Αφηρημένο

Το UDP-γλυκουρονοσυλοτρανσφεράσης (UGT) οικογένεια των ενζύμων που διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στην αποτοξίνωση των καρκινογόνων ουσιών, καθώς και κάθαρσης των φαρμάκων κατά του καρκίνου. Στους ανθρώπους, οι 19 UGT τα μέλη της οικογένειας έχουν ταυτοποιηθεί και εκφράζονται σε ένα ιστό ειδικό τρόπο σε όλο το σώμα. Ωστόσο, οι UGTs δεν έχουν προηγουμένως η οποία χαρακτηρίζεται από μελανοκύτταρα ή μελάνωμα. Στην παρούσα μελέτη, UGT2B7, UGT2B10, και UGT2B15 ταυτοποιήθηκαν ως κανονικά εκφράζεται σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα. Οι ίδιες τρεις UGT μέλη της οικογένειας εκφράστηκαν επίσης στην πρωτογενή κυτταρική γραμμή μελανώματος WM115. Δεν UGT έκφραση ανιχνεύθηκε σε άλλη πρωτογενή κυτταρική γραμμή μελανώματος, WM3211, ή σε οποιαδήποτε μεταστατική κυτταρική γραμμή μελανώματος που εξετάστηκαν. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση UGT χάνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του μελανώματος. Θεραπεία του μεταστατικού μελανώματος κυτταρικές γραμμές με αντικαρκινικούς παράγοντες (συμπεριλαμβανομένων vemurafenib) επαγόμενη έκφραση του UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 αποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα μελανώματος WM3211 ή διατηρούν την ικανότητα να εκφράσουν εκ νέου αυτά τα ίδια τρία UGTs. Παρατηρήθηκε επίσης η αντίστοιχη αύξηση στη δραστικότητα γλυκουρονιδίωση σε κύτταρα μελανώματος μετά από θεραπεία κατά του καρκίνου. Επιπλέον, knockdown του UGT2B7 σε WM115 κύτταρα ευαισθητοποιημένα αυτά τα κύτταρα σε αγωγή με αδριαμυκίνη και επιρουμπικίνη υποδεικνύοντας ότι UGT2B7 εμπλέκεται στην αντίσταση σε αυτά τα φάρμακα. Ωστόσο, νοκ ντάουν της UGT2B7 δεν είχε καμία επίδραση στην τοξικότητα τεμοζολομίδη. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν σαφώς ένα ρόλο για UGTs στην αιτιολογία του μελανώματος. Δεδομένου ότι οι UGTs είναι φάρμακο ενζύμων του μεταβολισμού, προτείνουμε ότι η εκ νέου έκφραση των UGTs αποτελεί προηγουμένως δεν υπήρχαν υποψίες μηχανισμό εντός του όγκου της αντίστασης στα φάρμακα σε μελάνωμα

Παράθεση:. Dellinger RW, Matundan HH, Ahmed AS, Duong PH, Meyskens FL Jr (2012) αντικαρκινικά φάρμακα προκαλούν Re-Έκφραση των UDP-γλυκουρονοσυλτρανσφερασών στο μελάνωμα κύτταρα. PLoS ONE 7 (10): e47696. doi: 10.1371 /journal.pone.0047696

Επιμέλεια: Keiran Smalley, Η Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιούλη του 2012? Αποδεκτές: 17 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 22, Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Dellinger et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από τη γενναιόδωρη υποστήριξη από τους Όξναρντ και Waltmar Ιδρύματα, καθώς και επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο του Εθνικού Ινστιτούτου καρκίνου Υγείας [P30CA62330] για να FLM και επιχορήγηση της κατάρτισης του καρκίνου βιολογία [T32CA009054] παρείχε υποστήριξη των μισθών για RWD για το έργο αυτό. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Η οικογένεια UGT ενζύμων καταλύει την γλυκουρονιδίωση της ένα ευρύ φάσμα των ξενοβιοτικών και ενδογενών ενώσεων. UGTs σύζευξη ενός ημίσεως γλυκουρονικό οξύ στα υποστρώματα τους, για τροποποίηση των βιολογικών ιδιοτήτων του υποστρώματος και την ενίσχυση της έκκρισης της στα ούρα ή χολή [1], [2]. Σε γενικές γραμμές, γλυκουρονιδίωση μετατρέπει τα υποστρώματα σε λιγότερο βιοδραστικά, πιο υδατοδιαλυτά προϊόντα διευκολύνοντας την απομάκρυνση τους από το σώμα. Με αυτόν τον τρόπο, οι UGTs είναι αναπόσπαστα εμπλέκονται στην αποτοξίνωση των πολλών καρκινογόνων, η κάθαρση των φαρμάκων και ο μεταβολισμός μιας ποικιλίας των ενδογενών υποστρωμάτων όπως χολερυθρίνη, στεροειδείς ορμόνες και βιοδραστικά λιπίδια [1], [2]. Υπάρχουν 19 λειτουργική ανθρώπινη UGTs ταξινομηθούν σε τρεις υπο-οικογένειες με βάση δομικές και αμινοξέων ομολογία αλληλουχίας, UGT1A, UGT2A και UGT2B [2].

Οι UGTs δεσμεύονται μεμβράνη ένζυμα σε μεγάλο βαθμό εντοπισμένη στο ενδοπλασματικό δίκτυο [1], [3]. εξειδίκευση υποστρώματος ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των μελών της οικογένειας, με την ευρεία επικάλυψη, και ειδικότητα υπόστρωμά τους μπορεί να μεταβάλλεται με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως φωσφορυλίωση [4]. Αν και οι UGTs εκφράζεται κυρίως σε ήπαρ, παίζουν επίσης ζωτικό ρόλο σε άλλους ιστούς του σώματος. Για παράδειγμα, UGT2B15 και UGT2B17 εκφράζονται στον προστάτη, όπου ρυθμίζουν τοπικά επίπεδα ανδρογόνων μέσω γλυκουρονιδίωσης [5] και UGT1A10 και UGT2B7 εκφράζονται στο στήθος, όπου ρυθμίζει τα οιστρογόνα [6]. Υπάρχουν επίσης άφθονες αποδείξεις ότι οι UGTs παίζουν σημαντικούς ρόλους στην αεροπεπτικού σωλήνα, του γαστρεντερικού σωλήνα, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, της ουροδόχου κύστης, των νεφρών και του εγκεφάλου [7], [8], [9], [10], [11]. Ωστόσο, ο ρόλος των UGTs στο δέρμα, το μεγαλύτερο όργανο του σώματος, δεν έχει ακόμη διερευνηθεί.

Το μελάνωμα είναι ένας από τους ταχύτερα αναπτυσσόμενους τύπους όγκων στις Ηνωμένες Πολιτείες και τον αριθμό των περιπτώσεων σε όλο τον κόσμο έχει διπλασιαστεί τα τελευταία 30 χρόνια [12]. Μελάνωμα, η οποία προκύπτει από μελανοκύτταρα, είναι μια εξαιρετικά επιθετική όγκου που εισβάλλει τα συστήματα αγγειακών και λεμφικών να σχηματίσουν όγκους σε άλλα σημεία του σώματος [12], [13], [14]. Το μελάνωμα είναι ένας ιδιαίτερα ανθεκτική καρκίνου, αντιπροσωπεύοντας μόνο το 4% όλων των καρκίνων του δέρματος, αλλά ευθύνεται για το 80% των θανάτων από καρκίνο του δέρματος [15]. Επιπλέον, μόνο το 14% των ασθενών με μεταστατικό μελάνωμα επιβιώσουν για 5 χρόνια [15].

συστημικές προσεγγίσεις θεραπείας έχουν επιτύχει ελάχιστη επιτυχία ενάντια μεταστατικό μελάνωμα με αποτέλεσμα σε λίγα μόνο FDA-εγκριθεί θεραπείες [16]. Η ιντερφερόνη-α 2b, ιντερλευκίνη-2 και τεμοζολομίδη έχουν όλα αποδειχθεί περιορισμένη αποτελεσματικότητα με ποσοστά ανταπόκρισης γενικά κάτω από 15% σε σύντομο χρονικό διάστημα χωρίς σαφή επίδραση στη θνησιμότητα του μελανώματος σχετίζεται [16]. Ωστόσο, η πρόσφατη επιτυχία της συγκεκριμένης BRAF μεταλλαγμένο αναστολέας vemurafenib σε μια κλινική μονοπάτι Φάση 1 είναι πολύ ελπιδοφόρα [17]. Εκτιμάται επιβίωση χωρίς εξέλιξη της 7 μήνες αναφέρθηκε μεταξύ όλων των ασθενών που φέρουν το BRAF V600E μετάλλαξη [17], η οποία είναι παρούσα σε περίπου 50% του συνόλου των μελανωμάτων [18]. Ωστόσο, ο ενθουσιασμός για vemurafenib ως μονοθεραπεία έχει μετριαστεί κάπως από επίκτητη αντοχή έχει ήδη παρατηρηθεί [17]. Έτσι, η κατανόηση του μηχανισμού (-ών) αντίστασης στη χημειοθεραπεία που τα κύτταρα του μελανώματος απασχολούν είναι υψίστης σημασίας για την καταπολέμηση αυτής της θανάσιμης ασθένειας.

Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει την έκφραση και τη λειτουργία των UGTs στα μελανοκύτταρα και το μελάνωμα και να εξετασθεί ο πιθανός ρόλος των UGTs της αντίστασης στα φάρμακα. Στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ αποκαλύπτει τρεις UGT μέλη της οικογένειας, UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15, όπως εκφράζεται συνήθως σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα απομονώθηκαν από νεογνική foreskins. Οι ίδιες τρεις UGTs βρέθηκαν να εκφράζονται σε πρωτογενή κυτταρική γραμμή μελανώματος WM115. Είναι ενδιαφέρον, δεν UGT έκφραση παρατηρήθηκε σε άλλο πρωτογενές κυτταρική γραμμή μελανώματος, WM3211, ή σε οποιαδήποτε από τις τρεις μεταστατικού κυτταρικές σειρές μελανώματος που εξετάστηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση UGT χάνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του μελανώματος. Ωστόσο, η θεραπεία του μελανώματος κυττάρων με αντικαρκινικούς παράγοντες έχει ως αποτέλεσμα την εκ νέου έκφραση αυτών των ίδιων τριών UGTs. Αυτή η νέα επανέκφραση του UGTs σε μελάνωμα ερευνάται περαιτέρω στην παρούσα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Cell Culture

τεμοζολομίδη, αδριαμυκίνη, επιρουβικίνη και αλαμεθικίνη ελήφθησαν από την Sigma . Vemurafenib αγοράστηκε από Σέλεκ (Houston, ΤΧ). Φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα απομονώθηκαν από απο-προσδιορίζονται νεογέννητο ακροποσθία από τη χειρουργική επέμβαση περιτομή, σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Εσωτερικής κριτική UC Irvine της. Σύμφωνα με αυτή την εγκεκριμένο πρωτόκολλο δεν υπάρχει πρόσληψη των θεμάτων, μόνο απορρίπτονται περιτομή ιστός συλλέγεται. Δεν εντοπισμό πληροφορίες συλλέγονται σχετικά με αυτό ιστό που θα μπορούσαν αλλιώς να απορρίπτεται. Τα μελανοκύτταρα απομονώθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [19], [20] και καλλιεργήθηκαν σε MCDB153 μέσα συμπληρωμένα με 2% εμβρυϊκό βόειο ορό, 10 ng /ml 12-Ο-tetradecanoylphobol-13-οξικό άλας και 0,15% εκχύλισμα βόειας υπόφυσης. Οι κυτταρικές σειρές μελανώματος WM115, WM3211, Lu1205, SKmel28 και Α375 καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [22], [23]. Μόνο WM3211 έχει WT B-Raf, όλοι οι άλλοι λιμάνι μεταλλάξεις V600E. Όλες οι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν αρνητικές για μυκόπλασμα.

Ολικό RNA Απομόνωση, αντίστροφη μεταγραφή και PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας το ολικό RNA Arum mini Kit (BioRad) σύμφωνα με τις εταιρείες που παρέχονται πρωτόκολλο. RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop 1000 (Thermo /Fisher) cDNA έγινε στη συνέχεια από 1.0 μg του RNA χρησιμοποιώντας το iScript Reverse Transcriptase Kit (BioRad) σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα. PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα Taq Quick φορτίο (2Χ) κύριο μίγμα (New England Biolabs) και τρέχουν σε ένα Applied Biosystems GeneAmp System 2700 θερμοκυκλωτή χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρωτόκολλο: Στάδιο 1 = 94 ° C για 5 λεπτά? Βήμα 2 (40 κύκλοι) = 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 68 ° C για 1 λεπτό? Βήμα 3 = 68 ° C για 10 λεπτά. Πίνακας S1 σε συμπληρωματικά στοιχεία παρατίθενται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση μεμονωμένων UGT μέλη της οικογένειας.

Real-Time PCR

Για να αναλύσουμε τα επίπεδα έκφρασης UGT mRNA σε κύτταρα μελανώματος σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3], [24]. Εν συντομία, προσχεδιασμένες δοκιμασίες έκφρασης TaqMan Gene [Applied Biosystems (Hs02383831_s1 ID για UGT2B4? Hs00426592_m1 για UGT2B7? Hs02556282_s1 για UGT2B10? Hs03008769_g1 για UGT2B15 και Hs99999905_m1 για GAPDH)] χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν συνολικό όγκο 20 μΙ που περιέχει 50 ng του cDNA χρησιμοποιώντας GAPDH ως γονίδιο ομαλοποίηση »housekeeping». Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα μηχάνημα CFX96 PCR Πραγματικού χρόνου (BioRad). Αναφερόμενες τιμές έκφρασης του mRNA είναι ο μέσος όρος τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα με τυπική απόκλιση.

shRNA

Έτοιμα κλωνοποιημένα shRNA στοχεύουν ενάντια UGT2B7 και τον έλεγχο άδειο φορείς έκφρασης αγοράστηκαν ΟηΟεηε. Κάθε φορέας shRNA μετασκευάστηκε σε WM115 κύτταρα με τη χρήση του παράγοντα επιμόλυνσης Biot (Bioland Scientific) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή και σταθερή έκφραση επιλέχθηκε από την προσθήκη πουρομυκίνης (Invivogen).

ΜΤΤ Δοκιμασία

Για να τον προσδιορισμό των επιδράσεων των φαρμάκων επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού εκτελέσαμε 3- (βρωμιούχο 4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ-2,5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ) δοκιμασίες (Sigma Aldrich). Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα στους 2000-4000 κύτταρα /καλά (ανάλογα με την κυτταρική χρόνους διπλασιασμού) σε πλάκες 96 φρεατίων, και αγωγή είτε με αδριαμυκίνη, επιρουβικίνη, ή temozolomide σε σειριακές αραιώσεις του φαρμάκου. Μετά την τρίτη ημέρα μετά την αγωγή, ΜΤΤ αραιωμένο σε βαφή χωρίς μέσου προστίθεται σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 3 ώρες. Μόλις η ΜΤΤ μεταβολίζεται από ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα σε αδιάλυτο στο νερό formazen τότε, διμεθυλοσουλφοξείδιο (Sigma Aldrich) προστίθεται και οι χρωματομετρικές αλλαγές αναλύονται και ποσοτικοποιούνται με φασματοφωτόμετρο στα 590 nm. τα αποτελέσματα από ΜΤΤ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Graphpad Prism όπου η δοσολογία του φαρμάκου έναντι επίδρασή της επί του πολλαπλασιασμού απεικονίζεται γραφικά? μια μη-γραμμική καμπύλη παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας την εξίσωση σιγμοειδούς δόσης-απόκρισης προσαρμόστηκε πάνω στο γράφημα και το ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) λαμβάνεται. Αναφέρθηκαν IC

50 τιμές είναι ο μέσος όρος τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα με τυπική απόκλιση.

UGT Δραστηριότητα Δοκιμασία

UGT δραστηριότητα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία UGT-Glo (Promega) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. ομογενοποιήματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με επαναιώρηση σύμπηκτα κύτταρα σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (25 mM βάση Tris, 138 mM NaCl και 2.7 mM ΚΟΙ? ρΗ 7.4) και την υποβολή τους σε τρεις γύρους κατάψυξης-απόψυξης πριν από την ομογενοποίηση χρησιμοποιώντας ένα ομογενοποιητή υάλου Dounce . ομογενοποιήματα κυττάρων (5-20 mg πρωτεΐνης /ml) αποθηκεύτηκαν στους -70 ° C σε 100 μΙ κλάσματα. Σύνολο συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των κυττάρων ομογενοποίημα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BCA από την Pierce Biotechnology (Rockford, IL) μετά από εκχύλιση της πρωτεΐνης με τη χρήση τυποποιημένων πρωτοκόλλων. Ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα (Xenotech, Lenexa, KS) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Τα ομογενοποιήματα επωάστηκαν με αλαμεθισίνη επί 10 λεπτά επί πάγου. Κάθε αντίδραση αποτελούνταν από 50 μg προϊόντος ομογενοποίησης, ρυθμιστικό UGT-Glo, 50 μΜ UGT πολυενζυμικό υποστρώματος και το νερό σε ένα σύνολο 30 μλ. Έπειτα προστέθηκαν είτε 10 μΙ ύδατος ή 10 μΙ 16 mM UDPGA (τελική συγκέντρωση 4 mM). Κάθε μία από αυτές τις αντιδράσεις έγινε εις τριπλούν (συνολικά 6 αντιδράσεων για κάθε προϊόν ομογενοποίησης). Οι αντιδράσεις στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά. Μόνο οι αντιδράσεις με το συν-υπόστρωμα UDPGA προστεθεί μπορεί glucuronidate υπόστρωμα. Μετά από 90 λεπτά, 40 μΙ αντιδραστηρίου λουσιφερίνης Detection συν D-κυστεΐνη προστίθεται σε όλα τα φρεάτια και το σήμα φωταύγειας αφήνεται να σταθεροποιηθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Πλάκα στη συνέχεια αναγνώστηκε σε ένα φωτόμετρο (Turner Biosystems μέτρο μικροπλάκα). Ως αρνητικός έλεγχος διεξήχθη ένα σύνολο έξι αντιδράσεις χωρίς καμία UGTs παρόν. Η UGT πολυενζυματικής υποστρώματος θα παράγει φωταύγεια, αλλά η γλυκουρονιδιακό UGT υπόστρωμα πολυενζυματικής δεν θα. Έτσι, ο μέσος όρος των τριπλών αντιδράσεων με το UDPGA συν-υπόστρωμα αφαιρείται από το μέσο όρο των εις τριπλούν αντιδράσεις χωρίς UDPGA να προσδιοριστεί UGT δραστηριότητα. Γραφήματα είναι το σύνθετο πολλαπλών ανεξάρτητων πειραμάτων με τυπική απόκλιση.

Αποτελέσματα

UGT Έκφραση στα ανθρώπινα μελανοκύτταρα και Μελανώματος

Αν και UGT έκφραση έχει προηγουμένως αναφερθεί στο δέρμα [25 ], UGT έκφραση στα μελανοκύτταρα δεν είχε αντιμετωπισθεί ειδικά. Στην παρούσα μελέτη, ανθρώπινα μελανοκύτταρα απομονώθηκαν από νεογέννητους ακροβυστίες αποχαρακτηριστούν αναλύθηκαν για UGT έκφρασης με RT-PCR. Primer σύνολα σχεδιασμένα για τα μέλη της οικογένειας επιμέρους UGT2B χρησιμοποιήθηκαν, καθώς και μία κοινή ομάδα εναρκτήρα για την ανίχνευση οποιουδήποτε μέλους της οικογένειας UGT1A. Οι UGT2As δεν μετρήθηκαν όπως βρίσκονται σε μεγάλο βαθμό στο οσφρητικό σύστημα [26]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 βρέθηκαν να εκφράζεται σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα. Τα προϊόντα PCR που υποδεικνύεται από τον μαύρα βέλη (Σχήμα 1Α) έτρεξε στα προβλεπόμενη μεγέθη, αποκόπηκαν και τα μεμονωμένα UGT αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν. Η ζώνη στην UGT2B4 λωρίδα (Σχήμα 1Α, λωρίδα 1) επίσης αποκόπηκε και προσδιορίσθηκε να είναι UGT2B7 με προσδιορισμό της αλληλουχίας. Αυτό δεν αποτελεί έκπληξη, όπως τα μέλη της οικογένειας UGT2B μοιράζονται υψηλής ομολογίας. Στην πραγματικότητα, UGT2B4 και UGT2B7 μοιράζονται μεγαλύτερη από 90% ταυτότητα στο επίπεδο ϋΝΑ και στρατηγικές για ειδικούς εκκινητές είναι δύσκολη. Ως μάρτυρας, RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση RNA ήπατος για να αποδειχθεί ότι η UGT εκκινητές σύνολα ήταν λειτουργική και δείχνουν προβλεπόμενη μεγέθη για κάθε UGT αμπλικόνιο (Σχήμα 1Β). Η έκφραση αυτών των ίδιων τριών UGT μέλη της οικογένειας παρατηρήθηκε επίσης σε ανθρώπινο μελανοκύτταρα από ένα δεύτερο νεογνική ακροποσθία αποχαρακτηριστούν (Πίνακας 1? ΣΗΜΕΙΩΣΗ ότι οι αριθμοί 322 και 423 υποδηλώνουν απλώς ημερομηνίες ακροποσθίας ελήφθη από Καυκάσιος βρέφη). Στη συνέχεια, UGT έκφραση εξετάστηκε σε διάφορες πρωτογενείς και μεταστατικούς κυτταρικές σειρές μελανώματος με RT-PCR. Σύμφωνα με την UGT πρότυπο έκφρασης που παρατηρείται στα μελανοκύτταρα, η κύρια κυτταρική σειρά μελανώματος WM115 εκτίθενται μόνο UGT2B7, UGT2B10 και έκφραση UGT2B15 (Σχήμα 1C). Λόγω της υψηλής ομολογίας των μελών της οικογένειας, και παρόμοιο με το Σχήμα 1Α, το συγκρότημα «UGT2B4» στο Σχήμα 1C προσδιορίστηκε να είναι UGT2B7 μετά της αλληλουχίας του DNA. Επίσης, η άνω ζώνη στη λωρίδα UGT1A αποκόπηκε και η αλληλουχία (παρόλο που ήταν μικρότερο από το αναμενόμενο μέγεθος) και ήταν αποφασισμένος να μην είναι οποιοδήποτε UGT μέλος της οικογένειας. Δεν UGT έκφραση παρατηρήθηκε σε άλλο πρωτογενές κυτταρική γραμμή μελανώματος, WM3211 (Σχήμα 1D), ή σε οποιαδήποτε από τις τρεις μεταστατικές κυτταρικές σειρές μελανώματος που εξετάστηκαν (συνοψίζονται στον Πίνακα 1? Απεικονίζονται στο Σχήμα S1). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η έκφραση UGT χάνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του μελανώματος.

(Α) RT-PCR ανάλυση του ολικού RNA από ανθρώπινο μελανοκύτταρα για UGT μέλη της οικογένειας. Primer σύνολα για τις UGT2Bs είχαν σχεδιαστεί ώστε να είναι συγκεκριμένες για κάθε ισομορφή ενώ ένα ενιαίο σύνολο αστάρι στρέφεται κατά της κοινής περιοχής όλων των UGT1As χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης UGT1A. Ολικό RNA από ανθρώπινο ήπαρ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος με τους εκκινητές UGT2B7. Τα βέλη δείχνουν ζώνες DNA του αναμενόμενου μεγέθους του οποίου η αλληλουχία επιβεβαιώθηκε. (Β) ανάλυση ελέγχου RT-PCR του ολικού RNA από ήπαρ χρησιμοποιώντας υποδεικνύεται εκκινητές σετ. ανάλυση (C) RT-PCR ολικού RNA από την κυτταρική γραμμή μελανώματος του ανθρώπου WM115 χρησιμοποιώντας υποδεικνύεται εκκινητές σετ. Τα βέλη υποδεικνύουν μπάντες που αποκόπηκαν και προσδιορίστηκε η αλληλουχία. Band στο UGT2B4 λωρίδα βρέθηκε να UGT2B7 με αλληλούχιση ενώ UGT2B10 και UGT2B15 μπάντες επιβεβαιώθηκαν πρέπει να αναμένεται UGTs. ανάλυση (Δ) RT-PCR ολικού RNA από την κυτταρική γραμμή μελανώματος του ανθρώπου WM3211. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος εδώ για να διασφαλιστεί η ποιότητα cDNA. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς TaqMan κατά υποδεικνύεται UGTs. ND = δεν ανιχνεύθηκε.

Η

Για να βελτιωθεί η ευαισθησία και η ειδικότητα της UGT mRNA ανίχνευσης, αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης TaqMan χρησιμοποιήθηκαν για το υπόλοιπο της παρούσας έκθεσης. Αυτές οι δοκιμασίες έχουν βελτιστοποιηθεί για να είναι ειδικά για επιμέρους UGTs χρήση ενός ανιχνευτή, καθώς και ένα σύνολο εκκινητών. Για να φανεί αυτό το σημείο, και την εκ νέου επιβεβαιώνουν ότι UGT2B7 είναι παρούσα στα μελανοκύτταρα, σε αντίθεση με UGT2B4, real-time PCR δοκιμασίες που χρησιμοποιούν TagMan πραγματοποιήθηκε σε cDNA μελανοκυττάρων. Σχήμα 1Ε δείχνει σαφώς ότι UGT2B7 πράγματι εκφράζεται σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα και UGT2B4 δεν ανιχνεύθηκε.

Re-έκφραση UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 σε μελάνωμα σε απάντηση αντικαρκινικά φάρμακα

Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι UGTs είναι φάση II ένζυμα του μεταβολισμού και μια από τις βασικές λειτουργίες τους συστηματικά είναι να εξαλείψει τα ναρκωτικά, εξετάσαμε αν οι UGTs θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην εγγενή αντίσταση των κυττάρων μελανώματος σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Έτσι, η κυτταρική σειρά μελανώματος WM3211 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορους παράγοντες κατά του καρκίνου και UGT έκφραση αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. WM3211 επελέγη για αυτά τα πειράματα δεδομένου ότι δεν έχει ανιχνεύσιμη έκφραση UGT όπως προσδιορίζεται με RT-PCR (Σχήμα 1 D).

Πρώτα κατεργάζεται WM3211 κυττάρων με τεμοζολομίδη, που σήμερα ενδείκνυται για τη θεραπεία του μεταστατικού μελανώματος. Μια δόση των 100 μΜ επιλέχθηκε για αυτό το πείραμα επειδή δημοσιευμένες αναφορές για την αγωγή τεμοζολομίδης κυτταρικής καλλιέργειας χρησιμοποιούν συνήθως τουλάχιστον 100 μΜ [27], [28]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2α, UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 επανα-εκφράζεται σε WM3211 κύτταρα σε απόκριση στην τεμοζολομίδη. Είναι ενδιαφέρον, καμία άλλη UGTs επάχθηκαν (τα δεδομένα δεν φαίνονται), μόνο οι τρεις UGT μέλη της οικογένειας που κανονικά εκφράζονται σε μελανοκύτταρα (Πίνακας 1). Η επαγωγή της UGT έκφρασης σε απόκριση στην τεμοζολομίδη συμπεριφέρθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με μέγιστη έκφραση κορυφώθηκε σε 8 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα 2Α). Για όλες τις τρεις UGTs έκφραση τους μειώνεται μετά από 8 Ώρες, αλλά η έκφρασή τους είναι ακόμα αυξημένα 24 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικόνα 2Α).

προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης προσχεδιασμένα Taqman χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει μεμονωμένα UGT έκφραση με πραγματικού χρόνου PCR παρακάτω κατεργασία των κυττάρων WM3211 με (Α) 100 μΜ τεμοζολομίδη, (Β) 1,0 μΜ αδριαμυκίνη ή (Γ) 0,1 μΜ επιρουβικίνη. Σε όλες τις περιπτώσεις, UGT2B7, UGT2B10 και έκφραση UGT2B15 εξετάστηκε για την υποδεικνυόμενη αντικαρκινικού παράγοντα σε 0, 8, 16 και 24 ώρες μετά τη θεραπεία. * Υποδηλώνει διαφορετική κλίμακα για y-άξονα.

Η

Για να διευκρινιστεί αν η εκ νέου έκφραση αυτών των τριών UGT μέλη της οικογένειας ήταν ειδική για την τεμοζολομίδη ή αν αυτή η παρατηρούμενη απόκριση μπορεί να είναι ένα γενικό μηχανισμό για το μελάνωμα να αμυνθεί κατά χημειοθεραπευτικά, εξετάστηκαν επίσης τα αντι-καρκινικοί παράγοντες αδριαμυκίνη και epirubicin. επιλέγεται Αυτές οι δύο ενώσεις, δεδομένου ότι συνδέονται στενά ανθρακυκλίνες που συνήθως χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία διαφόρων τύπων συμπαγών όγκων αν και το μελάνωμα έχει αποδειχθεί ότι είναι ανθεκτικά [29], [30]. Επιπλέον, επιρουβικίνη είναι γνωστό ότι μεταβολίζεται κυρίως από UGT2B7 [31], ενώ ο μεταβολισμός της αδριαμυκίνης είναι πολύ πιο περίπλοκη και περιλαμβάνει πολλά διαφορετικά ένζυμα II (συμπεριλαμβανομένων UGTs) Φάση και τους μεταφορείς ABC [30]. WM3211 κύτταρα μελανώματος ήταν είτε χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 0.1, 1.0 ή 10 μΜ αδριαμυκίνη (Σχήμα S2A) ή επιρουβικίνη (Σχήμα S2B) και UGT έκφραση εξετάστηκε με PCR πραγματικού χρόνου μετά από 8 ώρες. Και στις δύο περιπτώσεις UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 παρατηρήθηκαν να είναι εκ νέου εκφράζεται. Παρόμοια με τεμοζολομίδη, κανένα άλλο μέλος της οικογένειας UGT προκλήθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). μαθήματα Χρόνος εξέταση UGT έκφραση μετά την επεξεργασία των κυττάρων με WM3211 1,0 μΜ αδριαμυκίνη (Σχήμα 2Β) ή 0,1 μΜ επιρουβικίνη (Σχήμα 2C) στη συνέχεια διεξάγεται. Και στις δύο περιπτώσεις UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 επάγονται σε ένα χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, με την υψηλότερη έκφραση παρατηρήθηκε σε 24 ώρες.

Re-έκφραση UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 στο μεταστατικό μελάνωμα κυττάρων σε απόκριση σε Epirubicin και Vemurafenib

για να εξασφαλισθεί ότι η παρατηρηθείσα επαγωγή της UGTs δεν περιορίστηκε σε WM3211 κύτταρα, δύο κυτταρικές γραμμές μεταστατικού μελανώματος (Α375 SKmel28 και) εξετάστηκαν για επαγωγή UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 σε απόκριση σε επιρουβικίνη. μαθήματα Χρόνος εξέταση UGT έκφραση μετά από θεραπεία SKmel28 (Σχήμα 3Α) ή Α375 (Σχήμα S3) με 0,1 μΜ epirubicin συνέχεια διεξήχθησαν. Για άλλη μια φορά, η επαγωγή και των 3 UGTs παρατηρήθηκε σε δύο από αυτές τις μεταστατικές κυτταρικές γραμμές μελανώματος με μέγιστη έκφραση σε 24 ώρες. Επιπλέον, δεδομένου ότι η αντίσταση έχει παρατηρηθεί σε κλινικές δοκιμές με πολλά υποσχόμενη νέα vemurafenib φαρμάκου, εξετάσαμε αν οι UGTs μπορούσαν να προκαλείται μετά vemurafenib θεραπεία. κύτταρα SKmel28, τα οποία φιλοξενούν τη μετάλλαξη BRAF V600E, υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ vemurafenib, συλλέγονται σε 0, 8, 16 και 24 ώρες μετά την αγωγή και προσδιορίστηκαν για επίπεδα έκφρασης UGT. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 ήταν όλα επάγεται σε απόκριση vemurafenib.

προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης προσχεδιασμένα Taqman χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει μεμονωμένα UGT έκφρασης με PCR πραγματικού χρόνου μετά την αγωγή των κυττάρων με SKmel28 (Α ) επιρουβικίνη ή (Β) vemurafenib. Χρονική πορεία της UGT2B έκφρασης μετά επιρουβικίνη (100 ηΜ) ή vemurafenib (1 μΜ) αγωγή εξετάστηκε σε 0, 8, 16 και 24 ώρες. * Υποδηλώνει διαφορετική κλίμακα για y-άξονα. ND = δεν ανιχνεύθηκε.

Η

Αυξημένη γλυκουρονιδίωση στο μελάνωμα κύτταρα μετά από θεραπεία με ένα αντικαρκινικό παράγοντα

Μετά αποδεικνύοντας ότι UGTs μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν εκφράζεται σε κύτταρα μελανώματος μετά από θεραπεία με αντι- παράγοντες του καρκίνου, η προφανής ερώτηση ήταν αν δραστηριότητα UGT αποκαταστάθηκε, καθώς και. Ως εκ τούτου, γλυκουρονιδίωση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία UGT-Glo σε κυτταρικές σειρές μελανώματος που στερούνται έκφρασης UGT και σε σύγκριση με τις ίδιες κυτταρικές σειρές μετά από την επεξεργασία με epirubicin. Αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιεί ένα υπόστρωμα UGT πολυενζυμικό οποίο αντιδρά με το αντιδραστήριο ανίχνευσης λουσιφερίνη να δώσει φως που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί σε ένα φωτόμετρο. Ωστόσο, αν το υπόστρωμα γλυκουρονιδιώνεται τότε θα αντιδράσει πλέον με το αντιδραστήριο ανίχνευσης λουσιφερίνη να δώσει φως. Έτσι, οι δύο αντιδράσεις συσταθεί ανά δείγμα, ένας με τον UDPGA συν-υπόστρωμα και η άλλη χωρίς. Μόνο η αντίδραση με την UDPGA θα παράγει γλυκουρονιδιακό υπόστρωμα αν UGTs είναι παρόντες και ενεργοί. Με τον τρόπο αυτό η συνολική UGT δραστηριότητα για το δείγμα μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με τη διαφορά εκπεμπόμενο φως μεταξύ των δύο αντιδράσεων.

Πρώτον, τα κύτταρα WM3211 πρωτογενές μελάνωμα εξετάστηκαν για UGT δραστηριότητα. Τα κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (ΟΗΕ) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με επιρουβικίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα και δοκιμάστηκαν για UGT δραστηριότητα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, UGT δραστικότητα αυξήθηκε σε απόκριση προς epirubicin θεραπεία σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, υπήρξε κάποια βασική δραστικότητα γλυκουρονιδίωση στα μη επεξεργασμένα κύτταρα WM3211 υποδεικνύοντας ότι οι UGTs εκφράζονται σε αυτή την κυτταρική γραμμή, αλλά σε επίπεδα κάτω την ανίχνευση του πειράματος RT-PCR μας (Σχήμα 1 D). Ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος, καθώς έχουν πολύ υψηλές συγκεντρώσεις UGTs και δεν υπήρχε παρούσα στο αρνητικό έλεγχο στο λογαριασμό για κάθε σήμα υποβάθρου ομογενοποιήματος. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν το πείραμα επαναλήφθηκε για δύο μεταστατικά κύτταρα μελανώματος γραμμές, SKmel28 (Σχήμα 4Β) και Α375 (Εικόνα 4C). Σε δύο από αυτές τις κυτταρικές σειρές UGT δραστηριότητα αυξήθηκε δραματικά μετά τη θεραπεία με epirubicin. Σε αντίθεση με WM3211 κύτταρα, ούτε μεταστατική κυτταρική γραμμή εμφάνισε UGT δραστικότητα απουσία της θεραπείας. Για άλλη μια φορά ανθρώπινα μικροσώματα ήπατος χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος και ο αρνητικός έλεγχος δεν είχε ομογενοποίημα κυττάρου

δραστικότητα γλυκουρονιδίωση εξετάστηκε από τη Δοκιμασία UGT-Glo χρησιμοποιώντας 50 μg ομογενοποιήματος ανά αντίδραση σε κυτταρικές σειρές μελανώματος τρία.? (Α) WM3211 (Β) SKmel28 και (C) Α375 χωρίς επεξεργασία και σύγκριση με την θεραπεία με epirubicin (EPI) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 24 ώρες. (-) Υποδεικνύει ένα αρνητικό έλεγχο στην οποία κανένα προϊόν ομογενοποίησης ήταν παρούσα. (+) Υποδεικνύει τη χρήση μικροσωμάτων ανθρώπινου ήπατος (που είναι γνωστό ότι έχουν υψηλές συγκεντρώσεις σχεδόν όλα τα μέλη της οικογένειας UGT) ως θετικός έλεγχος.

Η

UGT2B7 Knockdown ευαισθητοποιεί WM115 Κυττάρων Μελανώματος σε αντικαρκινικά φάρμακα

για να εξακριβωθεί η λειτουργική συμβολή των γλυκουρονικίωση αντίστασης μελάνωμα, UGT2B7 χτυπήθηκε κάτω στο WM115 κύτταρα. shRNA κατευθύνονται έναντι UGT2B7 επιμολύνθηκε σταθερά σε κύτταρα WM115. Αυτή η κυτταρική σειρά ονομάστηκε WM115-2B7KD. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια για να επιβεβαιωθεί ότι τα επίπεδα mRNA UGT2B7 είχε μειωθεί. Το Σχήμα 5Α δείχνει σαφώς ότι τα επίπεδα UGT2B7 mRNA στο WM115-2B7KD κυτταρική γραμμή ήταν ~ 60% μικρότερη από εκείνη των WM115 κυττάρων σταθερά επιμολυσμένων με κενό φορέα (WM115-PRS). Στη συνέχεια, το ήμισυ της μέγιστης συγκεντρώσεις αναστολής (IC

50), όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες ΜΤΤ, διεξήχθησαν για να εξετάσει εάν knockdown του UGT2B7 ευαισθητοποιημένων WM115 κυττάρων σε αντικαρκινική θεραπεία. IC

50 τιμές για WM115-2B7KD προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν με WM115-pRS (σταθερή κυτταρική γραμμή γίνεται με κενό φορέα ως μάρτυρα) και της μητρικής κυτταρικής γραμμής έναντι τεμοζολομίδη, αδριαμυκίνη και επιρουβικίνη. Συνεπής με ένα ρόλο για τη γλυκουρονιδίωση στην αντίσταση μελάνωμα, WM115-2B7KD βρέθηκε να έχει σημαντικά χαμηλότερη (p & lt? 0,01) IC

50 αξία για αδριαμυκίνη και epirubicin μεταχείριση σε σχέση με τα δύο WM115 και WM115-υπηρεσία PRS (Εικόνα 5Β) υποδεικνύοντας ότι, πράγματι, knockdown του UGT2B7 ευαισθητοποιεί κύτταρα μελανώματος σε αυτά τα φάρμακα κατά του καρκίνου. Καμία επίδραση στα IC

50 τιμές παρατηρήθηκε για την τεμοζολομίδη ή θεραπεία vemurafenib στην WM115-2B7KD κυτταρική σειρά σε σύγκριση με τις δύο κυτταρικές γραμμές ελέγχου (Εικόνα 5Β).

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR της UGT2B7 τα επίπεδα mRNA συγκρίνοντας κυτταρικές σειρές μελανώματος που εκφράζουν σταθερά shRNA έναντι UGT2B7 (WM115-2B7KD) ή κενό φορέα (WM115-pRS). (Β) IC

50 τιμές που καθορίζονται από αναλύσεις ΜΤΤ την αξιολόγηση της συμβολής των UGT2B7 σε αντίσταση μελανώματος μετά από θεραπεία τεμοζολομίδη, αδριαμυκίνη, επιρουβικίνη ή vemurafeninb. (Γ) IC

50 τιμές προσδιορίζονται από προσδιορισμούς ΜΤΤ την αξιολόγηση της ευαισθησίας των κυτταρικών σειρών μελανώματος με (WM115) και χωρίς (WM3211) UGT έκφρασης για να αντικαρκινικά φάρμακα που είναι γνωστό ότι μεταβολίζονται από UGTs. Όλα τα γραφήματα των δεδομένων είναι ο μέσος όρος τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων αναλύθηκαν με GraphPad Prism. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση και το * υποδηλώνει τη σημασία p & lt?. 0.01 σε σύγκριση με είτε τον έλεγχο

Η

Αν χτυπήσει κάτω ένα UGT κατά περίπου 60% των κυττάρων ευαισθητοποιημένων μελανώματος σε αδριαμυκίνη και επιρουμπικίνη, στη συνέχεια, στέκεται στο λόγο ότι η IC

50 για WM3211 κύτταρα μελανώματος (τα οποία στερούνται UGT έκφραση) θα είναι σημαντικά χαμηλότερο από ό, τι WM115 γονικών κυττάρων (που έχουν UGT έκφραση). Έτσι, σε σύγκριση με το IC

’50 για WM115 και WM3211 άμεσα για αυτά τα φάρμακα. Όπως είχε προβλεφθεί, WM3211 κύτταρα ήταν 7 φορές και 9 φορές πιο ευαίσθητα στην αδριαμυκίνη και επιρουμπικίνη, αντίστοιχα (Σχήμα 5C).

Συζήτηση

Ο ρόλος των UGTs στην αιτιολογία του μελανώματος δεν είχε διερευνηθεί στο παρελθόν, παρά τις UGTs είναι ένα σημαντικό μηχανισμό εκκαθάρισης για αντικαρκινικών παραγόντων. Στην παρούσα μελέτη UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 ταυτοποιήθηκαν ως συνήθως εκφράζεται σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα. Οι ίδιες τρεις UGTs βρέθηκαν να εκφράζονται σε πρωτογενή κυτταρική γραμμή μελανώματος WM115. Ωστόσο, δεν UGT έκφραση ανιχνεύθηκε σε άλλο πρωτογενές κυτταρική γραμμή μελανώματος, WM3211, ή σε οποιαδήποτε από τις τρεις μεταστατικές κυτταρικές σειρές μελανώματος που εξετάσθηκαν υποδεικνύοντας ότι UGT έκφραση έχει χαθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του μελανώματος. Είναι ενδιαφέρον έχουμε αποδείξει ότι UGT2B7, UGT2B10 και UGT2B15 μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί εκφράζεται σε κύτταρα μελανώματος σε απάντηση των αντικαρκινικών παραγόντων. Η αντίστοιχη αύξηση στη δραστικότητα UGT καταδείχθηκε επίσης μετά τη θεραπεία. Έτσι, η εκ νέου έκφραση των UGTs θα προστατεύει πιθανώς τα καρκινικά κύτταρα κατά των αντικαρκινικών φαρμάκων μέσω ενισχυμένης μεταβολισμό και επακόλουθη κάθαρση. Σημαντικά, αυτές οι παρατηρήσεις ήταν σύμφωνες προς τις δύο άγριου τύπου κύτταρα μελανώματος Β-Raf (WM3211) και Β-Raf μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές (Α375 και SKmel28).

Δυστυχώς, καμία εμπορικά διαθέσιμο αντίσωμα έχει αποδειχθεί ότι ανιχνεύουν την ενδογενή UGT2B πρωτεΐνης και, κατά συνέπεια, οι προσπάθειες μας για να απεικονίσει την ενδογενή πρωτεΐνη UGT2B ήταν ανεπιτυχείς. Αυτό οφείλεται πιθανότατα στο γεγονός ότι UGTs είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη, αδιάλυτες πρωτεΐνες. Κατά συνέπεια, δεν πλήρους μήκους ανθρώπινο UGT έχει καθαριστεί ή /και κρυσταλλώνεται. Στην πραγματικότητα, η μόνη κρυσταλλική δομή αναφέρθηκε για έναν άνθρωπο UGT είναι το C-τερματικό ήμισυ του UGT2B7 δεδομένου ότι το Ν-τερματικό ήμισυ έπρεπε να αποκοπεί για τη διαλυτοποίηση της πρωτεΐνης [32]. Η συντριπτική πλειοψηφία των δημοσιευμένων UGT γουέστερν είναι κυτταρικές σειρές (συνήθως έντομο) που υπερεκφράζουν ανασυνδυασμένο UGTs. Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση καταδεικνύει σαφώς ότι ένα μεγάλο ποσοστό αυτών των υπερεκφράζεται, ανασυνδυασμένη UGTs είναι ανενεργά [33]. Κάποιος μπορεί εύκολα να φανταστεί κανείς ότι οι ανασυνδυασμένες UGT πρωτεϊνών που είναι ορατές σε γουέστερν δεν είναι πλήρως ώριμα, ενεργά ένζυμα. Αντίθετα, πλήρως ώριμο, ενεργό UGTs μπορεί να μην είναι ορατό σε γουέστερν, ακόμα και όταν υπερεκφράζεται. Έτσι, σύμφωνα με αρκετές προηγούμενες δημοσιεύσεις στον UGT τομέα, η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην έκφραση του mRNA των μελών της οικογένειας UGT2B σε συνδυασμό με την ανάλυση της UGT δραστηριότητας. Χρησιμοποιήσαμε προσδιορισμούς παρεμβολής και γλυκουρονιδίωση RNA για να εξετασθεί ο ρόλος της UGT2B7 επί κυττάρων μελανώματος επιβίωση [1], [3], [24], [34], [35], [36], [37].

Για να δοκιμάσετε το ρόλο της γλυκουρονιδίωσης στην αντίσταση μελάνωμα φάρμακο απευθείας, UGT2B7 χτυπήθηκε κάτω στο WM115 κύτταρα, η μόνη κυτταρική γραμμή μελανώματος έχουμε ταυτιστεί με UGT έκφραση μέχρι στιγμής. Εξόντωση UGT2B7 ευαισθητοποιημένων κυττάρων μελανώματος με την επιρουβικίνη και αδριαμυκίνη θεραπεία, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην τεμοζολομίδη ή θεραπεία vemurafenib. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν απόδειξη της αρχής ότι η γλυκουρονιδίωση εμπλέκεται στην αντίσταση μελάνωμα ναρκωτικών

in vitro

. Η πιο λογική υπόθεση είναι ότι UGT2B7 γλυκουρονιδίων epirubicin και αδριαμυκίνη μεταβολίτες που προκύπτουν άμεσα σε εκκαθάριση της πριν από αυτά τα φάρμακα μπορεί να ασκήσει την τοξικότητά τους. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές ότι epirubicin μεταβολίζεται κυρίως από UGT2B7 [31] και ότι γλυκουρονιδίωση συμμετέχει επίσης στην αδριαμυκίνη εκκαθάριση [30]. Η παρατήρηση ότι η τοξικότητα της τεμοζολομίδης και vemurafenib ήταν αμετάβλητη μετά UGT2B7 knockdown δεν ήταν εντελώς απροσδόκητο αφού UGTs έχουν ποτέ εμπλακεί στο μεταβολισμό των φαρμάκων αυτών.

Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι αυτά τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός UGT2B7 γκρεμίζω κυτταρική γραμμή, έτσι υπήρχε ακόμη κάποια UGT2B7 παρόν. Επιπλέον, UGT2B10 και UGT2B15 εξακολουθούν να υπάρχουν.