Αφηρημένο

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε αναπτύξει, χαρακτηρίζεται και να επικυρωθούν

in vitro

ένα λειτουργικό superparagmagnetic με βάση το σίδηρο-οξείδιο παράγοντα αντίθεσης μαγνητικού συντονισμού με σύζευξη ενός εμπορικά διαθέσιμου νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου, Molday ΙΟΝ ροδαμίνη-Β Καρβοξύλ (MIRB), με αποανοσοποιημένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (muJ591) στόχευσης ειδικό προστατικό αντιγόνο μεμβράνης (PSMA ). Αυτό το λειτουργικό παράγοντα αντίθεσης προορίζεται για την ειδική και μη επεμβατική ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη κύτταρα που είναι PSMA θετικός, ένας δείκτης που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου του προστάτη και τη μετάσταση. Η αντίδραση καρβοδιϊμίδιο δύο σταδίων που χρησιμοποιείται για τη σύζευξη του αντισώματος με το νανοσωματίδιο ήταν αποτελεσματική και μας δόθηκαν μία στοιχειακή περιεκτικότητα σε σίδηρο του 1958 ± 611 ανά αντίσωμα. Μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι το συζευγμένο muJ591: συγκρότημα MIRB δεσμεύεται ειδικά με PSMA-θετικά κύτταρα (LNCaP). Το muJ591: συγκρότημα MIRB μειωμένη κυτταρική προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα LNCaP και προκάλεσε απόπτωση όπως δοκιμάστηκε με τη δοκιμασία αννεξίνης V, γεγονός που υποδηλώνει αντι-ογκογόνο χαρακτηριστικά. Οι μετρήσεις του χρόνου Τ2 χαλάρωση του muJ591: συγκρότημα MIRB χρησιμοποιώντας ένα 400 MHz Innova NMR και ένα πολυ-ηχώ spin-echo ακολουθία σε 3T MRI (Achieva, Philips) παρουσίασαν σημαντική μείωση του χρόνου χαλάρωσης Τ2 για την muJ591: συγκρότημα MIRB, με μειωμένο χρόνο Τ2 χαλάρωση ως συνάρτηση της συγκέντρωσης σιδήρου. PSMA-θετικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με muJ591: MIRB παρουσίασαν σημαντικά μικρότερο χρόνο χαλάρωσης Τ2 όπως λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή 3T MRI. Η μείωση της Τ2 χρόνο χαλάρωσης για muJ591: MIRB, σε συνδυασμό με την εξειδίκευση του έναντι PSMA + LNCaP κύτταρα, υποδηλώνουν δυναμικό της ως βιολογικά-ειδικό παράγοντα αντίθεσης MR

Παράθεση:. Bates D, Αβραάμ S, M Campbell, Zehbe Ι, Curiel L (2014) Ανάπτυξη και Χαρακτηρισμός ενός αντισώματος επισημασμένου Super-παραμαγνητικά οξείδιο του σιδήρου Contrast Agent στόχευση κυττάρων του καρκίνου του προστάτη για την Μαγνητική Τομογραφία. PLoS ONE 9 (5): e97220. doi: 10.1371 /journal.pone.0097220

Επιμέλεια: Roberto Furlan, San Raffaele Επιστημονικό Ινστιτούτο, Ιταλία

Ελήφθη: 13, Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 16 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 του Μάη του 2014

Copyright: © 2014 Bates et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Ινστιτούτο του Οντάριο για την έρευνα του Καρκίνου, μέσω μια ερευνητική επιχορήγηση (10Nov-446) και των Εθνικών Επιστημών και Μηχανικής Συμβούλιο έρευνας του Καναδά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κατά τα τελευταία 10 χρόνια, η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη έχει αυξηθεί σταθερά, παραμένει η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου που διαγιγνώσκεται στους άνδρες σε όλο τον κόσμο. Μόνο στον Καναδά, αντιπροσωπεύει περίπου το 27% των νεοδιαγνωσθέντων καρκίνων το 2012 [1]. την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη και την εξάπλωση είναι συχνά πολύ αργή και θα εντοπιζόταν σε πρώιμα στάδια του καρκίνου. Τρέχουσες σχεδιασμό ανίχνευση και θεραπεία βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στη χρήση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) εκφράζοντα κύτταρα. Ωστόσο, η χαμηλή εξειδίκευση της δοκιμής αυτής έχει οδηγήσει σε υπερβολική θεραπεία της πρόωρης και λιγότερο επιθετικό καρκίνο και υπό-επεξεργασία των ανώδυνων αλλά επιθετικού καρκίνου, οδηγώντας σε υψηλή νοσηρότητα [2]. Επιπλέον, οι τρέχουσες θεραπείες έχουν υψηλή νοσηρότητα και πιθανές υποτροπές μετά τη θεραπεία, η οποία συμβιβασμός ποιότητα ζωής και την επιβίωση του ασθενούς [3], [4].

Μελέτες έχουν δείξει ότι, στρέφοντας συγκεκριμένα το ειδικό προστατικό αντιγόνο μεμβράνης (PSMA) κυττάρων που εκφράζουν, τόσο εντοπισμένη και επιθετικό συνθήκες μπορούν να θεραπευτούν [3], [5] – [17]. PSMA είναι ένα ιδιαίτερα χαρακτηριζόμενη βιοδείκτης του καρκίνου του προστάτη εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη του καρκίνου του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει τη χρησιμότητά του για

in vivo

καρκίνου του προστάτη συγκεκριμένες στρατηγικές στόχευσης [8], [9], [13] – [17]. Το γονίδιο PSMA έχει κλωνοποιηθεί, η αλληλουχία τους, και χαρτογραφηθεί στο χρωμόσωμα 11q14, και εκφράζεται σε ένα υψηλό ποσοστό των κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη, αλλά όχι στο φυσιολογικό αγγειακό ενδοθήλιο [6]. Στην πραγματικότητα, PSMA είναι το πιο καθιερωμένο εξαιρετικά περιορισμένου αντιγόνου επιθηλιακών προστάτη κυτταρική μεμβράνη, ενώ το PSA και όξινη προστατική φωσφατάση είναι εκκριτικές πρωτεΐνες [9], [17]. έχουν Ανοσοθεραπευτικοί και ανίχνευση προσεγγίσεις που χρησιμοποιούν αντι-PSMA αντισώματα έχουν προταθεί ως εξαιρετικά εργαλεία τόσο για την ανίχνευση και θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [8], [9], [13].

υποδοχείς PSMA εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στην κορυφαία μεμβράνη του πλάσματος του επιθηλίου του προστάτη και παίζουν έναν αναπόσπαστο ρόλο στην εξέλιξη των κακοηθειών του προστάτη, πιθανώς με την προώθηση αντι-αποπτωτική σηματοδότηση, εξασφαλίζοντας κύτταρο ανθεκτικότητα και την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [6], [18]. Στόχευση αυτόν τον υποδοχέα με το αντίσωμα αντι-PSMA J591 έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική ανίχνευση και θεραπευτικό εργαλείο για τον καρκίνο του προστάτη [10] – [12]. Προκειμένου να είναι κλινικά εφαρμόσιμο, το μονοκλωνικό ποντικού (mAb) αντι-υποδοχέα PSMA είναι απο-ανοσοποιημένα με αντικατάσταση αλληλουχιών ανοσοσφαιρίνης ποντικού με αλληλουχίες ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης, με αποτέλεσμα μία μη ανοσογόνο, εξανθρωπισμένο αντίσωμα, huJ591 [9], [13] – [15]. Η huJ591 mAb έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε κλινικές δοκιμές φάσης Ι, όπου έχει αποδειχθεί να είναι καλά ανεκτές χωρίς δυσμενή ανοσοαπόκριση ξενιστή [9], [14], [15].

endorectal απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) γίνεται κοινή μέρος του τοπικού έργου-up για τον καρκίνο του προστάτη. Δυναμική μελέτες χρησιμοποιώντας παράγοντες αντίθεσης γαδολίνιο-ΟΤΡΑ απέδειξαν χρήσιμη ενίσχυση των εικόνων όγκου [19] – [27]. Μη επεμβατική ανίχνευση κυττάρων που εκφράζουν PSMA-μπορούσαν ιδανικά να πραγματοποιηθεί με λειτουργική αυξημένης αντίθεσης τεχνικές MRI. παράγοντες αντίθεσης ενισχύσει την αντίθεση των ιστών με την αλλαγή φορές χαλάρωση των ιστών για τη βελτίωση της ορατότητας των δομών μέσω μαγνητικής τομογραφίας. Τέτοιες μέθοδοι ανίχνευσης απαιτούν την ανάπτυξη των λειτουργικών παραγόντων αντίθεσης MRI, για παράδειγμα συνδέοντας αντι-PSMA αντίσωμα για MRI παράγοντες αντίθεσης. Molday ΙΟΝ Rhodamine-Β Καρβοξύλ (MIRB) είναι ένα εμπορικά διαθέσιμο οξείδιο του σιδήρου που βασίζονται νανοσωματίδιο που μειώνει το χρόνο Τ2 χαλάρωση της απορρόφησης ιστών και επομένως πρέπει να ανιχνεύεται ως απώλεια του σήματος στις εικόνες MR [28], [29]. Ο πυρήνας οξειδίου του σιδήρου του νανοσωματίδιο MIRB μπορεί να ενεργοποιηθεί χημικά για να αντιδράσει με την αμινο τερματική πρωτεϊνών ή αντισωμάτων για να σχηματίσει ένα πεπτιδικό δεσμό, αποδίδοντας ένα αντίσωμα /πρωτεΐνη: MIRB συζυγούς συμπλόκου. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι MIRB μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση βλαστοκυττάρων, τα καρκινικά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος διατηρώντας υψηλές βιωσιμότητες κυττάρου και είναι ανιχνεύσιμος με MRI [28]. ευκολία MIRB της σύζευξης με πρωτεΐνες ή αντισωμάτων, υψηλή συγκέντρωση φόρτωσης του σιδήρου για την απεικόνιση MR, και καλή κύτταρο ανεκτικότητα είναι ένας καλός υποψήφιος για ένα λειτουργικό παράγοντα αντίθεσης MR αντίσωμα σημασμένο κάνουν.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει ένα λειτουργικό υπερ-παραμαγνητικά οξείδιο του σιδήρου (SPIO) -με βάση παράγοντα αντίθεσης MR που συνδέεται ειδικά σε υποδοχείς PSMA για MR απεικόνιση καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Παρουσιάζουμε μια μέθοδο για την ανάπτυξη αυτού του λειτουργικού παράγοντα αντίθεσης MR με τη χρήση ενός εμπορικά διαθέσιμου SPIO, Molday ΙΟΝ ροδαμίνη-Β Καρβοξύλ (MIRB), συζευγμένο με το J591 αντίσωμα αντι-υποδοχέα PSMA. Εμείς χαρακτηρίζεται και επικυρώνεται αυτό το αντίσωμα: συγκρότημα SPIO-νανοσωματιδίων για την ειδική ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων του καρκίνου του προστάτη θετική PSMA χρήση ανοσοφθορισμού, κυτταρομετρία ροής και 3T κλινικής MRI. νέος παράγοντας αντίθεσης μας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ειδική και μη επεμβατική ανίχνευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη με PSMA, έναν δείκτη που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου του προστάτη και τη μετάσταση [10] -. [17], [30], [31]

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα, παράγοντες αντίθεσης MR και αντιδραστήρια

ποντικού J591 mAb, σε συγκέντρωση 5 mg /ml και με γνωστή εξειδίκευση για PSMA, αγοράστηκαν από τον Dr. Neil εργαστήριο Η μπάντας του (εργαστήριο Ουρολογικής Ογκολογίας, Weill-Cornell Medical College, New York, NY, USA) μέσω ενός θεσμικού συμφωνία μεταφοράς υλικού. Το αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου για πειράματα σύνθεση και κυτταρική καλλιέργεια ήταν ένα ποντικού IgG1 (Monoclonal Mouse IgG1 κλώνος # 11711? Cat #: MAB002, R &? Συστήματα D, Minneapolis, USA) σε συγκέντρωση 5 mg /mL σε 1 × ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο χωρίς ιόντα ασβεστίου ή μαγνησίου (Cat #: SH30028.02, Hyclone Inc, Logan, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή

Molday ION ροδαμίνη Καρβοξύλια (MIRB, Cat #:. CL-50Q02-6C- 50, Biopal, Inc, Worcester, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του αντισώματος: SPIO συγκροτήματα. Όλα τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για τις αντιδράσεις σύζευξης και ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένων

N

– (3-διμεθυλαμινοπροπυλο) –

-αιθυλκαρβοδιϊμίδιο υδροχλωρικής Ν

‘(EDC), Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο (NHS), 2- (4-μορφολινο) ένυδρο αιθανοσουλφονικό οξύ (MES), όξινο ανθρακικό νάτριο, νερό ποιότητας HPLC (ChromoSolv νερού), χλωροφόρμιο, ακετονιτρίλιο, και οξείδιο του δευτερίου, αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ, Canada, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

αντισωμάτων επισήμανση

τα αντισώματα συζευγμένα με MIRB βασίζεται σε μια τροποποίηση της μεθόδου του κατασκευαστή (Cat # CL-50Q02-6C-50, Biopal, Inc, Worcester, MA, USA). Εν συντομία, MIRB (0,2 mg σιδήρου) προστέθηκε σε 100 μL muJ591 ή muIgG σε 1 mg /mL σε 1 × PBS ρυθμιστικό (ρΗ 7,65) σε αποστειρωμένους σωλήνες μικροφυγοκέντρου 1,5 ml. Το αντίσωμα με διάλυμα MIRB ήταν ελαφρά στροβιλίζεται πριν από την προσθήκη 100 μί 0,1 Μ ρυθμιστικό διττανθρακικού νατρίου (ρΗ 8,0), πάγος επωάστηκαν για 15 λεπτά με περιστασιακή περιδίνηση, τότε διατηρείται 24 ώρες στους 4 ° C σε ένα μίξερ πετάλου. Η ολονύκτια επώαση αντίσωμα: MIRB αναμίχθηκαν με 50 μι 2 mg /mL διαλύματος EDC σε απιονισμένο νερό συν 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος MES (ρΗ 5,6) και διατηρήθηκε στους 37 ° C για 5 λεπτά με περιστασιακή περιδίνηση, πριν από την προσθήκη 50 μL 2 mg /mL NHS και επώαση στους 37 ° C για περαιτέρω 15 λεπτά, με περιστασιακή ανάμιξη. Το διάλυμα στη συνέχεια ψύχθηκε σε πάγο για 15 λεπτά και διατηρήθηκε στους 4 ° C για 48 ώρες σε ένα μίξερ πετάλου. Μετά από 48 ώρες το μίγμα μεταφέρθηκε σε ένα αποστειρωμένο κωνικό σωλήνα 15 ml και ξεπλένονται δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα μι 1 χ PBS 500 να εξάγει το αντίσωμα: MIRB συζυγών επισυνάπτεται στο τοίχωμα του σωλήνα. Με σκοπό την απομάκρυνση μη δεσμευμένων αντισωμάτων, το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρθηκε σε ένα φρέσκο ​​στείρο κωνικό σωλήνα 15 ml που περιέχει 50 μι 2 mg /mL NHS συν 150 μί 0,25 Μ MES ρυθμιστικό διάλυμα και στροβιλίστηκε. Αυτός ο σωλήνας διατηρήθηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε ένα μίξερ rotator, πλύθηκε με ίσο όγκο 0.1 Μ ρυθμιστικό διττανθρακικού νατρίου (ρΗ 8.0) και φυγοκεντρήθηκε χρησιμοποιώντας 10 Κ Amicon Ultra Φυγοκεντρικοί Φίλτρα (Cat #: UFC201024, Millipore Ireland Ltd, Cork, Ιρλανδία), με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την υπερδιήθηση. Το διάλυμα διατηρείται στην στήλη διήθησης, που περιέχει το υπόλοιπο αντίσωμα: συζυγών MIRB, πλύθηκε με 0.01 Μ όξινο ανθρακικό νάτριο (ρΗ 7,65) χρησιμοποιώντας τα βήματα ανταλλαγής ρυθμιστικού που περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε ένα από τα μέσα έκλουσης αναλύθηκε για τα δύο περιεχόμενα αντίσωμα και σίδηρο χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bradford και δοκιμασία επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος φασματοσκοπία ατομικής εκπομπής (ICP-AES) με βάση, αντίστοιχα. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης των συζυγών προσδιορίστηκε με δοκιμασία πρωτείνης Bradford χρησιμοποιώντας κλίση συγκέντρωσης BSA και ανθρώπινη γ-σφαιρίνη ως πρότυπα για την έμμεση εκτίμηση της περιεκτικότητας αντισώματος.

Στοιχειακή ανάλυση περιεκτικότητα σε σίδηρο

ICP- AES χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των στοιχειακό περιεχόμενα σιδήρου των αντισωμάτων: συζυγή MIRB. Αντίσωμα: συζεύγματα MIRB ήταν οξύ πέψη χρησιμοποιώντας έναν ίσο όγκο 70% νιτρικού οξέος σε απιονισμένο νερό ποιότητας LC-MS, σε ένα τελικό όγκο δείγματος 6 mL? μόνο ένα ρυθμιστικό (αρνητικός έλεγχος) παρόμοια πέψη. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν στο Varian Vista Pro CCD ταυτόχρονη οργάνου ICP-OES (Varian Inc, Palo Alto, CA, USA).

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) και διασκορπισμού της ενέργειας με ακτίνες Χ (EDX) φασματοσκοπία

Ο συγκρότημα muJ591: MIRB ακινητοποιήθηκε πάνω σε μία μεμβράνη Nucleopore (Cat #: 800280, Whatman, Florham Park, NJ, USA) και θερμάνθηκε στους 57 ° C σε κλίβανο θερμού αέρα για 25 λεπτά για να απομακρυνθεί η υγρασία. Το συγκρότημα immoblized στη συνέχεια τοποθετήθηκε και επιστρωμένο με καθοδική διασκόρπιση με άνθρακα. SEM εικόνες αποκτήθηκαν σε 5.000 και 10.000 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα Hitachi Su-70 Schotty πεδίο εκπομπών SEM (Hitachi υψηλής τεχνολογίας America Inc, Ντάλας, Τέξας, ΗΠΑ) με ανάλυση 1.5 nm σε 1 kV. Το ίδιο σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει X-ray φασματοσκοπία διασκορπισμού της ενέργειας (EDX) σε 5000 × μεγέθυνση για να επιβεβαιώσει την παρουσία της οργανικής ύλης και νανοσωματίδια SPIO.

σωματιδίων μεγέθους ανάλυση

Το μέγεθος των σωματιδίων του muJ591: συζυγούς MIRB προσδιορίστηκε με δυναμική σκέδαση φωτός. Η muJ591: συζυγές MIRB διασκορπίστηκε σε 0.9% αλατούχο διάλυμα σε συγκέντρωση πρωτεΐνης 0,01% β /ο. Οι μετρήσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worchestershire, UK). Τα αποτελέσματα του μεγέθους των σωματιδίων έχουν αναφερθεί ως η αρμονική ένταση κατά μέσο όρο διάμετρο σωματιδίου (ή Ζ-μέσος) και εκφράζονται σε νανόμετρα.

Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) ανάλυση

Για να προσδιορίσετε αν το muJ591 : συζυγούς MIRB που παράγεται από τις αντιδράσεις επισήμανση διατήρησε τα υπερ-παραμαγνητικά χαρακτηριστικά που απαιτούνται από ένα παράγοντα αντίθεσης MR, μετρήσαμε τον χρόνο Τ2 χαλάρωσης στο NMR. Δείγματα με ίση συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης (0,04 μg /μL) του muIgG: MIRB και muJ591: σύμπλοκα MIRB ξεχωριστά παρασκευάζεται σε 600 μL του οξειδίου του δευτερίου και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες Wilmad NMR (Cat #: Z272019, Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ , ΗΠΑ). χρόνους χαλάρωσης Τ2 ελήφθησαν μετά τη βελτιστοποίηση του μαγνητικού πεδίου της μηχανής Innova Unity 500 NMR και τα δείγματα αναλύθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

φθορισμομετρική ανάλυση

Για να ελέγξετε αν η αντίδραση σύζευξης που προκαλούνται ενίσχυση φθορισμού ή απόσβεση του φθοροφόρου ροδαμίνης-B για τα προϊόντα σύζευξης MIRB πραγματοποιήσαμε μια φθορισμομετρική ανάλυση. MIRB νανοσωματίδια και muJ591: δείγματα συμπλοκών MIRB με ίση συγκέντρωση σιδήρου αναλύθηκαν για ένταση φθορισμού και το μήκος κύματος στη μέγιστη ένταση (λ

max) χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμομετρικής Synergy4 (BioTek, Winooski, VT, USA). Η κορυφή λ

max και λ

max μετατόπισης προσδιορίστηκαν με τη γραφική αναπαράσταση των τιμών έντασης φθορισμού σε διάφορα μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής.

Κυτταρική καλλιέργεια

PSMA-θετικά κύτταρα LNCaP (CRL -1740) και PSMA-αρνητικά κύτταρα DU145 (ΗΤΒ-81) έχουν αγοραστεί από την American Type Culture κυττάρων, Manassas, VA, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 37 ° C, 5% CO

2 επωαστήρα χρησιμοποιώντας RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% αντιβιοτικά /αντιμυκητιακά. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή σε 75 εκατοστά

2 εξαερώνεται καπάκι, κεκλιμένη φιάλες Falcon λαιμό (Cat #: 353136, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) με τα μέσα ενημέρωσης αναπληρώνονται κάθε τρεις ημέρες

αντίσωμα: MIRB συγκρότημα ειδικότητα για PSMA

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια αρχική συγκέντρωση του 1000 (για DU145) και 2000 κύτταρα (για LNCaP) ανά πηγάδι σε πλάκες 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες πριν από την εκτέλεση των πειραμάτων. μελέτες ανοσοφθορισμού Κατόπιν διεξήχθησαν τόσο LNCaP και DU145 μετά από θεραπεία με 0,1 μg /μL muJ591: MIRB για 1 ώρα με ή χωρίς την προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος συζευγμένου προς AlexaFluor-488 φθοροφόρο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με θερμό 0.5% BSA σε μέσο RPMI για να ενθαρρύνει τα κύτταρα να εσωτερικεύουν το αντίσωμα. Τα κύτταρα στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία (15 λεπτά, 30 λεπτά, 1 ώρα, 1.5 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, 6 ώρες και 12 ώρες) κάτω από ένα πρότυπο ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Axiovert 200, Carl Zeiss. Gottingen, Γερμανία ) που συνδέεται με ένα κλειστό κύκλωμα κάμερα (12-bit, Q-Imaging, Surrey, Canada).

μια δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με βάση μια τροποποίηση της μεθόδου που περιγράφεται από Peldschus Κ et al (2010) [ ,,,0],32]. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen, Carlsbad, CA), το οποίο αδρανοποιήθηκε με πλύση με 10% FBS RPMI-1650. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας ελεύθερο ορού RPMI-1640, πριν από την προσθήκη 250 μL muIgG, muIgG: MIRB, muJ591, muJ591: MIRB (συγκέντρωση πρωτεΐνης 0,05 μg /μL) ακολουθούμενο από 1 ώρα επώαση επί πάγου. Οι χωρίς θεραπεία έλεγχοι επωάστηκαν σε ισοδύναμο όγκο μέσου χωρίς ορό. Κυττάρων δεσμευμένο συζυγή αντισώματος σημαδεύτηκαν για ανίχνευση χρησιμοποιώντας φυκοερυθρίνη-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Cat # 550589, BD Pharmingen). Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας μία συσκευή FACSCalibur (Becton Dickson Ο Franklin Lakes, NJ, USA). μέτρηση φθορισμού δόθηκαν ως γεωμετρικοί μέσοι και διάμεσοι των 10.000 γεγονότων και σχεδιάστηκαν ως διαγράμματα. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και συγκρίναμε τη μετατόπιση έντασης του σήματος μεταξύ ακατέργαστα κύτταρα και κύτταρα επεξεργασμένα με muIgG, muIgG: MIRB, muJ591, ή muJ591:. MIRB

Η κυτταρική πρόσφυση

Η προσκόλληση κυττάρου μετά την αγωγή πλακών με muJ591 και muJ591: MIRB αξιολογήθηκε. Η muJ591: MIRB πολύπλοκες και muJ591 mAb παρασκευάστηκε σε 1 × αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) σε συγκέντρωση 0,01 μg /mL. Στη συνέχεια προεπιστρωμένες πλάκες 96-φρεατίων με 100 μλ muJ591: πολύπλοκων MIRB και muJ591 mAb εις τετραπλούν και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C για ακινητοποίηση του συμπλόκου στην επιφάνεια της πλάκας. Μετά από ολονύκτια επώαση, αναρροφήσαμε το διάλυμα και μπλοκάρει τα φρεάτια με 1% BSA σε 1 χ PBS επί τουλάχιστον 10 λεπτά και αναρροφήθηκε έξω πάλι. Μη επεξεργασμένα φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Περίπου 100.000 LNCaP ή DU145 κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται στα προεπικαλυμμένες και ελέγχου πηγάδια και επωάζονται στους 37 ° C, 5% CO

2 για 40 λεπτά. Τα κύτταρα τελικά πλένονται με RPMI-1640 χωρίς ορό μέχρις ότου τα κύτταρα στα μη επικαλυμμένα φρεάτια σταμάτησε την αποσύνδεση. Όλα τα κύτταρα μετά μονιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας παγωμένη μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες. Φιλτραρισμένο 2% SDS προστέθηκαν και οι πλάκες επωάστηκαν με ανακίνηση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, μετά τον οποίο χρόνο, αναγνώσεις απορρόφησης στα 550 nm ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πλάκας PowerWave XS (BioTek, Winooski, VT, USA). Συγκρίναμε τις μετρήσεις απορρόφησης από τις muJ591- και muJ591:. MIRB-επικαλυμμένες πλάκες σε σχέση με τα φρεάτια ελέγχου χωρίς αγωγή για την ανάλυση προσκόλλησης

πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση

Για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ένα ρεσαζουρίνη με έδρα φθορισμομετρική ανάλυση (Cat # AR002, R & amp? D Systems, Minneapolis, MA, USA) διεξήχθη. Αφού οι πλάκες 96 φρεατίων προεπικαλυμμένες με muJ591: MIRB ή 1 × αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (έλεγχος) και αποκλείστηκαν με 1% BSA όπως περιγράφηκε παραπάνω, 1.000 DU145 ή κύτταρα LNCaP 2.000 σπάρθηκαν. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι φρεάτια ελέγχου φτάσει το 80% συρροή. Τα κύτταρα LNCaP και DU145 υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αγωγή με muJ591: MIRB σύμπλοκο (0.01 μg /mL) ή μέσο ελεύθερο ορού (έλεγχος) για 1 ώρα, μετά την οποία μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο ελεύθερο ορού. Το διάλυμα ρεσαζουρίνης προστίθεται, όπως συνιστάται από το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω στους 37 ° C, 5% CO

2 για 2 ώρες ακολουθούμενο από 20 min επώαση με ανατάραξη στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Οι εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν στη συνέχεια σε 2, 6, 12 και 24 ώρες μετά muJ591:. Θεραπεία MIRB χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης πλάκας FLx800 σε διέγερση 540 nm και εκπομπή 590 nm

Για τον προσδιορισμό κυτταρικής απόπτωσης και θανάτου που προκαλείται από οι muJ591: σύμπλοκα MIRB σε κύτταρα LNCaP, μία δοκιμασία V-FITC Annexin διεξήχθη (Sigma Aldrich, St.Louis, ΜΟ, USA). Τα κύτταρα αποσπάστηκαν από τις φιάλες χρησιμοποιώντας 2 mM ΕϋΤΑ σε 1 × φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε στείρο, συμπληρωμένο μέσο, ​​και στη συνέχεια σπείρονται σε πλάκες καλλιέργειας καλά 6 σε συγκέντρωση 10.000 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μόλις τα κύτταρα έφθασαν 80-90% συρροή, muJ591: MIRB ή ελέγχου (muIgG: MIRB, 0,01 μg /mL και ελεύθερα από ορό μέσα) κατεργασία προστέθηκε στα φρεάτια για 1 ώρα ακολουθούμενη από 3 πλύσεις σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια με βάση τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Richard et al (2010) [33].

In vitro

MR απεικόνιση

Για την επικύρωση θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν αλλαγές στο ο χρόνος Τ2 χαλάρωση με μια κλινική σαρωτή MR εκτελέσαμε MR απεικόνιση των συζυγών πρώτα και στη συνέχεια προϊόν σύζευξης-κατεργασμένα κύτταρα. Η muJ591: MIRB και muIgG: σύμπλοκα MIRB, καθώς και muJ591, muIgG και MIRB μόνος ανεστάλησαν σε PBS σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0.28, 0.14, 0.07, 0.04, 0.02 και 0.01 μg /συγκέντρωση πρωτεΐνης μL για τα αντισώματα? Και 0.13, 0.06, 0.03, 0.02 μg /μL συγκέντρωση σιδήρου για την MIRB). Στη συνέχεια, 100 μι μέσο ελεύθερο ορού προστέθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (n = 3) και τοποθετήθηκε στο σαρωτή MR.

Για

in vitro

απεικόνισης MR κύτταρο, τόσο LNCaP και DU145 κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε συγκεντρώσεις 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν για 36-48 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μL αντισώματος: συζυγών MIRB ή μη συζευγμένα αντισώματα επί 1 ώρα, ξεπλύθηκαν 2 × φορές με μέσο ελεύθερο ορού, 1 × φορά με 1 χ Tris-EDTA ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, και 1 × φορές με 0,01 Μ ρυθμιστικό διττανθρακικού νατρίου για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο συζυγή, και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε 100 μL μέσο ελεύθερο ορού και τοποθετήθηκαν στο σαρωτή MR. χρησιμοποιήθηκαν MIRB και muIgG (0.28, 0.14, 0.07, 0.04, 0.02 και 0.01 μg /συγκέντρωση πρωτεΐνης μι)

Για να προσδιοριστεί το όριο των κυττάρων LNCaP ανίχνευσης ήταν: διαφορετικές συγκεντρώσεις muJ591: MIRB, muJ591, muIgG. επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων εις τριπλούν, σε συγκεντρώσεις 10

5, 7,5

5, 5

5, 2,5

5 και 1,25

5 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύχθηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 100 μL muJ591: MIRB για 1 ώρα, ξεπλύθηκε 2 × φορές με μέσο ελεύθερο ορού, 1 × φορά με 1 χ Tris-EDTA ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, και 1 × φορές με 0,01 Μ ρυθμιστικό διττανθρακικού νατρίου προς απομάκρυνση του μη δεσμευμένου συζεύξεις, πάλι σε 100 ελεύθερα μέσα ενημέρωσης μL ορού και τοποθετείται στο σαρωτή MR.

μια κλινική σαρωτή 3T MRI (Achieva 3.0T TX, Philips, Best, Ολλανδία) με μια μικρή επιφάνεια χρησιμοποιήθηκε Flex πηνίο. Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα πολυ-echo ακολουθία γύρισμα echo με χρόνους 64 ηχώ απέχουν κατά 5,8 ms (ΤΕ /TR = N * 5.8 /1245 ms, FOV = 160 mm × 160 χιλιοστά, πάχος τομής 1,5 mm μήτρα 184 × 184 απόκτηση, 384 × 384 μήτρα ανασυγκρότηση, άλλη γωνία 90 °, ETL = 32, 1 NEX, όπου N είναι ο αριθμός των ηχώ από 1 έως 64 ετών). Η ένταση ως συνάρτηση της ηχούς φορά ήταν εξοπλισμένο με: (1)

Όταν M

Ζ είναι η ένταση στην ηχώ του χρόνου ΤΕ? Α, Β και Τ2 είναι οι παράμετροι προσαρμογής [34]. Μία παραμετρική απεικόνιση του χρόνου χαλάρωσης Τ2 λήφθηκε για όλες τις εικόνες των δειγμάτων αντισώματος και κυττάρων που παράγουν αντισώματα αντιμετωπίζεται. Ο μέσος χρόνος Τ2 χαλάρωση για κάθε δείγμα αντισώματος και ζωντανών κυττάρων ελήφθη από τις τιμές Τ2 του κάθε pixel σε αυτές τις παραμετρικές εικόνες.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Graphpad Prism ( GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Όλα τα δεδομένα ελέγχθηκαν για κανονικότητα και η ομοιογένεια των διακυμάνσεων χρησιμοποιώντας μια δοκιμή Shapiro-Wilks και δοκιμή ενός Bartlett του, αντίστοιχα, πριν από την επιλογή ενός κατάλληλου παραμετρικά ή μη παραμετρική στατιστική δοκιμή. Μία προκύπτουσα τιμή ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε ότι ήταν σημαντική. Parametric σύνολα δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ του Student ή μονόδρομη ΑΝΟνΑ, που ακολουθήθηκε από μια κατάλληλη post-hoc όπως ένα Tukey HSD. Μη-παραμετρικές σύνολα δεδομένων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη Kruskal Wallis ANOVA που ακολουθείται από post hoc ενός Nemenyi, καθώς και δοκιμές Φρίντμαν που ακολουθείται από ένα ζεύγη συγκρίσεις χρησιμοποιώντας Wilcoxon signed τεστ κατάταξης με ρύθμιση Bonferroni.

Αποτελέσματα

αντίσωμα: MIRB πολύπλοκο μοριακό χαρακτηρισμό

ICP-AES χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η ποσότητα στοιχειακού σιδήρου που υπάρχει σε κάθε του συζευγμένου muIgG: MIRB και muJ591: συγκροτήματα MIRB. Παρατηρήσαμε ότι muJ591: σύμπλοκα MIRB είχε 1.958 ± 611 (η = 8) στοιχειακού σιδήρου ανά αντίσωμα ενώ muIgG: σύμπλοκα MIRB είχε 2.906 ± 631 (η = 8) στοιχειακού σιδήρου ανά αντίσωμα. Η παρουσία νανοσωματιδίων σιδήρου στο muJ591: συγκρότημα MIRB επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με φασματοσκοπία διασκορπισμού της ενέργειας με ακτίνες Χ (Σχήμα 1). Η παρουσία του σιδήρου επιβεβαιώθηκε και από μια γρήγορη Τ2 χρόνο χαλάρωσης που λαμβάνονται από την ανάλυση NMR στα 400 MHz, το οποίο ήταν 12,9 ± 0,7 ms για το muJ591: συγκρότημα MIRB και 10,2 ± 0,6 για την muIgG:. Πολύπλοκες MIRB

Α. Μικρογράφημα σάρωσης ηλεκτρονίου (SEM) του ακινητοποιημένου muJ591: σύμπλοκα MIRB και Β διασκορπισμού της ενέργειας με ακτίνες Χ (EDX) χαρτογράφηση για Fe, C, Ο και Ν προεξέχοντας πάνω από την SEM. Η παρουσία του MIRB νανοσωματίδια μπορεί να παρατηρηθεί ως σήμα σιδήρου (στερεό βέλος) και το αντίσωμα ως σήμα οργανικής ύλης (διακεκομμένη βέλος). Τα μεγάλα λευκά δομές είναι τα άλατα από το αποξηραμένο buffer

Η

Η παρουσία του muJ591:. Συγκρότημα MIRB ακινητοποιημένο σε κρυστάλλους άλατος από το ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να παρατηρηθεί στις εικόνες επιτεθειμένες EDX-SEM (Σχήμα 1). EDX χαρτογράφηση έδειξε την παρουσία άνθρακα, άζωτο και υδρογόνο που υποδηλώνει την παρουσία των οργανικών συστατικών (αντίσωμα), καθώς και σιδήρου από το νανοσωματίδιο MIRB

Τα μέσα μεγέθη σωματιδίων για το muJ591:. Συζυγών MIRB ήταν 34.75 ± 14.41 nm με τιμή δείκτη πολυδιασποράς (PDI) 0,23 ± 0,01. Για σύγκριση, πραγματοποιήσαμε μετρήσεις του μεγέθους των σωματιδίων, μόνο στα νανοσωματίδια MIRB και λαμβάνονται 34,64 ± 10,83 nm με PDI 0,25 ± 0,02 οι οποίες είναι εντός των τιμών που αναφέρονται από τον κατασκευαστή (35 nm)

Αντίσωμα:. Συγκρότημα MIRB ειδικότητα

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα PSMA θετικά LNCaP ανιχνεύθηκαν ειδικά από τον muJ591: συγκρότημα MIRB. Το Σχήμα 2 δείχνει το 2 ώρες μετά τη θεραπεία χρονικό σημείο για κύτταρα τόσο LNCaP και DU145 σε επεξεργασία με muJ591: συγκρότημα MIRB. χρώση AlexaFluor-488 επέτρεψε τον εντοπισμό του αντισώματος εντός υπο-κυτταρικών και εξωκυτταρικών περιοχών του PSMA εκφράζουν LNCaP κύτταρα (Σχήμα 2Α). Το φθοροφόρο ροδαμίνη-B (κόκκινο) που είναι συνδεδεμένη με MIRB ανιχνεύθηκε ειδικώς σε PSMA εκφράζουν LNCaP κύτταρα (Σχήμα 2C). Δεν κόκκινο ή πράσινο φθορίζοντα σήματα παρατηρήθηκαν σε κυτταρική γραμμή DU145 (Σχήμα 2Β και 2D) υποδηλώνοντας υψηλή εξειδίκευση του muJ591: συγκρότημα MIRB στην ανίχνευση PSMA-θετικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη

φθορισμού μικροσκοπία με βάση την ανίχνευση του PSMA-. θετικός προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή με muJ591: συγκρότημα MIRB: Δευτερεύουσα χρώση αντίσωμα συζευγμένο με AlexaFluor-488 δείχνει την πρόσδεση του αντισώματος J591 στο (Α) LNCaP και ότι (Β) κύτταρα ελέγχου DU145 δεν έχουν δεσμευτικό? και (C) Rhodamine-Β φθοροφόρου παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP (PSMA-θετικά) και όχι στο (D) κύτταρα DU145 (PSMA-αρνητικό).

Η

απόσβεση φθορισμού και ενίσχυση εκπομπών έχουν αναφερθεί για μέταλλο-φθοροφόρου συζυγούς συστήματα [35]. Έχουμε προσδιορίσει ότι απόσβεσης φθορισμού εμφανίστηκε στο σύστημά μας με σύγκριση της έντασης φθορισμού και της κορυφής λ

max της MIRB μόνο και muJ591: συγκρότημα MIRB (Σχήμα 3). Η λ

max για MIRB μόνο ήταν 575 nm, ενώ για την muJ591: συγκρότημα MIRB, το λ

max έδειξε δύο διακριτές κορυφές μεταξύ 560 να 575 nm. Επιπλέον, οι εντάσεις φθορισμού μεταξύ των κορυφών λ

μέγιστες τιμές ήταν 40 ± 2% χαμηλότερη για το muJ591: MIRB περίπλοκη σε σύγκριση με MIRB μόνο. Αυτή η μείωση στην μέγιστη τιμή και η μετατόπιση της κορυφής λ

max τιμές για το φθοροφόρο Rhodamine-Β δείχνουν ότι η σύζευξη μπορεί να σβήσει την ικανότητα φθορισμού ροδαμίνης-Β φθοροφόρου για το συγκρότημα.

Η επίδραση της σύζευξης αντισώματος σχετικά με την σχετική ένταση φθορισμού του συμπλόκου Molday ΙΩΝ ροδαμίνη-Β (n = 3)

Η

Η εξειδίκευση και η πρόσληψη του muJ591:. MIRB σε σύγκριση με το μη συζευγμένο muJ591 και τον έλεγχο muIgG εξετάστηκε σε ζωντανά καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. LNCaP κύτταρα κατεργασμένα με muJ591 ή muJ591: MIRB έδειξαν μια σημαντική ένταση φθορισμού μετατόπιση στο FL-2 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ή MIRB μόνο θεραπεία και οι δύο είχαν μια παρόμοια μετατόπιση (Σχήμα 4Α). Η στροφή για muJ591 και muJ591: θεραπεία MIRB των κυττάρων LNCaP δείχνουν ότι υπάρχει ειδική και υψηλή πρόσληψη του συμπλόκου αντισώματος και αντισώματος-νανοσωματιδίων από τα θετικά κύτταρα PSMA και ότι δεν αλλάζει μετά την σύζευξη με το νανοσωματίδιο. Μη ειδική σύνδεση όπως δοκιμάστηκε με την muIgG και muIgG: MIRB δεν παρατηρήθηκε (Πίνακας 1). κύτταρα ελέγχου DU145 άνευ PSMA δεν έδειξαν αλλαγή στην ένταση για οποιαδήποτε θεραπεία (Σχήμα 4Β)

Η ειδικότητα και η πρόσληψη των muJ591:. MIRB, muIgG: MIRB, muJ591 και muIgG των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. κύτταρα Α LNCaP παρουσίασε μια μετατόπιση που έδειξε πρόσληψη του muJ591 και του συζυγούς muJ591: MIRB και καμία πρόσληψη για αντισώματα των ελέγχων muIgG ή muIgG: συζευγμένο αντίσωμα MIRB. κυττάρων Β ελέγχου DU145 δεν έδειξε πρόσληψη

Η

Αντίσωμα:. MIRB πολύπλοκες λειτουργίες

Έχουμε καθορίσει την πιθανή αντι-πολλαπλασιαστική, προ-αποπτωτικών και αντι-ογκογόνο επιδράσεις της η muJ591: MIRB συζευγμένο νανοσωματίδια. Στις πλάκες επικαλυμμένες με τόσο muJ591 και muJ591: MIRB την ένδειξη απορρόφησης έδειξε μειωμένη ικανότητα προσκόλλησης σε κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν μετά την επικάλυψη (Σχήμα 5Α, ρ & lt? 0,01). Δεν υπήρξε καμία διαφορά σχετικά με την επίδραση επί κολλητικότητα μεταξύ του αντισώματος και του muJ591 muJ591: συγκρότημα MIRB (ρ = 0,7). Η επικάλυψη είχε επίσης επίδραση σε κύτταρα DU145 συγκολλητικότητα αλλά ήταν λιγότερο έντονη (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επίδραση της muJ591 αντισώματος στην κυτταρική κολλητικότητα παρέμεινε ανεπηρέαστη από την επισήμανση του αντισώματος με MIRB.

Α. Σημαντικά μειωμένη πρόσφυση σε κύτταρα LNCaP (έλεγχος τ, ** ρ & lt? 0,01, η = 4) παρατηρήθηκε ως μια μείωση στην απορρόφηση που προκαλείται τόσο από muJ591 mAb και muJ591: επίστρωση MIRB. B. Η προσκόλληση μειώθηκε επίσης με αυτή την επικάλυψη σε κύτταρα DU145 αλλά το αποτέλεσμα δεν ήταν τόσο έντονος.

Η φθορομετρικές δοκιμασίες

Η ρεσαζουρίνη με βάση εκτελείται σε 2, 6, 12, και 24 ώρες μετά τη θεραπεία προσδιορίστηκε η αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της muJ591: MIRB επί PSMA-θετικών LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μια χρονο-εξαρτώμενη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για κύτταρα LNCaP και καμία αλλαγή στην PSMA-αρνητικά κύτταρα DU145 παρατηρήθηκε (Σχήμα 6). Αυτό υποδηλώνει ότι muJ591: MIRB ήταν πολύ ειδικά για τον περιορισμό της κυτταρικός πολλαπλασιασμός των κυττάρων LNCaP

Επίδραση επί κυτταρικό πολλαπλασιασμό των LNCaP και DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα μετά muJ591:. Θεραπεία MIRB σε διαφορετικά χρονικά σημεία που λαμβάνεται σαν το κανονικοποιημένο ρεσαζουρίνη τιμή φθορισμού μονάδα (RFU) για κατεργασμένων κυττάρων έναντι των μη κατεργασμένων κυττάρων. LNCaP κύτταρα έδειξαν σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι RFU ελέγχου LNCaP κύτταρα υπό αγωγή με όχημα αρχίζοντας από το 6 h χρονικό σημείο, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στην muJ591: MIRB-επεξεργασμένα κύτταρα DU145. Student t test, * ρ & lt? 0,05 θεωρείται σημαντική, η = 4.

Η

Υπήρχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα αννεξίνης V θετικών κυττάρων στο muJ591: MIRB-κατεργασμένα κύτταρα LNCaP σύγκριση με τον μάρτυρα (όχημα ή muIgG : MIRB) αντιμετωπίζονται LNCaP κύτταρα. Το Σχήμα 7 δείχνει το ποσοστό των ζωντανών και νεκρών κυττάρων LNCaP όπως εκτιμήθηκαν από αννεξίνης V κυτταρομετρίας ροής παρουσία muJ591: MIRB και ελέγχου θεραπείες?