Αφηρημένο

Hedgehog (Hh) σηματοδότησης παίζει ουσιαστικό ρόλο σε διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες, και παρεκκλίνουσα ρύθμιση αποτελέσματά της σε γενετικές διαταραχές ή κακοήθειες σε διάφορους ιστούς. Υπερενεργοποίηση σηματοδότηση Hh σχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα, και έχουν υπάρξει εκτενείς προσπάθειες να ερευνήσει το πώς να ελέγχουν μονοπάτι σηματοδότησης Hh και ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε το ρόλο του CDO, ενός Hh συν-υποδοχέα, σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Η αναστολή της σηματοδότησης Hh με SANT-1 ή siCDO σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα μειώνεται πολλαπλασιασμό και ογκογονικότητα, μαζί με την μείωση στην έκφραση των συστατικών Hh. Η ιστολογική ανάλυση με NSCLC ιστό ποντικού έδειξαν ότι CDO εκφράστηκε σε προχωρημένο βαθμό του καρκίνου, και συγκεκριμένα συν-εντοπισμένη με GLI1. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι CDO απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα μέσω σηματοδότηση Hh

Παράθεση:. LEEM YE, Ha HL, Bae JH, Μπεκ KH, Kang JS (2014) CDO, ένα HH-συν-υποδοχέα , μεσολαβεί Καρκίνο του πνεύμονα πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ογκογονικότητα μέσω Hedgehog Σηματοδοσίας. PLoS ONE 9 (11): e111701. doi: 10.1371 /journal.pone.0111701

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Ιουνίου του 2014? Δεκτές: 1 Οκτωβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 LEEM et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από την Κορέα Κυβέρνηση (MSIP) (2012R1A1A2005448 να YEL) και (NRF-2011 – 0017315 για να JSK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Hh μονοπατιού σηματοδότησης είναι ένα από τα ουσιαστικά οδών σηματοδότησης, η οποία εμπλέκεται στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, μορφογένεση και τον πολλαπλασιασμό [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Ο μοριακός μηχανισμός πώς να ρυθμίζουν την σηματοδότηση Hh είναι ακόμη υπό έρευνα. Σε γενικές γραμμές, μια φορά Hh συνδετήρας συνδέεται προς τον υποδοχέα της πρωτογενούς, Patched 1 (PTCH1), smoothened (SMO) απελευθερώνεται από PTCH1 μεσολάβηση της αναστολής και μεταναστεύει στην πρωτογενή βλεφαρίδα. Η διέγερση του ΠΕΑ πυροδοτεί διαδοχικής μεταγωγής σήματος που ενεργοποιεί τους παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας GLI. Η δραστική μορφή του GLI πρωτεΐνη μετατοπίζεται στον πυρήνα και ρυθμίζει την έκφραση καθοδικών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων PTCH1 και GLI1 [1], [7], [8].

Η απώλεια σηματοδότηση Hh κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη σχετίζεται με αρκετές γενετικές διαταραχές που συμπεριλαμβάνουν ολοπροσεγκεφαλία, η οποία είναι η πιο κοινή δυσμορφία του προσθίου εγκεφάλου [9], [10], [11]. Σε αντίθεση, συστατική ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh έχει γίνει γνωστό ότι εμπλέκεται στην έναρξη και την εξέλιξη πολλών καρκίνων του δέρματος (σποραδικές βασικοκυτταρικό καρκίνωμα, BCC), εγκεφάλου (μυελοβλάστωμα), μυ (ραβδομυοσάρκωμα, RMS), του γαστρεντερικού σωλήνα, του προστάτη, του παγκρέατος και πνεύμονα [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] . Η σύνδεση του Hh μονοπάτι προς την καρκινογένεση αρχικά αναφέρθηκε στο σύνδρομο Gorlin στο οποίο η μετάλλαξη στο

PTCH1

γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την εμφάνιση καρκίνου [24]. Επιπλέον, η παρεκκλίνουσα ρύθμιση προς τα άνω του Hh σηματοδότησης μέσω της απώλειας της PTCH1 ή τη μετάλλαξη κέρδος-of-λειτουργία

ΠΕΑ

εκτενώς μελετηθεί σε BCC και μυελοβλάστωμα [13], [14].

Η σημασία της σηματοδότησης Hh στην καρκινογένεση Διερευνήθηκε επίσης στον πολλαπλασιασμό του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC), η οποία είναι μια πολύ επιθετική καρκίνου του πνεύμονα που αποτελούν περίπου το 20-25% όλων των καρκίνων του πνεύμονα [21]. Η αναστολή της δραστικότητας σηματοδότησης Hh χρησιμοποιώντας ανταγωνιστή SMO, κυκλοπαμίνης είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της ανάπτυξης σε SCLC κυτταρικές γραμμές [21], [23], [25], [26]. Ότι, ήταν αρχικά πρότεινε ότι σηματοδότηση Hh είναι λιγότερο σχετίζεται με NSCLC, το πιο κυρίαρχο τύπο του καρκίνου του πνεύμονα και πιο θανατηφόρα κακοήθεια. Ωστόσο, αρκετές αποδείξεις έχουν πρόσφατα ανέφεραν ότι NSCLC εξαρτάται από δραστικότητα σηματοδότησης Hh στον πολλαπλασιασμό καθώς [27], [28], [29], [30].

Αν και η μείζων υποδοχέας κατά Hh είναι PTCH1, υπάρχουν επιπλέον συν-υποδοχείς που επικουρεί την Hh σηματοδότησης θετικά, όπως CDO, BOC και GAS 1 [31], [32], [33], [34], [35]. Σηματοδότηση Hh εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές και αναπτυξιακών διαδικασιών, και, κατά συνέπεια, σφιχτό κανονισμοί είναι απολύτως απαραίτητα για τη σηματοδότηση να αναγνωρίσει και να ελέγχουν μικρο-διακύμανση κυτταρικό περιβάλλον. Εν τω μεταξύ, πολλοί καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών που παράγουν διάφορα επίπεδα συνδέτη Hh [25], [30]. Ακόμη και αν ένα χαμηλό επίπεδο συνδέτη Hh φαίνεται σε μερικά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, τα κύτταρα αυτά αποκαλύπτουν την αύξηση στην έκφραση του γονιδίου-στόχου Hh υπονοώντας αυξορρύθμιση σηματοδότησης Hh. Υπό αυτές τις συνθήκες, η παρουσία του Hh συν-υποδοχείς μπορεί να συμβάλει στην ενίσχυση των αδυνάτων εξωκυττάριας σύνθημα σε καρκινικά κύτταρα εκτός από την λεπτή ρύθμιση της σηματοδότησης Hh κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης.

Μεταξύ αυτών των συν-υποδοχείς, CDO είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που ανήκει στην ανοσοσφαιρίνη (Ig) /ινωδονεκτίνης τύπου III (ΡΝΙΙΙ) υπεροικογένεια και παίζει σημαντικό ρόλο στην μυϊκή διαφοροποίηση, εμβρυϊκή ανάπτυξη και νευρωνική διαφοροποίηση [36], [37], [38], [39]. Δομική ανάλυση απέδειξε ότι οι επαναλήψεις ινωδονεκτίνης στην εξωκυτταρική περιοχή του CDO είναι κρίσιμη για Hh δεσμευτικός [39]. Η θετική ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh από CDO αρχικά προσδιορίζονται στο

Drosophila

. Είναι γνωστό ότι ihog (ορθόλογο του CDO σε

Drosophila

) μαζί με boi (ορθόλογο της BOC σε

Drosophila

) είναι σημαντική για την ενεργοποίηση των σηματοδότηση Hh στον αναπτυσσόμενο πτέρυγα εμβρυικού δίσκου [ ,,,0],40], [41]. Σε ποντικούς, η ανεπάρκεια Cdo εμφανίζει πολλαπλές συγγενείς ανωμαλίες, συμπεριλαμβανομένης ολοπροσεγκεφαλία, το οποίο είναι το ελάττωμα συνήθως, συνδέονται με μεταλλάξεις σε σηματοδότηση Hh [39], [42]. Επιπλέον, CDO εμπλέκεται σε Hh μεσολάβηση κοιλιακή νευρική σχηματοποίηση του νευρικού σωλήνα των θηλαστικών [31] και, καθώς και σε Hh μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε εγκεφαλικά προγόνων κόκκος νευρώνων (CGNPs) [43].

Εκτός στο ρόλο του CDO στην ανάπτυξη οργάνων και την κυτταρική διαφοροποίηση, η ένωση των CDO σε σηματοδότηση Hh, το οποίο εμπλέκεται στην ογκογένεση μας κέντρισε το ενδιαφέρον για τη διαλεύκανση ρόλο των CDO στον πολλαπλασιασμό των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να αποκαλύψει τη συμβολή των CDO να Hh σηματοδότησης σε NSCLCs και επιπλέον να πολλαπλασιασμού και ογκογονικότητα σε κύτταρα του πνεύμονα όγκου. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της CDO ήταν υψηλότερη σε κύτταρα NSCLC, και ότι η αναστολή της έκφρασης CDO μειωτικά σηματοδότηση Hh, και μειωμένη πολλαπλασιασμό και ογκογένεση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, η έκφραση CDO παρατηρήθηκε σε προχωρημένο στάδιο των ιστών NSCLC. Λαμβανόμενα μαζί, όλα τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CDO, ως συν-υποδοχέας για Hh, είναι ζωτικής σημασίας για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και ογκογονικότητα, και ως εκ τούτου μπορεί να θεωρηθεί ως ένα καλό υποψήφιο για αντικαρκινικές θεραπευτικές εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταροκαλλιέργειες και τα αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές BEAS-2B και NSCLC, Α549, Η1299, Η460 και Η520 ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή DH Kim (Πανεπιστήμιο Sungkyunkwan, Samsung Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών, Κορέα) [44]. Η κουλτούρα της BEAS-2Β ακολούθησε τις κατευθυντήριες γραμμές ATCC του. κύτταρα NSCLC καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) συμπληρωμένο με πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη. Για τη μέτρηση του mRNA έκφρασης /πρωτεΐνη ή κυτταρικό θάνατο σε siCDO-επιμολυσμένα κύτταρα, το μέσο άλλαξε σε RPMI-1640 με 0,5% FBS μία ημέρα μετά την επιμόλυνση, και τα επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες περαιτέρω. 50 μΜ του Sant1 (S4572, Sigma-Aldrich) διαλύθηκαν σε DMSO ή τον αντίστοιχο όγκο του φορέα DMSO υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 0,5% FBS σε υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο.

πειράματα παρεμβολής RNA

Κάθε κυτταρική σειρά NSCLC ήταν επιμολυσμένα με siCDO χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipfectamine RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ακόλουθες αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν ως siRNA κατά CDO. siCDO # 1, Sense, 5′-GGAUCUUGGACCCUUAUGUUU-3 ‘, Antisense, 5′- ACAUAAGGGUCCAAGAUCCUU-3’. siCDO # 2, Sense, 5′-CUUCAAAGUCGAAUAUAAAUU-3 ‘, Antisense, 5’- UUUAUAUUCGACUUUGAAGUU ». Για

in vivo

δοκιμασία ογκογονικότητα, Α549 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά μικρά RNA φουρκέτας (shRNA) έναντι CDO παρασκευάσθηκαν με την επιμόλυνση με pSuper-puro-shCDO. διάνυσμα pSuper-puro-shCDO είχε αναφερθεί στο παρελθόν [42].

Σύνολο προετοιμασία RNA και σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας easyBLUE κιτ συνολική εκχύλιση του RNA (Intron Βιοτεχνολογία Inc. , Κορέα), και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (TAKARA, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα ExTaq κιτ (TAKARA, Japan) και Thermal Cycler Dice σύστημα πραγματικού χρόνου (TP800, TAKARA, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η προς τα εμπρός (F) και αντίστροφη (R) εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρατίθενται παρακάτω.

ΕΛΕΡΠΕ

F, 5′-CCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3 ‘, R, 5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3’?

PTCH1

F, 5′-CAGCACTGGAAAACTCGTCA-3 ‘, R, 5′-TCTGATGAACCACCTCCACA-3’?

GLI1

F, 5′-AAGGGGTTTCTATCCTTCCAGA-3 ‘, R, 5′-TCCTTTATTATCAGGAAACAGTGTCA-3’?

CDO

F, 5′-GGGAAATACATCTGCGAAGC-3 ‘, R, 5′-CTGAGCAGCATCAGGAAGTG-3’?

18S rRNA

F, 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 ‘, R, 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’. Σχετική ποσοτικοποίηση ενός γονιδιακής έκφρασης περιγράφηκε ως πλάσια των σχετικών μεταβολών στα επίπεδα mRNA σε σύγκριση με έναν έλεγχο, με τη χρήση του

-ΔΔCt εξίσωση 2, [ΔΔCt = ΔCt (γονίδιο στόχος) -ΔCt (γονίδιο αναφοράς)]. 18S rRNA χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 5 × 10

3 ή 1 × 10

4 κύτταρα ανά 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε 0.5% FBS. Θρυψίνη κύτταρα βάφτηκαν με κυανούν τρυπανίου διάλυμα (TB), και οι μη χρωματισμένο βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν. Για ΜΤΤ δοκιμασία, 20 μΐ από 5 mg /ml ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] 2,5-διφαινυλοτετραζολίου βρωμιούχο) προστέθηκε σε 5 × 10

3 ή 1 × 10

4 κύτταρα ανά 96 φρεατίων. Μετά από 4 ωρών επώαση στους 37 ° C, η σούπα καλλιέργεια άλλαξε σε 200 μΙ DMSO. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm. Για την ανίχνευση BrdU, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με 10 μΜ βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU? Sigma-Aldrich Corp.) για 1 ώρα. Σταθερή κύτταρα με 4% PFA ανιχνεύθηκαν με αντι-BrdU αντίσωμα (Chemicon International Inc.). Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε με Alexa Fluor αντίσωμα αντι-ποντικού κατσίκας 488 (Molecular Probe).

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας απόπτωσης

Η απόπτωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ApoScan αννεξίνης V FITC (BioBud, Κορέα ) και η ροή του BD FACS CANTO II κυτταρόμετρο (BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κηλίδος Western

αναλύσεις κηλίδος Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Οι πρωτογενείς αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, όπως αναφέρονται παρακάτω? Διασπασμένα Caspase3 (# 9664, Cell Signaling), Caspase9 (SC-81663, Σάντα Κρουζ), Cdk2 (SC-6248, Santa Cruz), η κυκλίνη D1 (SC-246, Santa Cruz), κυκλίνης Ε (sc25303, Santa Cruz), GAPDH (AbFRONTIER, Κορέα), ρ21 (sc-6246), ρ27 (ab7961, Abcam).

σχηματισμού αποικιών

δοκιμασία

Πέντε χιλιάδες κύτταρα αναμίχθηκαν απαλά με 10% FBS RPMI-1640 μέσο που περιέχει 0.35% αγαρόζη. Το μίγμα επιστρώνεται επί της αγαρόζης κάτω του 0,5% με 10% FBS μέσου σε 6-φρεατίων. Τα επιμεταλλωμένα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή για 3 εβδομάδες με διατροφή του μέσου κάθε δεύτερη μέρα. Ο σχηματισμός αποικίας οπτικοποιήθηκε με 0.01% κρυσταλλικό ιώδες και αναλύθηκαν με ένα ανατομικό μικροσκόπιο. Η ποσοτικοποίηση των αριθμών αποικιών ανά πεδίο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ImageJ. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές

Στο Viv

o ογκογενετικότητας δοκιμασία

5 × 10

6 του ελέγχου (pSuper-puro) -. Ή pSuper-puro-shCDO-επιμολυσμένα κύτταρα Α549 ενέθηκαν υποδορίως στα πλευρά του 6 έως 8 εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε κάθε 4 ημέρες, και υπολογίζεται όπως περιγράφεται [45]. Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν ελεγχθεί και εγκριθεί από τη Διεθνή Επιτροπή των Ζώων Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της SKKU της Ιατρικής Σχολής (SUSM). SUSM είναι μια ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) διεθνείς διαπιστευμένους εγκατάσταση και τηρεί το Ινστιτούτο Ερευνητικό Εργαστήριο Ζώων (ILAR) οδηγό.

Ποντίκια και ανοσοϊστοχημεία

LSL-K-ras

G12D

ποντίκια που παρέχονται από τον Δρ Tyler Jacks (MIT Κέντρο Καρκίνου) [46], [47]. Τα τμήματα παραφίνης από

LSL-K-ras

G12D

ποντικοί ανοσοαντέδρασαν με 2B3 (ασκίτης ποντικού έναντι CDO) και αντι-GLI1 αντίσωμα (1:100? Ab49314, Abcam), και ανιχνεύεται με τη χρήση ανοσοφθορισμού. Συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη σε SKKU Σχολή διευκόλυνσης Ιατρική-Μικροσκοπία κοινόχρηστο πόρο με Zeiss LSM-510 Meta ομοεστιακό μικροσκόπιο. Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν ελεγχθεί και εγκριθεί από τη Διεθνή Επιτροπή των Ζώων Φροντίδα και Χρήση (IACUC) της SKKU της Ιατρικής Σχολής (SUSM). SUSM είναι μια ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) διεθνείς διαπιστευμένους εγκατάσταση και τηρεί το Ινστιτούτο Ερευνητικό Εργαστήριο Ζώων (ILAR) οδηγό.

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και θεωρούνται σημαντικές όταν

σ

τιμές ήταν & lt? 0,05 (*) ή & lt?. 0.01 (**)

Αποτελέσματα

Hh εξαρτήματα, τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα ανεστάλησαν από εξάντληση CDO σε NSCLCs

Προηγούμενη βιβλιογραφία έχουν δείξει ότι CDO δρα ως εξάρτημα υποδοχέας για συνδέτη Hh και θετικά ρυθμίζει σηματοδότηση Hh [39] , [48]. Η στενή συνάφεια της ενεργοποίησης του Hh σηματοδότηση προς πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων μας ώθησε πρώτα να δοκιμάσει την έκφραση σε κύτταρα CDO NSCLC. Για να γίνει αυτό, το σύνολο των RNAs απομονώθηκαν από Α549, κυτταρικές γραμμές Η1299, Η460 και Η520 NSCLC, καθώς και από BEAS-2Β ανθρώπινο πνεύμονα μη-καρκινικές, και χρησιμοποιούνται για την ανάλυση της έκφρασης CDO κάνοντας πραγματικού χρόνου qRT-PCR. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι CDO εκφράστηκε υψηλότερη σε Α549, Η1299 και Η520 κύτταρα από BEAS-2Β ωστόσο H460 αποκάλυψε σχετικά χαμηλότερο επίπεδο CDO (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση των συστατικών σηματοδότησης Hh σε κύτταρα NSCLC εκτελώντας πραγματικού χρόνου qRT-PCR. Η υψηλότερη έκφραση του SHH παρατηρήθηκε σε όλες τις τέσσερις NSCLC κυτταρικές γραμμές από ότι στο πνεύμονα μη καρκινικά. Παρομοίως, οι μεταγενέστεροι γονίδια στόχους σηματοδότησης Hh, PTCH1 και GLI1 εκφράστηκαν υψηλότερες στις NSCLC κύτταρα (Σχήμα 1Α). Α549 έδειξε σχετικά χαμηλότερο επίπεδο του συνδέτη Hh, σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές γραμμές, ωστόσο αποκάλυψε ότι η αύξηση στην έκφραση του γονιδίου-στόχου Hh (PTCH1 και GLI1). Σε H520, CDO, ΕΛΕΡΠΕ και PTCH1 εκφράστηκαν συγκριτικά υψηλότερη από ό, τι οποιαδήποτε άλλη κυτταρικές σειρές, αλλά η έκφραση GLI1 ήταν αρκετά χαμηλή.

Α. Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR για τα επίπεδα έκφρασης του CDO και Hh συστατικά σηματοδότησης (SHH, PTCH1 και GLI1) σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Α549, Η1299, Η460 και Η520) BEAS-2Β και. Κάθε επίπεδο έκφρασης κανονικοποιήθηκε με το επίπεδο του 18S rRNA. Η σχετική ποσότητα του κάθε συστατικού σε NSCLCs προσδιορίστηκε ως η ποσότητα του καθενός σε BEAS-2Β ορίσθηκε σε 1,0. B. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με απαρίθμηση των κυττάρων σε προκαθορισμένο χρόνο σε Α549, Η1299, Η460 και Η520 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 μΜ Sant1. C. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε προκαθορισμένο χρόνο σε Α549, Η1299, Η460 και Η520 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 μΜ Sant1. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm. Δ RT-PCR για CDO σε Α549, Η1299 και Η460 επιμολυσμένα με το περιπλεγμένο siRNA ή siCDO 1 #. Ε πραγματικό χρόνο qRT-PCR για τα συστατικά σηματοδότηση Hh σε Α549, Η1299 και Η460 επιμολυσμένα με το μπερδεμένο siRNA ή siCDO. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε συστατικού κανονικοποιήθηκε με το επίπεδο του 18S rRNA. Η σχετική ποσότητα του κάθε συστατικού σε CDO-εξαντλημένο NSCLCs προσδιορίστηκε ως η ποσότητα του καθενός στα κύτταρα ελέγχου ορίστηκε σε 1,0 (κόκκινη γραμμή). Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο τουλάχιστον τριπλών προσδιορισμών ± 1 SD. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01

Η

Εμείς καθορίζεται για πρώτη φορά την ανασταλτική επίδραση της Sant1 σε σηματοδότηση Hh εξετάζοντας την έκφραση της hh σηματοδότησης γονίδια-στόχους μετά τη θεραπεία Sant1. Sant1 συνδέεται άμεσα με ΠΕΑ, εμποδίζοντας τη σηματοδότηση. Ολικά RNAs που απομονώνονται από DMSO-ή Sant1 επεξεργασμένο Α549, Η1299 και Η460 χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση PTCH1 και εκφράσεις GLI1 με πραγματικού χρόνου qRT-PCR. Όπως είχε προβλεφθεί, η προσθήκη Sant1 οδήγησε σε μείωση του PTCH1 και εκφράσεων GLI1 (Σχήμα S1 στο File S1). Προκειμένου να προσδιοριστεί η επίδραση του σηματοδότηση Hh στον πολλαπλασιασμό των NSCLCs, εμείς ανέστειλε σηματοδότηση Hh σε Α549, Η1299, Η460 και Η520 με τη χρησιμοποίηση SANT-1. Στη συνέχεια, καταμέτρηση ΤΒ κυττάρου και δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθησαν για να αναλύσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η βιωσιμότητα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η προσθήκη 50 μΜ Sant1 οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης και βιωσιμότητας των τεσσάρων μεμονωμένων κυττάρων NSCLC (Εικόνα 1Β και Γ). Η επίδραση του Sant1 μεσολάβηση αναστολή ήταν ισχυρότερη σε αργά χρονικά σημεία. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα που δοκιμάστηκαν NSCLC απαιτούν δράση σηματοδότησης Hh για τη διατήρηση του πολλαπλασιασμού τους.

Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν CDO συνέβαλε στη δραστηριότητα των σηματοδότηση Hh σε NSCLCs. Για τον προσδιορισμό αυτό, επιμολυσμένα τρία διαφορετικά NSCLC κυτταρικές σειρές, Α549, Η1299 και Η460 με siCDO ή την ομελέτα siRNA και αξιολόγησε την επίδραση της ανεπάρκειας CDO για τις εκφράσεις των συστατικών σηματοδότησης Hh με πραγματικού χρόνου qRT-PCR. Η έκφραση του CDO μειώθηκε σημαντικά με siCDO σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 D). Για να καταστρέφουν έκφραση CDO, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές ακολουθίες του siRNA, siCDO # 1 και # 2. Και οι δύο siCDOs έδειχναν την ανάλογη μείωση του CDO και τα αποτελέσματα (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), και παρουσιάζουμε τα δεδομένα της siCDO # 1. Τα επίπεδα των συστατικών Hh σηματοδότησης, η Shh, PTCH1, και GLI1 μειώθηκαν σημαντικά σε CDO-εξαντλημένο πνεύμονα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με το ανακατωμένο έλεγχο (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CDO δρα ως θετικός ρυθμιστής για σηματοδότηση Hh σε κύτταρα NSCLC, ανεξάρτητα από το επίπεδο έκφρασής του.

εξάντληση CDO οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης σε NSCLCs

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β και C, παρατηρήσαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων NSCLC ήταν αρκετά ευαίσθητη σε Sant1. Έτσι, αποφασίσαμε να προσδιοριστεί η επίδραση του κάτω ρύθμιση σηματοδότηση Hh με CDO knockdown επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Για να γίνει αυτό, θα αξιολογηθεί το ποσοστό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των Α549, Η1299, Η460 και Η520 κάτω CDO-εξαντλημένο κατάσταση εκτελώντας καταμέτρηση των κυττάρων της φυματίωσης και της δοκιμασίας ΜΤΤ (Σχήμα 2Α και D). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι CDO knockdown σε όλες τις δοκιμασμένες κύτταρα NSCLC μειώθηκαν σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων και τη βιωσιμότητα, σε σύγκριση με το ανακατωμένο έλεγχο. Ωστόσο, η έκταση της μείωσης του πολλαπλασιασμού δεν ήταν ισχυρότερη από ότι σε θεραπεία Sant1 (σύγκρινε Σχήμα 2Α και D στο Σχήμα 1 Β και C, αντίστοιχα). Η κλίση των γραφημάτων για τον αριθμό των κυττάρων και τη βιωσιμότητα σε CDO-εξαντλημένο καρκινικά κύτταρα ακόμη συνέχισαν να αυξάνονται σε μεγαλύτερο χρονικό σημείο 5η ημέρα, σε σύγκριση με εκείνη στο Sant1 θεραπεία, ακόμη και αν τα επίπεδα ήταν απολύτως πολύ χαμηλότερα από εκείνα στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της εξάντλησης CDO στον πολλαπλασιασμό περαιτέρω, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό ενσωμάτωσης BrdU. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι CDO knockdown σε κύτταρα NSCLC οδήγησε σε 20-40% των μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικόνα 2Β).

A. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με απαρίθμηση κυττάρων σε προκαθορισμένο χρόνο στον ελέγχου-ή CDO-εξαντλημένο Α549, Η1299, Η460 και Η520. Β κυτταρικός πολλαπλασιασμός των CDO νοκ ντάουν Α549, Η1299, Η460 και Η520 προσδιορίσθηκε με ενσωμάτωση BrdU. Η ανάλυση στυπώματος Western Γ για την έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου (Κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε και Cdk2), καταστολείς (ρ27 και ρ21) και αποπτωτικών δεικτών (διασπασμένη κασπάση 3 και διασπασμένη κασπάση 9) για τον έλεγχο ή CDO knockdown κυττάρων Α549. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ ΜΤΤ δοκιμασία για την κυτταρική βιωσιμότητα του ελέγχου-ή siCDO-επιμολυσμένα Α549, Η1299, Η460 και Η520 σε προκαθορισμένο χρόνο. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm. Ε Αννεξίνη V-FITC απόπτωση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με Α549, Η1299, Η460 και Η520 επιμολυσμένα με το περιπλεγμένο siRNA ή siCDO. Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο τουλάχιστον τριπλών προσδιορισμών ± 1 SD. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01

Η

Η μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας των CDO-εξαντλημένα κύτταρα NSCLC θα μπορούσε να είναι λόγω της μειωμένης προόδου του κυτταρικού κύκλου ή /και αυξημένη κυτταρικό θάνατο. Για να επαληθεύσει τα επίπεδα έκφρασης του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστών /καταστολείς, κύτταρα Α549 επιμολύνονται με το κωδικοποιημένο ή siCDO εξετάστηκαν για ανοσοκηλίδωση. Ως αποτέλεσμα, τα επίπεδα πρωτεΐνης των ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου (Κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε και Cdk2) έχουν μειωθεί, ενώ οι εκφράσεις των αναστολέων Cdk (ρ27 και ρ21) ήταν αυξημένα σε siCDO επεξεργασμένα Α549 κυττάρων σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα κύτταρα κατεργασμένα (Σχήμα 2C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της έκφρασης CDO φαίνεται να προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα NSCLC.

Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν η εξάντληση CDO συσχετίστηκε επίσης με κυτταρικό θάνατο. Ανοσοκηλίδωση κατά διασπασμένης μορφές της κασπάσης-9 και -3 έδειξε ότι αυτές οι αποπτωτικών παραγόντων ανιχνεύθηκαν ισχυρότερη σε siCDO επιμολυσμένα Α549 σε σχέση με το μάρτυρα (Σχήμα 2C). Σταθερά, κυτταρομετρία ροής προφίλ για απόπτωση με Α549, Η1299, Η460 και Η520 επέδειξαν ότι μεγαλύτερο ποσοστό αννεξίνης-ν και διπλά θετικών κυττάρων ΡΙ ευρέθη σε τέσσερις επιμέρους CDO-εξαντλημένο NSCLCs (Σχήμα 2Ε). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η μείωση του πολλαπλασιασμού των NSCLCs την εξάντληση CDO οφείλεται σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο καθώς και εξασθενημένου εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.

Αναστολή της έκφρασης CDO σε NSCLCs έδειξε την μείωση του

in vitro

και

in vivo

ογκογενετικότητας

το μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε CDO νοκ ντάουν μας οδήγησε να διερευνήσει την επίδραση της εξάντλησης CDO για κακοήθη χαρακτηριστικά των κυττάρων NSCLC. Για αυτό, εκτιμήσαμε την έκταση του σχηματισμού αποικίας siCDO-επιμολυσμένα Α549, Η1299, Η460 και τα κύτταρα H520 σε μαλακό άγαρ (Σχήμα 3Α και Β). Το αποτέλεσμα εμφανίζεται μια σημαντική μείωση της ικανότητας κλωνισμού

in vitro

όταν το επίπεδο CDO μειώθηκε.

Α. σχηματισμό αποικιών του ελέγχου ή CDO νοκ ντάουν Α549, Η1299, Η460 και Η520 σε μαλακό άγαρ. Β Ποσοτική ανάλυση του πειράματος που περιγράφεται στο αριθμούς Α αποικίας ανά πεδίο προσδιορίσθηκαν με ImageJ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο τριπλών προσδιορισμών ± 1 SD. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt? 0,01. Γ Αντιπροσωπευτικά ανάπτυξη του όγκου 50 ημέρες μετά την υποδόρια ένεση γυμνών ποντικών με τον έλεγχο ή shCDO-επεξεργασμένα κύτταρα Α549. D. Το μέγεθος του όγκου των γυμνών ποντικών με Α549 ελέγχου (n = 8) ή CDO-εξαντλημένο Α549 (n = 10) που περιγράφεται στο C. Μέσα παρουσιάζονται ως ράβδοι σφάλματος. Ε Όγκοι από την γυμνούς ποντικούς ένεση με το Α549 έλεγχο ή CDO-εξαντλημένα κύτταρα Α549 παρουσιάζεται στο Γ

Η

Για να υποστηρίξει τα στοιχεία του

in vitro

ογκογενετικότητας, ετοιμάσαμε σταθερή κυτταρική γραμμή του Α549 που εκφράζουν shRNA έναντι CDO, και υποδορίως με ένεση τον έλεγχο ή CDO-εξαντλημένο κυττάρων στα πλευρά γυμνών ποντικών. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε περιοδικά. Όπως φαίνεται Σχήμα 3C, D, και Ε, μια σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε γυμνά ποντίκια ενιεμένα με CDO-knockdown Α549. Μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι CDO απαιτείται για το

in vivo

ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC.

έκφραση CDO ανιχνεύθηκε με GLI1 μαζί σε προχωρημένα στάδια της NSCLCs

Για να προσδιορίσετε έκφραση CDO κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα, πήραμε πλεονέκτημα του μοντέλου NSCLC ποντίκι,

LSL-K-ras

G12D

ποντίκια [46], [47]. Μετά ενδορινική εισπνοή Ad-Cre να επάγει αυθόρμητη ογκογένεση του πνεύμονα σε

LSL-K-ras

G12D

ποντίκια, αξιολογήσαμε έκφραση CDO στον πνευμονικό ιστό όγκου που δείχνει τέσσερα επιμέρους βαθμίδες της εξέλιξης του όγκου με φθορίζουσα ανοσοϊστοχημεία. έκφραση CDO ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμο σε βαθμό-1, το οποίο είναι ένα πρώιμο στάδιο της εξέλιξης του όγκου χαρακτηρίζει άτυπη αδενωματώδη υπερπλασία (AAH) ή μικρό αδένωμα (Σχήμα S2 σε File S1). Ωστόσο, η έκφραση του έγινε εμπλουτισμένο ως την εξέλιξη του όγκου έχει προωθηθεί. Στην τάξη-2, στην οποία ανιχνεύονται μεγαλύτερα αδενώματα με λίγο διευρυμένη πυρήνες, η έκφραση CDO παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων στις καρκινικές βλάβες, και αυτή η υψηλή έκφραση διατηρήθηκε μέχρι βαθμού-3 (Σχήμα 4). Καθώς οι όγκοι εξελίχθηκαν να είναι επεμβατική αδενοκαρκινώματα (βαθμός-4), η έκφραση CDO ήταν κάπως μειωμένη και ανιχνεύεται σε κυτταρική μεμβράνη. Η έκφραση των CDO στις καρκινικές βλάβες μας οδήγησε να διερευνήσει την έκφραση των συστατικών μονοπατιού Hh στον ιστό του όγκου. Ομοεστιακή εικόνες ανοσοφθορισμού έδειξε ότι GLI1, ένας από τους παράγοντες σηματοδότησης Hh ήταν colocalized με CDO, και επιπροσθέτως η έκφραση της ήταν επίσης ιδιαίτερα παρατηρήθηκε σε βλάβες βαθμού-2 και -3 όγκου, όχι σε βαθμό-4 (Σχήμα 4). Η ανεπάρκεια της έκφρασης GLI1 βαθμού-4 που αντιστοιχούν στα αποτελέσματα που προτείνονται από αρκετές προηγούμενες μελέτες [23], [29]. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων δείχνουν ότι η έκφραση CDO μπορεί να συσχετίζεται με την αυξητική ρύθμιση του σηματοδότηση Hh σε αλλοιώσεις όγκου και CDO είναι επίσης πιθανό σχετίζεται με την εξέλιξη της όγκου πνεύμονα, δεν είναι σε την έναρξη του όγκου.

Confocal ανίχνευση ανοσοφθορισμού των CDO (κόκκινο) και GLI1 (πράσινο) στο βαθμό-2, -3 και -4 ιστούς καρκινικών όγκων από

LSL-K-ras

G12D

μοντέλο. Οι πυρήνες των κυττάρων έγιναν ορατά με DAPI (μπλε) και οι εικόνες αντίθεσης φάσης απεικονίζεται. μπαρ κλίμακας δείχνει 50 μm.

Η

Συζήτηση

Στην πραγματικότητα, η σημασία των CDO στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ήταν κάπως ακάλυπτες και αναφέρθηκε νωρίτερα. Hayashi

et al.

[49] έκανε μια προσπάθεια να ελέγξουν έξω γονίδια που κωδικοποιούν διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι ιδιαίτερα εκφράζονται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Μεταξύ των υποψηφίων, επικεντρώθηκαν σε 83% του CDO-υπερεκφράζεται καρκίνο του προστάτη, και απέδειξαν ότι η μείωση της έκφρασης CDO επαγόμενη απόπτωση και ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός πώς εμπλέκεται CDO στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη δεν εξηγήθηκε. Σε αυτή τη μελέτη, αποκάλυψε ότι η τελειοποίηση και πάνω ρύθμιση σηματοδότηση Hh με CDO είναι αρκετά απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον καρκίνο του πνεύμονα. Εμείς επιπλέον παρατηρηθεί ότι το επίπεδο του mRNA του CDO στις δοκιμαζόμενες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα εκτός H520 ήταν υψηλότερη από ό, τι σε BEAS-2Β, αλλά δεν ήταν σημαντική. Ιδιαίτερα επίπεδο CDO mRNA σε Α549 ήταν περίπου 1,7 φορές υψηλότερη από το βασικό επίπεδο αυτό σε BEAS-2Β. Ακόμη και αν η αύξηση αυτή δεν είναι δραματικά υψηλό, είναι άξιος της προειδοποίησης, αν λάβουμε υπόψη ότι η έκφραση CDO βρίσκεται γενικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της εμβρυογένεσης, και δύσκολα ανιχνεύονται σε ιστούς ενηλίκων [36].

Αρχικά είχε θεωρηθεί ότι Hh σηματοδότησης σπάνια συνδέεται με NSCLC επειδή HH και GLI1 παρατηρήθηκαν σε σχετικά χαμηλότερο επίπεδο σε NSCLC. Από τότε, τα δεδομένα, συμπεριλαμβανομένων των παρόντων στοιχείων, της αναστολής του πολλαπλασιασμού NSCLC από έναν ανταγωνιστή SMO πρότεινε ότι η ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh μέσω του χαμηλού επιπέδου Hh είναι σίγουρα σχετίζεται με ογκογένεση σε NSCLC. Σύμφωνα με αυτή την περίσταση CDO μπορεί να παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο ως αισθητήρας συνδετήρας για ένα μικρό ποσό του Hh, υποστηρίζοντας το κύριο υποδοχέα, PTCH1 και μετά από όλα επάγει την ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh.

Εν τω μεταξύ, η λειτουργία του CDO στο κελί πολλαπλασιασμό φαίνεται να είναι αμφίσημη ανάλογα με το επίπεδο HH. Delloye-Bourgeois

et al.

[50] πρόσφατα πρότεινε ότι, το επίπεδο Hh είναι σημαντική για CDO να λειτουργήσει ως ένας υποδοχέας εξάρτηση, η οποία σχετίζεται στενά με την επαγωγή της προαποπτωτική σήματος. Σύμφωνα με αυτούς, όταν συνδέτης Hh είναι αρκετά περιορισμένη, κασπάσης 3/9 στρατολογούνται στη θέση διάσπασης caspase στην μεσοκυττάρια περιοχή του CDO και προκαλούν πρωτεολυτική διάσπαση. Η διάσπαση αυτή της κασπάσης με τη μεσολάβηση πυροδοτεί τελικά απόπτωση. Ο ρόλος του CDO ως υποδοχέας εξάρτηση συγκρούεται βασικά με τη λειτουργία του CDO σε καρκινικά κύτταρα με έκφραση Hh, αυτό που αποκαλύφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Ως εκ τούτου, το κατάλληλο επίπεδο συνδέτη Hh φαίνεται να είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί η λειτουργία του CDO ως θετικός ρυθμιστής σηματοδότησης Hh ή έναν υποδοχέα εξάρτηση.

Η αναστολή σηματοδότησης Hh με Sant1 σε όλα τα κύτταρα NSCLC έδειξαν περισσότερο σημαντική μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας σε μεγαλύτερα χρονικό σημείο, σε σύγκριση με την αναστολή από εξάντληση γονίδιο CDO (σύγκρινε Σχήμα 1 Β και C στο Σχήμα 2Α και D, αντίστοιχα). Η περιορισμένη επίδραση των CDO νοκ ντάουν για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μπορεί να οφείλεται σε ότι και άλλα Hh συν-υποδοχείς, όπως BOC και GAS 1 εξακολουθούν να εκφράζονται και ενεργό, ακόμα κι αν δεν μπορούμε να αποκλείσουμε το ενδεχόμενο της παροδικής εξάντληση CDO με siRNA. Έχει αποδειχθεί ότι όλοι οι Hh συν-υποδοχείς, CDO, BOC, και GAS 1 συλλογικά απαιτούνται για την πλήρη ενεργοποίηση της σηματοδότησης Hh. CDO, BOC και GAS 1 ατομικά κάνουν ένα συγκρότημα με PTCH1 και το σχηματισμό των συμπλοκών είναι κρίσιμη για Hh μεσολάβηση πολλαπλασιασμού CGNP [43]. Με βάση αυτό, η κατανόηση των ρόλων των BOC και GAS 1 κατά τη διάρκεια HH-μεσολάβηση ογκογένεση θα χρειαστούν αργότερα.

Ανίχνευση της έκφρασης CDO σε υψηλής ποιότητας της καρκινικής βλάβης του μοντέλου ποντικού NSCLC, όχι στην αλλοίωση της ποιότητας-1 , κέντρισε την περιέργειά μας για το ρόλο των CDO μεσολάβηση σηματοδότηση Hh στην πρόοδο του όγκου. Έχει κυρίαρχα προταθεί ότι η αυξητική ρύθμιση του σηματοδότηση Hh φαίνεται να συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου, αν και είναι αμφιλεγόμενη σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Στον καρκίνο του προστάτη, τα επίπεδα του mRNA της ΕΛΕΡΠΕ, PTCH1 και GLI1 ήταν ιδιαίτερα αυξημένα σε πιο προχωρημένα στάδια του καρκίνου, και όλα εκείνα τα συστατικά που συνδέονται στενά με Gleason score [51]. Από την άλλη πλευρά, Gialmanidis

et al.

[29] έχουν ανοσοϊστοχημικώς αναλύθηκαν τμήματα ιστού του πνεύμονα εγκλεισμένων σε παραφίνη από 80 ασθενείς με NSCLC. Βρήκαν ότι η ενεργοποίηση της σηματοδότησης Hh συνδέθηκε με βαθμό του όγκου, και η υψηλή ενεργοποίηση της σηματοδότησης ήταν κυρίως ανιχνεύθηκε σε καλά διαφοροποιημένο και μετρίως διαφοροποιημένα όγκους. Η ισχυρή έκφραση του CDO στην υψηλής ποιότητας του όγκου μπορεί να οδηγήσει σε μια πιθανότητα που CDO ως ένας θετικός ρυθμιστής ρυθμίζει και τα αποτελέσματα σε ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου.

Μέχρι στιγμής, οι προσπάθειες για την έχουν βρει αντικαρκινικές θεραπείες έχουν στοχεύουν κυρίως ΠΕΑ, και μάλιστα αρκετές αναστολείς ΠΕΑ έχουν εφαρμογή στην κλινική [52]. Η έκφραση του CDO περιορίζεται γενικά στην ανάπτυξη και την εμβρυογένεση, όχι σε ενήλικες στάδιο. Ανώμαλη έκφραση του CDO στην καρκινική κατάσταση είναι πιθανόν σχετίζεται με ανώμαλο κυτταρικό πολλαπλασιασμό.