Αφηρημένο

Ιστορικό

Υπάρχουν δύο τρόποι με τους οποίους οι στατιστικές μέθοδοι μπορούν να μάθουν από βιοϊατρικών δεδομένων. Ένας τρόπος είναι να μάθουν ταξινομητές να εντοπίσει ασθένειες και να προβλέψει τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας το σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης με την καθιερωμένη διάγνωση για κάθε δείγμα. Όταν το σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης δεν είναι διαθέσιμο το έργο μπορεί να είναι με τη δική μου για την παρουσία σημαντικών ομάδων (clusters) των δειγμάτων και να εξερευνήσετε υποκείμενη δομή δεδομένων (μη επιβλεπόμενη μάθηση).

Αποτελέσματα

Εμείς διερευνηθεί η πρωτεομική προφίλ του κυτοσολικό κλάσμα των δειγμάτων ανθρώπινου ήπατος χρησιμοποιώντας δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (2DE). Δείγματα αποκόπηκαν μετά τη χειρουργική θεραπεία των ηπατικών μεταστάσεων σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση των εικόνων τζελ 2DE (n = 18) έδειξε ένα ζευγάρι των συστάδων, που περιέχουν 11 και 7 δείγματα. Προηγουμένως χρησιμοποιήσαμε τα ίδια δείγματα για τη μέτρηση βιοχημικών προφίλ με βάση το κυτόχρωμα ενζυματικές δραστηριότητες Ρ450 και διαπίστωσε επίσης ότι τα δείγματα ήταν σαφώς χωρίζονται σε δύο καλά διαχωρισμένες ομάδες με ανάλυση διασποράς. Αποδείχθηκε ότι οι ομάδες από τη δραστηριότητα του ενζύμου σχεδόν ταιριάζουν απόλυτα με τις ομάδες που προσδιορίζονται από πρωτεομική δεδομένων. Από τους 271 επαναλήψιμη σημεία σε πήγματα 2DE μας, επιλέξαμε 15 να διακρίνει τα ανθρώπινα συμπλέγματα ήπαρ του κυτταροπλάσματος. Χρησιμοποιώντας MALDI-TOF πεπτίδιο μάζα δακτυλικών αποτυπωμάτων, εντοπίσαμε 12 πρωτεϊνών για τα επιλεγμένα σημεία, συμπεριλαμβανομένων των γνωστών ειδών σχετίζονται με τον καρκίνο.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τη σημασία της ιεραρχικής ανάλυσης διασποράς της πρωτεομικής δεδομένων, και έδειξε συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων των βιοχημικών και πρωτεομική προσεγγίσεις. Ομαδοποίηση των δειγμάτων ανθρώπινου ήπατος ή /και ασθενείς σε διαφορετικές συστάδες μπορεί να παρέχει γνώσεις για πιθανή μοριακό μηχανισμό του μεταβολισμού του φαρμάκου και δημιουργεί μια λογική για την εξατομικευμένη θεραπεία

Παράθεση:. Petushkova NA, Pyatnitskiy MA, Rudenko VA, Larina OV , Trifonova ΕΠ, Kisrieva JS, et al. (2014) Η εφαρμογή της Ιεραρχική Ομαδοποίηση σε ανάλυση των μοτίβων πρωτεϊνών στο ανθρώπινο σχετίζονται με τον καρκίνο του ήπατος. PLoS ONE 9 (8): e103950. doi: 10.1371 /journal.pone.0103950

Επιμέλεια: Silvia Mazzuca, Università della Καλαβρία, Ιταλία

Ελήφθη: 26 Φεβρουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 4 του Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 του Αυγ 2014

Copyright: © 2014 Petushkova et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών της Ρωσικής Ομοσπονδίας, μέλος Σύμβαση αρ 16.522.12.2002. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Δύο συγγραφείς απασχολούνται επίσης από μια εμπορική εταιρεία Postgen Tech LLC, αλλά δεν το έκαναν λάβετε την πληρωμή ή τις υπηρεσίες από την εταιρεία για κάθε πτυχή της υποβληθείσας εργασίας (που περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται σε επιχορηγήσεις, το διοικητικό συμβούλιο παρακολούθησης δεδομένων, το σχεδιασμό της μελέτης, την προετοιμασία χειρόγραφο, στατιστική ανάλυση, κλπ). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ηπατικές μεταστάσεις συνήθως σταδιακά να βλάψουν τη λειτουργία του ήπατος και είναι ιδιαίτερα κακοήθεις και πυρίμαχα στις συμβατικές θεραπείες [1] . Η κατανόηση των μοριακών και βιολογικών μηχανισμών του καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να επιτρέψει την ανάπτυξη περαιτέρω θεραπευτικών στρατηγικών για την πρόληψη και τη θεραπεία ηπατικών μεταστάσεων [2], [3]. Επιπλέον, μοριακές θεραπείες που βασίζονται μπορεί να παρατείνει το χρόνο για να το συκώτι υποτροπή μετά από θεραπευτική εκτομή και μπορεί να παρατείνει την επιβίωση των ασθενών. Η ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και λιγότερο τοξικές αντικαρκινικές στρατηγικές επίσης θα επιτρέψει την εξατομίκευση των θεραπευτικών αγωγών σύμφωνα με τα μοριακά χαρακτηριστικά των μεμονωμένων ασθενών [4].

πρωτεομικής μελέτες δειγμάτων ήπατος μπορεί να βοηθήσει για την αναγνώριση ειδικών δεικτών πρωτεΐνης για μεταστάσεις [5]. Μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες διαδικασίες για χαρακτηρισμό των πρωτεϊνικών συστατικών των βιολογικών συστημάτων είναι δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (2DE) σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας. Τυπικά, 2DE χρησιμοποιείται για να συγκρίνει τις αλλαγές στο επίπεδο πρωτεΐνης, τροποποίηση, και την υποβάθμιση μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων [6]. Πρωτεομικής αλλαγές μπορούν να αποκαλυφθούν με ανάλυση εικόνας γέλη μετά οπτικοποίηση με χρώση και αναγνώριση των ειδών πρωτεΐνης με τροποποιημένη έκφραση ή σε μετα-μεταφραστική μέλη [7].

Οι περισσότερες μελέτες που βασίζονται σε 2DE ανάλυση του προφίλ πρωτεΐνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι διεξάγεται σε λύμα ιστού ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος, παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, και τις μεταστάσεις του ήπατος [8] – [10]. Μια τέτοια στρατηγική είναι σε μεγάλο βαθμό περιορίζεται σε άφθονες πρωτεΐνες (π.χ., δομικές πρωτεΐνες, γλυκολυτικά ένζυμα, αννεξίνες, καθεψίνες, και οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ) που υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους [8]. Ωστόσο, αυτές οι πρωτεΐνες μπορεί να παρεμποδίσει την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών χαμηλής αφθονίας, όπως οι πρωτεΐνες της μεμβράνης, οι οποίες παίζουν θεμελιώδη ρόλο στην κυτταρική σηματοδότηση, τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, την επικοινωνία, και μηχανισμούς μεταφοράς και είναι φαρμακευτικοί στόχοι [11]. Στοχευμένη προσεγγίσεις που σχετίζονται με την απομόνωση από subproteomes κλινικό υλικό, όπως το secretome, πρωτεάσωμα, κλάσμα πλάσματος-μεμβράνης, πυρηνική μήτρα, κλπ, έχουν προκύψει πρόσφατα. Υποκυτταρική κλασμάτωση σε συνδυασμό με τεχνικές φασματομετρίας μάζας είναι μια ισχυρή προσέγγιση για να αποκαλύψει νέα, χαμηλής αφθονίας, ειδικές του παχέος πρωτεΐνες που συνδέονται και υποψήφιων βιοσημειωτών [8]. Για παράδειγμα, το 1687 κηλίδες πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε μεγάλα πηκτώματα μορφή (24 × 33 cm) ενός διαλυτού πρωτεϊνικού κλάσματος των καρκινικών και φυσιολογικών ιστών βλεννογόνου και δείχθηκε ότι η ένταση του ≥96% κηλίδων πρωτεΐνης διασκορπισμένα μέσα σε 2-φορές διαφορές και & gt? 90,5% μέσα σε διαφορές 1,5 φορές [12]. Για ένα κλάσμα ανθρώπινου ήπατος κυτοσολικής στις 17 × 24 cm γελών, 2 φορές λιγότερες κηλίδες πρωτεΐνης (911 σημεία) συνδυάζονταν [13]. 2DE αναλύσεις εικόνας έδειξε ότι ο αριθμός των πρωτεϊνών κηλίδων μεταβλήθηκαν σημαντικά σε πρωτογενή καρκίνο και ηπατική μεταστατικών βλαβών. Σύμφωνα με πληροφορίες, το κλάσμα της μεμβράνης του πρωτογενούς καρκίνου και ηπατικές μεταστάσεις κατέδειξαν απώλεια της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες (δηλαδή, ο αριθμός των κηλίδων συμφωνημένα πρωτεΐνης σε γέλες 2DE) σε σύγκριση με το κλάσμα μεμβράνης του φυσιολογικού παχέος βλεννογόνου [10]. Muto et al. [12] ανέφεραν ότι γενικά η πρωτεώματος του φυσιολογικού ιστού μπορεί να είναι πιο ομοιογενής από εκείνη των ιστών όγκου.

Νωρίτερα, περιγράψαμε μια προσέγγιση για τη διάκριση δειγμάτων ήπατος μικροσωματικής σε ορισμένες κατηγορίες με βάση βιοχημικά χαρακτηριστικά [14]. Στην έκθεση αυτή, ένα πειραματικό σχεδιασμό για να συγκρίνουν τις βιοχημικές και πρωτεομική προφίλ παρουσιάζεται (Σχήμα 1). Στο πρώτο στάδιο της προσέγγισης αυτής ελήφθη η βιοχημικό προφίλ. Περιελάμβανε 12 παραμέτρους, δηλαδή δραστικότητα της ΝΑΟΡΗ-κυτοχρώματος Ρ450, το περιεχόμενο του κυτοχρώματος Ρ450 και 10 κυτοχρώματος δραστηριότητες μονοοξυγενάσης Ρ450 με υποστρώματα δείκτη. Καθαρά από ανεξέλεγκτους στατιστική ανάλυση των βιοχημικών χαρακτηριστικών του μικροσώματα ανθρώπινου ήπατος που προέρχονται ότι τα πρότυπα του συστήματος ήπατος μονοοξυγενάσης σχηματίζονται δύο καλά διαχωρισμένες ομάδες (Εικόνα 1, Α). Αποδείχθηκε ότι τουλάχιστον 6 μεταβλητές ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο μεγάλων συστάδων των δειγμάτων ανθρώπινων ηπατικών μικροσωματικών έχει

σ

-τιμή & lt? 0.05 με διόρθωση Bonferroni. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι οι μεταβολές στην ενεργότητα αναγωγάσης Ρ450 ΝΑϋΡΗ-κυτοχρώματος περιλαμβάνουν το κύριο παράγοντα, υπεύθυνο για το διαχωρισμό των βιοχημικών χαρακτηριστικών μεταξύ δύο ομάδες ασθενών [14].

(Α) Το προφίλ περιλάμβανε 12 παραμέτρους, δηλαδή δραστικότητα της ΝΑΟΡΗ-κυτοχρώματος Ρ450, το περιεχόμενο του κυτοχρώματος Ρ450 και του κυτοχρώματος δραστηριότητες μονοοξυγενάσης Ρ450 με υποστρώματα δείκτη (Petushkova et al., 2010). (Β) Το προφίλ περιλαμβάνονται εικόνες 2DE.

Η

Για να συσχετίσει το HLC προφίλ πρωτεΐνη, όπως ορίζεται από 2DE, με βιοχημικές δραστηριότητες του συστήματος μικροσωμικής που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως συλλεχθεί μορφολογικά φυσιολογικά δείγματα ήπατος γύρω ηπατικές μεταστάσεις του παχέος εντέρου Καρκίνος. πρωτόκολλο υπερφυγοκέντρηση χρησιμοποιήθηκε για να δώσει ανθρώπινο ήπαρ κυτοσόλιο και μικροσωμικές κλάσματα από τις ίδιες ήπαρ δείγμα. Η τρέχουσα μελέτη διεξήχθη για να συγκρίνει τις συστάδες δείγμα που λαμβάνεται σύμφωνα με μικροσωματική βιοχημική δραστηριότητα (Σχήμα 1, Α) με τα αντίστοιχα κυτοσολική πρωτεομική προφίλ (σχήμα 1, Β). Επιπλέον, ήμασταν ενδιαφέρονται για την ταυτοποίηση των διαλυτών πρωτεϊνών, οι οποίες μπορούν να με κάποιο τρόπο σχετίζονται με τη δραστηριότητα του συνδεδεμένου με μεμβράνη κυτοχρώματα P450.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικά διαδικασίες

Όλα τα δείγματα από την υπολειμματική του ήπατος μετά από ιστολογική ανάλυση εγκρίθηκαν από το Τμήμα Παθολογικής Ανατομικής του Εθνικού Κέντρου Ερευνών της Χειρουργικής, Ρωσικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Μόσχα, Ρωσία). Ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Τα άτομα που συμφώνησαν να συμμετάσχουν στη μελέτη, σύμφωνα επιτροπή δεοντολογίας του τοπικού οργάνου του Εθνικού Κέντρου Ερευνών της Χειρουργικής. Τα δείγματα έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις [14], [15].

Χημεία

2- [4- (2-υδροξυαιθυλ) πιπεραζιν-1-υλ] αιθανοσουλφονικό οξύ, φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF ), 2,5-διυδροξυβενζοϊκό οξύ, αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), νικοτιναμίδη αδενίνη φωσφορικό δινουκλεοτίδιο, διθειονώδες νάτριο, θρυψίνη, και δεοξυχολικό νάτριο αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA)? ακετονιτρίλιο και τριφθοροξικό οξύ αγοράστηκαν από ICN Pharmaceuticals Inc. (Costa Mesa, CA, USA)? Coomassie Brilliant Blue R-250 αγοράστηκε από την Fluka (Seelze, Germany). Τροποποιημένο θρυψίνη (αρ. Καταλόγου V511C) ελήφθη από την Promega (Madison, WI, USA). Άλλες χημικές ουσίες αγοράστηκαν από Reakhim-Πένζα, LLC (Πένζα, Ρωσία).

2.3 δείγματα ιστών και προετοιμασία

Τα ανθρώπινα κλάσματα διαλυτής πρωτεΐνης του ήπατος παρασκευάστηκαν σε προηγούμενη μελέτη μας (αποθηκεύεται στους -80 ° C πριν από την χρήση) από την εκτομή και απορρίπτεται μάζες γύρω ιστούς ήπατος, τα οποία ελήφθησαν από ασθενείς (n = 23) που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση ηπατική [14]. Δείγματα μορφολογικά φυσιολογικό ήπαρ (3-10 g,) ελήφθησαν από το περιφερικό άκρο της εκτομής, τουλάχιστον 5 cm από τον όγκο. Τα δείγματα είχαν διαγνωστεί με ιστοπαθολογική.

Όπως αποτελείτο με τις συνθήκες του πειράματος, δεν είχαμε λάβει υπόψη κάθε εξατομικευμένες πληροφορίες σχετικά με τους ασθενείς ή για την επεξεργασία των ασθενών. Ωστόσο, η συλλογή των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις ακόλουθες οδηγίες: (1) όλοι οι ασθενείς ήταν υπό σοβαρή νόσο του καρκίνου, η οποία οδήγησε στην χειρουργική του ήπατος ίσως μετά από μία προηγούμενη χημειοθεραπεία? (2) δεν ακτινοθεραπεία εκτελέστηκε πριν από την επέμβαση? (3) καμία ένδειξη ενδοκρινούς ή μεταβολικής νόσου? (4) καμία σοβαρή λοίμωξη ανιχνεύθηκε? (4) διατροφικές απαιτήσεις των ασθενών διευθύνονταν από το Εθνικό Κέντρο Ερευνών της Χειρουργικής με ένα σχετικά ομοιόμορφο πρότυπο? ως αποτέλεσμα, εξωγενείς διαιτητική επίδραση στο μεταβολικό προφίλ περιορίστηκε στο χαμηλότερο επίπεδο. Τα εκτομή δείγματα τοποθετήθηκαν αμέσως σε πάγο πριν από την απόκτηση του ήπατος μικροσωματικού κλάσματος ανθρώπινης [14] και HLC. Όλες οι διαδικασίες προετοιμασίας διεξήχθησαν στους 0-4 ° C. Τα δείγματα ήπατος ομογενοποιήθηκαν σε δύο όγκους ρυθμιστικού διαλύματος ομογενοποίησης, που περιέχει 1 mM EDTA, 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 0,1 mM PMSF, και 150 mM KCl χρησιμοποιώντας ένα γυάλινο Potter Elvehjem ομογενοποιητή με ύπερο από τεφλόν (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Γερμανία). Το ομογενοποιημένο ήπαρ διαδοχικά σε φυγοκέντρηση σε 10,000 χ

g

για 20 λεπτά και 105.000 χ

g

για 70 λεπτά. Το σφαιρίδιο (μικροσωμικό κλάσμα) αναλύθηκε όπως περιγράφεται στα προηγούμενα μελέτη μας [14]. Στην παρούσα μελέτη, το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε ως το HLC κλάσμα. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των δειγμάτων HLC εκτιμήθηκε με τη χρήση της Bradford δοκιμασίας [16] με αλβουμίνη βόειου ορού σαν πρότυπο.

προκλασματοποίησης δειγμάτων HLC πριν από δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου

υποπολλαπλάσιο HLC (200 μί, 13.2 ± 5.6 mg πρωτεΐνης) αναμίχθηκε με 1 ml ψυχρού 10% τριχλωροξικού οξέος (TCA) σε ακετόνη (ν /ν), που περιέχει 0.07% μερκαπτοαιθανόλη. Μετά από επώαση 3 ωρών στους -18 ° C, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 20.000 χ

g

για 10 λεπτά (4 ° C). Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και ο σβώλος διαλύθηκε σε 5 ml ψυχρής ακετόνης, που περιέχει 0.07% μερκαπτοαιθανόλη και φυγοκεντρήθηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το σφαιρίδιο που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε για διαχωρισμό με πρωτεΐνη 2DE.

δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (2DE)

2DE του HLC πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Bio -Rad, Hercules, CA, USA). Για κάθε δείγμα HLC, το προκύπτον δισκίο διαλύεται σε 200 μL ρυθμιστικού επανενυδάτωσης (4 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% 3 – [(3-χολαμιδοπροπυλ) διμεθυλαμμώνιο] -1-προπάνιο, 50 mM DTT, και 0.5 % ampholine). Οι πρωτεΐνες φορτώθηκαν με παθητική επανυδάτωση επάνω σε 11-cm, μη γραμμική, ακινητοποιημένοι, βαθμίδα ρΗ (IPG, ρΗ 3-10) λωρίδες διάρκεια της νύχτας (14 ώρες) στα 50 V και για περαιτέρω 30 λεπτά στους 250 V. Η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) ήταν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Protean IEF κυττάρων (Bio-Rad) με ένα εφαρμοζόμενο κλίση 250-5500 V για ένα σύνολο 35.000 V · h. Όλα τα στάδια IEF διεξήχθησαν στους 20 ° C. Μετά IEF, λωρίδες γέλης IPG εξισορροπήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 6.8, 6 Μ ουρία, 2% δωδεκυλο θειικό νάτριο (SDS), 20% γλυκερόλη) που περιείχε 1% DTT και ανακινήθηκε για 30 λεπτά σε 50 rpm σε τροχιακό αναδευτήρα [17]. Οι λωρίδες IPG μεταφέρθηκαν στη συνέχεια στο διάλυμα εξισορρόπησης, που περιέχει 2.5% ακρυλαμίδιο, και ανακινήθηκε για επιπλέον 30 λεπτά πριν από τον διαχωρισμό σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (135 × 80 × 1,0 mm, που 4% πηκτή ζωικού κεφαλαίου, και το 12% επίλυση γέλη). Διαχωρισμός στη δεύτερη διάσταση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Mini-Protean δωδεκα Κυττάρων (Bio-Rad) και ρυθμιστικό διάλυμα Τρις-γλυκίνης (βάση 25 mM Tris και 192 mM γλυκίνη), που περιέχει 0.1% SDS, κατά τη στιγμή 150 V. Εκτέλεση ήταν περίπου 60 λεπτά και κατά την έξοδο του μπλε βρωμοφαινόλης εντός ρυθμιστικού διαλύματος, ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός θεωρήθηκε πλήρης.

οπτικοποίηση πρωτεϊνών και ανάλυση εικόνας

τα πηκτώματα υποβλήθηκαν σε χρώση αργύρου [18], οι εικόνες γέλη αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα GS-800 Calibrated Πυκνότητας (Bio-Rad) και το ανέβασα στο ιδιόκτητο ψηφιακή εικόνα GelEditor λογισμικό ανάλυσης. Είναι γραμμένο σε Java και εργαλεία supportsl για τη φόρτωση εικόνων, αυτοματοποιημένη ανίχνευση τόπου με βάση Laplacian του Gaussian φίλτρου, οδηγίες ανίχνευσης σημείο, αντιστοίχιση του προφίλ πρωτεΐνης, και μια επιλογή για να αποθηκεύσετε τις εκθέσεις (Σχήμα S1). Η ένταση κηλίδα επί του πήγματος υπολογίστηκε ως το άθροισμα των pixels σε ένα χειροκίνητο ανιχνεύονται σημείο. Το λογισμικό GelEditor μπορείτε να το κατεβάσετε ελεύθερα από www.bioinformatics.ru/geleditor.zip.

In-gel πέψη

Οι κηλίδες πρωτεΐνη (~ 3 mm

3) αποκόπηκαν από το γέλη χρησιμοποιώντας τροποποιημένη 250 μL συμβουλές και αποχρωματίζονται με 50 μί 100 mM Κ

3 [Fe (CN)

6] και 100 mM θειοθειικού νατρίου σε αναλογία 1:01 (ν /ν) ανά τεμάχιο γέλης σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα τεμάχια της πηκτής πλένονται με νερό σε θερμοκρασία δωματίου και ανακινήθηκε για 15 λεπτά σε 50 rpm πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές. Στη συνέχεια, τα κομμάτια γέλη πλύθηκαν δύο φορές με 150 μL 50 mM ΝΗ

4HCO

3 σε 50% ακετονιτρίλιο σε 37 ° C, ανακινήθηκε για 15 λεπτά σε 50 rpm πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα, και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε διάλυμα αφυδάτωση (100% ακετονιτρίλιο). Αφού το ακετονιτρίλιο απομακρύνθηκε και τα κομμάτια γέλη ξηραίνεται, 8 ± 2.0 μL διαλύματος τρυψίνης (25 ng /μL τροποποιημένου θρυψίνη σε 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου) προστέθηκε και το μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, 15 μλ 0.7% τριφθοροοξικό οξύ προστέθηκαν σε κάθε τεμάχιο γέλης και τα δείγματα επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι εκχυλίζεται τρυπτικά πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση με φασματομετρία μάζας.

λέιζερ εκρόφησης ιονισμού χρόνου-πτήσης φασματομετρίας μάζας Matrix υποβοηθούμενη (MALDI-TOF MS)

Κάθε μίγμα πρωτεολυτικών πεπτιδίων (1 μι) εθεάθη σε MALDI στόχου (600/384 Anchor τσιπ? Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Γερμανία) σε τρία αντίγραφα και ξηραίνεται στον αέρα. Για ιονισμού, ένα διάλυμα από 2,5-dihydrobenzoic οξύ (3 mg /mL) σε ακετονιτρίλιο και 0,7% τριφθοροξικό οξύ (1:01 ν /ν) χρησιμοποιήθηκε. φάσματα μάζας στο

m /z

φάσμα 600-4000 ήταν το χέρι που αποκτήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού FlexControl (Bruker Daltonik GmbH) με τον τρόπο ανάκλασης /καθυστερήσει εκχύλιση με μία επιταχυνόμενη τάση των 25 kV και μια καθυστέρηση 135-ns χρησιμοποιώντας η Ultraflex II MALDI-TOF MS αναλυτή (Bruker Daltonik GmbH). Όλα τα φάσματα μάζας εκπροσωπείται σήματα κατά μέσο όρο 100 βολές λέιζερ από μία θέση σε ένα δείγμα τόπου. Από κάθε σημείο του δείγματος, 4-6 φάσματα μάζας αποκτήθηκαν. ευχέρεια laser ρυθμίστηκε πάνω από το όριο εκρόφηση της μήτρας για να επιτύχει την καλύτερη ανάλυση και την υψηλότερη ακρίβεια μέτρησης μάζας. Σήματα με ένα S N αναλογία /& gt? 6 και κατ ‘ανώτατο όριο των 100 κορυφές ανά φάσμα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή λίστες κορυφή με τον αλγόριθμο SNAP (λογισμικό FlexAnalysis ver 2.0?. Bruker Daltonik GmbH) και εσωτερικά βαθμονομηθεί με τα προϊόντα θρυψίνη αυτόλυση (

m /z 842.5094

και 2211.1046 Da, αντιστοίχως). Με αποτέλεσμα λίστες κορυφής χρησιμοποιήθηκαν για να αναζητήσετε τη βάση δεδομένων UniProtKB /Swiss-Prot (UniProt απελευθερώσει 2012_09 – 11 Σεπτεμβρίου 2012). Αναγνώριση από το πεπτίδιο μάζα δακτυλικών αποτυπωμάτων (PMF) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού μασκότ (Matrix Science, Inc., Boston, MA, USA). Κατά τη διάρκεια της αναζήτησης της βάσης δεδομένων, το πολύ ένα αναπάντητες διάσπασης αφέθηκε, μια μάζα ανοχή 80 ppm χρησιμοποιήθηκε, και μεταβλητές τροποποιήσεις, όπως η οξείδωση μεθειονίνης και τροποποίησης κυστεΐνης με ακρυλαμίδιο, ελήφθησαν υπόψη. Η ανοχή ιδιοποιηθεί m /z (80 ppm) υπολογίστηκε ως η μέγιστη μάζα απόκλιση με βάση στατιστική κατανομή των σφαλμάτων μάζα σε όλα τα φάσματα και την τυπική απόκλιση.

Η στατιστική ανάλυση

Το αρχικό σύνολο δεδομένων αποτελείται από 19 δείγματα (τζελ 2DE), το καθένα χαρακτηρίζεται κατά μέσο όρο από 271 ± 99 πρωτεΐνη κηλίδες /χαρακτηριστικά (Πίνακας S1). Τζελ Δεν υπάρχουν. 6 χρησιμοποιήθηκε ως κύριο τζελ για το εγχειρίδιο ευθυγράμμιση σημείο-προς-σημείο. Δεδομένου ότι ήμασταν ενδιαφέρονται για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων με την προηγούμενη γνώση σχετικά με βιοχημικές προφίλ μετρήθηκε για τα ίδια δείγματα [14], θα εξαιρούνται επίσης Νο.4 τζελ, επειδή σε προηγούμενη μελέτη μας, θεωρήθηκε ως μια ακραία? έτσι είχαμε μια συλλογή από 18 εικόνες gel. Για να εξασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα μελέτη και να μειώσει την ευαισθησία του θορύβου, αναλύσαμε μόνο ποιοτικές διαφορές μεταξύ γελών όσον αφορά την παρουσία /απουσία συγκεκριμένης κηλίδων πρωτεΐνης. Κάθε γέλη επαναλήφθηκε τρεις φορές και το καλύτερο αντίγραφο επιλέχθηκε με οπτική επιθεώρηση της ποιότητας του διαχωρισμού. Τελικό σύνολο δεδομένων παρουσιάστηκε ως μια δυαδική μήτρα D αποτελείται από 18 σειρές (τζελ εικόνες) και 389 στήλες (spots) όπου

d

ij

= 1 εάν

ι

-ου σημείο ήταν παρούσα στο

i

-ου gel, αλλιώς

d

ij

= 0. για ομαδοποίηση gel, που χρησιμοποιείται η μέθοδος του Ward. Απόσταση μετρικό μεταξύ δύο δυαδικούς φορείς ορίστηκε ως αριθμός των bits όπου οι εν λόγω φορείς διαφέρουν (επίσης γνωστή ως απόσταση Hamming). Όλες οι υπολογισμοί και τα γραφικά έγιναν με R στατιστική γλώσσα (www.r-project.org). Ο πηγαίος κώδικας του σεναρίου ανάλυσης δεδομένων μπορεί να βρεθεί στην Ανάλυση Δεδομένων Script S1. Για τη μέτρηση της ομοιότητας μεταξύ clusterings δύο δεδομένα, υπολογίζεται η αναπροσαρμοσμένη δείκτης Rand των οποίων η αξία είναι στην περιοχή μεταξύ -1 και +1, όπου 1 αντιστοιχεί σε τέλεια συμφωνία μεταξύ των χωρισμάτων.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Στα πειράματά μας, όλα τα δείγματα ελήφθησαν από τη μια κατηγορία ασθενών: χειρουργικά αγωγή για ηπατικές μεταστάσεις που προκύπτουν από καρκίνο του παχέος εντέρου (Σχήμα 1). Ως εκ τούτου, στόχος μας δεν ήταν να βρείτε τις διαφορές μεταξύ κανόνα και τον καρκίνο, αλλά μάλλον για να εξερευνήσετε τη δομή στο εσωτερικό ενός ομίλου σύνολο δεδομένων, που περιγράφει το σύστημα του ανθρώπινου ήπατος ναρκωτικών μεταβολισμό και κυτταρόπλασμα κλάσμα (η παρούσα μελέτη). Σε προηγούμενη μελέτη σχετικά με το μεταβολισμό του φαρμάκου [14] παρά το σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος (n = 22) έχει ως αποτέλεσμα αναμφίβολα επιβεβαίωσε την παρουσία μας δύο συστάδες στα δεδομένα. Υπολογίσαμε κριτήρια πλάτος σιλουέτα για την εγκυρότητα του συμπλέγματος, η οποία έδειξε ότι η παρουσία των δύο συστάδες επιβεβαιώνεται με πολύ υψηλή εμπιστοσύνη (p & lt? 0,0001). Ως εκ τούτου, το αποκάλυψε ετερογένεια μέσα στην ομάδα των ασθενών που αντιμετωπίζονται ισότιμα ​​ήταν ένα υπόβαθρο για το τρέχον αναφερθεί πρωτεομική έρευνα.

2DE ανάλυση των HLC

Μελέτες για ανθρώπινο ήπαρ ιστούς έχουν διεξαχθεί για να διαπιστώσετε εάν υπάρχουν ομάδες των δειγμάτων διακριτικό χαρακτήρα των πρωτεϊνών τους. Η proteome HLC χαρακτηρίστηκε από μια αντιπροσωπευτική συλλογή των 19 δειγμάτων που χωρίζονται από 2DE σε πήγματα μεσαίο φορμά σε τρία αντίγραφα, έτσι εξετάστηκαν συνολικά 58 2DE εικόνες. Οι καλύτερες επαναλήψεις 2DE επιλέχθηκαν από τις τεχνικές διαδρομές ανάλογα με την ποιότητα του διαχωρισμού (Εικόνα S2). Οι επιλεγμένες αντιπροσωπευτικές εικόνες μετατράπηκαν στους καταλόγους τόπου και περαιτέρω συγκεντρωμένα χρησιμοποιώντας την μέθοδο χωρίς επίβλεψη. Σταθερά με προηγούμενη εργασία μας με μικροσώματα ήπατος εδώ χρησιμοποιήσαμε μια ανεξέλεγκτη προσέγγιση επειδή η κλινική πληροφορίες σχετικά με τις εκτομή δείγματα ήπατος ήταν διαθέσιμος.

Εμείς απέρριψε κάποια δείγματα λόγω της χαμηλής ποιότητας 2DE διαχωρισμός λόγω της ιδιαιτερότητες στο πλαίσιο της προετοιμασίας του δείγματος (Σχήμα 2). Οι τυπικές εικόνες 2DE του Ag-χρωματισμένο πήκτωμα κανένα δείγμα. 6 πριν και μετά προκλασματοποίησης με TCA σε ακετόνη (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) δείχνονται στο Σχήμα 2,

ένα

και

b

. Χωρίς προκλασματοποίησης, 2DE των κυτταρόπλασμα κλάσμα δυσχεραίνει το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σημεία (Σχήμα 2

α

). Το Σχήμα 2

b

είναι μια αντιπροσωπευτική εικόνα κύριος γέλη που δείχνει τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών από ανθρώπινο ιστό ήπατος μετά από καθίζηση TCA /ακετόνη. Η πρακτική αυτή συχνά χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση προσμείξεων επειδή ελαχιστοποιεί την υποβάθμιση πρωτεΐνη [19], αλλά καθίζηση TCA /ακετόνη ήταν ανεπαρκής για να αποκτήσει τις κατάλληλες εικόνες τζελ των HLC nos δείγμα. 20-23, έτσι ώστε να αποκλείονται αυτά τα δείγματα από περαιτέρω αναλύσεις. Συνολικά, 687 σημεία πρωτεΐνη διαχωρίστηκαν σε άργυρο 2DE gel από HLC No.6 δείγματος, τεχνικές τρέχει # 1, χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανίχνευσης σημείο του λογισμικού GelEditor. Εκτός από την χρώση αργύρου με βάση το πρωτόκολλο του Shevchenko et al. μπλε χρώση [18] Coomassie επίσης διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη και περίπου μόνο 100 κηλίδες πρωτείνης ανιχνεύθηκαν στην ίδια Νο.6 γέλη (Σχήμα 2

γ

).

30 μg του ανθρώπινου κλάσμα διαλυτής πρωτεΐνης ήπατος (HLC) διαχωρίστηκε με 2DE και οπτικοποιήθηκαν με χρώση αργύρου (

ένα

και

b

) ή Coomassie Brilliant Blue χρώση (

γ

):

μια

– HLC πριν προεπεξεργασία με τριχλωροξικό οξύ σε ακετόνη?

β

και

c –

HLC μετά την προεπεξεργασία. Χρησιμοποιώντας χρώση Coomassie σχεδόν 100 σημεία της πρωτεΐνης θα μπορούσε να αποκαλυφθεί, αλλά χρησιμοποιώντας την επισήμανση χρώση αργύρου μέχρι 687 σημεία πρωτεΐνη ανιχνεύονται αυτόματα. Spots nos. 14, 25, 34, 36, 48, 56, 62, 63, 66, 210, 214, 219, 247, 252, 275, 276, 279, 301, 321, 322, και 408 είναι κοινές για όλες τις γέλες 2DE 19 δείγματα κυτταρόπλασμα ανθρώπινου ήπατος.

Η

Οι ελήφθησαν εικόνες gel εξετάστηκαν για να χαρακτηρίσει σημείο επαναληψιμότητα και τη μεταβλητότητα. Παρατηρήσαμε ότι το 96% της πρωτεΐνης σημεία ήταν στο κατώτερο όριο του ορίου ανίχνευσης του θειοθειϊκού αργύρου με μια κανονικοποιημένη ένταση & lt? 0.02 σχετικές μονάδες. Ένα μέσο ένταση των 0,02 – 0,04 μονάδων παρατηρήθηκε για το 2% των κηλίδων, ενώ το 1% των κηλίδων ήταν μεγάλη αφθονία με σχετική ένταση & gt?. 0,1 μονάδα

Επιπλέον, έχουμε επιλέξει τον πλοίαρχο τζελ ως το καλύτερο gel με τον μεγαλύτερο αριθμό των κηλίδων και ελάχιστη φάσμα σκέδασης της μέσης έντασης του κάθε τόπου. Ο πλοίαρχος gel αντιστοιχεί στο δείγμα δεν 6. Για να εκτιμηθεί η τεχνική παραλλαγή της πειραματικής διάταξης μας, πραγματοποιήσαμε τέσσερις ανεξάρτητες αντιγραφική πίστες του HLC δοκιμάσετε όχι. 6 σε διαφορετικούς χρόνους. Στο πρώτο βήμα της ανάλυσης που χρησιμοποιείται για τον αριθμό των κηλίδων ως ένα τραχύ μέτρο της αναπαραγωγιμότητας gel. Ένα σύνολο 449, 420, 444, και 406 κηλίδες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στα πειράματα αυτά σε σειρές των ρΐ 3.5-10.0 και MW 10-250 kDa. Η παρατηρούμενη μέσος αριθμός κηλίδων ήταν 430 ± 20, η οποία ήταν συγκρίσιμη με προηγούμενα δεδομένα που λαμβάνονται από την κυτταροπλασματική κλάσμα των πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων σε κυτταρικές γραμμές HepG2 και Hep2B [20]. Τα υπόλοιπα γέλες περιείχαν επαρκώς λιγότερες κηλίδες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 για 19 δείγματα HLC. Σε ολόκληρη σειρά, ο μέσος αριθμός των μη αυτόματο τρόπο ανιχνεύθηκαν κηλίδες πρωτεΐνης ήταν 271 ± 99 (μέση τιμή ± SD, η = 58). Οι ποσότητες spot ήταν τρεις φορές μικρότερες σε σύγκριση με τα προηγούμενα αναφερόμενα αποτελέσματα του κυτοσολίου ανάλυση κλάσμα δειγμάτων ανθρώπινου ηπατικού ιστού [13], [21], [22]. Η διαφορά στον αριθμό σημείο ήταν πιθανότατα λόγω της ρύθμισης 2DE, όπως χρησιμοποιείται 11-cm λωρίδες IPG αντί του 17 εκατοστών, που χρησιμοποιείται από Wimmer et al. [13] και Kim et al. [23], και έτσι οι κλίσεις για ισοηλεκτρική εστίαση ήταν μικρότερη. Kim et al. [23] αναλύονται όγκου και μη όγκου περιοχές εκτομή ιστών καρκίνου του ήπατος με τον προσδιορισμό της κυτοσολικής πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας 2DE και MALDI-TOF-MS. Χρησιμοποίησαν χρώση αργύρου για την ανίχνευση της πρωτεΐνης στα πηκτώματα και παρατηρείται έως 1060 σημεία και εντοπίστηκαν 127 πρωτεΐνες? ανέφεραν, επίσης, ότι ένα πρόβλημα με τη μεταβλητότητα του τόπου εντάσεις αποφασίστηκε χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες εντάσεις.

Τα πηκτώματα ανήκουν σε σύμπλεγμα 1 που φαίνεται στο λευκό στήλες. Οι γέλες που ανήκουν σε σύμπλεγμα 2 παρουσιάζεται σε γκρι στήλες. Gel το οποίο αφαιρείται από όλα τα μετέπειτα επεξεργασία των δεδομένων εμφανίζεται στη σκιασμένη στήλη.

Η

Για την αξιολόγηση τζελ-to-gel μεταβλητότητα, συγκρίναμε τις κηλίδες ανάμεσα σε τέσσερις εικόνες αναπαραχθεί τζελ που λαμβάνεται από το δείγμα δεν είναι. 6 χρησιμοποιώντας το εγχειρίδιο τόπου ταιριάζουν χαρακτηριστικό του ιδιόκτητου λογισμικού GelEditor (Σχήμα S1). Κάθε αντίγραφο το χέρι ευθυγραμμισμένο με τον κύριο εικόνα, η οποία περιείχε ένα μέγιστο αριθμό των κηλίδων. Βρήκαμε ότι 102 σημεία ήταν παρούσα σε τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις, 80 σημεία συμφωνημένα ήμισυ των πηκτωμάτων, ενώ το 58 κηλίδες ήταν παρόντες στην κύρια μόνο γέλη. Τέλος, το 47% των κηλίδων (209 σημεία) συμφωνημένα και τα τέσσερα αναπαραχθούν εικόνες 2DE.

Για να καθοριστεί η δυνατότητα αναπαραγωγής των 2DE, ερευνήσαμε τεχνικές πίστες του HLC δείγματος 6, ανέλυσε τις κανονικοποιημένες εντάσεις του κάθε τόπου, και συναρτήσει εκείνων ένας ενάντια στον άλλο σε μια Χ-Υ και ένα ποσοστημόριο – ποσοστημόριο (Q-Q) οικόπεδα [24]. Τα οικόπεδα Χ-Υ για την No.6 δείγματος, τεχνικές τρέχει # 1 (master gel) σε σύγκριση με το ίδιο δείγμα, τεχνικές τρέχει # 2 δείχνουν μια Pearson συντελεστής συσχέτισης r = 0.797 (Σχήμα 4

α

). Πραγματοποιήσαμε αυτή την ανάλυση για τις τέσσερις τεχνικές πίστες του τζελ 6 και προσδιορίζεται το μέσο συντελεστή συσχέτισης Pearson, η οποία ήταν ίση 0,72 ± 0,06 (μέση τιμή ± 95% διάστημα εμπιστοσύνης). Το μέγεθος του συντελεστή συσχέτισης r & gt? 0.7 υποδηλώνει μια ισχυρή συσχέτιση, ενώ οικόπεδα Q-Q χρησιμοποιήθηκαν ως γραφικό εργαλείο για τη σύγκριση δύο κατανομών μεταξύ τους. Δύο σύνολα δεδομένων θα μπορούσε να θεωρηθεί ταυτόσημα αν τα σημεία στα οικόπεδα Q-Q βρίσκονται κοντά σε μια γραμμή παλινδρόμησης

y = x

. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4β το κριτήριο αυτό είναι απόλυτα πληρούνται για HLC πρωτεΐνες

Κανονικοποιημένη σημείο εντάσεις από δύο τεχνικές πίστες του τζελ no.- οικόπεδο Υ και quantile-quantile. (Q – Q) οικόπεδο. Το X – Y διάγραμμα δείχνει ισχυρό συσχετισμό μεταξύ spot εντάσεις με ένα συντελεστή συσχέτισης Pearson r = 0.797 (α). Q – οικόπεδο Q παρουσιάζει μεγάλη ομοιότητα μεταξύ της διανομής σημείο εντάσεων (β). Ένταση του κάθε συμφωνημένα κηλίδα επί του πήγματος ομαλοποιήθηκε ανά συνολική ένταση του συμφωνημένα κηλίδων εντός αυτής της γέλης.

Η

Τα ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη κηλίδες (209) χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η διακύμανση της εντάσεως σημείο σε τέσσερις επαναλήψεις για δείγμα HLC όχι 6. στην συντελεστή ιστόγραμμα διακύμανσης (CV) διανομής (βλέπε σχήμα 5), το 65% των κηλίδων χαρακτηρίζονταν από CV & lt? 0,6. Αυτός ο βαθμός διακύμανσης μεταξύ των αναπαραχθούν τζελ ήταν συγκρίσιμο με το βιογραφικό σημείωμα που παρατηρήθηκε μεταξύ φυσιολογικού ιστού εναντίον διάφορα στάδια του καρκίνου [9], [25]. Για παράδειγμα, Shi et al. [9] που παρατηρήθηκε κατά μέσο όρο το βιογραφικό του 62-69% το 1223 σχετικά με τις δυνατότητές σημείο από 18 προφίλ σημείο 2D-ΨΗΦΟ μεταξύ των διαφόρων ομάδων του δείγματος (κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου, πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου και ηπατικές μεταστάσεις). Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι και οι δύο πρωτογενείς και δευτερογενείς όγκους που εμφανίζονται σημαντικά υψηλότερο βαθμό παραλλαγές spot όγκου από την κανονική του παχέος εντέρου.

Ένταση κάθε συμφωνημένα σημείο στην πηκτή ομαλοποιήθηκε ανά συνολική ένταση της συμφωνημένα σημεία σε αυτό το τζελ.

Γενικά, η CV εξαρτάται από τον τύπο του βιολογικού υλικού, καθώς και την προετοιμασία του δείγματος και την ανίχνευση spot προσεγγίσεις [26], [27]. Σε χρώση αργύρου, τα ταιριάζουν σημεία που παρασκευάζονται και να τρέξει κάτω από τις ίδιες συνθήκες ποικίλουν σε ένταση? Ως εκ τούτου, είναι δύσκολο να επιτευχθεί ακόμη και αναπαραγωγιμότητας με παράλληλες επαναλήψεις [26]. Ως εκ τούτου, όπως τζελ μας ήταν άσχημα να αναπαραχθούν στις εντάσεις των ταιριάζουν κηλίδες, δεν χρησιμοποιούν τιμές έντασης για περαιτέρω ανάλυση, αλλά μετατρέπονται τα σημεία σε δυαδική μορφή: είτε υπάρχει ένα σημείο, είτε όχι

3.2. χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση των τζελ και δείγματα μικροσωματικής

Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση διασποράς για το διαχωρισμό τζελ και τη διαλεύκανση των ομάδων στη συλλογή μας των δειγμάτων ήπατος. Αρχικά, σημεία σε κάθε τζελ 2DE συγκεντρώθηκαν στα σημεία για τον πλοίαρχο τζελ (αρ. 6 # 1) χρησιμοποιώντας το σενάριο Perl (Data Analysis Σενάριο S2). Τα αποτελέσματά μας είχαν διαμορφωθεί σε ένα τραπέζι στο οποίο οι σειρές που αναφέρονται στα πρωτεϊνικά στίγματα και οι στήλες αντιπροσώπευαν δείγματα HLC. Εάν η κηλίδα πρωτεΐνης ήταν παρούσα στην πηκτή HLC και master τζελ, η τιμή του κελιού ορίστηκε σε «1», αλλιώς αν το σημείο ήταν απούσα από την επόμενη HLC τζελ, που ορίστηκε στο «0». Πραγματοποιήσαμε ιεραρχική ανάλυση συστάδων του πίνακα δεδομένων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του Ward σε συνδυασμό με την απόσταση Hamming μετρική. Ομαδοποίηση των 2DE τζελ των δειγμάτων HLC οπτικοποιήθηκε ως δενδρόγραμμα (Σχήμα 6

α

). Δύο μεγάλες συστάδες ήταν σαφώς διακρίνονται: η πρώτη (cluster όχι. 1) σχηματίστηκε από τζελ nos. 1-3, 5 και 7-13, ενώ η δεύτερη (συμπλέγματος αρ. 2) που περιλαμβάνονται πηκτές nos. 6 τεχνικές τρέξιμο # 3, και 14-19. Έτσι, η μέθοδος του Ward έδωσε δύο ομάδες δειγμάτων ήπατος. Είναι ενδιαφέρον ότι η ιστόγραμμα στην Εικόνα 3 προκαταρκτικά επεσήμανε την ύπαρξη δύο συστάδων για τις HLC δείγματα. Ο μέσος αριθμός των μη αυτόματο τρόπο ανιχνεύεται πρωτεΐνη κηλίδες στο τζελ από συστάδες αρ. 1 και 2 ήταν 219 ± 72 και 342 ± 91 (μέση τιμή ± SD), αντίστοιχα? Ωστόσο, η διαφορά στον αριθμό των κηλίδων ήταν στατιστικά ασήμαντη (

p & gt?

0.05, n = 18)..

Δύο μεγάλες συστάδες μπορεί να δει

Η

Σύμφωνα με τα προηγούμενα στοιχεία μας, ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα διαχωρίζονται επίσης σε δύο ομάδες [14]: το πρώτο περιείχε δείγματα nos. 1-3, 5-12 και 23, ενώ το δεύτερο περιείχε δείγματα αρ. 13-22 (Σχήμα 1Α). Έτσι, υπήρχε ένας συσχετισμός μεταξύ ομαδοποίηση του δείγματος προέκυψε από τις δύο εντελώς διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις.

Ο δείκτης Rand ήταν 0,58, υποδεικνύοντας μια σημαντική αγώνα [27] μεταξύ των βιοχημικών και πρωτεομική δεδομένων. Μια μικρή διαφορά ανάμεσα στη σύνθεση ομάδα των δειγμάτων HLC και ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα (μεταβολίζον φάρμακο) σύστημα βρέθηκε. Οι αλλαγές αυτές ήταν ιδιαίτερα HLC δείγματα nos. 6 και 13, έχουν ανατεθεί σε σύμπλεγμα nos.