Αφηρημένο

μεταλλάξεις στο

TP53

γονίδιο είναι οι πιο κοινές αλλαγές σε ανθρώπινους όγκους.

TP53

τύπων μεταλλάξεων έχουν μερικές φορές συνδέονται με καρκινογόνο έκθεσης. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ένα ειδικό G Δεύτερον, βασίζεται σε μια συλλογή των πειραματικών και επιδημιολογικών δεδομένων σχετικά με μεταλλάξεις που σχετίζονται με ανθρώπινους όγκους, μπορούν χημικά που προκαλείται από μεταλλάξεις του

TP53

σε συγκεκριμένες θέσεις (κωδικόνια) να αναγνωριστεί ως ένα βασικό γεγονός στην καρκινογένεση;

Σχέση μεταξύ Β

[a] P

μεταλλαξιγένεση και

TP53

μεταλλάξεις

Πολλοί γενοτοξική μεταβολίτες που παράγονται από Β

[α]

π Ο κύριος τρόπος, η οποία περιλαμβάνει CYP1A, CYP1B, CYP3A και εποξείδιο υδρολάσες, οδηγεί στο τελικό γενοτοξικό μεταβολίτη (±) -αντι-BPDE που δεσμεύεται με DNA και σχηματίζει κυρίως ενώσεις προσθήκης DNA στο

Ν2

θέση της γουανίνης και σε μικρότερο βαθμό στο

Ν6

θέση της αδενίνης [23] – [25]. Μια άλλη οδός περιλαμβάνει dihydrodiol αφυδρογονάσες AKR1A1 και 1C1-4 που οξειδώνουν Β

[a] P

dihydrodiols να κατεχόλες [26]. Κατεχόλες μπορεί στη συνέχεια να υποβληθεί σε μονο-ηλεκτρονική οξειδώσεις που οδηγεί σε

o

-quinones τα οποία αποτελούν προϊόντα προσθήκης DNA, όπως είναι η B

[a]

P-7,8-dione-

N

2

-dG και το Β

[a]

P-7,8-dione-

N

6

-δα [27], [28]. Σε αυτή τη μελέτη, κατά τη διάρκεια της έκθεσης του AG1521 ινοβλαστών προς Β

[a]

P, μεταβολίζουν τα ένζυμα παρέχεται εξωγενώς, σύμφωνα με τις τυποποιημένες πρακτικές στις δοκιμές γονιδιοτοξικότητας. Η ανάλυση μετά την επισήμανση αποκάλυψε ένα σημαντικό σημείο που συν-μετανάστευσε με εκείνη που παρατηρήθηκε στο DNA ελέγχου που εκτίθενται σε BPDE. Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι B

[a] αποτελέσματα

P έκθεση, κυρίως σε προσαγωγές BPDE-DNA.

Σε συμφωνία με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας, διαπιστώσαμε ότι η πλειοψηφία των υποκαταστάσεις βάσεων που προκαλείται από Β

[a] P

βρίσκονταν στο G: C ζεύγη βάσης από τις οποίες μόνο 6 εντός περιοχών CpG. Γουανίνες σε μεθυλιωμένες αλληλουχίες CpG είναι τυπικές στόχοι για ενώσεις προσθήκης DNA [10], [23]. Είναι πιθανό ότι το DNA μεθυλίωση είναι φτωχή σε ένα κυτταρικό μοντέλο όπως αυτό που χρησιμοποιείται εδώ, αλλά Shen

et al.

, Χρησιμοποιώντας το ίδιο στέλεχος ανταποκριτού ζύμης μετασχηματίζονται με χημικά τροποποιημένα πλασμίδια, παρατήρησε ότι μεθυλίωση του DNA δεν επηρεάζει η παραγωγή προϊόντων προσθήκης BPDE [21].

Χρησιμοποιώντας UvrABC ενδονουκλεάσης σε συνδυασμό με απολίνωση μεσολάβηση PCR (LMPCR), την κατανομή των προϊόντων προσθήκης BPDE επί εξώνια 5, 7 και 8 του

ΤΡ53

σε τα κύτταρα HeLa χαρτογραφηθεί [29], [30]. Ισχυρή σχηματισμός προϊόντος προσθήκης συνέβη στις γουανίνες στα κωδικόνια 154, 156, 157, 158, 159, 245, 248 και 273, τα περισσότερα από τα οποία περιγράφονται ως θερμά σημεία σε καρκίνους του πνεύμονα (157, 158, 245, 248, και 273? IARC βάση δεδομένων, έκδοση R14). Πράγματι, το κωδικόνιο 248 ήταν πιο συχνά αποτελούν στόχο B

[a] P

σε δοκιμασία μας. Δεύτερον, με τη χρήση μεθυλιωμένου και BPDE εκτεθειμένων θραυσμάτων DNA που περιέχει εξόνιο 5 του

ΤΡ53

, προϊόντα προσθήκης βρέθηκαν σε τρία άλλα κωδικόνια: 152, 175, 181, τα οποία αποκαλύφθηκαν στην παρούσα μελέτη καθώς και [10] .

B

[a] έχουν

P προκαλείται από μετάλλαξης μελετηθεί εκτενώς σε πολλά γονίδια σε διάφορα βιολογικά συστήματα. Δοκιμασίες διεξήχθησαν σε κύτταρα τρωκτικών

in vitro

ή

in vivo

σε γονίδια ρεπόρτερ όπως

HPRT

ή

LacI

έχουν αναφερθεί με συνέπεια την επικράτηση της G & gt? Τ μεταστροφές και, σε μικρότερο βαθμό, του G & gt? A μεταβάσεις και διαγραφές [31] – [34]. Το ποσοστό της G & gt? T μεταστροφές φαίνεται να εξαρτάται από τη συγκέντρωση [31]. Είναι ενδιαφέρον ότι, χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ζύμης με διάφορα στελέχη με ανεπάρκεια σε επισκευή νουκλεοτίδιο εκτομή, καταδείχθηκε ότι η DNA πολυμεράσες και ζ απαιτήθηκαν σε συνδυασμό για την επισκευή translesion απέναντι προσαγωγές BPDE, οδηγώντας σε G & gt? Τ μεταστροφές [35]. Pol ζ μόνη της ήταν επίσης σε θέση να παράγουν μεγάλες διαγραφές σε αυτή τη δοκιμασία.

Ανάλογα με την πειραματική προσέγγιση, έχουν διαφορές έχουν παρατηρηθεί μεταξύ τύπων μεταλλάξεων σε

ΤΡ53

επάγεται από

in vitro

και

in vivo

έκθεση σε Β

[a] P

ή BPDE. Χρησιμοποιώντας την ίδια δοκιμασία μαγιά όπως μας, αλλά μετά από την άμεση έκθεση BPDE ενός μετουσιωμένο πλασμιδίου που φέρει το ανθρώπινο

TP53

ακολουθία, Yoon

et al

έχουν βρει μια σαφή υπεροχή της G & gt?. Τ μεταστροφές ενώ Shen

et al

έχουν βρεθεί κυρίως G & gt? α. μεταβάσεων [11], [21]. Η άμεση αλληλούχιση του

TP53

σε ανθρώπινο-ρ53 knock-in (Hupki) εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού μετά από

in vitro

έκθεση σε Β

[a] P

έχουν δείξει κυρίως G & gt ? T μεταστροφές [36], [37]. Ομοίως, G & gt? T μεταλλάξεις βρέθηκαν επίσης κυρίως σε όγκους του δέρματος μετά από Β

[a] P

έκθεση [38]. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του

TP53

από διάφορους όγκους που προκαλείται μετά από

in vivo

έκθεση ποντικών σε Β

[a] P

ή λιθανθρακόπισσας οδήγησε στον ίδιο βαθμό της G & gt? T , G & gt? Α και G & gt? C μεταλλάξεις [39]. Στο σύνολό της, είναι σαφές από τη συντριπτική πλειοψηφία των μελετών, ότι ανεξάρτητα του γονιδίου που μελετάται και να χρησιμοποιηθεί το βιολογικό σύστημα, G & gt? T μεταστροφής είναι το σήμα κατατεθέν της Β

[a]

P ή έκθεση BPDE. Σε αυτό το πλαίσιο, ήμασταν έκπληκτοι να βρείτε αυτές τις μεταστροφές που αντιπροσωπεύουν μόνο το 22% των μεταλλάξεων στη μελέτη μας, αλλά αυξάνεται από 17% σε 1 μΜ έως 27% στα 50 μΜ. Όπως προτείνεται από Wei

et al.

[31], μπορεί να είναι ένα θέμα της δόσης. Πολλοί

in vitro

μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί BPDE στην περιοχή μΜ [11], [35] ενώ εμείς χρησιμοποιήσαμε Β

[a] P

στην ίδια περιοχή, η οποία προφανώς οδήγησε σε χαμηλότερη έκθεση να BPDE στο πρωτόκολλο μας. Μερικά

in vitro μελέτες χρησιμοποίησαν

B

[a]

Ρ στην περιοχή μΜ, αλλά σε αυτές τις μελέτες ο χρόνος έκθεσης κυμαίνονταν από 4 έως 9 ημέρες αντί των 2 ωρών πρωτόκολλο μας [ ,,,0],36], [37]. Αυτό υποδηλώνει ότι η G & gt? T μεταστροφές θα μπορούσε να είναι το σήμα κατατεθέν μιας ισχυρής έκθεσης σε Β

[a]

P, ένα σενάριο το οποίο φαίνεται εύλογο, στο πλαίσιο της έκθεσης στον καπνό σε βαριές καπνίστριες, ενώ μέτρια έκθεση θα μπορούσε να οδηγήσει τόσο G & gt? T, G & gt? A, G & gt? C και διαγραφές, όπως διαπιστώθηκε σε πολλές μελέτες. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από την επικράτηση του G & gt? Τ μεταστροφές σε καρκίνους του πνεύμονα σε σχέση με την έκθεση του καπνού. Σύμφωνα με τη βάση δεδομένων του IARC (Σχήμα 5), η επικράτηση κυμαίνεται από 25% σε μη καπνιστές και 32% σε καπνιστές και 55% σε βαρείς καπνιστές

Από αριστερά προς τα δεξιά:.

in vitro

Β

[a]

P-εκτεθειμένες ανθρώπινους ινοβλάστες AG1521 (FASAY) (n = 37)? ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, μη καπνιστές (n = 288)? ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, οι καπνιστές (n = 870)? ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα, βαρείς καπνιστές (n = 20). Πνεύμονα δεδομένων για τον καρκίνο από τη βάση δεδομένων του IARC R14. Σπάνιες μεταλλάξεις είχαν παραλειφθεί σε αυτά τα σχέδια

Η

Αντίθετα με το ποσοστό της G & gt?. Τ μεταστροφής, βρήκαμε ένα υψηλό ποσοστό της G & gt? Α μεταβάσεις (38%), τα μισά εκ των οποίων να βρίσκεται σε αλληλουχίες CpG . Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί εν μέρει από αυθόρμητες μεταλλάξεις, όπως φαίνεται στα κύτταρα ελέγχου. Αλλά μια τεχνική προκατάληψη μπορεί να θεωρηθεί αφού πρωτόκολλο μας δεν έκανε διάκριση μεταξύ δύο ανεξαρτήτως που προκύπτουν αλλά πανομοιότυπα γεγονότα μετάλλαξης και ένα από τα ακόλουθα κατάσταση: (i) πολλαπλές μεταγραφές mRNA από το ίδιο μεταλλαγμένο κύτταρο που στην συνέχεια ανεξάρτητα συλλαμβάνονται σε πλασμίδια ή (ii) κλωνική επέκταση ενός μεταλλαγμένου κυττάρου πριν από τη συγκομιδή της ομάδας των κατεργασμένων κυττάρων. Στον Πίνακα 2 μόνο 3 μεταλλάξεις μπορεί να είναι δυνητικά σχετικών αυτών προκατάληψη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η τεχνητή επικάλυψη των μεταλλάξεων μπορεί να είναι σπάνια. Επιπλέον, διπλές μεταλλάξεις είναι ως επί το πλείστον G & gt? A μεταβάσεις στην CpG θέσεις. Αυτό μπορεί εσφαλμένα να αυξήσει το ποσοστό της συγκεκριμένης μετάλλαξης.

Σύγκριση των

TP53

προφίλ μεταλλάξεων που λαμβάνονται για τις γενοτοξίνες, Β

[a] P

, ακεταλδεΰδη και AFB

1

Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από την εφαρμογή των FASAY να αξιολογήσει μεταλλαξιογόνο δράση του

in vitro

έκθεση των φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών στο Β

[a] P

, ακεταλδεΰδη και AFB

1 συγκρίθηκαν. ακριβής δοκιμασία του Fisher αποκάλυψε ότι όσον αφορά το είδος της μετάλλαξης, Β

[a] P

και AFB

1 σχέδια δεν ήταν στατιστικά διαφορετικές (p = 0,6735), ενώ οι διαφορές μεταξύ των προτύπων για την ακεταλδεΰδη και είτε Β

[a] P

ή AFB

1 ήταν στατιστικά οριακής σημασίας (ρ τιμές των 0,0546 και 0,0705, αντίστοιχα). Αυτές οι τρεις ενώσεις είναι γνωστό ότι προκαλούν διαφόρων ειδών βλάβες DNA το οποίο θα μπορούσε με τη σειρά του, να σχετίζεται με συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Η ακεταλδεΰδη επαγόμενη μοτίβο χαρακτηρίζεται κυρίως από ένα πολύ υψηλό ποσοστό του G & gt? A μεταβάσεις (66%), ως επί το πλείστον βρίσκονται εντός των αλληλουχιών CpG που είναι μια πιθανή βάση για το σχηματισμό προϊόντων προσθήκης διακλαδική διασταυρωμένης σύνδεσης σε αλληλουχίες CpG [15]. Αντίθετα, το υψηλό ποσοστό της G & gt? T μεταστροφές που παρατηρούνται μεταξύ των Β

[a]

P- και AFB

1 που προκαλείται από μεταλλάξεις, έχει αναγνωριστεί ως σήμα κατατεθέν της μεταλλαξιγένεσης τους,

in vitro

και

in vivo

[4], [40]. Αυτό οφείλεται κυρίως στην παρουσία των ογκωδών προσαγωγών

B

[a] P

μοτίβο αποκαλύπτει δύο μοναδικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με εκείνες των AFB

1 και η ακεταλδεΰδη:. Η εμφάνιση της G & gt ? C μεταβάσεις και ένα υψηλότερο ποσοστό των διαγραφών (11% έναντι 5-6%). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η AFB

1 και προκαλείται από την ακεταλδεΰδη διαγραφές μίας βάσης, Β

[a] P

θα μπορούσε να δημιουργήσει διαγραφές έως 24 νουκλεοτίδια. Αυτό το χαρακτηριστικό μπορεί να είναι το αποτέλεσμα μιας συγκεκριμένης σύνθεσης translesion οδό Β

[a] P

προσαγωγές όπως συζητήθηκε παραπάνω.

Έτσι, μια προκαταρκτική ανάλυση χρησιμοποιώντας το FASAY μας έδωσε τη δυνατότητα να καταγράφει και να διακρίνει διαφορετικά πειραματικά δημιουργείται πρότυπα μετάλλαξης στο

TP53

, τα οποία στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τη σύγκριση με τα υπάρχοντα επιδημιολογικά δεδομένα σχετικά με τους χάρτες των προσαγωγών DNA και μεταλλάξεις του όγκου σε

TP53

.

Η εμφάνιση των πειραματικών

ΤΡ53

μεταλλάξεις σε ανθρώπινους όγκους και λειτουργική επίπτωση των μεταλλάξεων

Η συγκεντρωτική κατανομή των μεταλλαγμένα κωδικόνια ελήφθησαν μετά από έκθεση σε καθένα από τα τρία γενοτοξίνες συζητούνται εδώ μας επέτρεψε να εντοπιστούν 6 μεγάλες θερμά σημεία στο ανθρώπινο όγκων, κωδικόνια 248, 273, 175, 245, 282, 249 (Εικόνα 4).

στο επίπεδο φαινοτυπική, μεταξύ των 63 μεταλλακτών που προκύπτουν από υποκατάσταση νουκλεοτιδίου, οι δύο πιο συχνά ανακτώνται σε ανθρώπινους όγκους ήταν επίσης βρίσκονται σε πειραματικό σχέδια μας, δηλαδή Arg175His και Arg248Gln (Πίνακας 3). Επιπλέον, τέσσερις υποκαταστάσεις (Arg175His, Arg248Gln, Arg273Cys και Gly245Ser) αντιπροσωπεύουν μαζί περισσότερο από το 10% των μεταλλάξεων που βρέθηκαν σε ανθρώπινους όγκους. Μόνο τρεις μεταλλάξεις που βρέθηκαν στη μελέτη μας δεν έχουν ποτέ περιγραφεί σε ανθρώπινους όγκους (Gly117Val, Gly262Leu, Asn288Ile). Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι FASAY ανακτά μεταλλάξεις που φέρει μια λειτουργική αλλαγή που επιτρέπει επιλογή κατά τη διάρκεια της διαδικασίας καρκινογένεσης.

Η

Αξιολογήσαμε την λειτουργική συνέπεια μεταλλάξεων που συμβαίνουν μετά

in vitro

έκθεση σε τρεις χημικές ουσίες στο το φως των δεδομένων από Dearth

et al.

που παρέχουν κριτική για την επίδραση των 76

TP53

μεταλλάξεις που παρατηρείται συχνά σε ανθρώπινους όγκους [12]. Δεκατέσσερις από τους 76 που αναλύθηκαν μεταλλάκτες ανακτήθηκαν σε τρία πειραματικά μοντέλα μας (Πίνακας 3). Όπως ήταν αναμενόμενο, αυτές οι 14 μεταλλάξεις στερούνται δραστηριότητας στο

RGC

αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκε στο πρωτόκολλο FASAY μας. Αυτή η ανάλυση δείχνει ότι οι περισσότερες από τις πειραματικές μεταλλάξεις φιλοξενούν σημαντικές λειτουργικές διαταραχές, δηλαδή την πλήρη απώλεια της μεταγραφικής δραστηριότητας, στις 22 ρ53 αλληλουχίες DNA Binding (DBS) και κυρίαρχη αρνητική επίδραση (ΑΕΕ). Αντιστρόφως, ορισμένες από τις μεταλλάξεις που είναι συχνές σε ανθρώπινους όγκους είναι απίθανο να ανακτηθεί από το FASAY επειδή διατηρούν μεταγραφική δραστηριότητα [12]. Αυτό περιλαμβάνει, για παράδειγμα, Arg175Leu ή Glu285Lys που δεν βρέθηκαν σε δοκιμασία μας.

Ωστόσο, η λειτουργική ανάλυση των μεταλλάξεων από FASAY δεν μας επιτρέπει να κάνουν διακρίσεις μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνων. Πράγματι, αν FASAY μας επιτρέψει να ανακτήσετε μεταλλάξεις που συμβαίνουν συχνά σε ανθρώπινους όγκους, αυτές οι μεταλλάξεις δεν ήταν ούτε ιδιαίτερα συχνή ούτε σπάνια σε όγκους που συνδέονται με την έκθεση σε μια συγκεκριμένη genotoxin. Για παράδειγμα, Arg175His και Arg248Gln βρίσκονται στο Β

[a] P

και AFB

1 σχήματα είναι τα πιο συχνά εντοπίζονται μεταλλάξεις στους ανθρώπινους όγκους, αντιπροσωπεύοντας το 4,25% και το 3,21% του συνόλου των μεταλλάξεων, αντίστοιχα (Πίνακας 3), αλλά αντιπροσωπεύουν μόνο το 1,2% των καρκίνων του πνεύμονα ή μεταλλάξεις ηπατοκαρκινώματος σύμφωνα με τη βάση δεδομένων του IARC. Κατά τον ίδιο τρόπο, Arg273Cys απεικονίζεται στο σχήμα ακεταλδεΰδη είναι πιο συχνή σε όλο το φάσμα ανθρώπινου όγκου (2,44%) από το ότι για τον καρκίνο του οισοφάγου (1,3%).

Αυτή η ανάλυση καταδεικνύει την ικανότητα των χημικών να επάγουν συχνές και ιδιαίτερα εξασθενημένη

TP53

μεταλλάξεις που μπορεί να είναι ένα σημαντικό γεγονός που εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Σε σύγκριση με την κλασική δοκιμασίες μεταλλαξιγένεσης χρησιμοποιώντας γονίδια δημοσιογράφος, αυτό το λειτουργικό

in vitro

προσέγγιση παρέχει ισχυρά επιχειρήματα για μια βιολογική αξιοπιστία της καρκινογένεσης για genotoxin. Παρ ‘όλα αυτά ανακεφαλαιώνει μόνο το βήμα για την έναρξη της καρκινογένεσης και, κατά συνέπεια, είναι ανακριβής σε πρόβλεψη για το ποια συγκεκριμένη μετάλλαξη θα μπορούσε να είναι η κινητήρια δύναμη κατά τη διάρκεια των επόμενων βημάτων της καρκινογένεσης σε ένα δεδομένο ιστό.