Αφηρημένο

πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs) είναι μοριακοί συνοδοί που προστατεύουν τις πρωτεΐνες από τη ζημία. έκφραση HSP27 συνδέεται με μετασχηματισμό και εισβολή καρκίνου.

Ginkgo biloba

εκχύλισμα (EGb761), η πιο ευρέως πωλούνται φυτικό συμπλήρωμα, έχει αντιαγγειογενετικές αποτελέσματα και επάγει την απόπτωση του όγκου. Τα δεδομένα σχετικά με την επίδραση του EGb761 στην έκφραση HSP είναι περιορισμένη, ιδιαίτερα στον καρκίνο. έκφραση HSP27 σε ζεύγη όγκους και φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων των 64 ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ανιχνεύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, κηλίδωση Western, και ανοσοϊστοχημεία. NSCLC κυτταρικές γραμμές (Α549 /Η441) χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των μεταναστευτικών ικανότητες

in vitro

. NSCLC ιστού έδειξε υψηλότερη έκφραση HSP27 από το φυσιολογικό πνευμονικό ιστό. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με NSCLC με αναλογία χαμηλή έκφραση HSP27 (& lt? 1) είχαν σημαντικά μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από εκείνες με υψηλό λόγο έκφρασης (& gt? 1) (p = 0.04). EGb761 ανέστειλε έκφραση HSP27 και μεταναστευτικές ικανότητα των κυττάρων Α549 /Η441, η οποία είναι η ίδια όπως HSP27-siRNA αποτέλεσμα την επιμόλυνση. Επιπλέον, η θεραπεία EGb761 ενεργοποιήσει τις οδούς ΑΚΤ και ρ38 και δεν επηρέασε την έκφραση των ΡΙ3Κ, ERK, JNK και μονοπάτια. HSP27 είναι κακό προγνωστικό δείκτη του NSCLC. EGb761 μπορεί να μειώσει την ικανότητα μετανάστευσης των Α549 /Η441 με την αναστολή της έκφρασης HSP27 πιθανότατα μέσω της ενεργοποίησης ΑΚΤ και τα μονοπάτια της p38 ΜΑΡΚ

Παράθεση:. Tsai JR, Liu PL, Chen YH, Chou SH, Yang MC, Cheng YJ, et al. (2014)

Ginkgo biloba

Απόσπασμα Μειώσεις μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μετανάστευση των κυττάρων με ρύθμιση προς τα κάτω Μετάσταση-Associated Factor Heat-Shock Protein 27. PLoS ONE 9 (3): e91331. doi: 10.1371 /journal.pone.0091331

Επιμέλεια: Prasad Σ Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering,, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29η Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 9 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαρτίου του 2014

Copyright: © 2014 Tsai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από επιχορήγηση KMU-Q098022 από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Kaohsiung, και να χορηγήσει NSC102-2314-B-037-067 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Ακόμη και με τις βελτιώσεις και στις δύο διαγνωστικές και θεραπευτικές τεχνικές, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι ακόμη κακή. Κακή πρόγνωση του καρκίνου του πνεύμονα προκαλείται κυρίως από πρώιμη υποτροπή, μετάσταση, και η κακή απόκριση σε θεραπείες όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και [1] – [2]. Έλλειψη καλών προγνωστικών βιοδεικτών, το οποίο μπορεί να προβλέψει την ανταπόκριση στη θεραπεία και την πρόγνωση, επηρεάζει επίσης τα σχέδια της θεραπείας και την έκβαση των ασθενών.

πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs) είναι μια μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών που έχουν ουσιώδη αιμοστατική λειτουργίες στα κύτταρα υπό φυσιολογικές συνθήκες. Σύμφωνα με μοριακά βάρη, HSPs ομαδοποιούνται σε διάφορες υποοικογένειες: μικρό (HSP 20-30 kDa), Hsp40, HSP60, HSP70, HSP90, και HSP100. Η κύρια λειτουργία του HSP είναι να προστατεύουν τα κύτταρα από βλάβες σε στρεσογόνες συνθήκες [3]. Εκτός από την κυτταροπροστατευτική αποτελεσμάτων τους, HSPs μπορεί να προωθήσει την καρκινογένεση με αναστολή απόπτωσης [4] – [8] και με την ενίσχυση της αντίστασης στη θεραπεία [9] – [10]. Ωστόσο, ο ρόλος των HSPs σε διαφορετικούς όγκους είναι περίπλοκη [4], [9].

HSP27 είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε αρκετούς φυσιολογικούς ιστούς και κακοήθειες. Η έκφρασή του έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση σε ωοθήκης [11], του μαστού [9], [12], γαστρικό [13] – [14], το ήπαρ [15], και του προστάτη [16], καθώς και osteoscarcomas [7] . Σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [3] και του όγκου ουρογεννητικού συστήματος [17], η έκφραση HSP27 έχει καμία επίδραση στην πρόγνωση. Ωστόσο, ο προγνωστικός ρόλος της έκφρασης HSP27 στον καρκίνο του πνεύμονα είναι υπό συζήτηση. Zimmermann et al. [18] ανέφερε ότι το επίπεδο HSP27 ορού συσχετίστηκε θετικά με προχωρημένα στάδια του καρκίνου του πνεύμονα. έκφραση HSP27 μπορεί να αυξήσει την χημειοαντίσταση του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) και είναι μια φτωχή πρόγνωση του δείκτη [10], [19]. Σε αντίθεση, HSP27 υπερέκφραση συνδέεται με καλύτερη επιβίωση σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, σύμφωνα με μια μελέτη από Malusecka et al. [20]. Ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξαν ότι η έκφραση HSP27 σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα δεν συσχετίζεται με την T (πρωτογενής όγκος) Ν (λεμφαδένες) Μ (μετάσταση) και τα στάδια [21].

Εκχυλίσματα από τα φύλλα του

Ginkgo biloba

έχουν χρησιμοποιηθεί στην Κίνα και χώρες της Δύσης για αιώνες χάρη στις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες [22]. Ένα πρότυπο

G. biloba

εκχύλισμα, EGb761 (εμπορική ονομασία), περιέχει 22% -27% φλαβονοειδή και 5% -7% τερπενοειδή, τα οποία είναι τα πιο σημαντικά δραστικές ουσίες [23]. EGb761 να σαρώνουν τις ελεύθερες ρίζες και την εξουδετέρωση των φέρι peroxidants ιόντων που προκαλείται από [24]. Ως εκ τούτου, EGb761 είναι χρήσιμο για την πρόληψη και τη θεραπεία των εκφυλιστικών διαδικασιών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες [25] – [26]

Αν και η χημειοθεραπεία είναι ακόμα η κύρια θεραπεία που χρησιμοποιείται για τον καρκίνο του πνεύμονα, οι δυσμενείς παρενέργειες που σχετίζονται με αυτό. θεραπεία περιορίζουν τη χρήση της. Συμπληρωματικά φάρμακα, όπως τα φυτικά φάρμακα έχουν γίνει πιο δημοφιλή τα τελευταία χρόνια. Επιπλέον, διάφορα πειράματα έχουν αναφέρει ότι EGb761 έχει αποτελέσματα κατά του όγκου. Οι αντικαρκινικές ιδιότητες του EGb761 αποδίδεται στις αντιοξειδωτικές του, αντιαγγειογενετικές, και γονιδιακών ρυθμιστικών επιπτώσεων [24]. EGb761 μπορεί να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του όγκου μέσω απόπτωσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [27] και τον καρκίνο του στόματος κοιλότητα [28]. Φάση II συνδυασμένη θεραπεία που περιλαμβάνει 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και EGb761 έχει δοκιμαστεί σε ασθενείς με παγκρεατικό ή του παχέος εντέρου [29] – [30] και έχει δείξει ελπιδοφόρα αποτελέσματα. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση HSP27 σε ασθενείς με NSCLC και ανέλυσε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης HSP27 και τα κλινικά αποτελέσματα. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της EGb761 στην έκφραση HSP27. Ελπίζουμε ότι τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης θα παράσχει ιατρούς με ένα νέο συνδυασμό φαρμακευτικές αγωγές και να χρησιμεύσει ως προγνωστικός παράγοντας για τη βελτίωση της NSCLC πρόγνωση.

Αποτελέσματα

Δημογραφικά έκφρασης HSP27 δεδομένων και σε ασθενείς με NSCLC

Συνολικά, 64 ασθενείς με ΜΜΚΠ συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Από αυτούς, 47 (73%) ήταν ιστολογικά χαρακτηριστεί ως έχοντες αδενοκαρκίνωμα και 17 (27%) ασθενείς είχαν χαρακτηριστεί ως έχοντες καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 61,2 ± 9,5 έτη (εύρος, 36 έως 78 ετών). Η σταδιοποίηση TNM και το καθεστώς έκφραση HSP27 σε ασθενείς με NSCLC συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Η μέση αναλογία έκφραση HSP27 ήταν 2.05 ± 1.95. Οι ασθενείς με NSCLC με καρκίνους μετάσταση και προχωρημένο στάδιο (φάση ΙΙΙΒ-IV) είχαν υψηλότερη αναλογία έκφραση HSP27 από εκείνα χωρίς μετάσταση και πρώιμο στάδιο καρκίνους (ρ = 0,03 και ρ = 0,009, αντίστοιχα). καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε NSCLC ασθενείς με αναλογία έκφραση χαμηλού HSP27 είχαν σημαντικά καλύτερη χρόνο επιβίωσης από εκείνα με υψηλό λόγο έκφραση (ρ & lt? 0,05? Εικ. 1). Οι αναλογίες κινδύνου για πολλαπλές μεταβλητές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Cox παλινδρόμησης με επιπλέον μεταβλητές του φύλου (αρσενικό σε σχέση με γυναίκα), ηλικίας (έτη), μετάσταση, του όγκου, και η συμμετοχή των λεμφαδένων (Πίνακας 2). Με αυτόν τον τρόπο, βρήκαμε ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση HSP27 είχε ένα 2,30 φορές υψηλότερο κίνδυνο θνησιμότητας (p = 0,04) από ό, τι οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση HSP27

Η

Η

HSP27 έκφρασης. ασθενείς με NSCLC

έκφραση HSP27 σε ασθενείς με NSCLC αναλύθηκε (Εικ. 2). Η ανοσοϊστοχημική χρώση και ανάλυση κηλίδας Western των ιστών καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν υψηλότερη έκφραση HSP27 σε ιστό καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (Εικ. 2Α-Β).

(Α) του πνεύμονα δείγματα (καρκίνος του πνεύμονα και αντίστοιχο κανονικό γειτονικό πνεύμονα ιστούς) αναλύθηκαν με αντίσωμα για τη θέρμανση της πρωτεΐνης σοκ 27 (HSP27) στην ανοσοϊστοχημική χρώση (χρώση DAB και αιματοξυλίνη αντιχρωματισμός). Για αρνητικούς ελέγχους, το αντίσωμα αντικαταστάθηκε από IgG ελέγχου. HSP 27 υπερεκφράστηκε σε NSCLC ιστό από το κανονικό πνευμονικό ιστό. (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση της HSP 27 έκφραση σε NSCLC ιστό και φυσιολογικό ιστό. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τέσσερα διαφορετικά ασθενείς με NSCLC εμφανίζονται (Τ = όγκος? Ν = φυσιολογικό). Η έκφραση της πρωτεΐνης HSP27 έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη σε NSCLC ιστό συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (* ρ & lt? 0,05).

Η

Επίδραση της EGb761 στην κυτταροτοξικότητα και την έκφραση HSP27 σε κυτταρικές σειρές BEAS-2Β και NSCLC (Α549 και Η441)

Εμείς αντιμετωπίζεται 3 κυτταρικές σειρές (BEAS-2B, Α549, και Η441) με διαφορετικές συγκεντρώσεις EGb761. Η δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε ότι EGb761 δεν είχε κυτοτοξικό αποτέλεσμα σε αυτές τις 3 κυτταρικές σειρές ακόμη και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (Σχ. 3Α). Η δοκιμασία κατάτμησης DNA έδειξε επίσης ότι EGb761 δεν προκάλεσε απόπτωση σε BEAS-2Β, Α549, και κυτταρικές γραμμές Η441 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (Σχ. 3Β). έκφραση HSP27 σε Α549 και κυτταρικές σειρές Η441 μειώθηκε σημαντικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με μια αύξηση στην συγκέντρωση EGb761, όπως προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western (Σχ. 3C). Ωστόσο, η έκφραση HSP27 σε φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (BEAS-2Β) δεν άλλαξε όταν οι συγκεντρώσεις EGb761 ήταν κάτω από 500 μg /mL.

(Α) EGb761 δεν έχουν προφανή κυτταροτοξική επίδραση στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών ( Α549 και Η441) και φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (BEAS-2Β). δοκιμασίας (Β) θραύσμα DNA έδειξε EGb761 δεν επάγει BEAS-2Β, Α549 και την απόπτωση των κυττάρων Η441. (Γ) Η /πρωτεΐνη έκφραση HSP27 mRNA των κυττάρων BEAS-2Β δεν άλλαξε σημαντικά όταν οι συγκεντρώσεις των EGb761 ήταν κάτω των 500 [0-9] [A-Z] μg /ml. Επιπροσθέτως, η έκφραση /πρωτεΐνης HSP27 mRNA των κυττάρων Α549 /Η441 μπορεί να μειώνεται σημαντικά με την αύξηση της συγκέντρωσης EGb761 κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Εκπρόσωπος φωτογραφίες από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Επίδραση των EGb761 και HSP27-siRNA επιμόλυνση στην έκφραση HSP27

Εμείς επιμολυσμένα το Α549 /Η441 κυττάρων με HSP27-siRNA πλασμίδιο. Το πλασμίδιο διαμόλυνση HSP27-siRNA μειώθηκε σημαντικά έκφραση HSP27 σε κύτταρα Α549 /Η441, το οποίο επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου και στύπωμα Western (Εικ. 4Α-Β). EGb761 είχε επίσης το ίδιο αποτέλεσμα όπως HSP27-siRNA επιμόλυνση σε σημαντικά μειώνοντας HSP27 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε Α549 /Η441 (Εικ. 4Α-Β). Παρά το γεγονός ότι και οι δύο θεραπεία HSP27-siRNA και EGb761 μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση HSP27, αυτό δεν σημαίνει ότι υπάρχει μια σχέση τελεστή μεταξύ τους. Πρόσθετες μελέτες για να εξετάσει περαιτέρω αυτή τη σχέση.

(Α) Η έκφραση HSP27 mRNA των κυττάρων /Η441 Α549 μειώθηκε με τη θεραπεία EGb761 ή HSP27-siRNA επιμόλυνση 24 ώρες αργότερα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Β) Η πρωτεΐνη HSP27 έκφραση των κυττάρων Α549 /Η441 επίσης μειώθηκε με θεραπεία EGb761 και HSP27-siRNA διαμόλυνση 24 ώρες αργότερα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. *

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. NC-siRNA είναι ο αρνητικός μάρτυρας.

Η

Επιπτώσεις της EGb761 και HSP27-siRNA επιμόλυνση στην μεταναστευτική ικανότητα Α549 /Η441

Α549 /Η441 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η επίδραση της HSP27 σε NSCLC κυττάρων μεταναστευτική ικανότητα

in vitro

. Κυτταρική μετανάστευση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μηδέν πληγή. Σε σύγκριση με την μεταναστευτική ικανότητα της ομάδας ελέγχου, η μεταναστευτική δραστηριότητα των κυττάρων /Η441 Α549 αναστάλθηκε σημαντικά μετά HSP27-siRNA διαμόλυνση ή θεραπεία EGb761. (Ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5Α-Β.)

(Α) Κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με δοκιμασία μονοστιβάδας απογύμνωση και αναλύθηκαν από το λογισμικό Wimasis WimScratch. Η μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων Α549 /Η441 ανεστάλη με EGb761 (100 μg /ml) θεραπεία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Φίμωση της έκφρασης HSP27 από HSP27-siRNA επιμόλυνση, η μεταναστευτική ικανότητα μειώθηκε επίσης σε Α549 /Η441. NC-siRNA είναι ο αρνητικός έλεγχος. Εκπρόσωπος φωτογραφίες από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Η ρυθμιστική επίδραση των EGb761 στην έκφραση HSP27 μέσω ΑΚΤ και p38 MAPK μονοπατιού

Τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης, όπως ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ είναι σημαντικοί καθοριστικοί παράγοντες του καρκίνου μετανάστευση [31] – [33]. Ωστόσο, τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης ρυθμιστικές μεταξύ EGb761 και της έκφρασης HSP27 είναι ακόμα ασαφής. Αναλύσαμε την έκφραση διαφορετικών πρωτεϊνών οδού μετά την επεξεργασία των κυττάρων Α549 /Η441 με διαφορετικές συγκεντρώσεις EGb761. Η έκφραση του ρ-ΑΚΤ και ρ-Ρ38 αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία EGb761 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, και η έκφραση των ΡΙ3Κ, ERK, και JNK δεν άλλαξε μετά από θεραπεία EGb761 (Σχ. 6Α, D) Έχουμε περαιτέρω επεξεργασία το Α549 /κυτταρική γραμμή Η441 με αναστολέα ΑΚΤ (ΑΡΙ-59, 3 mM) και αναστολέα ρ38 ΜΑΡΚ (SB203580, 10 mM). Η ανασταλτική επίδραση του EGb761 επί της έκφρασης HSP27 έχει αποκλειστεί από τον αναστολέα ΑΚΤ ή ρ38 ΜΑΡΚ (Σχ. 6Β, E). Επιπλέον, η ικανότητα μετανάστευση κυττάρων Α549 /Η441 ανακτήθηκε επίσης μετά ΑΚΤ ή αναστολέα ρ38 θεραπεία, ακόμη και με την παρουσία του EGb761 (Σχ. 6C, F). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι EGb761 ρυθμίζεται η έκφραση HSP27, πιθανότατα μέσω της ΑΚΤ και p38 ΜΑΡΚ μονοπατιών σηματοδότησης.

(Α, D) Οι εκφράσεις της AKT /ρΑΚΤ, Ρ38 /ρρ38, PI3K /pPI3K, ΕΚΚ /pERK, JNK /pJNK του Α549 /Η441 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western μετά την επεξεργασία με EGb761 (100 μg /ml). Η έκφραση του ρΑΚΤ και ρ-ρ38 ενισχυθεί με αγωγή EGb761 σημαντικά (ρ & lt? 0,05) (Β, Ε). Κύτταρα Α549 /Η441 γραμμή υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολείς του ΑΚΤ (ΑΡΙ-59) (3 mM), ρ38 ΜΑΡΚ (SB203580) (10 mM) για 1 ώρα και EGb761 (100 μg /ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία αργότερα. Ο αναστολέας ΑΚΤ ή αναστολέα ρ38 μπορεί να εμποδίσει την ανασταλτική επίδραση της EGb761 στην έκφραση της πρωτεΐνης HSP27. (C, F) Cellular μετανάστευση προσδιορίστηκε με δοκιμασία μονοστιβάδας απογύμνωση και αναλύθηκαν από το λογισμικό Wimasis WimScratch. Με αναστολέα της ΑΚΤ ή αναστολέα p38, η κυτταρική μεταναστευτική ικανότητα Α549 /Η441 δεν ήταν εξασθενημένος από EGb761. Εκπρόσωπος φωτογραφίες από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05 έναντι του ελέγχου. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Οι πρωτεΐνες αυτές είναι πανταχού παρόντα μοριακές συνοδούς παρούσα σε όλα τα ζωντανά κύτταρα. Προστατεύουν τα κύτταρα από βλάβες περιβαλλοντικό στρες [34]. Το μικρό HSP27 παίζει ένα ρόλο στην μεταγωγή σήματος, ρύθμιση της ανάπτυξης, την ανάπτυξη, διαφοροποίηση, και ογκογένεση [35]. Οι αύξηση των επιπέδων της HSP27 έχουν παρατηρηθεί σε αρκετές κακοήθειες όπως ο καρκίνος του μαστού [36], καρκίνος του παχέος εντέρου [37], του καρκίνου του προστάτη [16], και του καρκίνου του πνεύμονα [10], [21]. Στη μελέτη μας, διαλογή την έκφραση των hsps, συμπεριλαμβανομένων Ηδρ10, HSP27, HSP30, HSP60, HSP70, HSP90 και σε δείγματα NSCLC ιστού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μόνο HSP27 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε NSCLC ιστό. Συντονισμό με τον ασθενή κλινικές παραμέτρους, η υπερέκφραση της HSP27 φαίνεται να αυξάνει το μεταστατικό δυναμικό του NSCLC και είναι μια φτωχή προγνωστική ικανότητα πρόβλεψης. Μπλόκο έκφραση HSP27 από EGb761 μείωσε τη μεταναστευτική ικανότητα των κυτταρικών σειρών NSCLC.

HSP27 έχει προσελκύσει πολλή προσοχή κατά τις τελευταίες δεκαετίες λόγω του ρόλου της στην καρκινογένεση του όγκου, προγνωστικών, έξυπνη, και τις επιπτώσεις της θεραπείας [4]. Στον καρκίνο του οισοφάγου, της έκφρασης HSP27 μειώνεται κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης σε αδενοκαρκινώματα, αλλά αυξάνει κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα [38]. έκφραση HSP27 συσχετίζεται με το βαθμό διαφοροποίησης του δέρματος [39], του ενδομητρίου [40], και οι καρκίνοι της μήτρας [41]. HSP27 υπερέκφραση προκαλεί επίσης χημειοαντίσταση στον καρκίνο του προστάτη [42] και καρκίνο του οισοφάγου [43], αλλά ενισχυμένη απόκριση στη θεραπεία σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [44]. Εν ολίγοις, ο ρόλος της HSP27 είναι μεταβλητή και εξαρτάται από διάφορους τύπους καρκίνου.

Στη μελέτη μας, HSP27 ήταν κακό προγνωστικό δείκτη σε ασθενείς με NSCLC μετά την προσαρμογή για άλλους παράγοντες. Υψηλότερες αναλογία έκφραση της HSP27 παρατηρήθηκε σε ασθενείς με NSCLC με προχωρημένο καρκίνο, η οποία ήταν ίδια με εκείνη που αναφέρθηκε σε μια μελέτη από Zimmermann et al. [18]. Ορός επίπεδο HSP27 είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για τη διάκριση υγιείς καπνιστές και ασθενείς με καρκίνο με πρώιμο και προχωρημένο στάδιο NSCLC [18]. Ωστόσο, μια έκθεση από Malusecka et al. έδειξαν ότι η έκφραση HSP27 μπορεί να είναι ένας ευνοϊκός προγνωστικός παράγοντας σε NSCLC [20]. Η ανάλυση των υποομάδων έδειξε ότι η HSP27 διατήρησε προγνωστική σημασία της στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, αλλά όχι σε αδενοκαρκίνωμα. Δύο τρίτα των ασθενών είχαν ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα στη μελέτη Malusecka, αλλά το ποσοστό των ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα ήταν μόνο 27% στη μελέτη μας. ανάλυση υποομάδας μας έδειξε καμία προγνωστική διαφορά μεταξύ των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Μικρά μεγέθη δείγματος και η ετερογένεια είναι περιορισμούς μας. Επιπλέον, η μεταναστευτική ικανότητα Α549 και Η441

in vitro

μειώθηκε σημαντικά μετά την φίμωση έκφραση HSP27, η οποία ήταν σύμφωνη με την κλινική παρατήρηση μας ότι η έκφραση HSP27 μπορεί να αυξήσει τον μεταστατικό δυναμικό. Αν και HSP27 είχε εντοπιστεί ως μετάσταση-πρωτεΐνης που συνδέεται με NSCLC [45] – [46], η ακριβής σχέση μεταξύ HSP27 και το μεταστατικό μηχανισμό απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση

Τα φάρμακα της χημειοθεραπείας επηρεάζουν συνήθως και τα δύο παθολογικά καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά. κύτταρα και να προκαλέσουν σοβαρές επιπλοκές και την τοξικότητα. Η σισπλατίνη, ένας αποτελεσματικός αντινεοπλασματικός παράγοντας, είναι το κύριο στοιχείο στην αγωγή χημειοθεραπείας του καρκίνου του πνεύμονα. Νευροαισθητήρια απώλεια ακοής και νεφροτοξικότητα είναι οι σημαντικότερες αρνητικές επιπτώσεις της σισπλατίνης, η οποία μπορεί να συνεπάγεται υπερβολικό σχηματισμό ελεύθερων ριζών [24]. Μέσω σάρωσης και την πρόληψη του σχηματισμού των ελεύθερων ριζών, EGb761 μπορεί να επάγει προστατευτικές επιδράσεις κατά της τοξικότητας που προκαλείται από σισπλατίνη. Σε ένα πείραμα σε αρουραίους, EGb761 μειώθηκε επιτυχώς τοξικότητα σισπλατίνης σχετιζόμενη χωρίς εξασθένηση αντικαρκινική δραστικότητα του [47]. Κατάστασης μη απόκρισης ή την επιβίωση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου μετά τη θεραπεία μπορεί να είναι υπεύθυνη για την επανεμφάνιση και την αντίσταση του καρκίνου του πνεύμονα σε σύγχρονες θεραπεία [48]. ενεργοποίηση HSP27 έχει παρατηρηθεί σε χημειοθεραπεία κύτταρα κύτταρο-όπως ο καρκίνος του πνεύμονα στέλεχος [10]. Η μελέτη μας έδειξε ότι EGb761 ανέστειλε την έκφραση HSP27 σε κύτταρα NSCLC. Ως εκ τούτου, EGb761 μπορεί να έχει μεγάλες δυνατότητες στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, λόγω της ανασταλτικής δράσης της επί της έκφρασης HSP27.

κυτταρική απόκριση θερμικού σοκ συνήθως αναπτύσσεται γρήγορα, η οποία σχετίζεται με την ενεργοποίηση των μεγάλων μονοπατιών μεταγωγής σηματοδότησης που περιλαμβάνουν την ενεργοποιούμενη από μιτογόνο πρωτεΐνης (ΜΑΡ) κινάσες, εξωκυτταρικό κινάσες σήματος ρυθμιζόμενη (ERKs), c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), ρ38 και [49]. Αυτές οι καταρράκτες σηματοδότησης παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση και τον καθορισμό της κυτταρικής τύχης όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, ή απόπτωση σε πολλές φυσιολογικές καθώς και τις συνθήκες στρες [50]. ΑΚΤ μονοπάτια μεταγωγής σήματος /ΡΙ3Κ-εξαρτώμενη είναι σήματα επιβίωση των κυττάρων που διεγείρονται από παράγοντες ανάπτυξης, κυτοκίνες, και ογκοπρωτεϊνών. Υπερδραστήρια AKT οδό /PI3K μπορεί να μειώσει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό [51]. Ωστόσο, η ρυθμιστική σχέση μεταξύ των HSP27, PI3K /AKT, και τα μονοπάτια κινάσης ΜΑΡ είναι πολύπλοκη. Για παράδειγμα, η οδός p38MAPK-ΜΑΡΚΑΡΚ2-HSP27 θα ενεργοποιείται με ciplastin χημειοθεραπευτικού παράγοντος συν γεμσιταβίνη σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του πνεύμονα [10]. Σε αντίθεση, HSP27 προκαλεί αντίσταση σισπλατίνη πιέζοντας ενεργοποίησης ρ38 και την ενίσχυση της ενεργοποίησης ΑΚΤ στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [52]. Αυτή η διαφορά μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και του σχεδιασμού της μελέτης. Guo et al. έδειξαν ότι η έγκαιρη, παροδική ενεργοποίηση των JNK ή ρ38 ΜΑΡΚ (ή και τα δύο) συνδέεται συνήθως με την επιβίωση ή διαφοροποίηση των κυττάρων, ενώ η καθυστερημένη, παρατεταμένη ενεργοποίηση αυτών των κινασών συνδέεται γενικά με την απόπτωση [53]. Σε παχέος εντέρου, HSP27 υπερέκφραση είναι KRAS μετάλλαξη εξαρτάται [54], αλλά και οι δύο Α549 και Η441 είναι KRAS κυτταρικές σειρές μετάλλαξη. Η σχέση του KRAS μεταλλάξεις και της έκφρασης HSP27 στον καρκίνο του πνεύμονα χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Στην έκθεσή μας, EGb761 εξασθενημένα έκφραση HSP27 σε Α549 /κυτταρικές σειρές Η441 με την ενεργοποίηση της p38 MAPK και μονοπάτια ΑΚΤ αλλά δεν ERK ή JNK οδού. Επειδή ο συνδυασμός της ΑΚΤ και θεραπεία αναστολέα ρ38 μπορεί να μειώσει την κυτταρική βιωσιμότητα, οι συνεργιστικές επιδράσεις της θεραπείας συνδυασμού στην έκφραση της HSP27 μπορεί να χρειαστεί περαιτέρω ανάλυση. Επιπλέον, επειδή η κατάσταση ενεργοποίησης (φωσφορυλίωση) είναι ασταθής και αποφωσφορυλίωση συμβεί γρήγορα υπό φυσιολογικές συνθήκες, είναι δύσκολο να παρατηρήσουμε τα πραγματικά αποτελέσματα της ενεργοποίησης ΑΚΤ και ρ38

in vivo

στην ομάδα των ασθενών χαμηλή έκφραση HSP27.

Εν κατακλείδι, HSP27 είναι ένας φτωχός προγνωστικός παράγοντας του NSCLC, και EGb761 έχει μεγάλες δυνατότητες για να χρησιμοποιηθούν ως θεραπεία συμπλήρωμα για τη θεραπεία του NSCLC λόγω ανασταλτική δράση της επί της έκφρασης HSP27.

Υλικά και μέθοδοι

συλλογή δειγμάτων όγκων

NSCLC και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών συλλέχθηκαν από 64 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο Τμήμα Θωρακοχειρουργική Κλινική, Τμήμα χειρουργικής, Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, 2004-2010 . δείγματα ιστού τοποθετήθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο για την αποστολή στο εργαστήριο και στη συνέχεια αποθηκεύεται σε καταψύκτες -80 ° C μέχρι διεξήχθησαν απομόνωση RNA και εκχύλιση πρωτεΐνης. Πλήρης διαδικασίες στάσης, περιλαμβανομένων ακτινογραφία θώρακα, η βρογχοσκόπηση, του εγκεφάλου και των θωρακικών αξονική τομογραφία, υπερηχογράφημα και σπινθηρογράφημα οστών διεξήχθησαν για να καθορίσουν με ακρίβεια τα χαρακτηριστικά του TNM σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, ανάλογα με το σύστημα σταδιοποίησης ΤΝΜ Διεθνούς για τον καρκίνο του πνεύμονα [55]. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν μέχρι το Μάρτιο του 2011, και ήταν ενημερωμένα στοιχεία των δημογραφικών και επιβίωση των δεδομένων τους.

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την ηθική κριτική του Διοικητικού Συμβουλίου για την Έρευνα (KMUH-IRB- 990358) της Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Kaohsiung, Ταϊβάν. Οι συμμετέχοντες παρέχουν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη.

εκχύλιση RNA και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (PCR)

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από κατεψυγμένα ιστούς των πνευμόνων του όγκου των ασθενών με NSCLC και το αντίστοιχο κανονικό γειτονικούς ιστούς των πνευμόνων. RNA από φυσιολογικό ιστό πνεύμονα, πνευμονικό ιστό του όγκου, και ο καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy Mini και μία RNase-free DNase Set (Qiagen, Valencia, CA, USA). Ολικό RNA (2 μα) υπέστη αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας SuperScript ™ και First-Strand Synthesis System για το κιτ RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μια αραίωση του προκύπτοντος cDNA 1:05 χρησιμοποιήθηκε ως το πρότυπο, και μια αραίωση 1:10 πρότυπο του προκύπτοντος cDNA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της σχετικής περιεκτικότητας του mRNA με τη χρήση PCR πραγματικού χρόνου (LightCycler FastStart DNA κύριο SYBR Green Ι, Roche, Mannheim, Germany). Οι παρακάτω εκκινητές για PCR πραγματικού χρόνου σχεδιάστηκαν με χρήση του λογισμικού Primer Express (RealQuant, Roche, Mannheim, Germany) χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες αλληλουχίες: ανθρώπινη HSP27 (GenBank: Accession number: AB020027.1) εναρκτήρας με νόημα: 5′-GTC CCA CGA GAT CAC CAT-3 ‘, ανθρώπινο HSP27 αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-GGT GGT TGC ΤΤΤ GAA CTT ΤΑΤ Τ-3′, ανθρώπινο GAPDH αίσθηση έναυσμα: 5’-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3 ‘, και GAPDH αντιπληροφοριακό έναυσμα: 5’-GCC CAA GAC TAC CAA ATC C-3 ‘. Τα δεδομένα φθορισμού αποκτήθηκαν στο τέλος της επέκτασης. Melt ανάλυση πραγματοποιήθηκε για όλα τα προϊόντα για να προσδιοριστεί η ειδικότητα της ενίσχυσης. Επιπλέον, τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα 1% αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί κατά πόσον τα σωστά μεγέθη μπάντα ήταν παρόντες. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε ως λόγος της έκφρασης στον όγκο σε σύγκριση με την έκφραση στον φυσιολογικό γειτονικό ιστό (υψηλή έκφραση: καρκινικής βλάβης /φυσιολογικού ιστού & gt? 1? Χαμηλή έκφραση: όγκος βλάβη /φυσιολογικού ιστού & lt? 1) [56] – [57]

Ανοσοϊστοχημική χρώση

δειγμάτων όγκου αποκόπηκαν από ανθρώπινο ιστό πνεύμονα, μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένο διάλυμα φορμαλίνης όλη τη νύκτα, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν σε 5-μm πάχη.. Οι τομές παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και βάφτηκαν με αντιανθρώπινο-HSP27 (Santa Cruz, Dallas, ΤΧ, USA) αντίσωμα. Μετά PBS έκπλυση, οι τομές επωάστηκαν με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για τις αντιδράσεις χρώμα, διαμινοβενζιδίνη (DAB) χρησιμοποιήθηκε και σε αντίθεση χρώση με αιματοξυλίνη. Για αρνητικούς ελέγχους, το αντίσωμα αντικαταστάθηκε από IgG ελέγχου.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [0,5 Μ NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,05% SDS, 0,5% Triton Χ-100, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), ρΗ 7.4] για 30 λεπτά στους 4 ° C και τα προϊόντα λύσης κυττάρου φυγοκεντρήθηκαν στις 4,000

g

για 30 λεπτά στους 4 ° C. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα υπερκείμενα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού πρωτείνης BioRad (BioRad, Hercules, CA, USA). Τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε 12% SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (ΝΕΝ) επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS που περιείχε 0,05% Tween 20 και 2% αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν χωριστά με το ποντίκι αντιανθρώπινο HSP27, ΑΚΤ /ρΑΚΤ, Ρ38 /ρρ38, ΡΙ3Κ /pPI3K, ΕΚΚ /pERK, JNK /pJNK ή α-τουμπουλίνης (Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, όπως εσωτερικού ελέγχου. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν για με ραφανιδική υπεροξειδάση-συζευγμένο antigoat κουνέλι ή IgG ποντικού σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου χημειοφωταύγειας συν NEN και η έκθεση σε Biomax MR Film (Kodak, Rochester, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Πολιτισμός κυττάρων NSCLC

αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα Α549 /Η441 κύτταρα (ATCC CCL- 185 /ATCC ΗΤΒ-174) καλλιεργήθηκαν σε φιάλες σε μέσο ανάπτυξης Ρ12Κ συμπληρωμένο με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 pg /mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. κύτταρα BEAS-2Β (ATCC CRL- 9609), τα οποία είναι φυσιολογικά βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος.

HSP27 σίγηση σε Α549 /Η441 κύτταρα

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA), ένα ειδικά διπλόκλωνα 21-νουκλεοτιδίων ομόλογη αλληλουχία RNA προς το γονίδιο-στόχο, χρησιμοποιήθηκε για να σιγήσει έκφραση HSP27. Ανθρώπινα HSP27 siRNA νοηματικό εκκινητή: 5′-GCG UGU CCC UGG Αύγουστο UCA ΑΤΤ-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-UUG ACA UCC ΑΓΓ GAC ACG CGC-3’. SiRNA για HSP27 και αρνητικό έλεγχο (NC-siRNA) σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό υπολογιστή από Ambion (Austin, ΤΧ, USA) και κιτ κατασκευής Silencer ™ siRNA από Ambion, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αναστολή της HSP27 mRNA και της πρωτεΐνης έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση ανοσοστυπώματος μετά την επιμόλυνση του Α549 /Η441 με HSP27-siRNA. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 6 φρεάτια και παροδικά επιμολυσμένα με 20 ηΜ siRNA με τη χρήση 8 μL siPORT αμίνη (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) σε ένα συνολικό όγκο επιμόλυνση 0,5 mL του μέσου. Μετά από επώαση στους 37 ° C, 5% CO

2 για 5 ώρες, 1.5 mL του κανονικού μέσου ανάπτυξης προστέθηκε, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες.

ΜΤΤ δοκιμασία για βιωσιμότητα των κυττάρων

Το βρωμιούχο 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ? Sigma, Louis, ΜΟ, USA) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας [58]. Η αρχή αυτής της δοκιμασίας είναι ότι μιτοχονδριακή αφυδρογονάση σε ζωντανά κύτταρα ανάγει ΜΤΤ σε μπλε φορμαζάνη. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις EGb761. Μετά από πλύση των κυττάρων δύο φορές με PBS, 100 μΙ του μέσου που περιείχε ΜΤΤ (0,5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 4 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε προσεκτικά, ώστε να μην ενοχλούν τους κρυστάλλους φορμαζάνης που σχηματίζεται. Στη συνέχεια 100 μL DMSO, το οποίο διαλυτοποιεί κρυστάλλων φορμαζάνης, προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και η απορρόφηση της διαλυτοποιημένης μπλε φορμαζάνης μετρήθηκε στα 540 nm με τη χρήση ενός αναγνώστη μικροπλακός (Multiskan Ex, ThermoLabsystems), με DMSO ως το κενό. Η μείωση της οπτικής πυκνότητας από τα φάρμακα χρησιμοποιήθηκε ως μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, κανονικοποιημένη σε κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελέγχου, τα οποία θεωρήθηκαν 100% βιώσιμα.

Ποσοτικοποίηση του κατακερματισμού του DNA

Κινητή DNA κατακερματισμός αναλύσεις ELISA πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 12 ώρες στους 37 ° C με ένα μη-ραδιενεργό ανάλογο θυμιδίνης 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU), η οποία μπορεί να ενσωματωθεί σε γονιδιωματικό DNA. Ακολούθως, τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς EGb761 για 6 ώρες. Τα κύτταρα μετά λύθηκαν, μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα μικροτίτλου επικαλυμμένη με ένα αντίσωμα αντι-ϋΝΑ και επωάστηκαν για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η πλάκα πλύθηκε 3 φορές και θερμαίνεται για 5 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων. Anti-BrdU-υπεροξειδάσης διάλυμα συζυγούς προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού η πλάκα πλύθηκε 3 φορές, διάλυμα προστέθηκε υπόστρωμα, και η πλάκα επωάστηκε στο σκοτάδι σε έναν αναδευτήρα μέχρις ότου η ανάπτυξη χρώματος ήταν επαρκής. Η αντίδραση στη συνέχεια διακόπηκε με προσθήκη 25 μL 0,56 Μ Η

2SO

4. Ένας αναγνώστης μικροπλάκας (BioRad, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 450 και 655 nm για κάθε πηγαδάκι.

In vitro

μετανάστευσης αναλύει

Το μεταναστευτικό ικανότητα των κυττάρων προσδιορίστηκαν σε μια δοκιμασία μονοστιβάδας απογύμνωση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [59]. Τα συρρέοντα κύτταρα τραυματίστηκαν με απόξεση με ρύγχος πιπέτας 100 μL, οι οποίες απογυμνωμένη μια λωρίδα της μονοστιβάδας που ήταν 300 μm σε διάμετρο. Οι καλλιέργειες πλύθηκαν δύο φορές με PBS? τότε ένα μέσο συμπληρωμένο 5% FBS προστέθηκε με, και ο ρυθμός κλεισίματος τραύματος παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην απογυμνωμένη περιοχή φωτογραφήθηκαν, και οι περιοχές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Wimasis WimScratch. Wimasis WimScratch είναι μια νέα γενιά web-based εργαλείο εικόνα για την ανάλυση της μετανάστευσης των κυττάρων. τεχνικές ανίχνευσης ακμών μπορεί να αναγνωρίσει εύκολα την αιχμή και την περιοχή κενό. Οι χρήστες μπορούν να φορτώσουν τις εικόνες και την ανάλυση θα ξεκινήσει αυτόματα.

αναστολείς EGb761 και οδός

Η αναστολείς ΑΚΤ και p38 MAPK, API-59 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) και SB203580 ( Selleckchem, Radnor, ΡΑ, USA), αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας. Οι EGb761 χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας συνεχίστηκαν από τον Δρ Willmar Schwabe GmbH & amp? Co., Καρλσρούη (Γερμανία).

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές διαφορές στην αναλογία έκφρασης HSP27 και κλινικές παραμέτρους εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας

t-test

ή μονόδρομη ανάλυση μαθητή διακύμανσης δοκιμής (ANOVA). Οι καμπύλες επιβίωσης σχεδιάζονται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM.