Abstract

Είναι γνωστό ότι η υποξία επαγόμενου παράγοντα 1 άλφα (HIF-1α) εμπλέκεται στη μετάσταση του καρκίνου, η χημειοθεραπεία και η κακή πρόγνωση. Έχουμε βρει προηγουμένως ότι η δεφεροξαμίνη, ένα υποξία-μιμητικό παράγοντα, επάγει επιθηλιακή-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) σε ορθοκολικό καρκίνο. Ως εκ τούτου, εδώ έχουμε διερευνηθούν ένα νέο μοριακό μηχανισμό για HIF-1α που συμβάλλουν στην EMT και τη μετάσταση του καρκίνου μέσω δέσμευσης σε ZEB1. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η υπερέκφραση του HIF-1α με μόλυνση αδενοϊού προωθείται EMT, κύτταρο εισβολή και τη μετανάστευση

in vitro

και

in vivo

. Σε μοριακό επίπεδο, ο HIF-1α δέσμευσης απευθείας στο εγγύς υποκινητή του ZEB1 μέσω στοιχείου απόκρισης υποξίας (HRE) θέσεις αυξάνοντας έτσι την transactivity και έκφραση του ZEB1. Επιπλέον, η αναστολή της ZEB1 ήταν σε θέση να καταργήσει την HIF-1α επαγόμενη EMT και κυτταρική διείσδυση. έκφραση HIF-1α ήταν υψηλή συσχέτιση με την έκφραση ZEB1 σε φυσιολογικό επιθήλιο παχέως εντέρου, πρωτογενών και μεταστατικών ιστών CRC. Είναι ενδιαφέρον, τόσο HIF-1α και ZEB1 συσχετίστηκαν θετικά με βιμεντίνη, ένα σημαντικό μεσεγχυματικά δείκτη του EMT, ενώ αρνητικά που συνδέονται με την έκφραση Ε-καδερίνης. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι HIF-1α ενισχύει EMT και τη μετάσταση του καρκίνου με τη δέσμευση να υποστηρικτής ZEB1 στο CRC. HIF-1α και ZEB1 είναι τόσο ευρέως θεωρείται ως παράγοντες όγκου κίνηση, αλλά τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ZEB1 είναι μια άμεση κατάντη του HIF-1α, προτείνοντας ένα νέο μοριακό μηχανισμό για HIF-1α-προκαλώντας EMT και του καρκίνου μετάσταση.

Παράθεση: Zhang W, Shi Χ, Peng Υ, Wu Μ, Zhang P, Xie R, et al. (2015) HIF-1α Προωθεί Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση και τη μετάσταση μέσω άμεση ρύθμιση των ZEB1 στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (6): e0129603. doi: 10.1371 /journal.pone.0129603

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 3η Φεβρουαρίου, 2015? Αποδεκτές: 11η Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 9 Ιούνη, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι διαθέσιμη εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81172057, 81302159), Πρόεδρος του Ιδρύματος της Nanfang Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Southern (2012C003, 2012B009), και υψηλού επιπέδου θέμα ισόποσων κονδυλίων των Nanfang Νοσοκομείο (G201227)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι ένα κρίσιμο γεγονός στη μετάσταση του καρκίνου, στη διάρκεια της οποίας πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα έχουν την τάση να αποκτήσουν ορισμένα χαρακτήρες μεσεγχυματικών κυττάρων, καθώς και πιο μετανάστευση και επεμβατική ιδιότητες [1]. Τα μοριακά hallmarkers διάρκεια ΕΜΤ περιλαμβάνουν ρυθμισμένα προς τα κάτω επιθηλιακή δείκτες (π.χ., E-cadherin, πλακοσφαιρίνης και δεσμοπλακίνη), επάνω ρυθμισμένη δείκτες μεσεγχυματικών (π.χ., βιμεντίνη, Ν-καντερίνης και α-λείου μυός ακτίνη) και αυξημένη έκφραση παραγόντων μεταγραφής τέτοιων ως σαλιγκάρι, Slug, Twist, ψευδαργύρου δάκτυλο E-box ομοιοακολουθίας πρόσδεσης 1 (ZEB1), ZEB2, και /ή Ε47, η οποία μπορεί να συνδεθεί με προαγωγό Ε-καδερίνης και αναστέλλουν τη δράση μεταγραφή του και την έκφραση [2]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η απώλεια ή η προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης θεωρείται ότι είναι η κύρια και πιο σημαντικό βήμα της EMT. E-cadherin μπορεί να σιγήσει από διαφορετικούς μηχανισμούς συμπεριλαμβανομένης της ανώμαλης μεθυλίωσης και μεταγραφική καταστολή. Μεταξύ αυτών, η ρύθμιση της μεταγραφής του ευρέως μελετηθεί σε διάφορα κακοηθών όγκων [3].

υποξία παράγοντα 1 άλφα (HIF-1α) έχει αναφερθεί για την προώθηση της EMT σε διάφορους τύπους όγκων μέσω διαμόρφωσης μιας ή περισσότερο ΕΜΤ-συνδέονται γονιδίων [4]. Ως παράγοντα μεταγραφής, ο HIF-1α ρυθμίζει τις δραστηριότητες των κατάντη γονιδίων της μέσω πρόσδεσης το στοιχείο απόκρισης υποξίας (HRE) στις περιοχές υποκινητή τους. Για παράδειγμα, ο HIF-1α είναι σε θέση να διενεργοποιεί μεταλλοπεπτιδάση μήτρα 9 (ΜΜΡ9) στον καρκίνο του μαστού [5]. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ενεργοποιεί σαλιγκάρι καταστέλλοντας έτσι την έκφραση Ε-καδερίνης [6]. Επιπλέον, ο HIF-1α ανταγωνίζεται με τον παράγοντα μεταγραφής 4 (TCF4) για απευθείας σύνδεση προς β-κατενίνης ενισχύοντας έτσι EMT σε καρκίνο του παχέος εντέρου [7]. Ως εκ τούτου, υπάρχει στενή σχέση μεταξύ EMT και την έκφραση του HIF-1α σε καρκίνο με τους μηχανισμούς άγνωστο.

ZEB1 είναι ένα κρίσιμο μεταγραφικός παράγοντας της EMT [8-10]. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ HIF-1α και ZEB1 είναι ελάχιστα γνωστό. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι HIF-1α υπερέκφραση επαγόμενη EMT και μεταστατικές φαινοτύπων σε CRC. HIF-1α ρυθμίζεται άμεσα έκφραση ZEB1 μέσω του στοιχείου απόκρισης υποξίας 3 (HRE-3), που βρίσκεται στον υποκινητή ZEB1 εγγύς. Καταστολή της ZEB1 αντιστραφεί αυτά τα αποτελέσματα που προκαλούνται από HIF-1α overexpresssion. Τα προφίλ έκφρασης του HIF-1α, ZEB1 και βιμεντίνης ήταν πολύ παρόμοιες σε ασθενείς CRC, η οποία ήταν αντίθετη με έκφραση Ε-καδερίνης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CRC εξέλιξη και τη μετάσταση, που προκαλείται από HIF-1α, διαμεσολαβείται από την άμεση ρύθμιση του ZEB1.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells και κλινικά δείγματα

CRC κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και HCT116 διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας, με την προϋπόθεση με RPMI 1640 (GIBCO) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Ανθρώπινα CRC και τα ανάλογα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από δέκα ασθενείς με CRC που υποβλήθηκαν σε κολονοσκόπηση? ανθρώπινο CRC και τα συμφωνημένα ιστούς κόμβο μεταστατικό λέμφου ελήφθησαν 30-2 ασθενείς CRC που υποβλήθηκαν σε ημικολεκτομή στο Nanfang Νοσοκομείο (Guangzhou, Κίνα). Τα άτομα αυτά μας έδωσαν την έγγραφη συγκατάθεση τους (όπως περιγράφεται στο έντυπο συγκατάθεσης PLoS) να συμμετέχουν σε αυτή τη μελέτη και δημοσιεύει αυτές τις λεπτομέρειες περίπτωση. Οι μελέτες που χρησιμοποιούν ανθρώπινους ιστούς εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από τις Επιτροπές Ηθικής Επανεξέταση της έρευνας στον άνθρωπο σε Nanfang Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Southern (Αριθμός Άδειας: NFYY-2012 έως 75).

Κατασκευή και παραγωγή ανασυνδυασμένων αδενοϊό

HIF-1α που εκφράζει πλασμίδιο, pDC316-HIF-1α-EGFP, κατασκευάστηκε με εισαγωγή του πλήρους μήκους ΗΙΡ-1α cDNA εντός των θέσεων περιορισμού μεταξύ NheI και NotI ενδονουκλεάσες του φορέα έκφρασης pDC316 που περιείχε EGFP (pDC316-EGFP). Για σταθερή knockdown του ZEB1, οι ακόλουθες αλληλουχίες κλωνοποιήθηκαν σε pDC316-HIF-1α-EGFP. shZEB1 εμπρός: 5′-GATCCCCAGATGATGAATGCGAGTCGttcaagagaTGACTCGCATTCATCATCTTTTTTGGAAA-3 ‘και αντίστροφος shZEB1: 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATGATGAATGCGAGTCAtctcttgaaCGACTCGCATTCATCATCTGGG-3’ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Αμφότερα τα πλασμίδια επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA.

Όλα αδενοϊούς, συμπεριλαμβανομένων του αδενοϊού 5 που εκφράζουν HIF-1α (Ad5-HIF-1α), HIF-1α υπερέκφραση και ZEB1 knockdown (Ad5-HIF-1α-shZEB1) και το ελέγχου, Ad5-EGFP, παρήχθησαν χρησιμοποιώντας AdMax σύστημα συσκευασίας αδενοϊού (Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canada) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μεγάλης κλίμακας ενίσχυση των παραπάνω αδενοϊικών φορέων διεξήχθησαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ με ομόλογο ανασυνδυασμό μεταξύ ενός πλασμιδίου μεταφοράς (pDC316) και ένα πλασμίδιο ραχοκοκαλιά (pBHGlox_E1, 3Cre). Τίτλοι των καθαρισμένων ιών προσδιορίστηκαν με πρότυπη δοκιμασία σχηματισμού πλάκας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Virapur, San Diego, CA).

λοιμώξεων αδενοϊού in vitro

ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή. Μετά από πλύσιμο με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), τα κύτταρα επωάστηκαν με Ad5-EGFP και Ad5-HIF-1α σε ΜΟΙ 0.1, 1, 10, 100 και 1000, αντίστοιχα. Ενενήντα λεπτά μετά την μόλυνση, οι ιοί αντικαταστάθηκαν από κανονικό μέσο ανάπτυξης. 24 ή 48 ώρες μετά τη μόλυνση, η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής του EGFP έκφραση κατασκευασμάτων παρατηρήθηκε υπό ανοσοφθορισμού μικροσκοπία και HIF-1α έκφραση αναλύθηκε με PCR ή στύπωμα Western.

Αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) , Ομαηίαύνβ πραγματικού χρόνου PCR (qPCR) και ανάλυση Western Blotting

Αυτές οι δοκιμασίες έγιναν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27-29]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για RT-PCR ήταν ως εξής: HIF-1α νόημα: 5′-TCCATGTGACCATGAGGAAA-3 ‘και αντινόημα: 5′-CCAAGCAGGTCATAGGTGGT-3′? εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qPCR ήταν ως ακολούθως: HIF-1α: 5’- TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA -3 ‘(νοηματικό) και 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG -3′ (αντινοηματικό)? ZEB1: 5’-CCTGTCCATATTGTGATAGAGGC-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ACCCAGACTGCGTCACATGT-3′ (antisense)? αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH): 5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’ (antisense). Τα πρωτογενή αντισώματα, HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton, CO), ZEB1 (Santa Cruz), E-cadherin (Santa Cruz), βιμεντίνη (προαραιωμένο, Abcam), πλακοσφαιρίνη (Abcam), Ν-cadherin (Santa Cruz) και GAPDH (Abcam) ήταν όλοι εμπορικά προϊόντα.

μετανάστευση, εισβολή και δοκιμασίες επούλωσης τραυμάτων

χωρίς επίχριση Costar transwells (Corning Costar Co., Corning, ΝΥ) χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες μετανάστευσης και επικαλυμμένα με Matrigel transwells (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) που χρησιμοποιούνται για τις δοκιμασίες εισβολής. Τα κύτταρα στερήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας στον ορό και στη συνέχεια σπείρονται εντός του άνω θαλάμου με RPMI 1640 χωρίς ορό. RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει κατά πλάτος της μεμβράνης transwell χρωματίστηκαν και ποσοτικοποιούνται. Για την δοκιμασία επούλωσης πληγών, το μηδέν έγινε κατά μήκος της κυτταρικής μονοστιβάδας χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη άκρη. Η ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν παρακολουθήθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο

Ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση

αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Και ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκαν όπως προηγουμένως περιγράφεται [28]. Εν συντομία, τα δείγματα μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για όλη τη νύχτα και στη συνέχεια τοποθετούνται σε παραφίνη κερί. Τα τμήματα κόπηκαν με πάχος 5 μm και χρωματίστηκαν με Η &? Ε για ιστολογική ανάλυση. ανάλυση IHC διεξήχθη για την έκφραση του HIF-1α, ZEB1, Ε-καδερίνη και βιμεντίνης. Ο ιστός στον οποίο & gt? 10% των καρκινικών κυττάρων που χρωματίστηκαν θετικά θεωρήθηκε ως θετική. Για την ποσοτική ανάλυση, η αναλογία των θετικά χρωσμένων κυττάρων σε όλα τα κύτταρα του όγκου σε πέντε τυχαία περιοχών σε 200-πλάσια μεγέθυνση υπολογίστηκε. Όλες οι ιστολογικές αξιολογήσεις, συμπεριλαμβανομένων του ποσοστού των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκαν σε διπλά τυφλό τρόπο από δύο παθολόγους για να ελαχιστοποιηθεί παρατηρητική προκατάληψη.

Κινητικότητα ηλεκτροφορητικής Shift Δοκιμασία (EMSA)

EMSA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει μια αλληλουχία πρόσδεσης συναίνεσης για την HIF-1α όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27, 28]. Οι ακόλουθες αλληλουχίες των κλώνων νόημα χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμασίες σύνδεσης και ανταγωνισμού: αλληλουχίες που περιέχουν άγριου τύπου HRE (P1: 5′- GAGGCGTGGGACTGATGGTAGCC -3 ‘, -521 ~ -517 nt? P2: 5′- GGGGGCGGACACGCGAGG -3′ -529 ~ – 525 nt? Ρ3: 5’-CCGGTCGCCGCGTGTCCTCGCC -3 ‘, -634 ~ -630 nt? Ρ4: 5′-ATACTCCGGTCACGTTTCAGTTTTCTC -3’, -1347 ~ -1342 nt) και τα ανάλογα μεταλλαγμένες αλληλουχίες HRE (P1-mut: 5 ‘ – GAGGCACAGGACTGATGGTAGCC -3 ‘? P2-mut: 5′-GGGGGCGGATGTGCGAGG -3′? Ρ3-mut: 5’-CCGGTCGCCGCACATCCTCGCC -3 ‘και Ρ4-mut: 5′-ATACTCCGGTTGTGTTTCAGTTTTCTC -3’). Τα νουκλεοτίδια άκρο σημασμένο με [γ-32Ρ] ΑΤΡ (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Fremont, CA) και Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης (Promega). Πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα μολυσμένα με Ad5-HIF-1α-EGFP και τον έλεγχο παρασκευάσθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε EMTs όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Και επωάστηκαν σε 1 × ρυθμιστικό σύνδεσης που περιέχει 2,5% γλυκερίνη, 50 ng /μl πολυ (dI-dC), 5 mM MgCl2, 0.05% Nonidet Ρ-40, και 4 pmol βιοτίνης επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Τα δεσμευμένα μίγματα ήταν κλασματώθηκε κατά μέγεθος επί ενός μη μετουσιωτικές 6% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου στα 180 V σε 0.5 χ ΤΒΕ ρυθμιστικό. Η πηκτή στη συνέχεια ξηραίνεται και αυτοραδιογραφήθηκε.

Δημιουργία πλασμιδίων έκθεση, Παροδική επιμόλυνση και Λουσιφεράσης δοκιμασία

Παραγωγή άγριου τύπου και μεταλλαγμένων κατασκευασμάτων ρεπόρτερ διεξήχθη όπως περιγράψαμε προηγουμένως [29]. Ένα 567 bp θραύσμα του υποκινητή ZEB1 που περιέχει το στοιχείο HRE-3 κλωνοποιήθηκε σε φορέα pGL3 για να δημιουργηθεί το κατασκεύασμα άγριου τύπου ανταποκριτή, που ονομάζεται ως pLuc-567. Μετάλλαξη στο HRE-3 μοτίβα (pLuc-567-mut) εισήχθη εντός pLuc-567 λουσιφεράσης κατασκεύασμα με την QuikChange τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jalla, CA, USA). Αμφότερα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad5-ΕΟΡΡ ή Ad5-HIF-1α για 48 ώρες που ακολουθείται από επιμόλυνση με pLuc-567 ή pLuc-567-mut και pRL-CMV (

Renilla

λουσιφεράσης). Το δυναμικό μετενεργοποίηση ελέγχθηκε με το Dual-Glo Σύστημα Δοκιμασίας Λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) με μέτρηση της δραστικότητας της λουσιφεράσης μετά 48 ώρες.

Γυμνά ποντίκια και δοκιμασία μετάστασης

Αυτό το πείραμα ζώο ήταν πραγματοποιούνται αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις του Οδηγού για την IACUC (Θεσμικές φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση), και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Nanfang Νοσοκομείο (Αριθμός άδειας: NFYY-2013-56) . Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγιναν κάτω από αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Μετά την επέμβαση, όλοι οι γυμνοί ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου. Ηλικίας έξι εβδομάδων θηλυκά BALB /c γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από Guangdong Provincial Πειραματικό Κέντρο Ζώων (Guangzhou, Κίνα) και διαιρέθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (Ad5-EGFP: N = 8? Ad5-HIF-1α: Ν = 12? Ad5- HIF-1α-shRNA: Ν = 5? Ad5-HIF-1α-shZEB1: Ν = 5) πριν από την ένεση. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ενδοπεριτοναϊκή αναισθησία με kg αμοβαρβιτάλη διάλυμα 40 mg /νατρίου. Μετά τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν βαθιά, μια μικρή διαμήκης τομή άνω αριστερό πλευρό έγινε και η σπλήνα απαλά εκτεθειμένη. Ενιαία αιωρούμενα κύτταρα (1,5 χ 106 κύτταρα /ποντικό) εγχύθηκαν σε 70 μΐ PBS κάτω από την κάψουλα σπλήνα. Μετά την απομάκρυνση της βελόνας, το σημείο της ένεσης πιέστηκε με ασηπτική βαμβάκι σφουγγάρι για να αποτραπεί διαρροή. Μετά από αυτό, η σπλήνα επεστράφη σε κοιλιακή κοιλότητα και η periotneium και κοιλιακό τοίχωμα ράφτηκαν με μεταξωτό [30-32]. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 5 εβδομάδες, η πιθανότητα μετάστασης αναλύονται και τα μεταστατικές θέσεις συλλέχθηκαν για Η &?. Ε χρώση και δοκιμασία qPCR

Στατιστική ανάλυση

Η ανάλυση έγινε με τη χρήση GraphPad Prism 6 λογισμικού. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών προσδιορίστηκε από Φοιτητών

t-test

. Όλες οι αναλύσεις ήταν δύο όψεων, σε συνδυασμό (για IHC αποτελέσματα σε κλινικά δείγματα) ή αταίριαστο και ένα

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

HIF-1α υπερέκφραση επαγόμενη EMT in vitro

Για να πάρετε μια καλύτερη αποτελεσματικότητα μόλυνση αδενοϊούς σε καρκινικές κυτταρικές σειρές CRC, ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα πρώτα σε μεταγωγή με αδενοϊό 5 εκφράζει ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Ad5-ΕΟΡΡ) ή Ad5-HIF-1α-EGFP στην πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 10, 100 και 1000, αντίστοιχα, με τις συνέπειες που καταγράφονται από μικροσκοπία επί 48 ώρα (Σχήμα 1Α). Σχεδόν το 100% των κυττάρων εξέφρασαν EGFP με ΜΟΙ 100, η ​​οποία ήταν πολύ παρόμοια με μια ΜΟΙ 1000. RT-PCR (Σχήμα 1Β αριστερά) και στύπωμα Western (Σχήμα 1Β δεξιά) τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τη δραματική αύξηση της έκφρασης HIF-1α . Ίδιο αποτέλεσμα βρέθηκε σε κύτταρα HCT116 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, η ΜΟΙ 100 εκδόθηκε σε όλα τα ακόλουθα πειράματα.

(Α) κύτταρα ΗΤ29 υποβλήθηκαν σε μεταγωγή με Ad5-HIF-1α στο υποδεικνυόμενο ΜΟΙ τιμές για 48 ώρες. Η ένταση φθορισμού και φωτεινό πεδίο στην ίδια περιοχή παρατηρήθηκαν κατά την αρχική μεγέθυνση 100Χ ως. (Β) mRNA (αριστερά) και πρωτεΐνη (δεξιά) εκφράσεις του HIF-1α ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR και στυπώματος western, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Cell μορφολογία του άγριου τύπου ΗΤ29 ή ΗΤ29 κύτταρα μεταδιεγείρονται με τις υποδεικνυόμενες αδενοϊούς (Αρχική μεγέθυνση = 400Χ). (Δ) Ανάλυση Western blot του HIF-1α, E-cadherin, πλακοσφαιρίνη, βιμεντίνη και Ν-καδερίνης σε ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα μολυσμένων με αδενοϊό. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Ε) Διπλώστε την αλλαγή της εισβολής και της μετανάστευσης στα υποδεικνύεται κύτταρα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων δίδεται στον ραβδόγραμμα με μέσο ± SD. *

P

& lt? 0.05. (F) Πληγή δοκιμασία επούλωσης. μονοστοιβάδες κυττάρων χαραχθεί με ένα ρύγχος πιπέτας και οι εικόνες λήφθηκαν 0, 24 και 48 ώρες μετά το σχηματισμό της πληγής. *

P

& lt? 0.05.

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν παρατηρώντας αδενοϊό κυττάρων που έχουν μολυνθεί, βρήκαμε ΗΤ29-Ad5-HIF-1α κύτταρα ήταν πολύ περισσότερο ατρακτοειδή, όπως fibrobalsts, σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου ΗΤ29 τα οποία ήταν γύρο με καλά προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (Σχήμα 1 C). Η παραπάνω μετάβαση της μορφολογίας των κυττάρων στην πραγματικότητα ήταν, όπως το ίδιο ως η μεταβολή στην διαδικασία EMT. Ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα εντόπισε τις εκφράσεις των δεικτών EMT και διαπίστωσε ότι το E-cadherin και πλακοσφαιρίνη, δύο σημαντικές επιθηλιακά δείκτες της EMT, ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε Ad5-HIF-1α-μολυσμένα ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου τους. Αντιθέτως, τα μόρια μεσεγχυματικά, βιμεντίνη και Ν-καδερίνης ήταν ραγδαία αυξημένο μετά την μόλυνση Ad5-HIF-1α-EGFP (Σχήμα 1 D). Επιπλέον, η αύξηση της εισβολής και της μετανάστευσης (κρίσιμο γνωρίσματα του ΕΜΤ φαινότυπος) και των δύο κυτταρικών σειρών με HIF-1α υπερέκφραση ανιχνεύθηκε επίσης (Σχήμα 1 Ε). Σταθερά, το τραύμα δοκιμασία επούλωσης απέδειξαν ότι το πλάτος σε ΗΤ29-Ad5-HIF-1α κύτταρα ήταν πολύ πιο περιορισμένο από εκείνο στα κύτταρα ΗΤ29-Ad5-EGFP στις ενδεικνυόμενες οικόπεδα ώρα, αντίστοιχα (Σχήμα 1 F). Τα ανωτέρω ευρήματα υποδεικνύουν ότι HIF-1α υπερέκφραση προκαλεί ΕΜΤ και προάγει εισβολή και τη μετανάστευση στις κυτταρικές σειρές CRC.

HIF-1α υπερέκφραση προωθείται μετάσταση in vivo

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της HIF-1α υπερέκφραση επί μετάστασης καρκίνου

in vivo

, ΗΤ29 κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με Ad5-HIF-1α-ΕΟΡΡ ή Ad5-EGFP, αντιστοίχως, σε ΜΟΙ 100. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, εναιωρήματα μονών κυττάρων συλλέχθηκαν και εγχύθηκαν σε BALB /c γυμνά ποντίκια μέσω ενός subsplenic μεθόδου. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2α, πολλαπλές ενδοηπατική οζίδια όγκου εύκολα επιθεωρήθηκαν χονδροειδώς στην ομάδα Ad5-HIF-1α-EGFP ένεση, ενώ λιγότερο ή ακόμα και καθόλου οζίδια βρέθηκαν σε ποντίκια ελέγχου. Για να επιβεβαιωθεί η παραπάνω διαφορά, εξετάσαμε Η &? Χρώση Ε και βρέθηκε πολύ πιο αναπτυγμένες περιοχές βασεόφιλα όγκου σε ήπατα από ποντικούς που ενέθηκαν με ΗΤ29-Ad5-HIF-1α κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β. ανάλυση Ποσότητα έδειξε ότι μία σημαντική αύξηση (5,3 φορές) από μετάσταση στο ήπαρ παρατηρήθηκε στην ομάδα Ad5-HIF-1α-με έγχυση, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2C). Real-time PCR αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το επίπεδο της HIF-1α σε αλλοιώσεις του ήπατος από ποντικούς που έλαβαν ένεση με ΗΤ29-Ad5-HIF-1α ήταν πολύ υψηλότερη από ότι ένεση με ΗΤ29-Ad5-EGFP (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση του HIF-1α προάγει μετάσταση στο ήπαρ του CRC σε ζωικό μοντέλο

Αντιπροσωπευτικά φωτογραφικές εικόνες (Α) και Η &?. Ε χρώση (Β) του ήπατος των ποντικών BALB /c πέντε εβδομάδες μετά subsplenic ένεση των κυττάρων ΗΤ29 μεταγωγή με Ad5-HIF-1α ή ελέγχου ιών. Λευκά βέλη υποδεικνύονται μεταστατικά οζίδια. (Γ) Η σύγκριση των ηπατικών μεταστάσεων μεταξύ ΗΤ29-Ad5-HIF-1α ποντικών (Ν = 12) και ελέγχου ποντικών (Ν = 8). *

P

& lt? 0.05. (D) Επιβεβαίωση της υπερέκφρασης του HIF-1α από μεταστατικά οζίδια σε ποντικούς που ενέθηκαν με Ad5-HIF-1α με qPCR, σε σύγκριση με εκείνους ένεση με ιούς ελέγχου.

Η

HIF-1α ρυθμισμένη έκφραση ZEB1

Τόσο HIF-1α και ZEB1 έχουν εμπλακεί στην μετάσταση καρκίνου και EMT [4, 9, 11]. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν HIF-1α υπερέκφραση είχε επίδραση στην έκφραση της ZEB1. Πράγματι, προς τα πάνω ρύθμιση του mRNA και της πρωτεΐνης επίπεδα ZEB1 έγινε βρέθηκε συνοδεύτηκε με την υπερέκφραση του HIF-1α σε κύτταρα ΗΤ29, όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α & amp? 3Β. Επιπλέον, οι τάσεις του HIF-1α και έκφραση ZEB1 σε κυτταρικές σειρές CRC (SW480, HCT116, ΗΤ29, LoVo και DLD1) ήταν αρκετά παρόμοια (Σχήμα 3C). Συνέπεια, η διαπίστωση αυτή παρουσιάστηκε επίσης σε ζεύγη δειγμάτων CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του επιθηλίου του παχέος εντέρου που είχαν εντοπιστεί από κηλίδα western και χρώση IHC (Σχήμα 3D & amp? 3Ε). Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα και των δύο πρωτεϊνών ήταν πολύ υψηλότερες σε όγκο από ότι σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. Σε κυτταρικό επίπεδο, τόσο HIF-1α και ZEB1 εκφράστηκαν κυρίως στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, ιδιαίτερα στον πυρήνα, οι οποίες ήταν θεωρητικά συνεπής με τη θέση των τοποθεσιών του παράγοντα μεταγραφής. Και επίσης, οι παρατηρήσεις τους συν-εντοπισμό αποκαλύπτουν ότι HIF-1α μπορεί να αλληλεπιδράσει με ZEB1 σωματικά.

(Α) ενδογενή επίπεδα έκφρασης του HIF-1α και ZEB1 στις ενδεικνυόμενες πέντε κυτταρικές σειρές ανιχνεύθηκαν με qPCR με GAPDH χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος. (Β & amp? C) κύτταρα ΗΤ29 υποβλήθηκαν σε μεταγωγή με Ad5-HIF-1α ή ελέγχου ιών για 48 ώρες, μετά από qPCR και στύπωμα western για την ανίχνευση της έκφρασης του HIF-1α και ZEB1. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. επίπεδα (D) HIF-1α και πρωτεΐνη ZEB1 σε συμφωνημένα απλαστικών /καρκινικούς ιστούς παχέος. N: κανονικό? Τ: όγκου. Το επίπεδο της κάθε πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε έναντι GAPDH. (Ε) Εκπρόσωπος εικόνες της κηλίδωσης για τα ανθρώπινα CRC δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη που καθορίζεται για HIF-1α και ZEB1. Αριστερό πάνελ έδειξε τα γειτονικά κανονική του παχέος ιστούς. Δικαίωμα πίνακα έδειξε δείγματα CRC. Αρχική μεγέθυνση, 200X.

Η

Κανονισμός του ZEB1 από HIF-1α μέσω της HRE-3

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον ZEB1 ρυθμίζεται άμεσα από HIF-1α, οι αλληλουχίες υποκινητή της ZEB1 αναλύθηκαν με μεθόδους βιοπληροφορικής. Βρήκαμε ότι υπήρχαν τέσσερις πιθανές τοποθεσίες HRE στο εγγύς υποκινητή (~ 3500 nt ανοδικά? Το κωδικόνιο έναρξης ATG ορίζεται ως 0) του γονιδίου ZEB1 (Σχήμα 4Α). Υπήρχαν HRE-1 σε -517 ~ -521 nt? HRE-2 σε -525 ~ -529 nt? HRE-3 σε -630 ~ -634 nt και HRE-4 στα -1342 ~ -1347 nt. Με βάση αυτά, ανιχνευτές Ρ1, Ρ2, Ρ3 και Ρ4 με θέσεις άγριου τύπου και μεταλλαγμένες HRE σχεδιάστηκαν, αντίστοιχα, όπως περιγράφεται στις μεθόδους και τα υλικά. Τα αποτελέσματα του ποσοτικού προσδιορισμού EMSA αποκάλυψε ότι HIF-1α πρόσδεσης αυξήθηκε σημαντικά μετά από επώαση των πυρηνικών εκχυλισμάτων από ΗΤ29-Ad5-HIF-1α κυττάρων με το HRE-3-ολιγονουκλεοτιδίου που περιέχει από ZEB1 προαγωγό (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, υπήρχαν μόνο πολύ μπάντες εβδομάδες ή ακόμη και καμία ταινία παρουσιάζονται σε κύτταρα ΗΤ29-Ad5-HIF-1α ή άλλα κύτταρα ελέγχου με το HRE-1, 2 ή 4-ολιγονουκλεοτιδίου που περιέχει (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, ο ανταγωνισμός για HIF-1α πρόσδεσης με μη επισημασμένα ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν HRE-3 και ανιχνευτών που περιέχουν μεταλλαγμένα HRE-3 δεν έδειξαν καμία ζώνες HIF-1α δέσμευσης (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι HIF-1α ήταν σε θέση να δεσμεύει υποκινητή ZEB1 μέσω HRE-3 θέση.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του εγγύς υποκινητή (~ 3500 nt ανοδικά) του γονιδίου ZEB1. HRE: στοιχείο απόκρισης υποξίας. (Β) ολιγονουκλεοτίδια για EMSA ήταν άγριου τύπου (λωρίδα 1-3) και μεταλλαγμένων (λωρίδα 4-5) καθετήρας 3 από τον υποκινητή ZEB1, που περιείχε μια συναινετική HRE-3. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται από ΗΤ29-Ad5-HIF-1α (λωρίδα 3 και 5) ή κύτταρα ελέγχου (λωρίδα 2 και 4) επωάστηκαν με [γ-32Ρ] ΑΤΡ-σημασμένο ανιχνευτή πριν από την ηλεκτροφόρηση. Αρνητικός έλεγχος διεξήχθη με ανιχνευτή άγριου τύπου χωρίς πυρηνικό εκχύλισμα (διαδρομή 1). (C) Σχηματική αναπαράσταση της περιοχής του υποκινητή του ZEB1 και τα κατασκευάσματα έκθεση χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα με αδενοϊό μολυνθεί. Τα κατασκευάσματα περιείχαν άγριου τύπου (pluc567-wt) ή μεταλλαγμένου (pluc567-mut) HRE-3 που βρίσκεται -634 ~ -630 nt ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής του ZEB1. (Δ) Η ενεργοποίηση του plu567 ή pluc567-mut σε Ad5-EGFP μολυσμένα κύτταρα ΗΤ29 (πειράματα Ν = 3 επαναληπτικές) Ad5-HIF-1α- ή. *,

#

P

& lt? 0.05.

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η επίδραση του HIF-1α υπερέκφραση σχετικά με τη δραστηριότητα της μεταγραφής του ZEB1. Με βάση τα αποτελέσματα της EMSA, ενός πλασμιδίου που περιέχει προαγωγό HRE1-3 (pluc567) και την τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση του HRE-3 πλασμίδιο (pluc567-mut) δημιουργήθηκαν και παροδικά επιμολυσμένα σε κύτταρα ΗΤ29 τα οποία ήταν προ-επωάστηκαν με Ad5-HIF -1α ή Ad5-EGFP για 24 ώρες, δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης έδειξε ότι η δραστηριότητα των pluc567 σε ΗΤ29-Ad5-HIF-1α κυττάρων αυξηθεί περισσότερο από 5 φορές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, ενώ η μεγέθυνση αποικοδομήθηκε σημαντικά με pluc567-mut διαμόλυνση (σχήμα 4Γ & amp? 4D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι HIF-1α ενεργοποιούνται ZEB1 απευθείας με σύνδεση προς τη θέση HRE-3 στον υποκινητή ZEB1 εγγύς.

ZEB1 είναι κρίσιμη για HIF-1α-επαγόμενη EMT και μετάσταση

Για την ανίχνευση αν ZEB1 απαιτείται για HIF-1α-επαγόμενη EMT και μεταστατικό φαινότυπο, δημιουργήσαμε ένα πλασμίδιο με HIF-1α που εκφράζουν και ZEB1 knockdown, και στη συνέχεια συσκευάζεται σε αδενοϊό (Ad5-HIF-1α-shZEB1). Επειδή το ενδογενές επίπεδο του ZEB1 σε κύτταρα ΗΤ29 ήταν πολύ χαμηλότερη από ότι στα κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3C, δεξιά), το οποίο ήταν σύμφωνο με τα επίπεδα πρωτεΐνης τους σε προηγούμενα δεδομένα μας [12]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HCT116 διορίστηκαν για να εκτελέσει όλες τις ZEB1 νοκ ντάουν πειράματα.

In vitro

, τα κύτταρα HCT116 μετήχθησαν με Αά5-HIF-1α-shZEB1 και Ad5-HIF-1α, αντίστοιχα . δοκιμασίες κηλίδος, εισβολή και τη μετανάστευση Western διεξήχθησαν μετά από 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν upregualted και έκφραση βιμεντίνης ήταν μειωτικά συνοδεύτηκε με την knockdown του ZEB1. Συνέπεια, η εισβολή και η μετανάστευση ικανότητες μειώθηκαν κατά 34% και 45%, αντίστοιχα.

In vivo

, παρατηρήσαμε πολλαπλές οζίδια όγκου επί της επιφανείας του συκωτιού και του Η &? Χρώση Ε έδειξε βασεόφιλα περιοχές όγκου σε ήπατα ποντικών που ενέθηκαν με HCT116-Ad5-HIF-1α κύτταρα. Αντίθετα, τα ζώα εγχύθηκαν με κύτταρα HCT116-Ad5-HIF-1α-shZEB1 είχε μειωθεί δραματικά φορτία όγκου με τη μείωση του αριθμού και του μεγέθους των υπολειμματικών φωλιές όγκου, που συνοδεύεται με μεγαλύτερη μάζα νέκρωση με περιοχή φλεγμονή (Σχ 5D & amp? 5Ε).

ανάλυση

(Α) Western στύπωμα της ZEB1, Ε-καδερίνης και βιμεντίνης σε HCT116-Ad5-HIF-1α ή κύτταρα HCT116-HIF-1α-shZEB1. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εισβολή (Β) και τη μετανάστευση (C) δοκιμασίες διεξήχθησαν στις ίδιες δύο κυτταρικές σειρές. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των εισέβαλαν κυττάρων στα ένθετα του επικοινωνούντα δοχεία δείχθηκε στην αρχική μεγέθυνση 200Χ =. *

P

& lt? 0.05. (D) Αντιπροσωπευτική φωτογραφικές εικόνες και Η &? Ε χρώση του ήπατος των ποντικών BALB /c 5 εβδομάδες μετά την ένεση subsplenic HCT116-Ad5-HIF-1α ή κύτταρα HCT116-HIF-1α-shZEB1. (Ε) Ποσοτικοποίηση των μέσων αριθμών των μεταστατικών εστιών στα ήπατα των ποντικών (Ν = 5). *

P

& lt? 0.05.

Η

Η έκφραση του HIF-1α, ZEB1, E-cadherin και βιμεντίνης στην πρωτοβάθμια και μεταστατικό δείγματα CRC

Για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ των HIF-1α, ZEB1 και EMT βασικούς δείκτες στην κλινική ιστούς, χρώση IHC διεξήχθη σε 32 ζεύγη δειγμάτων πρωτογενών και μεταστατικών CRC λεμφαδένα (Σχ 6Α). Το μέσο ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων σε όλα τα κύτταρα του όγκου σε κάθε ιστό αξιολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο ερευνητές, όπως περιγράφεται στα υλικά και στην μέθοδο. Βρήκαμε ότι τα ποσοστά των δύο HIF-1α- και ZEB1-θετικά κύτταρα CRC ήταν περισσότερο από 65%, ενώ το ποσοστό σε μεταστατικό λεμφαδένα αυξήθηκε περίπου σε 86% για HIF-1α και 78% για ZEB1 (Σχήμα 6Β). Την ίδια στιγμή, το επίπεδο των βιμεντίνης ήταν επίσης αρκετά υψηλή και στις δύο πρωτογενείς και μεταστατικούς ιστούς? αν και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ αυτών των δύο ομάδων. Για το E-cadherin, το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων E-cadherin-θετικά σε πρωτογενείς ιστούς CRC ήταν περίπου 29%, ενώ μειώθηκε σημαντικά σε 12,7% σε μεταστατική ομάδα (Σχήμα 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τις παρατηρήσεις μας με τις κυτταρικές σειρές CRC που HIF-1α έκφραση σχετίζεται θετικά με ZEB1 και βιμεντίνης, και αρνητικά που συνδέονται με την E-cadherin, και HIF-1α και ZEB1 μπορούν να συμβάλλουν διαφορικά στην EMT και μετάσταση.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες του IHC (Α) και ποσοτικοποίηση των θετικών κυττάρων όγκου (Β) και στα δύο πρωτογενή δείγματα CRC και ο σύμφωνα μεταστατικό λεμφαδένα. Αρχική μεγέθυνση, 200X. *

P

& lt? 0,05 και

#

P

& gt? 0.05.

Η

Συζήτηση

Ένας από τους βασικούς τρόπους για τη θεραπεία του καρκίνου είναι η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών για την ογκογένεση και τη μετάσταση του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, αποκάλυψε ότι ZEB1 είναι μεταγενέστερος στόχος του HIF-1α και έχει ένα κρίσιμο ρόλο στην ΕΜΤ και μεταστατικούς φαινοτύπους που προκαλείται από υπερέκφραση του HIF-1α. Προτείνουμε ότι HIF-1α συνδέεται άμεσα με τον υποκινητή του ZEB1 και χρησιμεύει ως κρίσιμη θετικός ρυθμιστής της, προωθώντας έτσι την ΕΜΤ και μετάσταση καρκίνου. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο HIF-1α ρυθμίζει την εξέλιξη του όγκου και την εισβολή.

HIF-1α έκφραση συνήθως ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλά κακοήθεις όγκους, και πολλές δημοσιεύσεις έχουν αναφέρει την στενή σχέση μεταξύ της έκφρασης του HIF-1α και αυξημένη επιθετικότητα και υψηλότερη μεταστατική ικανότητα των ωοθηκών, του μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη, του παχέος εντέρου και του παγκρέατος καρκινώματα [11-14]. Για μοριακό επίπεδο, HIF-1α ασκεί τη βιολογική του λειτουργία μέσω ενεργοποίησης γονιδίων-στόχων, όπως σαλιγκάρι, Twist και TCF3, τα οποία είναι όλα συνδέονται με την EMT και μετάσταση [15-18]. Ωστόσο, είναι σημαντικό να ταυτότητα περισσότερο άγνωστες στόχους και να αποκαλύψει τη σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης HIF-1α και άλλα ογκογονιδίου ή του όγκου καταστολείς.

ZEB1, ένα προ-μεταστατικό παράγοντα μεταγραφής, εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [ ,,,0],19, 20]. Μηχανιστικά, έκτοπη έκφραση της ZEB1 είναι επαρκής για να ρυθμίζουν προς τα κάτω Ε-καδερίνης και να επάγουν EMT στον καρκίνο του μαστού με σύνδεση προς τις συντηρημένες E-κουτιά υποκινητή Ε-καδερίνης. Η λειτουργία αναστολής της ZEB1 επί Ε-καδερίνης προωθώντας έτσι EMT παρατηρείται επίσης σε μοντέλα ξενομοσχεύματος CRC [8]. Επιπλέον, ZEB1 μεσολαβεί κλαουδίνης-1-ρυθμίζονται αλλαγές στην κυτταρική εισβολή και anoikis σε CRC [21]. Παρόμοια με ZEB1, σαλιγκάρι και Twist είναι επίσης σημαντικοί παράγοντες μεταγραφής EMT από φίμωση E-cadherin μέσω της σύνδεσης με το στοιχείο E-box σε E-cadherin υποκινητή [22]. Σαλιγκάρι ταυτοποιείται ως γονίδιο στόχος HIF-1α σε ποντικό [23]? Twist άμεσα ρυθμίζεται από HIF-1α στο κεφάλι και το καρκίνωμα του λαιμού πλακωδών κυττάρων (HNSCC) [18, 24]. Με άλλα λόγια, αυτοί σημαίνουν επίσης ότι η οδός HIF-1α μπορεί να ρυθμίσει Ε-καδερίνης καταστολή, πιθανώς μέσω σαλιγκάρι ή συστροφή. Ως εκ τούτου, λόγω των παρόμοιων ικανότητες του HIF-1α και ZEB1 να επάγει ΕΜΤ και των επικαλυπτόμενων φαινοτύπων του HIF-1α και ZEB1 σε μηδενικούς ποντικούς, είναι πιθανό ότι αυτά τα δύο γονίδια που βρίσκονται στο ίδιο μονοπάτι για τη ρύθμιση της μετάστασης του καρκίνου. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι μπορεί να υπάρχει ένας ισχυρός δεσμός μεταξύ διαδραστική ZEB1 και HIF-1α. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι HIF-1α ήταν σε θέση να δεσμεύει υποκινητή ZEB1 μέσω HRE-3 και θετικά ρυθμιζόμενων transactivity ZEB1. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν επίσης ότι Σαλιγκάρι, Twist και ZEB1, οι τρεις μεγάλες ρυθμιστικές EMT μπορούν να ρυθμίζουν EMT και τη μετάσταση με μερικές πολύ παρόμοιους μηχανισμούς.