PLoS One: Nanostring-Based Δοκιμασία πολυγονιδιακής να προβλέψουν Υποτροπή για γαστρικός καρκίνος ασθενών μετά την επέμβαση


Αφηρημένο

Παρά τα οφέλη από επικουρική χημειοθεραπεία ή χημειοραδιοθεραπεία, περίπου το ένα τρίτο του γαστρικού καρκίνου σταδίου ΙΙ (GC) ασθενείς ανέπτυξαν υποτροπές. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αναπτύξει και να επικυρώσει μια προγνωστική αλγόριθμο για καρκίνο του στομάχου (GCPs) που μπορούν να σθεναρά τον εντοπισμό ομάδα υψηλού κινδύνου για υποτροπή σε ασθενείς σταδίου II. Μια γονιδιακή έκφραση πολλαπλών σταδίων προφίλ μελέτη διεξήχθη. Πρώτον, ένα γονίδιο μικροσυστοιχιών προφίλ έκφρασης του αρχειοθετηθεί τμήματα του όγκου εμπεδωμένα σε παραφίνη χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση υποψήφιων προγνωστικούς γονίδια (Ν = 432). Δεύτερον, μια εστιασμένη ανίχνευση έκφρασης γονιδίου συμπεριλαμβανομένων προγνωστικών γονιδίων χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη ενός στέρεου κλινική δοκιμασία (GCPs) στη φάση ασθενείς II από την ίδια ομάδα (Ν = 186). Τρίτον, ένα προκαθορισμένο cut off για την GCPs ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας μια ανεξάρτητη ομάδα σταδίου ΙΙ (Ν = 216). Η GCPs ελέγχθηκε σε ένα άλλο σύνολο με τη φάση ΙΙ GC ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση χωρίς επικουρική θεραπεία (Ν = 300). GCPs αναπτύχθηκε αθροίζοντας το προϊόν των συντελεστών παλινδρόμησης Cox και ομαλοποιήθηκε επίπεδα έκφρασης των γονιδίων 8 (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4, TFDP1). Ένας προοπτικά ορίζεται cut-σημείο για GCPs ταξινομηθεί 22,7% της κοόρτης επικύρωση αντιμετωπίζονται με χημειοακτινοθεραπεία (Ν = 216) ως ομάδα υψηλού κινδύνου με ποσοστό υποτροπής 5 ετών 58,6% σε σύγκριση με 85,4% στην ομάδα χαμηλού κινδύνου (αναλογία κινδύνου για υποτροπή = 3.16, ρ = 0.00004). GCPs εντοπίζονται επίσης ομάδα υψηλού κινδύνου μεταξύ των ασθενών σταδίου ΙΙ αντιμετωπίζονται μόνο με χειρουργική επέμβαση (αναλογία κινδύνου = 1,77, p = 0,0053)

Παράθεση:. Lee J, Sohn Ι Do IG, Kim KM, Πάρκο SH, το Park JO, et al. (2014) Nanostring-Based Δοκιμασία πολυγονιδιακής να προβλέψουν Υποτροπή για γαστρικός καρκίνος ασθενών μετά την επέμβαση. PLoS ONE 9 (3): e90133. doi: 10.1371 /journal.pone.0090133

Επιμέλεια: Ju-Seog Λι, του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 26 Ιαν, 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια Τειχών επιχορήγηση από το Ιατρικό Κέντρο της Samsung. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Patrick Tan είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

γαστρικών καρκίνων είναι εξαιρετικά θανατηφόρα κακοήθειες με ποσοστά πενταετούς επιβίωσης είναι ένα από τα χειρότερα αναφέρθηκαν για τυχόν συμπαγείς όγκους. Σύμφωνα με στοιχεία από το National Cancer Institute επιτήρηση, την επιδημιολογία και τα τελικά αποτελέσματα (SEER) Πρόγραμμα, η πενταετής επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου (GC) βελτιώθηκε μόνο συγκρατημένα κατά τα τελευταία 50 χρόνια, 12-22 τοις εκατό [1]. Η τάση του GC για την πρόωρη μεταστατική διάδοση έχει καλώς τεκμηριωθεί σε προηγούμενες μελέτες [2], [3]. Με βάση τις πρόσφατες δίκες επικουρική φάσης ΙΙΙ, όφελος επιβίωσης από επικουρική χημειοθεραπεία ή θεραπεία chemoradiation έχει τεκμηριωθεί σε GC [4] – [7]. Ωστόσο, 25 έως 40% όλων των ασθενών χειρουργικά GC συνεχίσουν να αναπτύσσουν υποτροπές που δεν επιδέχονται εκ νέου εκτομή [4], [7] – [9]. Για παθολογικό στάδιο ΙΙΙ και IV GC, 5-ετή επιβίωση ελεύθερη νόσου είναι πολύ κακή (στάδιο ΙΙΙΑ, 57,6%, το στάδιο IIIB, 39,6%? Και το στάδιο IV 26,3%) [8] που εμπλέκουν ότι αυτοί οι όγκοι έχουν εγγενώς επιθετική συμπεριφορά. Αντίθετα, οι ασθενείς GC παθολογική στάδιο ΙΙ έχουν πιο ευνοϊκή κλινική έκβαση με νόσο δωρεάν ποσοστά επιβίωσης 5 ετών 76% -90% μετά από χειρουργική επέμβαση και επικουρική θεραπεία [8], [9]. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχει ένα ευρύ φάσμα κλινικών επιθετικότητα, ακόμη και μέσα στην ίδια φάση με μερικοί ασθενείς που θεραπεύονται μόνο με χειρουργείο, ενώ μερικοί ασθενείς επαναληφθεί σύντομα μετά τη θεραπεία χειρουργική επέμβαση και ανοσοενισχυτικό chemoradiation. Ως εκ τούτου, με βάση την υπόθεση ότι υπάρχει μια σημαντική μοριακή ετερογένεια, σχεδιάσαμε ένα μεγάλης κλίμακας έκφραση γονιδίου profiling μελέτη για την ανάπτυξη ενός μοριακού δοκιμή που μπορεί να κάνει διακρίσεις αποτελεσματικά χαμηλού κινδύνου από τις ομάδες GC υψηλού κινδύνου για υποτροπή μετά από χειρουργική επέμβαση.

Ένα μοριακό τεστ που εντοπίζει τους ασθενείς υψηλού κινδύνου για υποτροπή μπορεί να οδηγήσει σε βελτιστοποιημένη περιεγχειρητική στρατηγικές θεραπείας σε GC. Η φάση ανακάλυψη περιελάμβανε ασθενείς GC από όλα τα κλινικά στάδια αντιμετωπίζονται με χημειοακτινοθεραπεία (Ν = 520). τμήματα του όγκου από αυτούς τους ασθενείς υποβλήθηκαν σε προγνωστικούς ανακάλυψη γονιδίων χρησιμοποιώντας δοκιμασία ολόκληρο το γονιδίωμα DASL (WG-DASL) (Illumina, San Diego, CA), μια γονιδιακή έκφραση microarray προφίλ μέθοδος για σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστού (FFPE). Ο σκοπός ήταν να αναπτυχθεί η υπόθεση για την κλινική χρησιμότητα και ανακαλύψτε υποψήφιο προγνωστικό ή εσωτερική γονίδια αναφοράς που θα βοηθήσουν δοκιμασία γονιδιακής έκφρασης σχεδιασμού επικεντρώθηκε. Τα αποτελέσματα από αυτή τη φάση πρότεινε ότι η κλινική χρησιμότητα ενός γονιδιακής έκφρασης με βάση προγνωστικούς αλγόριθμος μπορεί ενδεχομένως να διακρίνουν μια ομάδα υψηλού κινδύνου μεταξύ των ασθενών σταδίου ΙΙ.

Ο στόχος του έργου ήταν να αναπτυχθεί μια υπόθεση με την κλινική χρησιμότητα και να ανακαλύψετε τις υποψήφιες προγνωστικές ή εσωτερικά γονίδια αναφοράς, προκειμένου να σχεδιάσουν προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης εστιασμένη. Τα αποτελέσματα από τη φάση της ανακάλυψης δείχνουν ότι η κλινική χρησιμότητα ενός προγνωστικού αλγορίθμου έκφραση γονιδίων που βασίζεται σε δυνητικά μπορεί να διακρίνει μια ομάδα υψηλού κινδύνου μεταξύ των ασθενών σταδίου ΙΙ. Με τη χρήση ενός ισχυρού πολλαπλών σταδίων προγνωστική αλγόριθμο, γαστρικός καρκίνος Προγνωστικοί Score (GCPs) για τους ασθενείς GC σταδίου II αναπτύχθηκε για τον εντοπισμό ασθενών υψηλού κινδύνου για υποτροπή μετά από χειρουργική επέμβαση.

Μέθοδοι

Από το Σεπτέμβριο 1994 έως τον Δεκέμβριο του 2005, 1.557 ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπευτική GC γαστρεκτομή στο Samsung Medical Center. Μεταξύ αυτών, επιλεγμένα 1.107 ασθενείς με βάση τα ακόλουθα κριτήρια: επιβεβαιώθηκε ιστολογικά αδενοκαρκίνωμα του στομάχου? χειρουργική εκτομή του όγκου χωρίς μακροσκοπική ή μικροσκοπική υπολειμματικής νόσου? ηλικίας ≥18? στάδιο παθολογία ΙΒ (T2bN0, T1N1 αλλά όχι T2aN0) έως IV, σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) σύστημα σταδιοποίησης (6

ου Ed)? πλήρη χειρουργική ρεκόρ και ρεκόρ θεραπεία και ασθενείς που έλαβαν το δοσολογικό σχήμα INT-0116 ως επικουρική θεραπεία [7]. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Κέντρου Samsung, Σεούλ, Νότια Κορέα (IRB αριθμός έγκρισης: SMC 2010-10-025). Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη παρείχε γραπτές έντυπο συγκατάθεσης που συνιστώνται από τον IRB. Στους ασθενείς που έχουν αποβιώσει κατά το χρόνο της εισόδου της μελέτης, γραπτή ενημέρωσε μορφές συναίνεσης παραιτηθεί από την IRB. σχεδιασμός της μελέτης και ομάδες ασθενών παρέχονται σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ (Εικόνα 1Α, 1Β, Αρχείο S1, τμήμα 1). Της κλάσης του 1107 ασθενών, ένα σύνολο ανακάλυψη των 520 ασθενών και ένα σύνολο επικύρωσης των 587 ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν και κατανέμονται σε 6 παρτίδες στρωματοποιημένη με το μέγεθος του όγκου και το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης για τον προσδιορισμό WG-DASL.

(Α ) Μια έκφραση του γονιδίου προσέγγιση πολλαπλών βημάτων προφίλ του σχεδιασμού, (Β) Consort Διάγραμμα.

Η

για την αποφυγή ψευδώς θετικά συμπεράσματα οφείλονται στην υπερβολική τοποθέτηση, προγνωστικούς αλγορίθμους και προκαθορισμένα σημεία αποκοπής τους δοκιμάστηκαν σε ανεξάρτητο ομάδες που δεν είχαν χρησιμοποιηθεί για προγνωστικούς ανακάλυψη γονιδίων και την οικοδόμηση αλγόριθμο. Μια μελέτη 4-φάση σχεδιάστηκε, με 4 προκαθορισμένες ανεξάρτητες ομάδες που προσλαμβάνονται από το Ιατρικό Κέντρο της Samsung. Οι πρώτες 3 ομάδες περιλαμβάνουν ασθενείς με παρόμοια κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά από τις ομάδες της μελέτης χημειοραδιοθεραπεία-αγωγή (File S1, τμήμα 2). Η πρώτη φάση (φάση ανακάλυψης) της μελέτης περιελάμβανε ασθενείς GC από όλα τα κλινικά στάδια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χημειο-ακτινοθεραπεία (Ν = 520) [8]. τμήματα του όγκου από αυτούς τους ασθενείς υποβλήθηκαν σε προγνωστικούς ανακάλυψη γονιδίων χρησιμοποιώντας το WG-DASL (Illumina, San Diego, CA), μια γονιδιακή έκφραση microarray μέθοδος δημιουργίας προφίλ για FFPE [7]. Μια ad-hoc εξωτερική επικύρωση της σειράς γονιδίου διεξήχθη για να ελαχιστοποιηθεί οποιαδήποτε προκατάληψη από ενιαίο θεσμικό ομάδα. Η δεύτερη φάση (ανάπτυξη αλγόριθμο) ήταν να μεταφράσει τα ευρήματα από την πρώτη φάση σε μια κλινικά εφαρμόσιμη μορφή δοκιμής. Επιλέξαμε την πλατφόρμα nCounter (Nanostring Technologies, Seattle, WA), λόγω της ικανότητάς της να ανακρίνει τα επίπεδα έκφρασης του μέχρι 800 γονίδια χρησιμοποιώντας ολικό RNA που εκχυλίζεται από FFPE σε μία αντίδραση μονού σωλήνα [8]. Θα προβληθεί το στάδιο ασθενείς II από την πρώτη φάση (Ν = 186) για

de novo

ανακάλυψη των προγνωστικών γονιδίων, που επιλέγονται ιδανικούς συνδυασμούς γονιδίων χρησιμοποιώντας την κλίση τουλάχιστον απόλυτη συρρίκνωση και φορέα επιλογής (LASSO) αλγόριθμο [10], και στη συνέχεια να κατασκευαστεί ένα πρώτης γενιάς GCPs (GCPs-g1) με την προσθήκη των προϊόντων της κανονικοποιημένη έκφραση γονιδίων και συντελεστές από το μοντέλο Cox για DFS. Στην τρίτη ομάδα των ασθενών σταδίου ΙΙ (Ν = 216). Στην τέταρτη φάση (δοκιμή της κλινικής χρησιμότητας σε μία χειρουργική μόνο ρύθμιση), ελέγξαμε την πιθανή κλινική χρησιμότητα των GCPs σε ασθενείς σταδίου II που έλαβαν θεραπεία με μόνο χειρουργική επέμβαση. Ένα πρωτόκολλο σφραγίδα χρόνου (Σχήμα S12) αναπτύχθηκε πριν από την επεξεργασία αυτού του τελικού ομάδα. Εμείς στη συνέχεια ανέπτυξε μια εκλεπτυσμένη GCPs δεύτερης γενιάς (GCPs-G2) (το τελευταίο σετ γονιδίων), αναλύοντας το συνδυασμό στάδιο ομάδες II από τη δεύτερη και την τρίτη φάση της μελέτης.

γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας ολόκληρο το γονιδίωμα DASL

δοκιμασία

πριν από κάθε γονίδιο προφίλ πείραμα, δείγματα ιστού κατανεμήθηκαν τυχαία σε διαφορετικές παρτίδες στρωματοποιημένη κατά την ώρα της επέμβασης (πριν το 2000 έναντι μετά το 2000) και το μέγεθος του όγκου (≤5 cm vs & gt? 5 cm) για να ελαχιστοποιηθεί οποιαδήποτε παραλλαγές από την ποιότητα του DNA. Ολικό RNA εξήχθη από 2-4 τμήματα 4-μm πάχους τομές FFPE από αντιπροσωπευτικά τμήματα πρωτογενούς όγκου χρησιμοποιώντας το υψηλής καθαρότητας κιτ RNA παραφίνης (Roche Diagnostic, Mannheim, Germany) μετά την αφαίρεση στοιχεία μη-όγκου με χειροκίνητη macrodissection καθοδηγείται από αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρωματισμένο διαφάνειες. δοκιμασία WG-DASL διεξήχθη χρησιμοποιώντας 200 ng RNA ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή [11]. Για τη δοκιμασία nCounter, 200 ng ολικού RNA υβριδοποιείται με το ειδικά σχεδιασμένο σύνολο κωδικών 800 γονίδια για 18 ώρες στους 65 ° C και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [12]. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε μέσο όρο επίπεδα έκφρασης 48 εσωτερικών γονιδίων αναφοράς που επιλέγεται από το πείραμα μικροσυστοιχιών. Η λεπτομερής περιγραφή της φάσης ανακάλυψης χρησιμοποιώντας δοκιμασία WG-DASL παρέχεται σε S1 αρχείου, τμήμα 3. Η συγκρισιμότητα στην ποιότητα του DNA του FFPE ιστού και φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστούς χρησιμοποιώντας δοκιμασία DASL δημοσιεύθηκε στο παρελθόν [13], [14].

Προγνωστικοί κτίριο μοντέλο και την επικύρωση

Ο αλγόριθμος για την ανάπτυξη δοκιμασία n-Counter-βάση για την κλινική χρησιμότητα με βάση WG-DASL παρέχεται στο αρχείο S1, τμήματα 4-6. Χρησιμοποιήσαμε το λάσο αλγόριθμο κλίση για να χωρέσει ένα μοντέλο πρόβλεψης βασίζεται στο μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox για DFS χρήση των ανιχνευτών με την οριακή τιμή p & lt? 0,01 (Σχήμα S2 στο αρχείο S1) [10]. Χρησιμοποιήσαμε άδεια ένας στους σταυρό επικύρωση με de novo ανακάλυψη σε κάθε αφήσει ένα έξω βήμα για την αξιολόγηση της απόδοσης του προγνωστικού μοντέλου στην ομάδα αυτή ανακάλυψη. Βέλτιστη cut-σημείο προσδιορίστηκε με τη δημιουργία ενός οικοπέδου για την p-τιμές για κάθε περικοπή σημείων για την προγνωστική βαθμολογία. Για τη μελέτη επικύρωσης, χρησιμοποιήθηκαν a priori καθορισμένες τιμές cut-σημείο αλγόριθμο και. Η μέθοδος επικύρωσης για GCPs περιγράφεται στο αρχείο S1, Τμήμα 7.

Αποτελέσματα

προφίλ γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών των ασθενών GC αντιμετωπίζονται με ανοσοενισχυτικό χημειοακτινοθεραπεία (φάση 1)

Πραγματοποιήσαμε γονίδιο προφίλ έκφρασης του FFPE από την ανακάλυψη ομάδα των 520 περιπτώσεων σταδίου ΙΒ-IV GC έλαβαν την καθιερωμένη χημειοραδιοθεραπεία μετά θεραπευτική εκτομή χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία WG-DASL (Σχήμα 1). Μεταξύ αυτών, 432 δείγματα πέρασαν RNA ελέγχου ποιότητας (βάση δεδομένων GEO GSE 26253) (File S1, τμήμα 3). Το πρωτεύον τελικό σημείο ήταν DFS. Μονοπαραγοντική ανάλυση εντόπισε 369 ανιχνευτές που σχετίζονταν σημαντικά με την ελεύθερη νόσου επιβίωση σε ρ & lt? 0,01 χωρίς προσαρμογή για άλλες κλινικές μεταβλητές (File S1, Τμήμα 3d). Στη συνέχεια, κλίση Lasso χρησιμοποιήθηκε για να αναπτυχθεί ένα προγνωστικό αλγόριθμο για την πρόβλεψη υποτροπής (File S1, τμήμα 3e). Η άδεια-one-out cross-επικύρωσης (LOOCV) διαδικασία με

de novo

ανακάλυψη των προγνωστικών γονιδίων και την οικοδόμηση ενός προγνωστικού αλγορίθμου σε κάθε βήμα χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την ευρωστία του προγνωστικού αλγορίθμου. Σύμφωνα με την προγνωστική υπογραφές γονίδιο (26 γονίδια, Αρχείο S1, τμήμα 3στ) και παθολογικές στάδια (τοπική έναντι προχωρημένους), 432 ασθενείς ταξινομήθηκαν στις ακόλουθες ομάδες: χαμηλού κινδύνου και το στάδιο ΙΒ /ΙΙ (Ν = 145? 5-ετή DFS, 84,8%), υψηλού κινδύνου και το στάδιο ΙΒ /ΙΙ (Ν = 90? 5-year DFS, 61,1%), χαμηλού κινδύνου και το στάδιο III /IV (Ν = 83? 5-year DFS, 48,9%), και υψηλού κινδύνου και το στάδιο III /IV (Ν = 114? 5-year DFS, 36,9%) (Σχήμα 2). Ως ανάλυση ad-hoc, ελέγξαμε αυτό το γονίδιο υπογραφή χρησιμοποιώντας την έκφραση του γονιδίου προφίλ δεδομένα από τον πληθυσμό των ασθενών Σιγκαπούρη (Ν = 199) για την ελαχιστοποίηση των εγγενών προκατάληψη από ένα μόνο ίδρυμα ομάδα [15]. Στην εξωτερική ομάδα ασθενών, το γονίδιο υπογραφή ήταν σε θέση να διαχωρίσει την ομάδα υψηλού κινδύνου (Ν = 100) από την ομάδα χαμηλού κινδύνου (Ν = 99) για υποτροπή με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,00001? Αναλογία κινδύνου (HR), 2.3? 95% CI, 1,62 – 3,28) (Σχήμα 2). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κύρια κλινική χρησιμότητα των προφίλ γονιδιακής έκφρασης των GC στην αναγνώριση των ασθενών υψηλού κινδύνου μεταξύ των ασθενών σταδίου ΙΙ (χαμηλού έναντι υψηλού κινδύνου σταδίου ΙΒ /ΙΙ, 84,8% έναντι 61,1%? Στάδιο χαμηλό έναντι υψηλού κινδύνου III /IV, 48,9% έναντι 36,9%). Ως εκ τούτου, για την ανάπτυξη της κλινικής δοκιμής και επικύρωσης, εστιάσαμε στην ανάπτυξη ενός γονιδίου-σετ, το οποίο μπορεί να προβλέψει σθεναρά υποτροπών σε ασθενείς II στάδιο.

HR δηλώνει αναλογία κινδύνου και p-value υπολογίζεται από 100 παραλλαγές. (Α) όλοι οι ασθενείς σταδίου, υψηλού vs χαμηλού κινδύνου? (Β) σύμφωνα με το στάδιο και τις ομάδες κινδύνου? (C) Εξωτερική επικύρωση του αρχικού προφίλ γονιδιακής έκφρασης.

Η

Ανάπτυξη γαστρικός καρκίνος Πρόγνωσης Score (GCPs) για τη φάση ΙΙ GC χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία nCounter (φάση 2) ​​

Εμείς έθιμο σχεδίασε ένα σετ ανιχνευτή nCounter αποτελείται από υποψήφια προγνωστικών γονιδίων από δεδομένα WG-DASL μικροσυστοιχιών (φάση 1), καθώς και γνωστά γονίδια του καρκίνου, της κινάσης γονίδια, και τα γονίδια υποδοχέα συζευγμένου με πρωτεΐνη. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος μεταβλητότητα στην ακεραιότητα του RNA μορίων σε αρχειοθετημένα FFPE λόγω προ-αναλυτική μεταβλητές, όπως ο χρόνος σταθεροποίηση και την ηλικία των μπλοκ, που εφαρμόζεται στο δείγμα εξομάλυνση χρησιμοποιώντας ένα σύνολο 48 εσωτερικών γονιδίων αναφοράς που επιλέγεται από τα δεδομένα μικροσυστοιχιών βασισμένη σχετικά με τις ελάχιστες διαφορές μεταξύ των περιπτώσεων και την έλλειψη σύνδεσης με την πρόγνωση (File S1, τμήμα 4). Συσχέτιση μεταξύ των δεικτών επικινδυνότητας των προγνωστικών γονιδίων με βάση nanostring και WG-DASL παρέχονται στο αρχείο S1, Τμήμα 4β, και το σχήμα S3 στο S1 αρχείου.

Εμείς προφίλ 186 σταδίου ασθενείς II από το σύνολο ανακάλυψη. Μετά την αξιολόγηση της ευρωστίας των προγνωστικών αλγορίθμων που χτίστηκε από κλίση LASSO μέσω LOOCV, εφαρμόσαμε κλίση LASSO σε όλους τους 186 ασθενείς και προσδιόρισε 8 γονίδια (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4, και TFDP1) που σε συνδυασμό παρέχεται ισχυρή προγνωστική πληροφορίες (Πίνακας 1). Η GCPs στη συνέχεια αναπτύχθηκε ως γραμμικός συνδυασμός των εκτιμήσεων παλινδρόμησης Cox και ομαλοποιήθηκε επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων 8. Η ανάλυση cut-σημείο αποδεικνύει ότι η GCPs ήταν πιο ισχυρή στην ταυτοποίηση 25% των ασθενών με χειρότερες εκβάσεις (File S1, Τμήμα 4). Εμείς επιλέξαμε μια περικοπή-σημείο των 0,2205 για τους υποψήφιους επικύρωση στην ανεξάρτητη ομάδα επικύρωσης.

Η

Επικύρωση GCPs και προκαθορισμένες cut-σημείο σε ασθενείς GC σταδίου II που έλαβαν θεραπεία με χημειοακτινοθεραπεία (φάση 3)

Για να αποφευχθεί η πιθανή πάνω-τοποθέτηση ζήτημα που σχετίζεται με διασταυρούμενη επικύρωση [16], θα επικυρωθεί GCPs με το σταθερό αλγόριθμο και κομμένα σημεία σε μια ανεξάρτητη ομάδα ασθενών που δεν χρησιμοποιήθηκε στην ανακάλυψη γονιδίων. Τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά των 216 ασθενών σταδίου II από την επικύρωση που ήταν παρόμοιες με αυτές από την ανακάλυψη ομάδα (File S1, τμήμα 6, και τα σχήματα S4-6 στο S1 αρχείου). Όταν εφαρμόζεται GCPs-g1 στο σύνολο επικύρωσης, η κατανομή βαθμολογίας κίνδυνος ήταν πολύ παρόμοια, γεγονός που υποδηλώνει την ισχυρή αναλυτική απόδοση του προσδιορισμού (File S1, το τμήμα 7α, και το σχήμα S7 είναι S1 αρχείου). Το προκαθορισμένο cut-σημείο (0,2205) για GCPs-g1 ταξινομηθεί 22,7% των όγκων από την επικύρωση έχει οριστεί ως ομάδα υψηλού κινδύνου. Η εκτίμηση κατά Kaplan Meier 5 ετών DFS για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου ήταν 58,6%, σε σύγκριση με 85,4% για τους ασθενείς χαμηλού κινδύνου (HR για υποτροπή, 3,16? P = 0,00004) (Σχήμα 3). GCPs ήταν σημαντική τόσο intestinal- και diffuse- τύπου GCs, όπως φαίνεται στο Σχήμα S8 στο Αρχείο S1 (File S1, Ενότητα 7β). Η πολυπαραγοντική ανάλυση περαιτέρω δείχνει ότι GCPs-g1 παρέχονται πρόσθετες προγνωστικές πληροφορίες, εκτός των άλλων γνωστών παραγόντων, όπως η Lauren ταξινόμηση, ο βαθμός διαφοροποίησης, την ηλικία, και η χειρουργική επέμβαση τύπου (HR, 3.027? P = 0,00016? Πίνακας 2). Ως εκ τούτου, GCPs μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσει το στάδιο ΙΙ οι ασθενείς που παραμένουν σε υψηλό κίνδυνο ακόμη και μετά την τυπική επικουρική χημειοραδιοθεραπεία και οι οποίοι έχουν παρόμοιο κίνδυνο της υποτροπής, οι ασθενείς σταδίου ΙΙΙ.

(Β) DFS του σταδίου 2 ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χειρουργική επέμβαση σύμφωνα με GCPs.

η

GCPs ως προγνωστικός παράγοντας για τους ασθενείς GC σταδίου II αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση στηρίζεται μόνο σε μια προοπτικά σχεδιασμένη πρωτόκολλο (φάση 4)

η αναθεώρηση της κλινικών δεδομένων εντοπίστηκαν 306 ασθενείς οι οποίοι δεν έλαβαν μετεγχειρητική θεραπεία βασίζεται σε κοινές απόφαση των γιατρών και των ασθενών (S1 αρχείου, τμήμα 1, πίνακας S1 στο S1 αρχείου). Αυτοί οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε διερευνητικές αναλύσεις για την εκτίμηση της προγνωστικής ρόλος του GCPs σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με μόνο χειρουργική και τη δοκιμή την υπόθεση ότι το όφελος από χημειοραδιοθεραπεία είναι περιορισμένη σε ασθενείς υψηλού κινδύνου που ορίζεται από GCPs. Για αυτό το βήμα, έχουμε αναπτύξει GCPs-G2 (Πίνακας S8 στο αρχείο S1), το δεύτερης γενιάς GCPs, αναλύοντας όλα τα στάδια περιπτώσεις ΙΙ από τις φάσεις 2 και 3 για να μεγιστοποιήσουν το μέγεθος του δείγματος. Εμείς προοπτικά δοκιμαστεί το προκαθορισμένο αλγόριθμο GCPs-G2 και cut-σημείο, όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο σφραγίδα χρόνου (Σχήμα S12 σε File S1). Η GCPs-G2 προβλέψει υποτροπή σε 300 σταδίου όγκους II με αναλογία κινδύνου 2.131 (95% CI, 1,428 έως 3,180? P = 0,00021) (HR, 3,16) (Σχήμα S9 στο S1 αρχείου). Για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα της υπερβολικής τοποθέτηση του αλγορίθμου σε ασθενείς που έλαβαν χημειοραδιοθεραπεία, δοκιμάσαμε επίσης την GCPs-g1, η οποία προηγουμένως επικυρωθεί στο χημειοραδιοθεραπεία επεξεργασμένο ομάδα, σε χειρουργική επέμβαση από μόνη ομάδα (Σχήμα S10 σε File S1). Η αναλογία κινδύνου για GCPs-g1 (HR, 1,77? 95% CI, 1,18 – 2,67? P = 0,0053) είναι παρόμοια με εκείνη για GCPs-G2 (Σχήμα 3). Ως εκ τούτου, η GCPs προέβλεψε σθεναρά υποτροπή στο στάδιο ΙΙ GC με ή χωρίς μετεγχειρητική θεραπεία. Με βάση αυτά τα δεδομένα, μπορεί να σκεφτεί ότι το στάδιο υψηλού κινδύνου ασθενείς II ορίζεται από GCPs δεν κερδίσει ένα τεράστιο όφελος από χημειοακτινοθεραπεία.

Η έκφραση των αρνητικών προγνωστικών γονιδίων σε μικροπεριβάλλοντα όγκου

Σε όλες 3 στάδιο ομάδες ΙΙ που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη, αυξημένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων 4 από GCPs (NOX4, LAMP5, MATN3 και CLIP4) σχετίστηκαν με φτωχή πρόγνωση. Δεδομένου ότι οι γνωστές λειτουργίες των γονιδίων αυτών προτείνουν την έκφρασή τους σε μικροπεριβάλλοντα και όχι στο πραγματικό κύτταρα του όγκου, πραγματοποιήσαμε την δοκιμασία nCounter για μικροτομή όγκους σε σχέση με τα συστατικά των στρωματικών από 4 εκπρόσωπο όγκους υψηλού κινδύνου (Σχήμα S11 στο αρχείο S1). Η έκφραση αυτών των γονιδίων ήταν σημαντικά υψηλότερη σε συστατικά στρωματικά, σε σύγκριση με τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα, με NOX4 δείχνει τις πιο έντονες διαφορές (ρ = 0.04).

Συζήτηση

Σε μια αρχική φάση ανακάλυψης, πραγματοποιήσαμε WG-DASL σε όλους τους ασθενείς σταδίου GC. Στη συνέχεια, με βάση τα στοιχεία WG-DASL, παρατηρήσαμε ότι ο διαχωρισμός της ομάδας υψηλού κινδύνου από την ομάδα χαμηλού κινδύνου ήταν πιο σημαντικό σε πρώιμο στάδιο ασθενείς Ib /II (χαμηλού έναντι υψηλού κινδύνου σταδίου ΙΒ /ΙΙ, 84,8% έναντι 61,1% ? χαμηλό έναντι φάση υψηλού κινδύνου III /IV, 48,9% έναντι 36,9%). Ως εκ τούτου, για την ανάπτυξη της κλινικής δοκιμής και επικύρωσης, εστιάσαμε στην ανάπτυξη ενός γονιδίου-σετ, το οποίο μπορεί να προβλέψει σθεναρά υποτροπών σε ασθενείς II στάδιο. Έχουμε αναπτύξει και να επικυρώσει μια προγνωστική αλγόριθμο για καρκίνο του στομάχου, GCPs, η οποία μπορεί να σθεναρά τον εντοπισμό ομάδων υψηλού κινδύνου για υποτροπή σε ασθενείς σταδίου II. GCPs, αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα nCounter, έδειξε την ισχυρή απόδοση σε δείγματα FFPE. Επιπλέον, η συμπερίληψη των εσωτερικών γονιδίων αναφοράς επέτρεψε την εφαρμογή του GCPs σε μεμονωμένους ασθενείς. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι GCPs μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα σε κλινική χρήση ρουτίνας. Η GCPs από 8 γονίδια (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4 και TFDP1) ανακαλύφθηκαν και επικυρώθηκαν σε πάνω από 700 στάδιο ΙΙ ασθενείς GC. Βρήκαμε ότι η GCPs εντοπίστηκαν ασθενείς GC υψηλού κινδύνου για υποτροπή, ανεξάρτητα επικουρική θεραπεία και σε αυτό το στάδιο ΙΙ ασθενείς GC υψηλού κινδύνου έδειξε παρόμοια DFS στο στάδιο ΙΙΙ τους ασθενείς. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η GCPs προβλεπόμενη επανεμφάνιση των δύο τύπων Lauren (διάχυτη ή του εντέρου) (Σχήμα S8 στο αρχείο S1).

Τα δεδομένα μας δείχνουν καθαρά την παρουσία των μοριακών ετερογένεια σε GC, η οποία συνδέθηκε με κλινικά αποτελέσματα, αλλά ανεξάρτητα από κλινικοπαθολογοανατομικές πληροφορίες στάσης. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το στάδιο ασθενείς ΙΒ /ΙΙ είχαν πολύ κακή πρόγνωση, όταν οι όγκοι τους εξέφρασαν υπογραφές γονίδιο κακή κινδύνου. Υπήρχε μια διαφορά 23,7% σε 5-ετή DFS μεταξύ υπογραφές υψηλού κινδύνου και γονιδίων χαμηλού κινδύνου στο στάδιο ΙΒ /ασθενείς ΙΙ, και 5-ετή DFS του σταδίου υψηλού κινδύνου IB ασθενείς /ΙΙ ήταν κάτω από 60%, παρά το γεγονός ότι χρήση του ανοσοενισχυτικού χημειοακτινοθεραπεία (Σχήμα 1). Ως εκ τούτου, μπορεί να είναι απαραίτητο να σχεδιάσουμε προοπτικά μια δίκη να αναρωτηθούμε αν χημειοραδιοθεραπεία απαιτείται για το στάδιο ΙΒ /ασθενείς II με προφίλ γονιδιακής έκφρασης χαμηλού κινδύνου. Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί οποιαδήποτε πιθανή προκατάληψη από διαφορές στην κλινική πρακτική ή επέμβαση σε ένα ενιαίο κέντρο, πραγματοποιήσαμε μια ad hoc εξωτερική επικύρωση της υπογραφής για την επικύρωση της υπογραφής. Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα, η υπογραφή προέβλεψε με συνέπεια να επαναληφθεί στη Σιγκαπούρη ομάδα.

Ανάμεσα στους 8 τελικούς γονίδια GCPs (LAMP5, CDC25B, CDK1, CLIP4, LTB4R2, MATN3, NOX4, και TFDP1), CDC25B και CDK1, τα οποία είναι γνωστό ότι σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, βρέθηκαν να συσχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση (αρνητικός εκτιμήσεις Cox παλινδρόμησης στον πίνακα 2). Συγκεκριμένα, μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε για τον καρκίνο του παχέος εντέρου με προσδιορισμό γονιδιακής έκφρασης [17], [18]. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να αντανακλά την κατάσταση διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων του όγκου, αφού η κανονική γαστρικού βλεννογόνου και του παχέος εντέρου επιθηλιακά κύτταρα έχουν υψηλά ποσοστά του κύκλου εργασιών. TFDP1 κωδικοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα DP-1, το οποίο δρα ως ένας θετικός ρυθμιστής της μετάβασης G1 /S κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου [19], [20]. Ιδιαίτερα σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, TFDP1 υπερέκφραση ουσιαστικά συνδέεται με την εξέλιξη της νόσου [19]. Δεδομένου ότι το πεδίο εφαρμογής της παρούσας τρέχουσας μελέτης δεν περιλαμβάνει τη λειτουργική μελέτη των γονιδίων αυτών, βιολογική σημασία τους θα πρέπει να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες. Πρόσφατα, Cho

et al.

Έχει πραγματοποιήσει τη μεγαλύτερη γονιδιακής έκφρασης σε 213 ασθενείς με GC χρησιμοποιώντας κατεψυγμένα ιστούς [21]. Εντόπισαν 6 προγνωστική γονίδια (CTNBB1, EXOCS3, TOP2A, LBA1, CCL5, και LZTR1) για την επιβίωση των ασθενών μετά από θεραπευτική εκτομή. Ωστόσο, για το καλύτερο της γνώσης μας, GCPs είναι το μόνο γονίδιο σύνολο το οποίο έχει ήδη επικυρωθεί σε περισσότερες από 700 σταδίου ΙΙ ασθενείς GC, ανεξάρτητα από την κατάταξη Lauren (διάχυτη ή του εντέρου), ένα γνωστό προγνωστικός παράγοντας, ή επικουρική θεραπεία.

Εν κατακλείδι, με τη χρήση πολλαπλών σταδίων προσέγγισης, έχουμε αναπτύξει 8-γονιδίου GCPs, η οποία ήταν σε θέση να προσδιορίσει σθεναρά στάδιο ΙΙ ασθενείς GC υψηλού κινδύνου για υποτροπή μετά από χειρουργική επέμβαση, ανεξάρτητα από επικουρική θεραπεία. Επί του παρόντος, με την εν εξελίξει δίκη ΚΑΛΛΙΤΕΧΝΗΣ-II (NCT # 01761461), σχεδιάζουμε να επικυρώσει GCPs μας σε μια προοπτικά σχεδιασμένη μελέτη φάσης ΙΙΙ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

1. χαρακτηριστικά των ασθενών της μελέτης των κοινωνικών ομάδων σε κάθε βήμα (Πίνακας S1). ένα. Πίνακας S1. Ασθενείς χαρακτηριστικά. 2. Κλινική και παθολογικά χαρακτηριστικά των περιπτώσεων που εξετάστηκαν σε κάθε φάση. 3. Λεπτομερής περιγραφή του βήματος ανακάλυψη χρησιμοποιώντας δοκιμασία WG-DASL (στάδιο 1). ένα. Εικόνα S1. QA των δεδομένων WG-DASL. σι. Πίνακας S2. Σύγκριση των ψαριών και τα αποτελέσματα IHC για την κατάσταση του HER2 στο γαστρικό καρκίνο στο Βήμα 1. γ. Πίνακας S3. Λίστα ανιχνευτές που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ομάδων ασθενών HER2-θετικών και αρνητικών HER2- στο Βήμα 1. d. Πίνακας S4. Κατάλογος όλων των ανιχνευτών με μονοπαραγοντική τιμές p & lt? 0.01 στο Βήμα 1. ε. Εικόνα S2. αλγόριθμο κλίση Λάσο. φά. Πίνακας S5. Λίστα των 26 ανιχνευτών που περιλαμβάνονται στο μοντέλο πρόβλεψης έχει τοποθετηθεί από τον σύνολο των δεδομένων (n = 432). σολ. Πίνακας S6. Η πολυπαραγοντική Cox αποτελέσματα της ανάλυσης παλινδρόμησης στο σύνολο ανακάλυψη γονιδίων (n = 432). 4. Σχεδιασμός της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης επικεντρώθηκε χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα nCounter. ένα. Πίνακας S7. Λίστα των γονιδίων αναφοράς για την ανάλυση nCounter. σι. Εικόνα S3. Συσχέτιση μεταξύ των δεικτών επικινδυνότητας των προγνωστικών γονιδίων με βάση quantile εξομάλυνση και την αυτο-ομαλοποίηση χρησιμοποιώντας δοκιμασία WG-DASL. 5. nCounter προσδιορισμό και τον έλεγχο της ποιότητας. 6. Η επιλογή των cut-off για γαστρικός καρκίνος Πρόγνωσης Βαθμολογία (GCPs (Σχήμα S4, S5, & amp? S6) ένα σχήμα S4 DFS σύμφωνα με κάθε τεταρτημόριο του GCPs-g1 β Σχήμα S5 Cut-σημείο ανάλυσης για…… GCPs-g1. γ. Εικόνα S6. DFS σύμφωνα με βελτιστοποιημένη cut-σημείο GCPs-g1. 6. Κατανομή των GCPs μεταξύ σετ ανακάλυψη και σύνολο επικύρωσης. α. Σχήμα S7. Κατανομή GCPs-g1 μέσα στο σύνολο ανακάλυψη και την επικύρωση. β Σχήμα S8 GCPs:… εντερική vs τύπου διάχυτη 7. Έλεγχος της κλινικής χρησιμότητας της GCPs-G2 σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία μόνο με χειρουργική επέμβαση ένα σχήμα S9 DFS των ασθενών σταδίου II που έλαβαν θεραπεία με χημειοραδιοθεραπεία βασίζεται σε τεταρτημόριο GCPs-G2…. β. Σχήμα S10. DFS του σταδίου ΙΙ οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με μόνη την επέμβαση βασίζεται στην τεταρτημόριο GCPs-G2. γ. Εικόνα S11. έκφραση των αρνητικών προγνωστικών γονιδίων που περιλαμβάνονται στο γαστρικός καρκίνος Πρόγνωσης βαθμολογία σύμφωνα με διαμερίσματα ιστού (όγκου έναντι στρώμα). Κανονικοποιημένη έκφρασης τα επίπεδα της περιόδου αυτής. δ. Πίνακας S8. Κατάλογος των nCounter ανιχνευτές που περιλαμβάνονται στο 8. Η γαστρική πρωτόκολλο της μελέτης GCPs-G2. επικύρωσης του καρκίνου. ένα. Εικόνα S12. Γαστρικό πρωτόκολλο της μελέτης επικύρωσης του καρκίνου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090133.s001

(DOCX)

You must be logged into post a comment.