικό αυτί). Έξι ώρες μετά την εφαρμογή του πετρελαίου Croton, τα ζώα θανατώθηκαν, διατρήσεις αυτί ζυγίστηκαν και αποθηκεύτηκαν για απομόνωση RNA. * Υποδηλώνει σημασία σε Ρ & lt? 0,05 από ακετόνη εφαρμόστηκε ζώα υπό αγωγή με όχημα. # Υποδηλώνει σημασία στην P & lt? 0.05 από τον Κρότωνα πετρελαίου εφαρμόζονται τα ζώα υπό αγωγή με όχημα. Β RNA απομονώθηκε από διατρήσεις αυτί των ζώων στο πλαίσιο Α και έκφραση των γονιδίων που αναφέρονται μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH χρησιμοποιώντας εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές. Οι τιμές εκφράζονται ως Μέσος ± S.E. Dex-δεξαμεθαζόνη? 186-ΘΤχ-186? NGF-Nerve Growth Factor? IL-ιντερλευκίνη? συνδέτη CCL-χημειοκινών? MMP-Matrix Μεταλλοπρωτεϊνάσης? MCSF-μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών.

Η

ΘΤχ-186 Αναστέλλει καραγενάνη που προκαλείται από φλεγμονή στο Rat θήκη Μοντέλο Air

αντισώματα NGF είναι κλινικά επιτυχής στην αντιμετώπιση αρθριτικούς πόνους [38]. Ωστόσο, το δυναμικό για τη θεραπεία συστηματική φλεγμονή, σε συνδυασμό με πόνο δεν αξιολογήθηκε. Από GTx-186 ανέστειλε φλεγμονωδών κυτοκινών σε μια ποικιλία κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, ελέγξαμε GTx-186 σε καραγενάνη που προκαλείται από συστημική φλεγμονή χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο θύλακα αέρος. Το μοντέλο θύλακα αέρος είναι φυσιολογικώς και μηχανιστικά συγκρίσιμα με αρθρίτιδα, και ως εκ τούτου αυτό το μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση GTx-186 [25], [39]. Η χορήγηση καρραγενάνης αυξημένη λευκοκυττάρων και μακροφάγων διείσδυση σε ασκός αέρος, σε σύγκριση με θεραπεία με αλατούχο ορό ζώα (Εικόνες 5Α και 5Β). Υποδόρια και ενδο-θήκη χορήγηση ΘΤχ-186 μείωσε σημαντικά λευκοκυττάρων και μακροφάγων διείσδυση. χορήγηση Intra-θύλακα του GTx-186 προκάλεσε μία καλύτερη απόκριση από υποδόρια χορήγηση, υποδεικνύοντας μία θετική συσχέτιση μεταξύ της έκθεσης φαρμάκου στη θέση της φλεγμονής και αντι-φλεγμονώδη αποτελέσματα.

A-C. Ένας ασκός δημιουργήθηκε υποδορίως σε μία πλευρά αρουραίων (η = 3) με έγχυση 20 ml αέρα τέσσερις ημέρες πριν και 10 ml αέρα δύο ημέρες πριν από τη θεραπεία. GTx-186 (sc στο πλαίσιο Α και ενδο-θύλακα ή sc στο πάνελ Β? 40 mg /kg), δεξαμεθαζόνη (30 mg /kg sc), ή ινδομεθακίνη (30 mg /kg sc) χορηγήθηκαν τρεις φορές, 48 ώρες, 24 ώρες και 1 ώρα πριν από τη χορήγηση καρραγενάνης (1 ml 2%). Έξι ώρες μετά την χορήγηση καρραγενάνης, τα ζώα θυσιάστηκαν, 5 ml φυσιολογικού ορού εγχύθηκε σε θύλακα για να ξεπλύνετε το ρευστό σακκουλιού και τον αριθμό των λευκοκυττάρων και μακροφάγων διεισδύσει μέσα στο θύλακα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. TNF-α μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία ELISA στα εκκρίματα θύλακα από το πείραμα στον πίνακα Β (C). D. Επίδραση της GTx-186 σε φλεγμονώδεις κυτοκίνες σε καραγενάνη που προκαλείται ασκός αέρος φλεγμονή μετρήθηκε στα εκκρίματα θύλακα χρησιμοποιώντας ένα πίνακα κυτοκίνη. Βασικά κυτοκίνες προσδιορίστηκαν ποσοτικά και εκφράζεται ως γραφήματα ράβδου στα δεξιά. Οι τιμές εκφράζονται ως Μέσος ± S.E. η = 3. 186-GTx-186? Indom-ινδομεθακίνη? Dex-δεξαμεθαζόνη? TNF-Παράγοντα Νέκρωσης Όγκου? IL-ιντερλευκίνη? CINC-προκαλούμενη από κυτοκίνη ουδετερόφιλων-Χημειοελκτικής πρωτεΐνη.

Η

εκκρίματα Air θύλακα υποβλήθηκαν σε συστοιχία κυτοκίνη να προσδιοριστεί η επίδραση της GTx-186 και ινδομεθακίνη για την έκφραση της πρωτεΐνης παγκόσμια κυτοκίνης (Σχήμα 5D και Πίνακας S2) . Είναι ενδιαφέρον, ΘΤχ-186 και ινδομεθακίνη διέφεραν ως προς τα αποτελέσματά τους να αναστέλλουν κυτοκίνες. Ενώ και οι δύο GTx-186 και ινδομεθακίνη ανέστειλε καρραγενάνη επαγόμενη TNF-α, IL-1β, φρακταλκίνη, IL-13, και της λεπτίνης, μόνο GTx-186 ανέστειλε CINC-1, CINC-2, IL-6, και LIX. Από την άλλη πλευρά, ούτε GTx-186 ούτε ινδομεθακίνη ανέστειλε καρραγενάνη επαγόμενη CINC-3, ΤΙΜΡ-1, PDGFa, ΜΜΡ-8 και MCP-1, δεικνύοντας ότι αυτές οι κυτοκίνες μπορεί να μην είναι κρίσιμη μεσολαβητές της φλεγμονής στο μοντέλο θύλακα αέρος .

ΤΝΡ-α είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της φλεγμονής στο καραγενάνη που προκαλείται οξεία φλεγμονή στο αρθρικό θύλακα αέρα μοντέλα. Τοπική επίπεδα ΤΝΡ-α συσχετίζονται με διόγκωση και την έκταση της φλεγμονής, τα οποία αναστρέφεται από ένα αντίσωμα αντι-ΤΝΡ-α [25].