Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα επιθηλιακά μόριο προσκόλλησης κυττάρων (EpCAM) -με βάση την καταμέτρηση του κυκλοφορούντος όγκου κύτταρα (CTC) έχει προγνωστική αξία σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους, όπως η προηγμένη του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, μικρή ευαισθησία έχει αναφερθεί για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, έχουμε αναπτύξει ένα σύστημα συστοιχίας μικροκοιλότητας (MCA) συνδυάζεται με μια μικρογραφία συσκευή για την απομόνωση της CTC, χωρίς να στηρίζονται σε έκφρασης EpCAM. Εδώ, αναφέρουμε τα αποτελέσματα μιας κλινικής μελέτης στην ΚΜΑ των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα στην οποία συγκρίνεται το σύστημα MCA με το CellSearch σύστημα, το οποίο χρησιμοποιεί τη συμβατική μέθοδο EpCAM-βάση.

Μέθοδοι

Αξιόπιστες δείγματα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν από 43 ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα να απαριθμήσει ΚΜΑ χρησιμοποιώντας το CellSearch σύστημα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και του συστήματος MCA από ανοσοϊστοχημικής και κυτταρομορφολογική ανάλυση. Η παρουσία της ΚΜΑ αξιολογήθηκε τυφλά και ανεξάρτητα από τα δύο συστήματα.

Αποτελέσματα

ΚΜΑ εντοπίστηκαν σε 17 από 22 ασθενείς με NSCLC τη χρήση του συστήματος ΝΕΠ έναντι 7 από 22 ασθενείς που χρησιμοποιούν το CellSearch συστήματος. Από την άλλη πλευρά, CTCs ανιχνεύθηκαν σε 20 από 21 μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) ασθενείς που χρησιμοποιούν το σύστημα MCA έναντι 12 από τους 21 ασθενείς που χρησιμοποιούν το σύστημα CellSearch. Σημαντικά περισσότερα CTC σε ασθενείς με NSCLC ανιχνεύθηκαν από το σύστημα MCA (διάμεση 13, εύρος 0 – 291 κύτταρα /7.5 ml) από ό, τι από το CellSearch σύστημα (διάμεση τιμή 0, εύρος 0-37 κύτταρα /7,5 ml) καταδεικνύοντας στατιστικά σημαντική υπεροχή (p = 0,0015 ). Η στατιστική σημαντικότητα δεν επιτεύχθηκε σε SCLC αν και παρατηρήθηκε η τάση που ευνοεί το σύστημα MCA πάνω από το CellSearch συστήματος (p = 0,2888). Το σύστημα MCA απομονωθεί επίσης CTC συστάδες από ασθενείς οι οποίοι είχαν χαρακτηριστεί ως CTC αρνητικό χρησιμοποιώντας το CellSearch συστήματος.

Συμπεράσματα

Το σύστημα MCA έχει δυνατότητα να απομονώσουν σημαντικά περισσότερα CTC και συστάδες CTC σε προχωρημένο ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με το CellSearch σύστημα

Παράθεση:. Hosokawa Μ, Kenmotsu η, Κο Υ, Yoshino Τ, Yoshikawa Τ, Naito Τ, et al. (2013) με βάση το μέγεθος Απομόνωση των κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μικροκοιλότητας Array. PLoS ONE 8 (6): e67466. doi: 10.1371 /journal.pone.0067466

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 18, Γενάρη του 2013? Αποδεκτές: 17η Μάη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Hosokawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει υποστηρίζεται από το Περιφερειακό Πρόγραμμα Καινοτομίας Cluster και Grant-in-Aid για την Έρευνα υποτροφία για Νέους επιστήμονες (11J11150) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. ΜΗ, TYoshino, HKanbara και TM έχουν υποβάλει αίτηση για τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας που σχετίζονται με το σύστημα MCA . HKanbara απασχολείται από την Hitachi Chemical Co., Ltd. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου σχετίζονται με το θάνατο στις περισσότερες βιομηχανικές χώρες. μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 15% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα, και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), που περιλαμβάνει αδενοκαρκίνωμα (ADC) και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC), αντιπροσωπεύει το 85% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα . Έχει πρόσφατα δειχτεί ότι η ταυτοποίηση των ασθενών με NSCLC από ανίχνευση γενετικών ανωμαλιών, ειδικά

EGFR

-activating μεταλλάξεις και το

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης, επιτρέπει την καλύτερη πρόβλεψη της αντίδρασης στη τυροσίνης EGFR αναστολείς κινάσης και αναστολείς ALK, αντίστοιχα [1], [2]. Παρά τις προόδους στον τομέα της πρόληψης και της θεραπείας, οι ασθενείς με NSCLC είναι συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και έχει φτωχή πρόγνωση λόγω της τάσης της ασθένειας προς την μακρινή μετάσταση, η κύρια αιτία θνησιμότητας σε ασθενείς με ΜΜΚΠ. χαρακτηρίζονται από την επιθετική ανάπτυξη του όγκου και συχνά εμφανίζουν μεταστάσεις στα περιφερειακά κόμβους και απομακρυσμένα όργανα, SCLC είναι αρχικά εξαιρετικά ευαίσθητο σε χημειοθεραπεία, αλλά τείνει να αποκτήσει χημειοαντίσταση, οδηγεί σε αναπόφευκτη υποτροπής.

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) ορίζεται ως καρκινικά κύτταρα που κυκλοφορούν στο περιφερικό αίμα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο. Όταν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ο Αμερικανικός Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) CellSearch συστήματος (Veridex, Raritan, NJ, USA), ο αριθμός των CTCs στο περιφερικό αίμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει την πρόγνωση των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού [3], καρκίνο του παχέος εντέρου [4], ο καρκίνος του προστάτη [5], NSCLC [6], και SCLC [7]. Το CellSearch σύστημα εμπλουτίζει CTCs χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με ένα μονοκλωνικό δείκτη επιθηλιακών κυττάρων με αντίσωμα στόχευσης, όπως το επιθηλιακό μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM) [8], [9]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η παρουσία του EpCAM στα κύτταρα του όγκου ποικίλει ανάλογα με τον τύπο του όγκου [10], [11]. Η έκφραση των δεικτών των επιθηλιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των EpCAM, ρυθμίζεται προς τα κάτω για την αύξηση της διήθησης και μετάστασης από επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [12] – [16]. Έχει προταθεί ότι η χαμηλή επικράτηση των CTCs ανιχνεύονται σε ασθενείς με προχωρημένο NSCLC χρησιμοποιώντας το CellSearch σύστημα μπορεί να οφείλεται στην απώλεια της έκφρασης EpCAM [17], υποδεικνύοντας ότι ΕρΟΑΜ-based CTC μεθόδους απομόνωσης δεν μπορεί να επιτύχει σταθερή και επαναλήψιμη ανάκτηση CTC από όλα τύπους όγκων.

Άλλες μέθοδοι απομόνωσης CTC βασίζεται κυρίως σε διαφορές στο μέγεθος και παραμόρφωσης μεταξύ ΚΜΑ και των κυττάρων αιματολογικές. Καθώς τα κύτταρα όγκου (& gt? 8 μm) είναι μεγαλύτερα από λευκοκύτταρα [18] – [21], η απομόνωση κατά μέγεθος των επιθηλιακών κυττάρων όγκου (ISET) μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας διήθηση σε χωριστά κύτταρα. ISET χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο από πολυανθρακικό, μια φθηνή, φιλική προς το χρήστη μέθοδος εμπλουτισμού ΚΜΑ, επιτρέπει την ανάκτηση και την ανίχνευση των επιθηλιακών-δείκτη αρνητικά ΚΜΑ με βάση το μέγεθος που εξαρτάται από την απομόνωση CTC. Σε κλινικές δοκιμές, η χρήση ενός συστήματος που βασίζεται ISET έχει βρεθεί να επιτευχθεί υψηλότερη ευαισθησία ανίχνευσης CTC σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με τη χρήση του συστήματος CellSearch [22] – [24].

Πρόσφατα, μικροκατασκευασμένο συσκευές για το μέγεθος με βάση το διαχωρισμό των κυττάρων του όγκου έχουν ευρέως αναπτυχθεί για να επιτρέπουν ακριβή και αποτελεσματική εμπλουτισμός των CTCs από πλήρες αίμα [25] – [28]. Αυτές οι συσκευές περιλαμβάνουν ένα σύστημα μινιατούρας array μικροκοιλότητας (MCA) που έχουμε αναπτύξει για την υψηλής απόδοσης παγίδευση μονά κύτταρα με διήθηση με βάση τις διαφορές στα μεγέθη των κυττάρων [29], [30]. Σε προηγούμενη μελέτη, εξετάσαμε την εφαρμογή του συστήματος μας MCA στην ανίχνευση αιχμηρών κυττάρων όγκου από μη κατεργασμένες ανθρώπινο ολικό αίμα με βάση τις διαφορές στο μέγεθος και παραμορφωσιμότητα μεταξύ κυττάρων όγκων και άλλων κυττάρων του αίματος [31]. Χρησιμοποιώντας τη συσκευή μας, ήμασταν σε θέση να παγιδεύουν τα καρκινικά κύτταρα σε μεγέθους- και γεωμετρία ελεγχόμενη συστοιχίες μικροκοιλότητας αποτελείται από 10.000 ανοίγματα με εφαρμογή αρνητικής πίεσης, επιτρέποντας στα κύτταρα να παγιδευμένο εύκολα να απαριθμηθούν και να αναλυθούν με μικροσκοπική απεικόνιση συγκεκριμένων περιοχών. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η χρήση της συσκευής μινιατούρας επιτρέπεται για εισαγωγή μιας σειράς αντιδραστηρίων για την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων μέσω της μικρορευστονικής δομή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το σύστημά μας είναι ένα απλό αλλά ακριβές σύστημα για την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων εντός πλήρους αίματος. Για να επιβεβαιώσετε και να βασίζονται σε προηγούμενα ευρήματα μας, σε σύγκριση με την ικανότητα και την αποτελεσματικότητα του νέου μας συστήματος MCA και την τρέχουσα χρυσό πρότυπο CellSearch σύστημα στην εκτέλεση ανίχνευσης CTC και καταμέτρηση σε δείγματα ολικού αίματος που λαμβάνεται από μια ομάδα του NSCLC και SCLC ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

μελέτη και δήλωση Δεοντολογίας

Αυτή η προοπτική μελέτη διεξήχθη για να αξιολογήσει CTC απαρίθμηση χρησιμοποιώντας το CellSearch σύστημα και το σύστημα MCA σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα σε τυφλό πείραμα (Umin κλινική δοκιμή μητρώου, αριθμός UMIN000005189). Η παρουσία της ΚΜΑ αξιολογήθηκε ξεχωριστά, σύμφωνα με τα κριτήριά τους προτού γίνει γνωστό κάποιο αποτέλεσμα από το άλλο. Τα κριτήρια ένταξης της μελέτης ήταν η διάγνωση των παθολογικά αποδεδειγμένο καρκίνο του πνεύμονα με ακτινολογικά εμφανής μεταστατικών βλαβών, δηλαδή, ιστολογικά ή κυτταρολογικά επιβεβαιωθεί μεταστατικό NSCLC ή SCLC, και την εγγραφή στο Κέντρο Καρκίνου Σιζουόκα. Οι θεσμικές συμβούλια αναθεώρηση του Κέντρου Καρκίνου Shizuoka ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης, και όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση. Από κάθε μία από τις 43 ασθενείς που τυχαιοποιήθηκαν, μεταξύ των οποίων 22 είχαν διαγνωστεί με NSCLC και 21 με SCLC, 10-15 ml αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA για CTC απαρίθμηση από το σύστημα MCA στο εργαστήριο μας (Shizuoka Cancer Center, Shizuoka , Ιαπωνία) και 20 ml συλλέχθηκε σε σωληνάρια συλλογής CellSave για CTC απαρίθμηση από το CellSearch σύστημα στο εργαστήριο SRL Inc. (Τόκιο, Ιαπωνία).

Cell Culture και Σήμανση

HCC827, NCI-Η358, ΝΟΙ-Η441, DMS79, ΝΟΙ-Η69, και NCI-H82 κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection, χωρίς περαιτέρω δοκιμή ή ταυτότητας. Α549 (Riken Bioresource Κέντρο, Tsukuba, Ιαπωνία) και PC-14 [32] ευγενικά από τον Dr. Fumiaki Κοϊζούμι (Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Tokyo, Japan). Το Α549, κυτταρικές σειρές HCC827, ΝΟΙ-Η358, ΝΟΙ-Η441, PC-14, DMS79, ΝΟΙ-Η69, και NCI-H82 NSCLC και SCLC καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma-Aldrich, Irvine, UK), 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), και 1% (ν /ν) πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen Corp.) για 3-4 ημέρες στους 37 ° C με

2 συμπλήρωση 5% CO. Αμέσως πριν από κάθε πείραμα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή θρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Ως μέτρηση του μεγέθους των κυττάρων του όγκου, κατανομή μεγέθους των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την Counter CASY® κυττάρων + System Analyzer Model TTC (Scharfe System GmbH, Reutlingen, Γερμανία). Για να αξιολογηθεί η απόδοση της συσκευής, οι κυτταρικές γραμμές όγκου σημάνθηκαν με CellTracker Red CMTPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), με την επισήμανση επιτεύχθηκε με επώαση των κυττάρων με μια χρωστική παρακολούθησης (5 μΜ) για 30 λεπτά. Αφού τα κύτταρα είχαν σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (200 g για 5 λεπτά), το υπερκείμενο αποχύθηκε. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS για την απομάκρυνση τυχόν περίσσειας χρωστικής πριν επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 2 mM ΕϋΤΑ και 0,5% λευκωματίνη βόειου ορού (BSA).

κατασκευή του συστήματος MCA

Η σύστημα MCA κατασκευάστηκε με τον ίδιο τρόπο όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [29], [31]. Για CTC απαρίθμηση με την παρατήρηση μικροσκόπιο φθορισμού, η MCA που είχε κατασκευαστεί από την ηλεκτρικη νικελίου χρησιμοποιήθηκε. Για CTC μορφολογική ανάλυση με χρώση Giemsa, ένα διαφανές MCA που είχε κατασκευαστεί από την ακτινοβολία λέιζερ από πολυ (τερεφθαλικό αιθυλένιο) (ΡΕΤ) χρησιμοποιήθηκε. Κάθε ένα από τα 10.000 κοιλοτήτων διατεταγμένων σε κάθε συστοιχία 100 × 100 κατασκευάστηκε για να έχουν διάμετρο 8-9 μm στην άνω επιφάνεια και να είναι 60 μm μακριά από το παρακείμενο μικροκοιλότητας. Πολυ (διμεθυλοσιλοξάνης) (PDMS) δομές κατασκευάσθηκαν και στη συνέχεια ενσωματωμένη με το MCA τέτοια ώστε η άνω υπόστρωμα αποτελείτο από ένα μικροθαλάμου, μια είσοδο δείγματος, και μια έξοδο, ενώ το κάτω υπόστρωμα κάτω από την MCA περιείχε μια γραμμή κενού για την παραγωγή αρνητικής πιέσεως, επιτρέποντας κυττάρων παγίδευση. Η συσκευή απομόνωση CTC κατασκευάστηκε με τη συναρμολόγηση της MCA, ενώ τα άνω και κάτω στρώματα PDMS κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ταινίες αποστάτη (Σχήμα 1α). Η είσοδος δείγμα συνδέεται με μια δεξαμενή, ενώ το μικροδιαύλου κενό συνδέθηκε με μία περισταλτική αντλία.

(α) Σχηματικό διάγραμμα της δομής του συστήματος MCA. (Β) ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης εικόνα μιας καλλιεργημένης κυτταρικής γραμμής όγκου παγιδευμένος στο σύστημα MCA. (C-F) κύτταρα που απομονώνονται από το αίμα του ασθενούς SCLC χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (γ) και φθορίζουσα-σημασμένα αντισώματα που στοχεύουν κυτοκερατίνης (d) και CD45 (Ε). Συγχώνευση των εικόνων (στ) επιτρέπονται για την αναγνώριση της ΚΜΑ και των κυττάρων αιματολογικές. μπαρ κλίμακας = 60 μm.

Η

CTC Καταμέτρηση χρησιμοποιώντας τα MCA Σύστημα

δείγματα ανθρωπίνου αίματος συλλέχθηκαν σε ένα σωλήνα συλλογής με EDTA για την πρόληψη της πήξης και χρησιμοποιείται μέσα σε 2 ώρες. Ο μέσος όγκος του αίματος που αναλύθηκαν ήταν 4,0 ml ανά δείγμα (εύρος 3,0 – 7,5 ml). Όλα CTC απαρίθμηση χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA έγινε χωρίς τη γνώση των ασθενών κλινικής κατάστασης στο εργαστήριο της Σιζουόκα Cancer Center Research Institute. Μετά την εισαγωγή των δειγμάτων αίματος μέσα στη δεξαμενή, η αρνητική πίεση εφαρμόζεται σε ένα κυτταρικό εναιώρημα χρησιμοποιώντας μία περισταλτική αντλία συνδεδεμένη με γραμμή κενού, επιτρέποντας στο δείγμα να περάσει μέσω των μικροκοιλοτήτων σε ένα ρυθμό ροής 200 μΕ /λεπτό. Για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε κύτταρα του αίματος που παραμένουν στη συστοιχία, PBS που περιέχει 2 mM EDTA και 0.5% BSA (1 mL) εισήχθη εντός της δεξαμενής και διέρχεται από τα μικροκοιλοτήτων σε ένα ρυθμό ροής 200 μΕ /λεπτό για 5 λεπτά.

για χρώση των CTCs με αντι-pancytokeratin αντίσωμα, παγιδευμένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με ροή 400 μι 1% παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε PBS μέσω της MCA με ρυθμό ροής 20 μL /λεπτό για 20 λεπτά. Μετά από πλύση με 100 μL PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 300 μι 0,2% Triton Χ-100 σε PBS σε ρυθμό ροής 20 μL /min για 15 λεπτά. Μετά διαπερατότητας, τα κύτταρα κατεργάστηκαν με 3% BSA σε PBS σε ρυθμό ροής 20 μL /λεπτό για 30 λεπτά. Για τον εντοπισμό ΚΜΑ και λευκοκύτταρα, 600 μL διαλύματος κυττάρου-χρώσης περιείχε 1 μg /mL του Hoechst 33342 (Molecular Probes)? ένα κοκτέιλ αντισωμάτων αντι-pancytokeratin (Alexa488-AE1 /ΑΕ3 (1:100 αραίωση? eBioscience, San Diego, CA, USA) και ΡΙΤΟ-CK3-6H5 (1:60 αραίωση? Miltenyi Biotec, Auburn, Καλιφόρνια Καλιφόρνια ΗΠΑ)? και ΡΕ-επισημασμένο αντι-CD45 αντίσωμα (αραίωση 1:120? BD Biosciences, San Jose, CA, USA) έρεε μέσα από τα μικροκοιλοτήτων σε ένα ρυθμό ροής 20 μL /λεπτό για 30 λεπτά Τέλος, η συστοιχία πλύθηκε με 400. . μι PBS που περιείχε 2 mM EDTA και 0.5% BSA για την απομάκρυνση τυχόν περίσσειας χρωστικής Μετά την ανάκτηση των κυττάρων του όγκου, μια εικόνα ολόκληρης της περιοχής συστοιχίας στοιχείων ελήφθη χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (BX61? της Olympus Corporation, Tokyo, Japan) ενσωματωμένη με 10 × αντικειμενικό φακό και έναν υπολογιστή που λειτουργεί με μοτέρ στάδιο? WU, Niba, και σετ φίλτρων WIG? α ψύχεται ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (DP-70? Ολύμπου Corporation)?. και λογισμικού απόκτηση Lumina Vision (Mitani Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία)

σε κλινικές μελέτες, μια ολόκληρη εικόνα της περιοχής συστοιχίας κυττάρων είχε ληφθεί χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Axio Imager Ζ1? Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) με ενσωματωμένο 10 × 20 × ή αντικειμενικό φακό και ηλεκτρονικό υπολογιστή- λειτουργεί με μοτέρ στάδιο? WU, FITC, και Texas Red σετ φίλτρων? μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (AxioCam HRc? Carl Zeiss)? και το λογισμικό απόκτηση AxioVision (Carl Zeiss). Στη συνέχεια, η ανάλυση της εικόνας είχε πραγματοποιηθεί και τα αντικείμενα που να ικανοποιεί προκαθορισμένα κριτήρια είχαν μετρηθεί. Φθορισμού εντάσεις και μορφομετρικών χαρακτηριστικών, όπως το μέγεθος των κυττάρων, το σχήμα, και η πυρηνική μέγεθος, θεωρήθηκαν κατά την εκτέλεση αναγνώρισης CTC και τον αποκλεισμό κυττάρων μη-όγκου, με κύτταρα που χαρακτηρίζονται από ένα γύρο για να οβάλ μορφολογία και ευδιάκριτο πυρήνα (δηλαδή, ως Hoechst-33342 θετικό) που ήταν θετικά για κυτοκερατίνη και αρνητικά για CD45 ταυτοποιήθηκε ως ΚΜΑ. Μεμονωμένες CTCs στο διαφανές MCA επίσης χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα May-Grünwald-Giemsa (MGG) μέθοδος χρώσης που αποτελείται από στερέωση με 4% PFA, μη αραιωμένο λεκές May-Grünwald για 2 λεπτά, Μάιος-Grünwald λεκές αραιωμένο κατά 50% σε PBS για 1 λεπτό , και χρώση Giemsa για 18 λεπτά, ακολουθούμενη από έκπλυση με PBS για 1 λεπτό.

CTC Καταμέτρηση χρησιμοποιώντας το σύστημα CellSearch

Ολόκληρα δείγματα αίματος διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, όλη τη νύκτα ταχυδρομηθεί στο εργαστήριο του SRL Inc., και υποβάλλονται σε επεξεργασία εντός 96 ωρών από τη συλλογή. Όλες οι αξιολογήσεις CTC διεξήχθησαν χωρίς γνώση του ασθενούς κλινικής κατάστασης στο εργαστήριο και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ποσοτικά ως ο αριθμός των CTCs /7.5 mL αίματος. ΚΜΑ ορίστηκαν ως άθικτα κύτταρα EpCAM-απομονωθεί δείχνει θετική χρώση για κυτοκερατίνη και αρνητική χρώση για CD45. Σύμφωνα με τις προηγούμενες εκτιμήσεις του CellSearch συστήματος [8], ο ασθενής θεωρήθηκε CTC θετική εάν ≥2 ΚΜΑ /7,5 ml αίματος ανιχνεύθηκαν στο δείγμα του ασθενούς.

Αποτελέσματα

CTC Απομόνωση και ανάλυσης εικόνας χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA

Απομόνωση και χρώση των καρκινικών κυττάρων από ολικό αίμα ολοκληρώθηκε μέσα σε 120-180 λεπτά, και σάρωση εικόνας της MCA πραγματοποιήθηκε σε 3 μήκη κύματος φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα 10 × 20 × ή αντικειμενικό φακό και ένα μηχανοκίνητο στάδιο. Σχήμα 1β-f δείχνει το μικροσκόπιο ηλεκτροσκοπίου σάρωσης (SEM) και οι εικόνες φθορισμού των χρωματισμένων κυττάρων που ανακτήθηκαν από την MCA. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, μοναχικά κύτταρα και συστάδες κυττάρων ξεχωριστά παγιδευτεί και διατηρούνται επί των μικροκοιλοτήτων που θα μπορούσαν να απαριθμηθούν εύκολα. Τα ανακτημένα κύτταρα που είχαν γύρο για να οβάλ μορφολογία και ένα ορατό πυρήνα (δηλαδή, ήταν Hoechst 33342 θετικοί) και ήταν θετικά για pancytokeratin και αρνητικά για CD45 ταυτοποιήθηκαν ως κύτταρα όγκου, ενώ CD45-θετικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως μολυσματικά φυσιολογικά κύτταρα αιματολογική. Οι εικόνες αποκαλύπτουν την ύπαρξη μιας ξεχωριστής ανοσοφαινότυπος των καρκινικών κυττάρων δείκτη θετικών επιθηλιακών κυττάρων. Αν και ένας αριθμός των λευκοκυττάρων συγκρατήθηκαν στη συστοιχία, καρκινικών κυττάρων απαρίθμηση ήταν σχετικά εύκολη, επειδή τα μεμονωμένα κύτταρα είχε παγιδευτεί στις ακριβώς ευθυγραμμισμένα μικροκοιλοτήτων.

ευαισθησία του συστήματος MCA σε CTC διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών γραμμών

Σε προηγούμενη μελέτη μας, ποικίλους αριθμούς κυττάρων της κυτταρικής σειράς καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-Η358 εμπλουτίστηκαν στο αίμα, και την απομόνωση των κυττάρων του όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα MCA μας [31]. Η υπολογιζόμενη απόδοση ανίχνευσης ήταν σταθερή και πάνω από 90% κατά 10-100 καρκινικά κύτταρα ήταν παρόντες ανά χιλιοστόλιτρο αίματος. Σε αυτή τη μελέτη, προκειμένου να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα ανάκτηση των διαφόρων καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA, 100 κύτταρα από κάθε μία από καρκινικές κυτταρικές γραμμές 8 πνεύμονα (Α549, HCC-827, NCI-H358, ΝΟΙ-Η441, PC-14 , DMS-72, ΝΟΙ-Η69, και NCI-H82) εμπλουτίστηκαν σε υγιή δείγματα αίματος δότη και στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία από δοκιμασία MCA. Ο Πίνακας 1 δείχνει τη μέση απόδοση ανάκτησης και τυπική διάμετρος των κυτταρικών γραμμών. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, ένα υψηλό ποσοστό ανάκτησης ελήφθη, ανεξάρτητα από τον τύπο του όγκου, που κυμαίνονται από 68% έως 100% στα πειράματα ακίδα-in κυτταρική γραμμή. Τα περισσότερα από τα ανακτηθέντα κύτταρα ήταν βιώσιμα και ικανά να πολλαπλασιάζονται ακόμη και μετά το στάδιο της απομόνωσης, υποδηλώνοντας τη δυνατότητα για περαιτέρω βιολογικές και μοριακή ανάλυση των CTCs.

Η

Στη συνέχεια, προκειμένου να αξιολογηθεί η ειδικότητα και ευαισθησία της ανίχνευση ΚΜΑ, οι δοκιμές ευαισθησίας πραγματοποιήθηκαν σε τεχνητά δείγματα που παρασκευάστηκαν με την προσθήκη 1 και 3 καλλιεργημένα κύτταρα NCI-Η358 σε υγιή δείγματα αίματος του δότη, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από Vona et al. [20]. Ένα και 3 καλλιεργημένα κύτταρα NCI-H358 εμπλουτίστηκαν σε ξεχωριστά κλάσματα 7.5 mL αίματος. Αυτά τα δείγματα αίματος 7.5 κ.εκ. υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το σύστημα MCA σε 3 ανεξάρτητες δοκιμές (Πίνακας S1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ένα όριο ευαισθησίας για το σύστημα MCA κοντά στο 1 κύτταρο όγκου ανά 7.5 mL αίματος. Επιπλέον, ΚΜΑ δεν ήταν ανιχνεύσιμα από 6 υγιείς αίματα δότη χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA (Σχήμα 2). Ως εκ τούτου, ένας ασθενής θεωρήθηκε CTC θετική εάν ≥1 ΚΜΑ ανά 7,5 mL αίματος ανιχνεύτηκε από το σύστημα MCA.

CTC καταμέτρηση /7,5 ml αίματος παρουσιάζεται για 6 υγιείς δότες, 22 ασθενείς με NSCLC και σε 20 ασθενείς με SCLC .

η

Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα ανάκτησης των κυττάρων του όγκου του συστήματος MCA συγκρίθηκε με εκείνη του συστήματος ISET (Σχήμα S1). Σε αυτή τη σύγκριση, 100 κύτταρα NSCLC κυτταρική γραμμή NCI-H358 εμπλουτίστηκε σε υγιή δείγματα αίματος δότη και στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία από το σύστημα MCA και ένα κομμάτι χαραγμένο πολυανθρακικό μεμβράνης πόρων 8-μm (Nucleopore? Whatman Ltd., Kent, Ηνωμένο Βασίλειο). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν το ποσοστό ανάκτησης χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA (100% ± 5%) για να είναι σημαντικά υψηλότερη από ότι η χρήση του συστήματος ISET (91% ± 2%) (ρ & lt? 0,05, t-test), υποδεικνύοντας ότι η χρήση της MCA σύστημα επιτρέπει την απομόνωση της CTC με απόδοση ισοδύναμη προς ή μεγαλύτερη από εκείνη του συστήματος ΟΑΣΗΣ.

CTC Καταμέτρηση χρησιμοποιώντας το CellSearch σύστημα και σύστημα MCA

για τη διεξαγωγή τυφλή σύγκριση της ευαισθησίας ανίχνευσης του συστήματα CellSearch και MCA, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από 22 μεταστατικό NSCLC και 21 ασθενείς με SCLC μεταξύ Απριλίου 2011 και Φεβρουάριος του 2012 και αναλύονται για τον προσδιορισμό του αριθμού των ασθενών που προσδιορίζονται ως CTC θετική από κάθε σύστημα (Πίνακας 2). Από αυτά τα δείγματα, 1 δείγμα συλλέγεται από την 1η SCLC ασθενής δεν αξιολογήθηκε από το σύστημα MCA επειδή μια ανεπαρκής όγκος του αίματος είχαν συλλεχθεί για επεξεργασία από τα δύο συστήματα. Ως αποτέλεσμα, 17 από τα 22 (77%) ασθενείς με NSCLC αναγνωρίστηκαν ως CTC θετικά χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA αλλά μόνο 7 από τους 22 ασθενείς (32%) με τη χρήση του NSCLC CellSearch σύστημα (Πίνακας 3). Από αυτούς τους ασθενείς, 8 ταυτοποιήθηκαν ως CTC θετική τόσο από την CellSearch συστήματος και του συστήματος των ΝΕΠ, 1 αναγνωρίστηκε ως CTC θετικό από μόνο του CellSearch σύστημα, και 9 ταυτοποιήθηκαν ως CTC θετικό από μόνο του συστήματος ΝΕΠ. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα που λαμβάνονται και από τα δύο συστήματα μαζί, 18 (82%) από τους ασθενείς με NSCLC ταυτοποιήθηκαν ως CTC θετική. Η ανάλυση αυτών των ευρημάτων αποκάλυψε ότι ένα σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό ασθενών με NSCLC ταυτοποιήθηκαν ως CTC θετικά από το σύστημα MCA (διάμεση τιμή αριθμού κυττάρων 13, εύρος 0-291 κύτταρα /7,5 ml? Σχήμα 2) από ό, τι από το CellSearch σύστημα (διάμεση τιμή αριθμού κυττάρων 0 , εύρος 0-37 κύτταρα /7,5 ml), αποδεικνύοντας τη στατιστική υπεροχή του συστήματος ΝΕΠ στην CTC απαρίθμηση (p = 0,0015, Wilcoxon τεστ?. πίνακα 3)

η

σε αντίθεση, 20 από τα 20 (100%) ασθενείς με SCLC ταυτοποιήθηκαν ως CTC θετικά με τη χρήση του συστήματος MCA έναντι 12 από τους ασθενείς 21 (57%) με τη χρήση του συστήματος CellSearch. Η διάμεση καταμέτρηση CTC βρέθηκε να είναι 2 κύτταρα /7,5 ml (εύρος 0-325) χρησιμοποιώντας το σύστημα CellSearch και 23 κύτταρα /7,5 ml (εύρος 2-2329) χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA (Σχήμα 2). Αν και δεν φθάνοντας σε επίπεδο στατιστικής σημασίας, η ευαισθησία ανίχνευσης του συστήματος MCA σε CTC απαρίθμηση έδειξε μία τάση προς μεγαλύτερη από εκείνη του CellSearch συστήματος (p = 0,2888, Wilcoxon τεστ? Πίνακας 3). Για κάθε ενδεχόμενο, η συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων των δοκιμών των συστημάτων αξιολογήθηκε από Bland-Altman οικόπεδα [33]. Στην ανάλυση της συμφωνίας σχετικά με CTC απαρίθμηση σε ασθενείς με NSCLC, η μέση διαφορά ήταν 50,1 (95% CI, εύρος 11,1 – 89,1), με τα όρια της συμφωνίας που κυμαίνονται -125,8 με 226,0. Το σύστημα MCA απέδωσε δυσανάλογα υψηλότερα CTC μετράει σε υψηλότερες μέσες τιμές σε σύγκριση με το CellSearch συστήματος (Σχήμα S2a). Αντίθετα, στην ανάλυση της συμφωνίας σχετικά με CTC απαρίθμηση στο SCLC ασθενείς, η μέση διαφορά ήταν 202,6 (95% CI, εύρος -116,7 – 521,9), με τα όρια της συμφωνίας που κυμαίνονται -1162,0 με 1567,2. Σε αντίθεση με την ανάλυση των δειγμάτων αίματος NSCLC, δεν παρατηρήθηκε καμία προκατάληψη μεταξύ των συστημάτων κατά την ανάλυση των δειγμάτων SCLC εκτός από άτομα με εξαιρετικά υψηλή CTC τίτλο (Σχήμα S2B). Η στατιστική ανάλυση έδειξε επίσης καμία συσχέτιση ανάμεσα στο site της μετάστασης και την καταμέτρηση CTC των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με τη χρήση είτε του συστήματος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η μορφολογική Χαρακτηριστικά της ΚΜΑ Απομονωμένα χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA

ΚΜΑ ήταν μετρήθηκαν, καθορίσθηκε ως θετικός κυτοκερατίνη και CD45 αρνητικών, και ότι έχει ένα ορατό πυρήνα με βάση την ανάλυση των εικόνων φθορισμού. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί στο Σχήμα 3, το οποίο δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό συλλογή από ΚΜΑ που προσδιορίζονται από την ανάλυση της εικόνας, ΚΜΑ είναι μεγαλύτερα από τα γύρω λευκοκυττάρων και συχνά εμφανίζονται σε ομάδες, ορίζονται εδώ ως συνεχόμενες ομάδες κυττάρων που περιέχουν 3 ή περισσότερους πυρήνες. Το Σχήμα 4 δείχνει ένα μοναχικό CTC και ένα σύμπλεγμα CTC ανιχνεύεται σε ένα SCLC ασθενή με τη χρήση του συστήματος ΝΕΠ. Χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA, CTC συστάδες παρατηρήθηκαν σε 2 από τους ασθενείς με NSCLC 22 (Ασθενής Νο 13 και 21) και 4 από τους ασθενείς με SCLC 21 (Αρ Ασθενής 31, 33, 34, και 43). Μάιος-Grünwald-Giemsa χρώση των CTCs απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA αποκάλυψε ότι χαρακτηρίζονται από μία υψηλή αναλογία N /C, πυρηνική χύτευση, και μορφολογική ομοιότητα με πρωτογενή κύτταρα όγκου.

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 , FITC-επισημασμένο αντι-κυτοκερατίνης αντίσωμα, και ΡΕ-επισημασμένο αντίσωμα αντι-CD45.

Η

Μπορεί-Grünwald-Giemsa χρώση κύτταρα έδειξαν μια υψηλή αναλογία πυρήνα-κυτταροπλάσματος και της πυρηνικής χύτευσης (× 40). Μαύρο βέλος δείχνει μικροκοιλότητας 9-μm. μπαρ κλίμακας = 60 μm.

Η

Συζήτηση

Τα συστήματα ISET έχουν βρεθεί να έχουν μεγαλύτερη ευαισθησία ανίχνευσης CTC από το CellSearch συστήματος σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC [17], [22] Ωστόσο, οι πόροι των φίλτρων ISET, τα οποία είναι κατασκευασμένα από πολυανθρακικό με χάραξη γραμμής, τοποθετούνται τυχαία μέσα στα συστήματα σε μία μη ομοιόμορφη πυκνότητα. Σε αντίθεση με τέτοια τροχιά-χαραγμένο πολυανθρακικά φίλτρα, το μέγεθος, τη γεωμετρία και την πυκνότητα των μικροκοιλοτήτων στο σύστημα MCA αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι επακριβώς ελεγχόμενη για την επίτευξη συγκεκριμένων διαχωρισμού κυττάρων ανάλογα με τις διαφορές στην κυτταρική μέγεθος και παραμόρφωσης. Ευθυγράμμιση κύτταρα στην MCA διευκολύνει όχι μόνο την απεικόνιση των κυττάρων, επιτρέποντας τη σάρωση των συγκεκριμένων περιοχών με ένα αυτοματοποιημένο μικροσκόπιο φθορισμού αλλά και δίνει τη δυνατότητα μείωσης του εργατικού δυναμικού που απαιτείται για την CTC καταμέτρηση [29], [31]. Ως εκ τούτου, το σύστημα MCA παρέχει μια πλατφόρμα για τη χρήση των τεχνολογιών απεικόνισης υψηλής απόδοσης που παρέχουν πιο ταχεία και λιγότερο δαπανηρή συλλογή των δεδομένων καθώς και CTC απαρίθμηση και προηγμένη ανάλυση των μοριακών φαινομένων, συμπεριλαμβανομένων in situ υβριδοποίηση για την ανίχνευση όγκο-ειδικών γονιδιωματική αλλαγές. Επιπλέον, η MCA είναι ενσωματωμένη με μια μικρογραφία της συσκευής έτσι ώστε ο εμπλουτισμός της ΚΜΑ από το αίμα, καθώς και βαφή και το πλύσιμο στο μικρορροϊκές δοκιμασία, μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσα σε μία ολοκληρωμένη συσκευή.

Στην παρούσα μελέτη, ΚΜΑ απομονωμένες σχετικά με την MCA επιτυχώς χρωματίστηκαν με φθορίζοντα σημασμένο αντισώματα που στοχεύουν δείκτες των καρκινικών κυττάρων, και χρώση και πλύσιμο βρέθηκαν να έχουν μικρή ή καμία επίδραση στην κατακράτηση των καρκινικών κυττάρων στις μικροκοιλότητες. Λόγω του πολύ μικρού μεγέθους του, το σύστημα MCA είναι φορητό, το οποίο, επιτρέποντας point-of-care καταμέτρηση CTC, εξαλείφει την ανάγκη για την αποστολή του αίματος για τον έλεγχο κάτω από αντίξοες συνθήκες μεταφοράς και επισπεύδει τη λήψη κλινικών αποφάσεων. Αυτά τα χαρακτηριστικά, εκτός από την πρόσφατα αναπτυχθείσα διαδικασία μας για την απομόνωση μεμονωμένων κυττάρων από την MCA χρησιμοποιώντας μικροτριχοειδή, επιτρέπουν στα κύτταρα του όγκου που πρέπει να ανακτηθεί από την MCA για τις επόμενες μοριακή ανάλυση της ΚΜΑ [29].

Σε αυτή την τυφλή σύγκριση της χρήση του συστήματος MCA με εκείνη του συμβατικού CellSearch σύστημα CTC απαρίθμηση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, το σύστημα MCA βρέθηκε ικανό απομόνωσης διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα εμβολιάζεται εντός ολικού αίματος σε υψηλά επίπεδα απόδοσης. Ωστόσο, το σύστημα MCA πραγματοποιήθηκε απομόνωση του SCLC κυτταρικών γραμμών ελαφρώς λιγότερο αποτελεσματικά σε σύγκριση με εκείνη των κυτταρικών σειρών NSCLC, υποδεικνύοντας ότι οι μικρές (& lt? 8 μm σε διάμετρο) κύτταρα των SCLC κυτταρικές γραμμές θα μπορούσε να περάσει διαμέσου των μικροκοιλοτήτων διάρκεια της διήθησης του αίματος. Σε μια προηγούμενη μελέτη [31], βρήκαμε ότι μαστού (MCF-7 και Hs578T), γαστρικό (AGS και SNU-1), και του παχέος εντέρου (SW620) κυττάρων όγκου γραμμές που περιλαμβάνουν ΕρΟΑΜ-αρνητικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να ανακτηθούν επιτυχώς χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA με απόδοση μεγαλύτερη από 80%. Ωστόσο, βρήκαμε επίσης ότι η αποτελεσματικότητα της ανάκτησης των μικρών κυττάρων (μέσος όρος διαμέτρου 11.6 μm) της κυτταρικής γραμμής όγκου SW620 να είναι ελαφρώς μικρότερη από εκείνη των άλλων κυτταρικών σειρών, όπως κάναμε των SCLC κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη.

το σύστημα MCA που εξετάζεται στην παρούσα μελέτη βρέθηκε να κατέχει μια μεγαλύτερη ευαισθησία ανίχνευσης από το CellSearch σύστημα NSCLC CTC απαρίθμηση, γεγονός που υποδηλώνει την υπεροχή του μεγέθους- και παραμόρφωσης που βασίζονται σε τεχνικές απομόνωσης σε σύγκριση με ανοσομαγνητικά με βάση τεχνικές. Η κακή ευαισθησία της CellSearch έχει αποδοθεί στην χαμηλή έκφραση EpCAM σε προχωρημένο NSCLC. Ωστόσο, ένα από τα NSCLC ασθενείς αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη βρέθηκε να είναι CTC θετικό με τη χρήση του CellSearch σύστημα αλλά CTC αρνητικό χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA, υποδεικνύοντας ότι οι μεταβολές στην έκφραση του EpCAM δεν μπορούν να εξηγήσουν μόνο για τις διαφορές που βρέθηκαν μεταξύ των δύο συστημάτων σε NSCLC απαρίθμηση .

το ποσοστό ανίχνευσης CTC χρησιμοποιώντας το CellSearch συστήματος σε ασθενείς με SCLC ήταν 67%, σημαντικά υψηλότερο από ότι σε ασθενείς με NSCLC και συνεπείς με αυτό που βρέθηκε σε προηγούμενες μελέτες [7], [34] – [36]. Αν και το σύστημα MCA δεν βασίζεται σε EpCAM έκφραση, η οποία κυκλοφορεί SCLC κύτταρα έχουν αναφερθεί ότι παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα [37], κατά την εκτέλεση απομόνωση CTC, η χρήση του βρέθηκε να δώσει ένα υψηλό ποσοστό ανίχνευσης, υποδεικνύοντας ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την CTC ανίχνευσης σε όχι μόνο NSCLC, αλλά και SCLC ασθενείς. Παρ ‘όλα αυτά, οι μετρήσεις CTC αρκετών ασθενών ήταν υψηλότερη όταν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το CellSearch System σε σύγκριση με το σύστημα MCA, υποδεικνύοντας ότι ορισμένες μικρές καρκινικών κυττάρων στο αίμα του ασθενούς θα μπορούσε να ρεύσει διαμέσου των μικροκοιλοτήτων, όπως περιγράφεται παραπάνω. Προηγούμενη έρευνα είχε δείξει ότι ανοσομαγνητικά τεχνικές διαχωρισμού δεν έχουν την ικανότητα να απομονώσει μεγάλες ομάδες, ενώ η χρήση των τεχνικών διαχωρισμού μεγέθους με βάση οδηγεί σε απώλεια των μικρών ΚΜΑ [17]. Για την αντιμετώπιση αυτών των προβλημάτων, το σχήμα των μικροκοιλοτήτων στην MCA τροποποιήθηκε για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητά τους στην απομόνωση μικρών κυττάρων από κύτταρα όγκου σε πλήρες αίμα σε πρόσφατη μελέτη μας [38].

Παρατήρηση των συστάδων CTC έχει αναφερθεί σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [23], [24], [39] – [42]. Υποτίθεται ότι σχηματίζουν σε συστάδες παρέχει κύτταρα CTC με πλεονεκτήματα σε σχέση με υπόλοιπα μοναχική άποψη της επιβίωσης, πολλαπλασιαστική ικανότητα, και την ικανότητα να σχηματίζουν μικρομεταστάσεων. Σε αυτή τη μελέτη, η CTC συστάδες απομονώθηκαν από δύο NSCLC και SCLC ασθενείς που χρησιμοποιούν το σύστημα των ΝΕΠ. Είναι ενδιαφέρον, τα CTC-θετικά συμπλέγματα ταυτοποιήθηκαν ως έχουν ένα μικρό αριθμό κυττάρων CTC από το CellSearch σύστημα, αλλά ένα μεγάλο αριθμό από το σύστημα MCA. Ένας λόγος για τον οποίο πολλές SCLC ασθενείς βρέθηκαν να έχουν ένα μεγάλο καταμέτρηση CTC όταν αξιολογούνται από το σύστημα MCA μπορεί να είναι ότι αυτό το σύστημα επιτρέπει την απομόνωση μεγαλύτερων συστάδων CTC που δεν μπορούν να απομονωθούν με ανοσομαγνητικό διαχωρισμό. Η εξέταση αυτής της υπόθεσης απαιτεί περαιτέρω λεπτομερή ανάλυση των χαρακτηριστικών της CTC συστάδες, όπως έκφραση των επιθηλιακών δεικτών και την παρουσία αποπτωτικών κυττάρων εντός συστάδες CTC, το οποίο θα μπορούσε να διεξαχθεί χρησιμοποιώντας το σύστημα MCA.

Εν κατακλείδι, μας