Αφηρημένο

EGFR-MEK-ERK μονοπάτι σηματοδότησης έχει μια καθιερωμένη ρόλο στην προώθηση της ανάπτυξης κακοηθών και την εξέλιξη της νόσου σε ανθρώπινους καρκίνους. Ως εκ τούτου, αναγνώριση των μεταγραφικών στόχων διαμεσολάβηση των ογκογόνων αποτελέσματα της οδού EGFR-ΜΕΚ-ΕΚΚ θα ήταν ιδιαίτερα χρήσιμο. Νεοπλασματικές αναστολέας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (CIP2A) είναι ένα πρόσφατα χαρακτηρίζεται από ανθρώπινο ογκοπρωτεΐνη. CIP2A προάγει την ανάπτυξη κακοηθών κυττάρων και υπερεκφράζεται σε υψηλή συχνότητα (40-80%) στα περισσότερα από τα ανθρώπινους τύπους καρκίνου. Ωστόσο, οι μηχανισμοί επαγωγής της έκφραση στον καρκίνο παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Εδώ παρουσιάζουμε συστηματική ανάλυση της συμβολής των πιθανών ρυθμιστικών μηχανισμών γονίδιο για υψηλή έκφραση CIP2A στον καρκίνο. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η εξελικτική διατηρημένη νησιά CpG στο εγγύς υποκινητή CIP2A δεν είναι μεθυλιωμένα τόσο υπό κανονικές συνθήκες και τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας της περιοχής δραστικής CIP2A προαγωγού από συνολικά επτά φυσιολογικούς και κακοήθεις τύπους κυττάρων δεν αποκάλυψε αλλοιώσεις ακολουθίας που θα αυξήσει την έκφραση CIP2A ειδικά σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με διάφορους αναστολείς οδού σηματοδότησης αποκάλυψε ότι η έκφραση του mRNA CIP2A ήταν ευαίσθητη σε αναστολή της δραστικότητας του EGFR, καθώς και αναστολή ή ενεργοποίηση της ΜΕΚ-ΕΚΚ μονοπάτι. Επιπλέον, ΜΕΚ1 /2-ειδική siRNAs μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης CIP2A. Σειρά κατασκευασμάτων CIP2A υποκινητή-λουσιφεράση, δημιουργήθηκαν για να προσδιορίσει περιοχή προαγωγού εγγύς -27 έως -107 υπεύθυνη για ΜΕΚ-εξαρτώμενη διέγερση της έκφρασης CIP2A. Επιπλέον πειράματα ανοσοκατακρήμνισης μεταλλαξιγένεση και χρωματίνης αποκάλυψε ETS1 ως μεταγραφικός παράγοντας διαμεσολαβεί διέγερση της έκφρασης CIP2A μέσω EGFR-ΜΕΚ οδού. Έτσι, ETS1 πιθανώς μεσολαβεί υψηλή έκφραση CIP2A σε ανθρώπινους καρκίνους με αυξημένη δραστικότητα μονοπάτι EGFR-ΜΕΚ1 /2-ΕΚΚ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν επίσης ότι εκτός από την καθιερωμένο ρόλο της στην εισβολή και την αγγειογένεση, μπορεί να υποστηρίξει ETS1 κακοήθη κυτταρική ανάπτυξη μέσω ρύθμιση της έκφρασης και CIP2A πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α αναστολή

Παράθεση:. Khanna Α, Okkeri J, Bilgen Τ, Tiirikka Τ, Vihinen Μ, Visakorpi Τ, et al. (2011) ETS1 Μεσολαβεί ΜΕΚ1 /2-Dependent υπερέκφραση των καρκινικών αναστολέα της πρωτείνης φωσφατάσης 2Α (CIP2A) σε κύτταρα ανθρώπινου Cancer. PLoS ONE 6 (3): e17979. doi: 10.1371 /journal.pone.0017979

Συντάκτης: Robert Oshima, SanfordBurnham Medical Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Νοεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 17, Φεβρουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Μαρτίου 2011

Copyright: © 2011 Khanna et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Ακαδημία της Φινλανδίας (τα έργα: 217676 και 217675), ο Σύνδεσμος Διεθνών Ερευνών Καρκίνου (έργο 08 – 0614), του Ιδρύματος για το Ινστιτούτο της Φινλανδίας Καρκίνου (JW), Emil Ίδρυμα Aaltonen, Ίδρυμα Sigrid Juselius, ανταγωνιστική έρευνα Χρηματοδότηση της Pirkanmaa νοσοκομείο District (έργα: 9K152 και 9L115), Τάμπερε Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στη Βιοϊατρική και Βιοτεχνολογίας (AK), και Το Επιστημονικό και Τεχνολογικό Ερευνητικό Συμβούλιο της Τουρκίας (TB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή ή την ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

η συσσώρευση των διαφόρων γενετικών αλλοιώσεων έχει θεωρηθεί ως απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη του καρκίνου. Αυτές οι γενετικές αλλοιώσεις συχνά οδηγεί σε υπερέκφραση ή δραστηριότητα του πρωτο-ογκογονιδίων και αναστολή της λειτουργίας του ογκοκατασταλτικού [1], [2] .Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους η δραστικότητα και των δύο πρωτο-ογκογονίδια και κατασταλτικά όγκου μεταβάλλεται σε καρκίνο είναι εξαιρετικά σημαντική τόσο ακαδημαϊκά, όσο και για την ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων με στόχο τα καρκινικά κύτταρα για τη θεραπεία.

υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μεσολάβηση δραστηριότητα οδός /2-ERK MAPK MEK1 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει όλες σχεδόν τις πτυχές που εμπλέκονται στην ογκογένεση. Κατά συνέπεια, η αυξημένη δραστικότητα και υπερέκφραση του EGFR, τόσο και το ΜΕΚ1 /2 κινασών έχει παρατηρηθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [3], [4], [5], [6]. Επιπλέον, αναστολείς για EGFR, Raf και ΜΕΚ1 /2 κινάσες βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές έναντι διαφόρων τύπων συμπαγών όγκων [3], [4], [7], [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αυξημένη ΜΕΚ1 /2 δραστικότητα μονοπάτι λόγω υπερκινητικότητας της Ras και Raf πρωτείνες έχει επίσης δείξει να συμβάλλει στην κλινική αντοχή στο EGFR αναστολέας της τυροσινικής κινάσης [4], [9], [10]. Αυτά τα αποτελέσματα μαζί υποδηλώνουν ότι μπορεί να απαιτείται η αναστολή της δραστικότητας της οδού τόσο στο επίπεδο του υποδοχέα, και κατάντη δράστες της για μια αποτελεσματική θεραπεία κατά του καρκίνου.

ETS οικογένεια παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων Elk1, ETS1 και ETS2 είναι μερικές από τις γνωστές στόχους για την οδό σηματοδότησης EGFR-Ras-ΜΕΚ1 /2 [11]. ETS1 και ETS2 οι δύο φωσφορυλιώνονται με Ras σηματοδότησης [11], [12]. ETS1 είναι ιδρυτικό μέλος της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων ETS-τομέα. Έχει συνδεθεί με τον καρκίνο αφού αναγνώριση της ως ογκογόνο σύντηξη με το προϊόν του c-Myb πρωτο-ογκογονίδιο στον ιό της γρίπης λευχαιμίας E26 [13], [14]. ETS1 είναι γνωστό ότι έχουν στόχο μια ευρεία ποικιλία των γονιδίων [11], [12], [15], η οποία με τη σειρά της υπαγορεύει ο ρόλος της σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες. Σχετικά με ETS1 καρκίνο είναι γνωστός για το ρόλο της στην προώθηση του όγκου των κυττάρων εισβολής, την κινητικότητα και τη μετάσταση [13], [16]. Εισβολή προώθηση ρόλος του ETS1 πιστεύεται ότι προκαλείται από μεταγραφικές επάνω ρύθμιση των γονιδίων που συμμετέχουν στην αποδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας και τη διέγερση της αγγειογένεσης [16]. Είναι ενδιαφέρον, ακόμη και αν ETS1 και άλλους παράγοντες ETS-οικογένεια μεταγραφή έχουν συνδεθεί κυρίως στην εισβολή όγκου, σύντομα μετά την κλωνοποίηση ανθρώπινων ETS1, Seth και συνεργάτες απέδειξαν ότι ETS1 υπερέκφραση μετασχηματισμένα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 καθιστώντας τα ικανά ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και την αύξηση όγκου σε γυμνούς ποντικούς [17]. Πιο πρόσφατα δείχθηκε επίσης ότι ETS1 προωθείται μετασχηματισμένο κυτταρικό φαινότυπο σε ανθρώπινα κύτταρα, καθώς και [18], [19]. Ωστόσο, τα γονίδια στόχους που εμπλέκονται στην κυτταρική εξαλλαγή ETS1 μεσολάβηση είναι ελάχιστα κατανοητές.

Νεοπλασματικές αναστολέα της πρωτείνης φωσφατάσης 2Α (CIP2A) είναι ένα πρόσφατα χαρακτηρίζεται από ανθρώπινο ογκοπρωτεΐνη [20]. CIP2A αλληλεπιδρά με και αναστέλλει πρωτεΐνη 2Α φωσφατάση (ΡΡ2Α) σύμπλοκο ογκοκατασταλτικό και έτσι αναστέλλει την αποφωσφορυλίωση και μετέπειτα πρωτεολυτική αποικοδόμηση του παράγοντα μεταγραφής MYC [20], [21]. CIP2A προωθεί Ras-προκάλεσε σχηματισμό εστιών σε ινοβλάστες εμβρύου ποντικού και υποστηρίζει μετασχηματισμό των αθανατοποιημένων ανθρώπινων κυττάρων [20]. Σε απώλεια των μελετών λειτουργίας, η εξάντληση CIP2A έχει αποδειχθεί ότι μειώνει το συνολικό μέγεθος ξενομοσχεύματος όγκου σε γυμνούς ποντικούς [20], [22], και να βλάψουν κλωνογονικότητας και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων [20], [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Πρόσφατα, CIP2A αποδείχθηκε επίσης ότι αναστέλλει Akt δραστικότητα ΡΡ2Α κινάση που σχετίζεται και με αυτά τα μέσα για την προστασία των κυττάρων ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος από bortezomib επαγόμενη απόπτωση [26]. CIP2A εκφράζεται μόνο σε πολύ λίγες φυσιολογικούς ιστούς αλλά υπερεκφράζεται με πολύ υψηλή συχνότητα (40-80%) σε διάφορους ανθρώπινους τύπους καρκίνου όπως κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (HNSCC), καρκινώματα του παχέος εντέρου, γαστρικά καρκινώματα, καρκινώματα του μαστού και μη -μικρό καρκίνο του πνεύμονα [20], [22], [23], [24], [25]. Εκτός από την υπερέκφραση του σε καρκίνους, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ανοσοθετικότητα CIP2A συσχετίζεται με την επιθετική νόσο και /ή κακή επιβίωση των ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου [22], [23], [24]. Όσον αφορά τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την έκφραση CIP2A, έχουμε μέχρι σήμερα εντοπιστεί MYC ως διεγέρτης της έκφρασης CIP2A [24]. Ωστόσο, άλλοι μηχανισμοί που συμβάλλουν στην αυξημένη έκφραση CIP2A σε καρκίνους του ανθρώπου εξακολουθούν να παραμένουν ασαφείς.

Στην παρούσα μελέτη, κλωνοποιημένη περιοχή λειτουργική CIP2A υποκινητή και προσδιόρισε τις περιοχές υποκινητή διαμεσολάβηση υψηλή CIP2A μεταγραφική δραστηριότητα. Επιπλέον, με τη χρήση χημικών αναστολέων για διάφορες οδούς σηματοδότησης και ειδικών siRNAs στόχο, εμείς ανατομή το ρόλο του EGFR-ΜΕΚ1 /2 οδό στη ρύθμιση της έκφρασης CIP2A. Χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση, μεταλλαξιγένεση υποκινητή και το στόχο των ειδικών siRNAs στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει ETS1 ως μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει /2-εξαρτώμενη έκφραση CIP2A EGFR-ΜΕΚ1 σε ανθρώπινους καρκίνους.

Αποτελέσματα

βιοπληροφορική ανάλυση και τη μεθυλίωση ιδιότητα του CIP2A Διοργανωτή

Για να ξεκινήσει μια συστηματική ανάλυση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση CIP2A, 1.8 ακολουθία kb ανάντη της προβλεπόμενης θέσης έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου CIP2A αναλύθηκε με τη χρήση του λογισμικού Genomatix. Το Σχήμα 1Α δείχνει την προβλεπόμενη παράγοντα μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης, που έχουν ομοιότητα μήτρα 95% και πυρήνα ομοιότητα 100%, σε αυτή τη γονιδιωματική περιοχή. λογισμικό Genomatix χρησιμοποιήθηκε επίσης για να ληφθεί το φυλογενετικό δέντρο του προαγωγού CIP2A σε διαφορετικά είδη (Εικ. 1Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ανάλυση της περιοχής -1500 να +450 bp με λογισμικό MethPrimer εντόπισε CpG νησίδα μεταξύ των νουκλεοτιδίων -150 να +400 bp (μπλε σκιασμένη περιοχή στην Εικόνα 1 C). Είναι σημαντικό, ευθυγράμμιση των υποκινητών CIP2A σε διάφορα είδη αποκάλυψε επίσης τη διατήρηση των CpG αλληλουχίες πλούσιες σε εκείνη την περιοχή (Εικ. S1 Α). Η μεθυλίωση των περιοχών CpG στις ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων προτείνεται να συσχετίζεται με μεταγραφική σίγηση. Ως εκ τούτου, υποτέθηκε ότι η έκφραση CIP2A σε φυσιολογικούς ιστούς και κυτταρικές γραμμές [20], [22], [23], [25] θα μπορούσε να σιγήσει λόγω μεθυλίωση προαγωγού. Για το σκοπό αυτό, κατάσταση μεθυλίωσης του -150 να +400 περιοχή bp αναλύθηκε με τη χρήση όξινου θειώδους προσδιορισμού αλληλουχίας. Γονιδιωματικό δειγμάτων DNA που συλλέγονται για την ανάλυση αυτή περιλαμβάνεται πρόσφατα απομονωμένα κύτταρα από κανονικό ανθρώπινο αίμα, καλλιεργημένους ινοβλάστες ανθρώπινου δέρματος και καλλιεργήθηκαν καρκινικά κύτταρα (AGS και HeLa). Διθειώδες κατεργασία του γονιδιωματικού DNA είχε ως αποτέλεσμα τη μετατροπή όλων των κυτοσίνες στην περιοχή αλληλουχία υποκινητή να θυμιδίνες, σε όλα τα δείγματα (Εικ. 1 D και το Σχ. S1). Επομένως, δεδομένου ότι η μεθυλίωση των CpG νησίδων σε προαγωγό CIP2A δεν παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά κύτταρα, είναι απίθανο ότι υποκινητής de-μεθυλίωση θα μπορούσε να εξηγήσει την αυξημένη έκφραση CIP2A σε καρκινικά κύτταρα.

A. Προσδιορισμός του παράγοντα μεταγραφής περιοχές με ομοιότητα μήτρα 95% και των βασικών ομοιότητα του 100% σε -1802 bp υποστηρικτής CIP2A χρησιμοποιώντας το λογισμικό Genomatix δεσμευτική. B. φυλογενετικό δέντρο που απεικονίζει την εξελικτική διατήρηση του υποκινητή CIP2A. Γ Προσδιορισμός των θεωρούμενων CpG νησί από -150 bp έως 400 bp (μπλε σκιασμένη περιοχή) για τον υποκινητή CIP2A χρησιμοποιώντας το λογισμικό MethPrimer. Δ δείχνει τα αποτελέσματα αλληλούχισης του εκχυλίζεται γενωμικού DNA από κανονικό ανθρώπινο αίμα. Όλες οι περιοχές CpG (εκπρόσωπος μαύρο ορθογώνιο μπλοκ) που βρίσκεται στο εσωτερικό του νησιού CpG μετατράπηκαν από CG σε TG όταν λαμβάνουν θεραπεία με όξινο θειώδες, υπονοώντας έτσι ότι υποστηρικτής CIP2A σε αυτές τις περιοχές είναι μη μεθυλιωμένα.

Η

Λειτουργική και SNP ανάλυση της CIP2A υποστηρικτής

οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) έχουν αναφερθεί για τη δημιουργία νέων μεταγραφικού παράγοντα sites για τους φορείς του γονιδίου δεσμευτικές. Συγκεκριμένα, μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι ένα SNP επί της ΜΜΡ-1 προαγωγέα δημιούργησε ένα νέα θέση δέσμευσης ETS που αύξησε την μεταγραφή των ΜΜΡ-1 σε καρκινικά κύτταρα [27]. Προκειμένου να εκτιμηθεί η κατάσταση του SNP CIP2A υποκινητή, μια περιοχή που περιέχει τον προαγωγό CIP2A απεικονίζεται στο Σχ. 1Α και εξονίου 1 (-1802 bp έως 182 bp) υποβλήθηκε σε καθορισμό αλληλουχίας από γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από φυσιολογικό ανθρώπινο περιφερικό αίμα, ανθρώπινα μη κακοήθεις μονοπύρηνα μονοκύτταρα (ΜΝ-50), η κανονική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDFc), ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοσαρκώματος ( ΗΤ1080), πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα γραμμή (SCC7), του τραχήλου της μήτρας κυτταρική γραμμή καρκινώματος (HeLa) και του γαστρικού αδενοκαρκινώματος κυτταρική σειρά (AGS). Η ανάλυση αυτή εντοπίστηκαν αρκετές SNPs στο αναλύονται περιοχή, αλλά μόνο δύο από αυτούς (T & gt? C σε -592 σε HeLa και G & gt? Ένα στο -1100 στο SCC7) δεν βρέθηκαν από οποιαδήποτε φυσιολογικά δείγματα (Σχήμα 2Α.). Ωστόσο, καθώς κάθε μία από αυτές τις δύο SNPs βρέθηκαν μόνο από τη μία καρκινική κυτταρική γραμμή, αλλά όχι στα άλλα αναλυθεί, είναι απίθανο ότι θα δημιουργήσουν θέσεις πρόσδεσης παράγοντα μεταγραφής που θα αυξήσουν τη μεταγραφή CIP2A γενικά στον καρκίνο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, Τ & gt? C σε -592 σε κύτταρα HeLa δεν έχει τεκμηριωθεί προηγουμένως σε βάσεις δεδομένων

Α.. Προσδιορίζονται πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων σε -1.802 με 182 περιοχή του υποκινητή CIP2A από υποδεικνύεται κύτταρα. Δύο καρκινική κυτταρική σειρά συγκεκριμένες αλλαγές παρατηρήθηκαν, δηλαδή G /Α σε -1,101 σε SCC-7 κυτταρική γραμμή και Τ /Κ σε -592 στην κυτταρική σειρά HeLa. Β δοκιμασία Σχετική λουσιφεράσης που δείχνει τη σχετική δραστηριότητα -1802 bp του CIP2A υποκινητή σε σύγκριση με το πολύ γνωστό ογκογόνο υποστηρικτές όπως EGFRLuc και 5xJunLuc. δοκιμασία C. λουσιφεράσης που δείχνει σύγκριση της δραστικότητας μεταξύ άγριου τύπου (WT) CIP2A υποκινητή και τις υποδεικνυόμενες μεταλλάξεις SNP. Δ δοκιμασία λουσιφεράσης που δείχνει τη δραστηριότητα που αναφέρεται υποστηρικτές CIP2A. Υψηλή βασική δράση διαμεσολαβείται από πρώτα 392 bp του υποκινητή, εκ των οποίων, σχεδόν τα δύο τρίτα του οφειλόταν στην πρώτη 108 bp. B-D, που παρουσιάζεται είναι ο μέσος όρος + SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να ξεκινήσει λειτουργικό χαρακτηρισμό του υποκινητή CIP2A, το -1802 bp με 182 bp 5 ‘ανοδική περιοχή του γονιδίου CIP2A ότι αναλύθηκε για SNPs ανωτέρω, κλωνοποιήθηκε σε φορέα pGL4.10 να δημιουργήσει CIP2A κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης υποκινητή (-1802CIP2ALuc). Η περιοχή προαγωγού ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό DNA των κυττάρων AGS, και αυτό το συγκεκριμένο κλώνο harbored νουκλεοτίδια Α στη θέση -98 και Τ στη θέση -1487 (Εικ. 2Α). Για να εκτιμηθεί η σχετική μεταγραφική δραστικότητα του κλωνοποιημένου θραύσματος CIP2A υποκινητή, συγκρίναμε την δραστικότητα λουσιφεράσης των -1802CIP2ALuc να προαγωγέα /λουσιφεράσης κατασκευάσματα που είναι γνωστό ότι είναι ενεργός σε καρκινικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, -1802CIP2ALuc δραστηριότητα ήταν είτε ισοδύναμη ή σαφώς υψηλότερο από ό, τι δραστηριότητα EGFRLuc [28] ή ελάχιστη 5xJunLuc [29] υποστηρικτές αντίστοιχα. Με βάση αυτό το αποτέλεσμα καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το κλωνοποιημένο -1802 bp με 182 bp 5 ‘ανοδική περιοχή του γονιδίου CIP2A περιέχει ένα δραστικό υποκινητή CIP2A

Στη συνέχεια η -1802CIP2ALuc κατασκεύασμα χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί το κατά πόσον το SNPs 592 T & gt.? C και 1100G & gt? Α προσδιορίζονται ανωτέρω ήταν λειτουργικά. Για το σκοπό αυτό, 592 Τ & gt? C και 1100G & gt? A μεταλλάξεις εισήχθησαν στην -1802CIP2ALuc με τοπο-ειδική μεταλλαξογένεση και της δραστηριότητας των μεταλλαγμένων κατασκευασμάτων συγκρίθηκε με τον άγριο τύπο 1802CIP2ALuc σε AGS κύτταρα. Στη σύγκριση με τον άγριο τύπο, δεν υπήρχε μεταβολή που παρατηρείται στη δραστηριότητα λουσιφεράσης CIP2A με το 1100 G & gt? Α μεταλλαγμένο κλώνο, ενώ 592 Τ & gt? C μεταλλαγμένο κλώνο έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης (Σχήμα 2C).

Τέλος, για να χαρακτηρίσει τις περιοχές στον προαγωγέα CIP2A που μεσολαβούν υψηλή μεταγραφική δραστηριότητα του, κλωνοποιήθηκαν αρκετές 5′-διαγραφές του προαγωγού /ανταποκριτή. Σύγκριση των βασικών δραστηριοτήτων αυτών των κατασκευασμάτων διαγραφής στο AGS κύτταρα αποκάλυψε ότι περιοχές μεταξύ -392 και -1802 δεν φαίνεται να περιέχει θέσεις πρόσδεσης παράγοντα μεταγραφής, που θα συμβάλλουν σε μεγάλο βαθμό στην υψηλή βασική δράση προαγωγού CIP2A (Σχ. 2D). Είναι ενδιαφέρον ότι η υψηλή δραστικότητα λουσιφεράσης του -392CIP2ALuc ήταν σημαντικά μειωμένη όταν επιπλέον 57 νουκλεοτίδια έχουν διαγραφεί με αποτέλεσμα -335CIP2ALuc κατασκεύασμα (Σχ. 2D). Αυτό φάνηκε να προκαλείται από την έκθεση ενός μεταγραφικού τομέα καταστολής, ως περαιτέρω διαγραφή του -335CIP2ALuc να -108CIP2ALuc οδήγησε πάλι σε σημαντικά αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης (Σχ. 2D). Κατά περίεργο τρόπο, αυτό υποστηρικτής CIP2A 108 bp αντιπροσώπευαν πάνω από το 50% της δραστηριότητας της λουσιφεράσης που παράγεται από το -1802CIP2ALuc (Σχ. 2D).

Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα παρουσιάζει την πρώτη λειτουργική ανάλυση της περιοχής CIP2A υποκινητή. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι SNPs με υποκινητή CIP2A δεν συμβάλλουν σημαντικά στην CIP2A υπερέκφραση στον καρκίνο.

Κανονισμός της έκφρασης CIP2A από τον EGFR-MEK1 /2 οδό

Αποτελέσματα παραπάνω πρότεινε ότι CIP2A έκφραση μπορεί να ρυθμίζεται θετικά από οδούς που διεγείρουν δραστικότητα προαγωγού γονιδίου του σηματοδότησης. Για την αντιμετώπιση είτε γνωστές οδούς σηματοδότησης ογκογόνο είχε ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης CIP2A, AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καλά καθορισμένα αναστολείς χημικής οδού και ενεργοποιητές. Ενώ αναστολή είτε ρ38 είτε ΡΙ3 κινασών με SB23580 ή LY294002, αντίστοιχα, δεν ρυθμίζουν τα επίπεδα CIP2A mRNA, τόσο ΜΕΚ1 /2 και αναστολείς EGFR (PD98059 και AG1478) μειωμένη έκφραση CIP2A mRNA (Σχ. 3Α). Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων με εστέρα φορβόλης ΤΡΑ, ένας καλά χαρακτηρισμένο ενεργοποιητής της οδού σηματοδότησης ΜΕΚ1 /2-ΕΚΚ, η αυξημένη έκφραση του mRNA CIP2A περισσότερο από το τριπλάσιο (Σχ. 3Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, τα αποτελέσματα των δύο AG1478 και ΤΡΑ στην έκφραση του mRNA CIP2A ήταν ήδη εμφανής 6 ώρες μετά τη θεραπεία η οποία προτείνει μια άμεση τρόπο δράσης. Προκειμένου να χαρτογραφηθεί η περιοχή σε CIP2A προαγωγού που ανταποκρίνεται στην δραστηριότητα μονοπάτι EGFR-ΜΕΚ1 /2, κύτταρα επιμολυσμένα με διάφορους μήκος CIP2A κατασκευασμάτων υποκινητή λουσιφεράσης υποβλήθηκαν σε αγωγή με AG1478 ή ΤΡΑ, και η δραστικότητα της λουσιφεράσης, σε σύγκριση με τον έλεγχο της θεραπείας DMSO, μετρήθηκε ως αναγνώσεως της δραστηριότητας του υποκινητή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C και D, θεραπεία AG1478 μειώθηκε, ενώ η θεραπεία ΤΡΑ αύξησε τη δραστηριότητα λουσιφεράσης από όλους, εκτός από τη συντομότερη -27CIP2ALuc κατασκεύασμα.

Α. Ποσοτική ανάλυση PCR (qPCR) δείχνει τα επίπεδα της CIP2A mRNA που εξάγεται από AGS κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO, SB23580 (20 μΜ), LY294002 (10 μΜ), ΡΟ98059 (20 μΜ), AG1478 (10 μΜ) και ΤΡΑ (100 ηΜ) σε 24 h χρονικό σημείο. Ενώ μια μείωση στο επίπεδο mRNA CIP2A παρατηρήθηκε με PD98059 και θεραπείες AG1478, θεραπεία ΤΡΑ επαυξημένης τα επίπεδα CIP2A mRNA σε κύτταρα AGS. Ανάλυση Β qPCR δείχνει εξαρτώμενη από το χρόνο ρύθμιση των επιπέδων mRNA σε CIP2A AGS κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO, AG1478 (10 μΜ) και ΤΡΑ (100 ηΜ) για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Γ και Δ λουσιφεράσης δοκιμασίες που δείχνουν την δραστικότητα των διαγραφών υποκινητή ενδεικνυόμενης CIP2A σε κύτταρα κατεργασμένα είτε με DMSO, AG1478 (10 μΜ) ή ΤΡΑ (100 ηΜ) για 24 ώρες. (*,

P

& lt? 0,05? N.S. = μη σημαντική). B-D. Ορατή είναι η μέση + SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση CIP2A θετικά regulated` με EGFR-ΜΕΚ1 /2 οδό και ότι η περιοχή απόκρισης για τα ψέματα δραστηριότητα οδού μεταξύ -27 bp και -672 bp για τον υποκινητή CIP2A.

Χαρακτηρισμός ανταποκρίνεται περιοχής MEK1 /2 κινάσης για τον υποκινητή CIP2A

για να είναι έγκυρη η συμβολή των ΜΕΚ 1/2 κινασών στην θετική ρύθμιση της έκφρασης CIP2A, AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UO126, μια πιο συγκεκριμένη και ισχυρός /2 αναστολέα ΜΕΚ1 από το χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως PD98059, και η έκφραση της πρωτεΐνης CIP2A μελετήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, UO126 μειωμένη δοσοεξαρτώμενο έκφραση πρωτεΐνης CIP2A. Επιπλέον, δύο διαφορετικά siRNAs έναντι τόσο ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2 μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα CIP2A AGS (Εικ. 4Β). Είναι σημαντικό ότι τα αποτελέσματα δεν ήταν κυτταρική σειρά συγκεκριμένων είτε ως χημική ή siRNA που βασίζεται MEK1 /2 αναστολή πρωτεΐνη ανέστειλε CIP2A έκφραση και σε PC-3 καρκίνου του προστάτη κυτταρική σειρά (Σχ. S2). Για να περιοριστεί το ΜΕΚ1 /2 αποκρίνονται περιοχή στον υποκινητή CIP2A, AGS κύτταρα επιμολυσμένα με σειρά CIP2A λουσιφεράσης κατασκευάσματα αναφοράς υπέστησαν αγωγή με UO126 (20 μΜ) και δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν 48 ώρες μετά τη θεραπεία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με AG1478 και ΤΡΑ θεραπείες, μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης από όλα τα άλλα κατασκευάσματα εκτός παρατηρήθηκε η -27CIP2ALuc σε UO126 επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 5Α). Για την περαιτέρω περιορίσετε την MEK1 /2-απόκρισης περιοχή στον υποκινητή CIP2A, διάφορα πρόσθετα κατασκευάσματα υποκινητή λουσιφεράσης CIP2A κλωνοποιήθηκαν (Εικ. 5Β). Σύγκριση των βασικών δραστηριοτήτων αυτών των νέων κατασκευασμάτων μαζί με επιλεγμένα μορφώματα υποκινητή ήδη αναλυθεί στο Σχ. 2D, επιβεβαίωσε ότι υπάρχουν δύο κατασταλτικά περιοχές προαγωγέα ενεργοποίησης σε προαγωγός CIP2A μεταξύ -27 bp και -400 bp (Σχ. 5Β). Ωστόσο, ανεξάρτητα από την βασική δραστικότητα του ανταποκριτή, θεραπεία UO126 ανέστειλε την δραστηριότητα όλων των ρεπόρτερ, συμπεριλαμβανομένων -108CIP2ALuc, με αξιοσημείωτη εξαίρεση του -27CIP2ALuc κατασκευάσματος (Σχ. 5C). Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ΜΕΚ1 /2 κινάσες ρυθμίζουν θετικά τόσο δραστηριότητα υποκινητή CIP2A και η έκφραση πρωτεΐνης. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα εντοπίσει 81 bp μεταξύ -108 bp και -27 ως MEK1 /2-απόκρισης περιοχή με υποκινητή CIP2A.

Α. κηλίδα Western που δείχνει εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επίδραση του ειδικού αναστολέα ΜΕΚ, U0126, σχετικά με τα επίπεδα της πρωτεΐνης CIP2A στα κύτταρα AGS στις 48 χρονικό σημείο h. Β Western blot που δείχνει την επίδραση των δύο ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2 siRNAs στα επίπεδα πρωτεΐνης στα κύτταρα CIP2A AGS σε 72 ώρες χρονικό σημείο.

Η

A. δοκιμασία λουσιφεράσης που δείχνει τη δραστικότητα των διαφορετικών προαγωγών CIP2A μήκος όταν έλαβαν θεραπεία με DMSO και U0126 (10 μΜ) για 24 ώρες, που αντιστοιχεί στην περιοχή ανταποκρίνεται ΜΕΚ να βρίσκεται μεταξύ -672 bp έως -27 bp του υποκινητή CIP2A. Β λουσιφεράσης δοκιμασία που δείχνει τη βασική δραστηριότητα που αναφέρεται υποστηρικτές CIP2A. Γ λουσιφεράσης που δείχνει την δραστικότητα των διαφορετικών προαγωγών CIP2A μήκος όταν έλαβαν θεραπεία με DMSO και U0126 (10 μΜ) για 24 ώρες, περαιτέρω περιορισμό των ανταποκρίνεται περιοχή ΜΕΚ να είναι μεταξύ -108 bp και -27 bp του υποκινητή CIP2A (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,00? ns = μη σημαντική). Παρουσιάζεται είναι ο μέσος όρος + SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

EGFR-MEK1 /2 μονοπατιού ρυθμίζει την έκφραση CIP2A μέσω ETS1

Για να προσδιορίσει τον παράγοντα (ες) μεταγραφή που μεσολαβούν τη διεγερτική επιδράσεις του EGFR-ΜΕΚ1 /2 οδού στη ρύθμιση της έκφρασης CIP2A, έχουμε επανήλθε πίσω στην βιοπληροφορική ανάλυση γίνεται για την περιοχή μεταξύ -27 bp έως -108 bp (Εικ. 1Α). Από τους παράγοντες μεταγραφής αναμένεται να δεσμεύονται σε αυτή την περιοχή, ETS1 έχει εδραιωμένη ρόλο ως καθοδικός τελεστής του ΜΕΚ1 /2 μονοπατιού [11], [12]. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη δημιουργούνται μεταλλάκτες για αυτές τις περιοχές ETS1 και συγκρίθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης της -108CIP2ALuc κατασκευάσματα που φέρουν τις μεταλλάξεις με αυτή του άγριου τύπου. Οι δύο θέσεις ETS και η στρατηγική μετάλλαξη που απεικονίζεται στο Σχ. 6Α, Β Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, μετάλλαξη είτε από τις τοποθεσίες ETS1 μειωθεί δραματικά τη δραστηριότητα CIP2A υποκινητή. Για να διερευνηθεί αν ETS1 μεσολαβεί στην ΜΕΚ1 /2-εξαρτώμενη ρύθμιση CIP2A, κύτταρα επιμολυσμένα με αμφότερα άγριου τύπου και μεταλλαγμένου ETS1 (θέση 1) -108CIP2ALuc κατασκευάσματα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με AG1478, UO126 ή ΤΡΑ. Ενώ η -108CIP2ALuc δραστηριότητα άγριου τύπου ανεστάλη σημαντικά με AG1478 (Εικ. 6D) ή UO126 (Εικ. 6Ε), και αντιστρόφως ενεργοποιείται από ΤΡΑ (Σχ. 6F), ο υποκινητής ETS1 μεταλλαγμένο δεν ανταποκρίθηκε σημαντικά σε αυτές τις θεραπείες.

Α. Σχηματικό διάγραμμα του θραύσματος 108 bp του υποκινητή CIP2A που δείχνει τη θέση δύο επικαλυπτόμενα θέσεις πρόσδεσης προβλεφθεί ETS1. B. αποτελέσματα αλληλουχίας του ETS-1 μεταλλαγμάτων της τοποθεσίας πρόσδεσης επί του υποκινητή CIP2A δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας μεταλλαξογένεση. Η αλληλουχία στην κορυφή αντιπροσωπεύει την αλληλουχία άγριου τύπου (που διαβάζεται από 5 ‘προς 3’ άκρο), ενώ κάτω από την αλληλουχία είναι η μεταλλαγμένη αλληλουχία (που διαβάζεται από 5 ‘προς 3’ άκρο). Η προκαλούμενη αλλαγή στην αλληλουχία παρουσιάζεται μέσα στο ορθογώνιο πλαίσιο. Γ λουσιφεράσης δοκιμασία συγκρίνοντας την δραστηριότητα είτε άγριου τύπου -108CIP2ALuc ή υποδεικνύεται ETS δέσμευσης μεταλλαγμένης θέση -108CIP2ALuc κατασκευάσματα. D, E & amp? F. προσδιορισμοί λουσιφεράσης σύγκριση της δραστικότητας του άγριου τύπου είτε -108CIP2ALuc ή ETS1 site1 μεταλλαγμένο -108CIP2ALuc κατασκευάσματα μετά τη θεραπεία με DMSO, AG1478 (10 υΜ? D), UO126 (10 υΜ? Ε) ή ΤΡΑ (100 ηΜ? F) για 24 ώρες. (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01? N.S. = μη σημαντική). Παρουσιάζεται είναι ο μέσος όρος + SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Όλα μαζί αυτά τα αποτελέσματα εντοπίσει δύο λειτουργικές περιοχές ETS1 στο εγγύς υποκινητή CIP2A. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η MEK1 /2-εξαρτώμενη διέγερση της δραστηριότητας υποκινητή CIP2A διαμεσολαβείται από παράγοντες ETS οικογένειας μεταγραφής.

ETS1 συνδέεται με υποκινητή CIP2A και ρυθμίζει την έκφραση του σε καρκινικά κύτταρα

για να βεβαιωθείτε ότι ETS πρωτεΐνες δεσμεύονται με τον προαγωγέα CIP2A για ΜΕΚ1 /2 δραστικότητα με τρόπο που εξαρτάται, πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης με αντίσωμα ETS1 και ενίσχυση του -66 bp έως +20 bp θραύσμα του υποκινητή CIP2A. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, ETS1 ανοσοκαθίζηση οδήγησε σε περίπου κατά 4 φορές εμπλουτισμό πληρότητας υποκινητή CIP2A σε σύγκριση με την IgG ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, στο ίδιο πείραμα CIP2A εμπλουτισμού ήταν ακόμη πιο ισχυρή από ό, τι UNQ9419, μια καθιερωμένη στόχος ETS1 που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος [30]. Επιπλέον, ο εμπλουτισμός του CIP2A υποκινητή ανεστάλη σημαντικά με την κατεργασία των κυττάρων με U0126. Επιπλέον, ενώ η αναστολή των CIP2A εμπλουτισμού με UO126 ήταν στατιστικά σημαντική, η αναστολή του εμπλουτισμού UNQ9419 δεν ήταν (Εικ. 7Α).

Α. δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης των δεσμευτικών ETS1 με την υποστηρικτής CIP2A είτε σε DMSO ή UO126 επεξεργασμένα κύτταρα. UNQ9419 υποκινητής εμφανίζεται ως θετικός έλεγχος. (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01? N.S. = μη σημαντική). B. λουσιφεράσης δοκιμασία συγκρίνοντας την δραστηριότητα είτε άγριου τύπου -1802CIP2ALuc ή υποδεικνύεται ETS δέσμευσης μεταλλαγμένης θέση -1802CIP2ALuc κατασκευάσματα. C, D & amp? Ε. Ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων πρωτεΐνης CIP2A και ETS1 είτε σε AGS (C), PC-3 (D) ή LNCaP (Ε) κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο (SCR). ή ETS-1 ειδικό siRNAs για 72 ώρες.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πάνω από τα στοιχεία ETS μεσολαβήσει μεγάλο βαθμό τη βασική και ΜΕΚ-προκάλεσε δραστηριότητα της ελάχιστης -108CIP2ALuc υποκινητή (Εικ. 6). Προκειμένου να διαπιστωθεί κατά πόσον αυτά τα ETS στοιχεία είναι απαραίτητα για τη δραστηριότητα CIP2A υποκινητή πλήρους μήκους έχουμε μεταλλαχθεί αυτά τα sites για -1802CIP2ALuc και σε σύγκριση με τη δραστηριότητά του με εκείνη του άγριου τύπου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Β, μετάλλαξη είτε από τις τοποθεσίες ETS1 μειωθεί δραματικά τη δραστηριότητα -1802CIP2ALuc υποκινητή. Επιπλέον, για να βεβαιωθείτε ότι ETS1 ρυθμίζει ενδογενή έκφραση πρωτεΐνης CIP2A, δύο διαφορετικά siRNAs ειδικά για ETS1 επιμολύνθηκαν σε AGS κύτταρα και προϊόντα κυτταρικής λύσης ανοσοστυπώθηκαν 48 ώρες μετά για CIP2A, ETS1 και τα επίπεδα ακτίνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης CIP2A παρατηρήθηκαν τόσο με τις ειδικές siRNAs ETS1. Επιπλέον, ETS1 θετικώς ρυθμισμένη έκφραση CIP2A σε καρκινικές κυτταρικές σειρές LNCaP του προστάτη (Σχ. 7Ε) PC-3 (Σχ. 7D) και. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν συγκεκριμένες πειραματικές αποδείξεις ETS1 είναι ο μεταγραφικός παράγοντας διαμεσολαβεί EGFR-MEK1 /2 εξαρτώμενη ρύθμιση της CIP2A σε καρκινικά κύτταρα.

Τέλος, προκειμένου να αποκαλύψει αν η κατάσταση έκφρασης του EGFR-ΜΕΚ-ETS1 συστατικά μονοπάτι και CIP2A σε ανθρώπινους καρκίνους, που αναφέρεται στην Oncomine βάση δεδομένων (www.oncomine.org). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε M6 υπότυπο της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας ως τύπος καρκίνου κατά την οποία CIP2A και αντιπροσωπευτικές γονίδια του κάθε επιπέδου της οδού (EGFR, ΜΕΚ2 και ETS1) ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε δύο διαφορετικές μελέτες γονιδιώματος ευρύ λευχαιμία [31], [32] ( Εικ. 8)

A, B, C & amp?. Δ. Oncomine ανάλυση της βάσης δεδομένων των προφίλ γονιδιακής έκφρασης για τα γονίδια οδού EGFR-ΜΕΚ-ETS1 αποκάλυψε M6 υπότυπο της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας ως τύπος καρκίνου κατά την οποία CIP2A και αντιπροσωπευτικές γονίδια του κάθε επιπέδου της οδού αυξορυθμίζονται σημαντικά (**,

P

& lt?. 0.01)

Η

Συζήτηση

μια πρόσφατη συστηματική χαρακτηρισμός των σωματικών μεταλλάξεων σε 441 ανθρώπινων όγκων που προσδιορίζονται υποδοχέα αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση προς MEK1 μονοπάτι /2-ΕΚΚ να είναι ένας από οι πιο σημαντικές μετατροπές πορείες σε όλη καρκίνους του ανθρώπου [33]. Επιπλέον, η αναστολή της ογκογόνου μορφής Β-Raf σε ανθρώπινα κακοήθη μελανώματα από ένα μικρό μόριο αναστολέα αποδεικνύεται πολύ ελπιδοφόρα κλινική αποτελεσματικότητα ήδη σε κλινική δοκιμή Φάσης Ι [7]. Με βάση τα αποτελέσματα αυτών των μελετών και άφθονο των προηγούμενων δεδομένων που αποδεικνύουν ογκογόνο λειτουργία της ενεργοποίησης ΜΕΚ1 /2-ΕΚΚ μονοπάτι EGFR μεσολάβηση, είναι προφανές ότι ο προσδιορισμός των ογκογόνων τελεστές της δραστηριότητας οδός είναι σημαντική. Στη μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι CIP2A είναι ένας νέος στόχος ογκογόνος απορυθμίζεται με δραστηριότητα μονοπάτι ΜΕΚ1 /2-ΕΚΚ EGFR που προκαλείται. Μετά την αρχική κλωνοποίηση του [34], και περαιτέρω λειτουργικός χαρακτηρισμός [20], CIP2A έχει αποδειχθεί ότι προάγουν την ανάπτυξη κακοηθών κυττάρων, χρησιμοποιώντας διάφορα μοντέλα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών [20], [22], [23], [24], [25 ]. Επιπλέον, η πρωτεΐνη CIP2A έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται με πολύ υψηλή συχνότητα σε διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων κακοηθειών. Εκτός ανθρώπινου καρκίνου του μαστού, όπου CIP2A υπερεκφράζεται στο 40% των δειγμάτων των ασθενών [22], σε όλους τους άλλους τύπους μελετημένα καρκίνος, η συχνότητα είναι μεταξύ 65 και 87% των ασθενών [20], [23], [24], [25]. Αυτό καθιστά CIP2A υπερέκφραση μαζί με την ενεργοποίηση ΜΕΚ1 /2-ΕΚΚ μονοπάτι ως μία από τις πιο συχνές αλλαγές σε ανθρώπινους καρκίνους. Ωστόσο, πριν από την μελέτη αυτή, οι μηχανισμοί με τους οποίους η έκφραση CIP2A επάγεται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα έχουν πολύ καλά κατανοητή.

Για τον εντοπισμό των μηχανισμών που ευθύνονται για την υψηλή βασική έκφραση CIP2A σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, δεν έχουμε σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν συστηματικά συμβολή πολλών ρυθμιστικών μηχανισμών δυναμικό γονίδιο που έχουν προγενέστερα αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την έκφραση του γονιδίου σε ανθρώπινους καρκίνους. Αν και δεν έχουμε αποκλειστικά αποκλεισθεί ότι είτε μεθυλίωση προαγωγού ή λειτουργικές SNPs στον προαγωγέα CIP2A θα μπορούσαν να συμβάλουν στην υψηλή έκφραση CIP2A στον καρκίνο, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι δεν οι μηχανισμοί αυτοί πιθανότατα δεν είναι σημαντικές για τη ρύθμιση της δραστικότητας CIP2A υποκινητή. Για τον εντοπισμό περιοχών προαγωγού λειτουργικά εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης CIP2A σε καρκινικά κύτταρα, δημιουργήσαμε συνολικά 10 προαγωγέα μορφώματα διαγραφής ανταποκριτή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται στα σχήματα 2D και 5Β μας επέτρεψε να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η περιοχή του υποκινητή μεταξύ -335 bp και -392 bp περιέχει ένα ισχυρό στοιχείο προαγωγού ενεργοποίησης, ενώ την περιοχή μεταξύ -108 bp και -204 bp περιέχει ένα ισχυρό στοιχείο καταστολέα. Επιπλέον, τα στοιχεία δείχνουν, ότι η περιοχή του υποκινητή ανάντη του -417 bp δεν συμβάλλουν σημαντικά στην υψηλή βασική δραστηριότητα του μελέτησαν υποκινητή CIP2A στα AGS κύτταρα, ενώ, περιοχή του υποκινητή μεταξύ -27 bp και -108 bp έχει ένα πολύ ισχυρό στοιχείο ενεργοποίησης αντιπροσωπεύει τουλάχιστον το 50% της συνολικής δραστηριότητας του υποκινητή -1802 bp. Εκτός από την ρύθμιση υποκινητή, ένα άλλο σημαντικό μηχανισμό που συμβάλλει έκφραση πρωτεΐνης είναι τροποποίηση του τη σειρά της πάνω ρυθμού ή σταθερότητα. CIP2A έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι πολύ μακράς διάρκειας ζωής σε πρωτεΐνη κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [26]. Ως εκ τούτου, αποσαφήνιση των μηχανισμών που συμβάλλουν στη σταθερότητα CIP2A στα καρκινικά κύτταρα θα είναι μια σχετική ερώτηση που πρέπει να αντιμετωπιστούν στο μέλλον.

επόμενα πειράματά μας με τον υποκινητή CIP2A εντόπισε δύο εν μέρει επικαλυπτόμενες περιοχές ETS-δέσμευσης μεταξύ -60 bp έως -30 bp για να είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνες για την υψηλή δραστικότητα του υποκινητή πλήρους μήκους.