Αφηρημένο

Από τις εκτιμώμενες 565.650 άνθρωποι στις ΗΠΑ που θα πεθάνουν από καρκίνο το 2008, σχεδόν όλοι θα έχουν μετάσταση. Μαστού, του προστάτη, του νεφρού, του θυρεοειδούς και καρκίνων του πνεύμονα με μεταστάσεις στο κόκκαλο. καρκινικά κύτταρα βρίσκονται μέσα στο οστό χρησιμοποιώντας υποδοχείς κυτταρικής προσκόλλησης τύπου ιντεγκρίνης και προκαλούν ανικανότητα οστικό πόνο και κατάγματα. Ειδικότερα, μεταστατικούς όγκους ανθρώπινου προστάτη εκφράζουν και διασπούν το Α6 ιντεγκρίνης, έναν υποδοχέα για συστατικά εξωκυτταρικής θεμέλιας ουσίας του οστού, δηλαδή, λαμινίνη 332 και λαμινίνη 511. Περισσότερο από το 50% όλων των ασθενών με καρκίνο του προστάτη αναπτύσσουν έντονο πόνο οστού κατά υπόλοιπο της ζωής τους. Ένας σημαντικός στόχος είναι να αποτρέψει ή να καθυστερήσει προκαλείται από τον καρκίνο του πόνου των οστών. Χρησιμοποιήσαμε ένα νέο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού για να προσδιοριστεί άμεσα αν ο πόνος των οστών θα μπορούσε να προληφθεί με την παρεμπόδιση της γνωστή διάσπαση του υποδοχέα ιντεγκρίνης προσκόλλησης Α6. Ανθρώπινα κύτταρα όγκου που εκφράζουν είτε την άγριου τύπου είτε μεταλλαγμένη Α6 ιντεγκρίνη τοποθετήθηκαν εντός της οστικής μήτρας διαβίωσης και 21 ημέρες αργότερα, ιντεγκρίνης έκφραση επιβεβαιώθηκε με RT-PCR, ακτινογραφίες συλλέχθηκαν και οι μετρήσεις της συμπεριφοράς της αυθόρμητης και προκάλεσε τον πόνο που εκτελούνται. Όλα τα ζώα ανεξάρτητα από την κατάσταση της ιντεγκρίνης είχε διακριθεί το φορτίο του όγκου και να αναπτυχθεί απώλεια οστού 21 ημέρες μετά την επέμβαση. Μια σύγκριση των ζώων που περιέχουν το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο ιντεγκρίνη αποκάλυψε ότι κύτταρα όγκου που εκφράζουν το μεταλλαγμένο ιντεγκρίνης είχε ως αποτέλεσμα μια δραματική μείωση στην απώλεια οστού, μονού μανδύα ή διφλοιώδεις κατάγματα και μείωση στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να φθάσουν στην πλάκα επίφυσης του οστού. Περαιτέρω, τα καρκινικά κύτταρα μέσα στο οστό που εκφράζουν την ιντεγκρίνη μετάλλαξη παρεμποδίζεται προκληθέντα καρκίνο αυθόρμητες συσπάσεις, απτική αλλοδυνία, και την κίνηση που προκαλείται από τον πόνο. Πρόληψη A6 ιντεγκρίνης διάσπασης πάνω στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου του προστάτη μειώθηκε η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων εντός του οστού και την έναρξη και τον βαθμό του πόνου των οστών και κατάγματα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι στρατηγικές για την παρεμπόδιση της διάσπασης των υποδοχέων προσκόλλησης στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου μπορεί να εμποδίσει σημαντικά προκληθέντα καρκίνο πόνου των οστών και την αργή εξέλιξη της νόσου εντός του οστού. Από ιντεγκρίνης διάσπαση διαμεσολαβείται από πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης Activator (υΡΑ), περαιτέρω εργασία είναι αναγκαία για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα των αναστολέων υΡΑ για την πρόληψη ή την καθυστέρηση που προκαλείται από τον καρκίνο του πόνου των οστών

Παράθεση:. Βασιλιάς ΤΕ, Pawar SC, Majuta L, Sroka IC, Wynn D, Δημητρίου MC, et al. (2008) Ο ρόλος της Alpha 6 ιντεγκρίνη στον καρκίνο του προστάτη Μετανάστευση και πόνο στα οστά σε ένα μυθιστόρημα μοντέλο ξενομοσχεύματος. PLoS ONE 3 (10): e3535. doi: 10.1371 /journal.pone.0003535

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 27 Ιούνη 2008? Αποδεκτές: 26 Σεπτέμβρη 2008? Δημοσιεύθηκε: 28 Οκτωβρίου του 2008

Copyright: © 2008 King et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ χορηγεί CA56666, CA23074, και GM008718. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

από τις εκτιμώμενες 565.650 άνθρωποι στις ΗΠΑ που θα πεθάνουν από καρκίνο το 2008, σχεδόν όλοι θα έχουν μετάσταση [1]. Μαστού, του προστάτη, του νεφρού, του θυρεοειδούς και καρκίνων του πνεύμονα με μεταστάσεις στο κόκκαλο. Τα καρκινικά κύτταρα εντός του οστού προκαλούν αντιδράσεις οστεολυτικές και οστεοβλαστικές και ανικανότητα οστικό πόνο και κατάγματα [2], [3]. Ένας σημαντικός στόχος είναι να αποτρέψει ή να καθυστερήσει προκαλείται από τον καρκίνο του πόνου των οστών. Επεμβατική και μεταστατικούς ανθρώπινους όγκους του προστάτη εκφράζουν ιντεγκρίνη A6B1, έναν υποδοχέα για συστατικά εξωκυτταρικής θεμέλιας ουσίας του οστού, δηλαδή, η λαμινίνη 332 και λαμινίνη 511 [4] – [10]

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη είναι μία βραδείας νόσος που χαρακτηρίζεται από. προοδευτικές αλλαγές προσκόλληση κατά τη μετάβαση από κανονικούς αδένες να προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) σε διηθητικό καρκίνο [5], [16] – [19]. Πρόσφατη εργασία έχει δείξει μεταβολή στο φυσιολογικό ανθρώπινο οργανισμό και την προσκόλληση μορίων προστατικού ιστού κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου του προστάτη [5], [15]. Διαφυγής από τον αδένα του προστάτη και εισβολή διαμέσου της κάψουλας συνδέεται με κακή πρόγνωση ενώ περιορίζονται νόσος είναι θεραπεύσιμη. Μεταβολές στα μόρια προσκόλλησης και οι μεταγενέστεροι συνέπειες σηματοδότησης μπορεί να ευθύνεται για την διεγείρεται εισβολή των καρκινικών κυττάρων από τον τόπο προέλευσής τους. Οι ιντεγκρίνες είναι διαμεμβρανικές υποδοχείς προσκόλλησης ετεροδιμερούς κυττάρου [15]. Ιντεγκρίνης έκφρασης εντός του φυσιολογικού προστάτη αδένα αντικατοπτρίζει την ποικιλομορφία των συστατικών της εξωκυττάριας μήτρας. Τα φυσιολογικά πρότυπα ιντεγκρίνης έκφρασης διατηρείται σε αλλοιώσεις σε οποίο η κανονική βασικά κύτταρα που διατηρούνται και εισβολή δεν έχει συμβεί (δηλαδή, PIN αλλοιώσεις) [5], [16] – [19]. Ωστόσο, μέσα σε διηθητικά καρκινώματα, η πλειοψηφία των ιντεγκρίνης υπομονάδες δεν παρατηρήθηκαν στα κυττάρου όγκου επιφάνειες. Μια αξιοσημείωτη εξαίρεση την διάχυτη απώλεια της ιντεγρίνης έκφρασης είναι επίμονη έκφραση των υποδοχέων λαμινίνης, Α3 (10% των περιπτώσεων) και Α6 (69% των περιπτώσεων) ιντεγκρίνες, παρατηρήθηκε στο επιθετικό καρκίνωμα ανθρώπινου προστάτη που λαμβάνεται μετά από ριζική προστατεκτομή [5], [17]. Οι μελέτες δείχνουν ότι οι υποδοχείς λαμινίνης A6B1 και Α3Β1 διατηρούνται στην πλειοψηφία των καρκινωμάτων του προστάτη. Κατά τη διάρκεια της ανθρώπινης ΡΙΝ για μετάβαση καρκίνωμα του προστάτη, A6B4 ιντεγκρίνης έκφραση έχει χαθεί και A6B1 ιντεγκρίνης κυριαρχεί στην επεμβατική ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και σε μεταστατικές αλλοιώσεις [4], [6]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν εμπλέξει τις ιντεγκρίνες A6 στην πρόοδο του καρκίνου [20]. Τα εξωκυτταρικά προσδέματα για A6B1 λαμινίνης 332 και 511, εξέχοντα συστατικά των ανθρώπινων και των οστών ποντικού μυελού [7], [21].

Μια επιθεώρηση της A6B1 ιντεγκρίνης έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη αποκαλύπτει μία νέα δομική παραλλαγή η επιφάνεια των κυττάρων που ονομάζεται A6pB1 [11], [14], [22]. Η υπομονάδα ιντεγκρίνης Α6 διασπάται στο μισό στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων σε συγκεκριμένα υπολείμματα αμινοξέων με αποτέλεσμα την απώλεια του τομέα βήτα βαρέλι και αφήνοντας το υπόλοιπο του υποδοχέα ανέπαφη [12]. καρκινικά κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν ένα μεταλλαγμένο υποδοχέα που δεν μπορεί να διασπαστεί, είχε ως αποτέλεσμα μια αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων σε λαμινίνη 332 υπό συνθήκες καλλιέργειας ιστού [13].

Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε αν ιντεγκρίνης διάσπαση θα μπορούσε να επηρεάσει κύτταρο όγκου μετανάστευση εντός κλινικά σχετική ιστοσελίδα μετάσταση, όπως των οστών. Χρησιμοποιήσαμε ένα νέο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού πόνου των οστών για να προσδιοριστεί άμεσα τα αποτελέσματα ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων τοποθετείται εντός του ζώντος οστικής μήτρας επί προκληθέντα καρκίνο πόνο των οστών. Ο μυελός των οστών είναι πλούσια σε λαμινίνη 332 (λαμινίνης 5) και λαμινίνη 511 (λαμινίνη 10) [8], [9], οι συνδέτες για την ιντεγκρίνη A6B1 [7]. Δοκιμάσαμε περαιτέρω την επίδραση στην επαγόμενη από τον καρκίνο του πόνου των οστών από την προηγούμενη δουλειά εμπλέκεται έντονα ιντεγκρινών στη διατήρηση του νευροπαθητικού πόνου [23].

Αποτελέσματα

Κατά συνέπεια, χρησιμοποιήσαμε το PC3N-Α6-WT και PC3N-A6-RR καρκινικά κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν ισοδύναμα επίπεδα της υπομονάδας A6 άγριου τύπου (διασπώμενων να A6p μέσω επεξεργασίας υΡΑ) και ο μη-διασπάσιμο υπομονάδα, αντίστοιχα (Σχ. 1α). Τα επίπεδα έκφρασης επιφανείας των υποδοχέων ήταν ισοδύναμα όπως προσδιορίστηκε με ανάλυση ροής (Σχ. 1β) Cytometry (FACS). Η ικανότητα να διασπούν τον υποδοχέα με πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης Activator (υΡΑ) και την παραγωγή του δομικού παραλλαγής A6p δείχνεται σχηματικά (Εικ. 1c). Στη συνέχεια εξετάσαμε τις λειτουργικές ιδιότητες του Α6 ιντεγκρίνης χρησιμοποιώντας μια μήτρα που περιέχει λαμινίνη 111, matrigel, τροποποιημένο ώστε να περιέχει λαμινίνη 332. Matrigel είναι ένα λαμινίνη πλούσια εξωκυτταρική μήτρα που μοντέλα φυσιολογικώς σχετικές συνθήκες [24]. Τα κύτταρα PC3N-A6-WT μετανάστευσαν μέσα matrigel κατά τρόπο που ιντεγρίνης εξαρτώμενη (Σχ. 1 d). Τα κύτταρα που περιέχουν το uncleavable υποδοχέα, PC3N-A6- RR, δεν ήταν σε θέση να μεταναστεύσουν σε matrigel, σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας συνήθεις συνθήκες καλλιέργειας ιστού (Σχ. 1δ) [13].

(α) την έκφραση της το πλήρες μήκος 6 ιντεγκρίνης (6) και υΡΑ εξαρτώμενη παραγωγή του 6P παραλλαγής (6ρ) προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. κατάσταση Ιντεγκρίνης εντός συνολικά κυτταρολύματα από δοξυκυκλίνη (Dox) ή ουροκινάση (υΡΑ) χωρίς αγωγή (-) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία (+) κυτταρικές γραμμές PC3N-A6-RR PC3N-A6-WT και προσδιορίστηκε. (Β) Η επιφανειακή έκφραση του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων ιντεγκρίνης 6 σε δοξυκυκλίνη επαγόμενη PC3N-A6-WT και τα κύτταρα PC3N-A6-RR προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. PC3N-A6-WT και PC3NA6- RR κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ιντεγκρίνης J1B5 Α6 αντίσωμα πρωτογενούς Rat ακολουθείται από Alexa 488 αντίσωμα αντι-αρουραίου και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το BD FACScan. Η γκρίζα κορυφή δείχνει σήμα φθορισμού από μόνο δευτερεύον αντίσωμα. (C) Σχηματική να απεικονίσουν την διάσπαση του μορφή πλήρους μήκους της 6 ιντεγκρίνης για να δώσει την παραλλαγή 6ρ. Ο ορισμός της PC3N-A6-WT και τα κύτταρα PC3N-A6-RR όσον αφορά την ιντεγκρίνη κατάσταση εμφανίζεται. (D) Ιντεγκρίνης μεσολάβηση μετανάστευση κυττάρων PC3N-A6-WT (επάνω πάνελ) και κύτταρα PC3NA6- RR (κάτω πάνελ) επί matrigel. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν επί matrigel παρουσία καλυπτρίδα να δημιουργήσει μια ελεύθερη ζώνη κύτταρο στην επιφάνεια matrigel. Μετά προσκόλληση των κυττάρων ήταν πλήρης, οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν από την επιφάνεια matrigel για να επιτρέψει τη μετανάστευση προς την ελεύθερη ζώνη κύτταρο υποδεικνύεται από λευκό ή μαύρο καμπύλη γραμμή. Κύτταρα μετανάστευση συνέβη κάτω από βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης στους 37 ° C για περίπου 18 ώρες. Τα κύτταρα είτε αφέθηκαν να μεταναστεύσουν σε απουσία (αριστερά πάνελ) ή παρουσία (δεξιά πάνελ) ιντεγκρίνης αποκλεισμού ΑΙΙΒ2 αντίσωμα. Εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Zeiss Axiovert εφοδιασμένο με αντικειμενικό 2,5Χ.

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα εντός του οστού, προσαρμόσαμε το μοντέλο ποντικού Clohisy-Mantyh στην οποία ο καρκίνος τα κύτταρα εγχέονται άμεσα και σφραγίζεται μέσα στο μηριαίο οστό ενός ποντικού [25]. Αρσενικοί SCID ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη /ξυλαζίνη και ένα αθροτομή έκθεση των κονδύλων του μηριαίου οστού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Μία οπή διανοίχθηκε στον μηριαίο οστό για τη βελόνα ένεσης για να εξασφαλίζεται η ακριβής τοποθέτηση των κυττάρων του όγκου εντός του οστού. Η ακριβής τοποθέτηση της βελόνας εντός του χώρου ενδομυελική του μηριαίου οστού επιβεβαιώθηκε με απεικόνιση (Εικ. 2α, αριστερό πάνελ). Ανθρώπινα κύτταρα όγκου του προστάτη εγχύθηκαν στο δεξί πόδι του ποντικού και της ένεσης σφραγίστηκε με οδοντιατρικό αμάλγαμα (Σχ. 2α, δεξί πάνελ).

λήφθηκαν (Α) Ακτινογραφική φωτογραφίες για να επαληθεύσει την τοποθέτηση της βελόνας μέσα στην ενδομυελική χώρος του μηρού μέχρι το απώτερο τρίτο του οστού (αριστερό πάνελ). Τα καρκινικά κύτταρα ήταν σφραγισμένα εντός του οστού (δεξί πάνελ). (Β) Ακτινογραφική εικόνων που λαμβάνονται σε 21 ημέρες μετά τις ενέσεις που υποδεικνύει την απώλεια οστού είτε από μη κατεργασμένα ποντίκια (έλεγχος) ή ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα όγκου που εκφράζουν την ιντεγκρίνη άγριου τύπου (PC3N-A6-WT) ή το μεταλλαγμένο ιντεγκρίνη (PC3N-A6-RR). (Γ) Ποσοτικοποίηση της απώλειας οστού σε ζώα είτε ψευδή εγχύεται (έλεγχος) ή ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν την ιντεγκρίνη άγριου τύπου (PC3N-A6-WT) ή το μεταλλαγμένο ιντεγκρίνη (PC3N-A6-RR). Η οστική απώλεια βαθμολογήθηκε σύμφωνα με την ακόλουθη 5 σημείο κλίμακα: 0 = κανονικό, 1 = απώλεια οστού που παρατηρείται σε λιγότερο από το μισό του περιφερικού τρίτου του οστού, 2 = απώλεια οστού που παρατηρείται σε περισσότερο από το ήμισυ του περιφερικού τρίτου του οστού, δεν κάταγμα, 3 = πλήρης πάχος μονού μανδύα της οστικής απώλειας που δείχνει κάταγμα μονού μανδύα των οστών, 4 = πλήρης πάχος διφλοιώδεις απώλεια οστικής μάζας που δείχνει διφλοιώδεις κάταγμα οστού. (Δ) Το ποσοστό των ποντικών με κάταγμα 21 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση. Ο αριθμός των ποντικών σε κάθε ομάδα ήταν δώδεκα.

Η

Προσδιορίσαμε επόμενο τα δηλητηριώδη αποτελέσματα των καρκινικών κυττάρων που κατοικούν μέσα στο οστό με τη χρήση τυποποιημένων ακτινογραφική απεικόνιση σε ζώντα ζώα 21 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση. Όλα τα ζώα που ενέθηκαν με PC3N-A6-WT, και τα κύτταρα PC3N-A6-RR αναπτυχθεί απώλεια οστού 21 ημέρες μετά το χειρουργείο (Σχ. 2β). Εικόνες έδειξε σταθερά οστεολυτικές δραστηριότητας, ιδίως του οστού μεταφυσιακού στο άπω (γόνατο) άκρο του μηριαίου οστού. Ποντικοί εγχύθηκαν με τα κύτταρα PC3N-A6-WT δείχνει δραματικά πιο απώλεια οστικής μάζας σε σύγκριση με εκείνους με ένεση με τα κύτταρα PC3N-A6-RR. Αριθ απώλεια οστού παρατηρήθηκε σε ζώα που έλαβαν ένεση με μέσο μόνο (Σχήμα 2β). Τα ζώα εγχύθηκαν με τα κύτταρα PC3N-A6-WT έδειξαν αυξημένη απώλεια οστικής μάζας σε σύγκριση με εκείνους που ενέθηκαν με κύτταρα PC3N-A6-RR (Σχ. 2β). Οι ακτινογραφίες βαθμολόγησαν σύμφωνα με μια κλίμακα 4 σημείων όπου το 0 δεικνύει κανονικό οστό και 3 υποδεικνύει πλήρους πάχους διφλοιώδεις απώλεια οστού (Σχ. 2c). Ζώα ενέθηκαν με κύτταρα PC3N-A6-WT παρουσίασαν δραματική αύξηση στην κατάγματα (μονού μανδύα ή διφλοιώδεις) 21 ημέρες μετά τη χειρουργική επέμβαση σε σύγκριση με τα PC3N-A6-RR ποντίκια με αγωγή (Σχ. 2δ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η τοποθέτηση των κυττάρων του όγκου εντός του οστού που περιέχει μια μη διασπάσιμη Α6 ιντεγκρίνης καταλήγει σε μία σημαντική καθυστέρηση στην ανάπτυξη της οστικής απώλειας.

Αν και τα αποτελέσματα απεικόνισης παρέχονται πληροφορίες σχετικά με σοβαρή καταστροφή του οστού, το έκανε δεν δίνουν άμεσες πληροφορίες σχετικά με την κατανομή των κυττάρων του όγκου. Η οστική απώλεια είναι συνέπεια σε μέρος των κυττάρων του όγκου που κατοικούν μέσα στο οστό? ένα γεγονός που επηρεάζει δραματικά την κρίσιμη ισορροπία της οστεολυτικές και οστεοβλαστικές δραστηριότητα [3]. Ερευνήσαμε άμεσα την κατανομή των κυττάρων του όγκου μέσα στο οστό χρησιμοποιώντας ιστολογική ανάλυση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση απασβεστωμένες δειγμάτων. Τα οστά ποντικού προσεκτικά προσανατολισμένες για τις διαμήκεις τομές για να συμπεριλάβει την παρατήρηση της επιφυσιακής πλάκας, καθώς και την περιφερική περιοχή του οστού στο ίδιο τμήμα (Εικ. 3Α, άνω πλαίσιο). Η ανάλυση των οστών από τα ζώα του όγκου εγχύθηκαν απέδειξαν την παρουσία του όγκου σε ολόκληρο ενδομυελική χώρο του οστού σε εκείνους ένεση με κύτταρα PC3N-A6-WT μαζί με εισβολή στο φλοιώδες οστό (Σχ. 3Α, κεντρικό φύλλο). Τα καρκινικά κύτταρα που περιέχουν το διασπάσιμο ιντεγκρίνη είχε φθάσει την πλάκα επιφύσεων? ο μυελός των οστών ήταν εντελώς αντικατασταθεί. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τη γνώση ότι μόλις ο καρκίνος του προστάτη έχει εγκατασταθεί στο μυελό των οστών θα αντικαταστήσει τελικά το μυελό, διακόπτοντας την ομοιόσταση των οστών [3]. Σε αντίθεση, PC3N-A6-RR εγχυθεί ζώων που περιέχονται καρκινικά κύτταρα στα μέσα άξονα περιοχή του οστού και ο όγκος απέτυχε να φθάσει την πλάκα επίφυσης. Φυσιολογικό μυελό των οστών ήταν παρούσα στις περιοχές που δεν περιείχαν κύτταρα όγκου (Σχ. 3Α, κάτω πλαίσιο). Τα καρκινικά κύτταρα στο εσωτερικό της μεσαίας περιοχής άξονα ή εκείνες που είχαν φθάσει την πλάκα επιφύσεων ήταν βιώσιμα και μορφολογικά δυσδιάκριτα. (Εικ. 3Α, και στο κάτω πάνελ, ένθετα). Το πρότυπο κατανομής όγκου βρέθηκε να είναι συνεπής στην ιστολογική ανάλυση όλων των ζώων δοκιμής δοκιμάστηκαν.

(Α) χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης του κανονικού οστού (έλεγχος) ή οστό ένεση με PC3N-A6-WT κύτταρα (WT, μεσαίο πάνελ και ένθετο) και PC3N-Α6-RR κύτταρα (RR, κάτω πάνελ και ένθετο). Η πλάκα της ανάπτυξης του οστού (επιφύσεων πλάκα) είναι προσανατολισμένη στην επάνω αριστερή γωνία του κάθε πάνελ για σκοπούς σύγκρισης. (Β) Ανάλυση RT-PCR για την ανίχνευση της έκφρασης του μεταλλαγμένου 6 ιντεγκρίνης στο μυελό των οστών. Είκοσι μία ημέρες μετά την ένεση, το μυελό των οστών συλλέχθηκε, RNA εκχυλίστηκε και αναλύθηκε. RNA από κύτταρα PC3N-A6-WT και τα κύτταρα PC3N-A6-RR αναπτύσσονται σε καλλιέργεια ιστού σε σύγκριση με το μυελό των οστών που απομονώνεται από ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PC3N-A6-WT (κύτταρα από μυελό των οστών WT) ή κύτταρα PC3NA6- RR (οστό κύτταρα μυελού-RR). ενίσχυση GAPDH πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος και οι δείκτες kB είναι όπως φαίνεται.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι τα ένεση καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το μεταλλαγμένο ιντεγκρίνης, 21 ημέρες μετά την ένεση PC3N-Α6-WT ή κύτταρα PC3N-A6-RR, ο μυελός εκφράστηκε από το χώρο ενδομυελική των μηριαίων οστών ποντικού. Η ανάλυση των δειγμάτων μυελού των οστών οδήγησε σε mRNA ειδικών για τα κύτταρα PC3N-A6-RR στο μυελό από ποντίκια ενιεμένα με PC3N-A6-RR, αλλά δεν PC3N-A6-WT ποντικούς. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα κύτταρα PC3N επιμολυσμένα με το uncleavable A6 ιντεγκρίνης διατηρείται έκφραση του μεταλλαγμένου ιντεγκρίνης εντός του χώρου ενδομυελική του μηριαίου οστού και ήταν παρόντες 21 ημέρες μετά την έγχυση των κυττάρων εντός του μηριαίου οστού (Σχ. 3Β).

Συμπεριφορική αναλύσεις αυθόρμητη και προκάλεσε τον πόνο προσδιορίστηκαν 21 ημέρες μετά την ένεση του PC3N-A6-WT ή κύτταρα PC3N-A6-RR στο μηριαίο οστό για την αξιολόγηση του ρόλου της διάσπασης του Α6 ιντεγκρίνης για την ανάπτυξη της αυθόρμητης και προκάλεσε τον καρκίνο συμπεριφορές πόνου. Αυθόρμητη πόνου μετρήθηκε με αξιολόγηση συσπάσεις του καρκίνου αντιμετωπίζονται οπίσθιου άκρου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Ποντικοί εγχύθηκαν με κύτταρα PC3N-A6-WT έδειξαν αυξημένη αυθόρμητη συμπεριφορά συσπάσεις σε σύγκριση με ποντικούς που υπέστησαν αγωγή PC3N-A6-RR η οποία κατέδειξε χαμηλά επίπεδα συσπάσεις που ήταν συγκρίσιμα με τα ζώα ελέγχου (Εικ. 4α). Προκλητά πόνος, όπως υποδεικνύεται από απτική αλλοδυνία, προσδιορίστηκε με την απόσυρση του ποδιού από σχολαστικά του οπισθίου ομόπλευρων ποδιών προς το μηρό θεραπεία του καρκίνου με βαθμονομημένο νημάτια νοη Frey όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Ποντικοί εγχύθηκαν με τα κύτταρα PC3NA6-WT έδειξε απτική αλλοδυνία, όπως υποδεικνύεται από μείωσε κατώτατο όριο για την απόσυρση του ποδιού από νοη Frey νημάτια (Εικ. 4β). Σε αντίθεση, PC3N-A6-RR εγχυθεί ποντίκια δεν έδειξαν αλλοδυνία αφής, με τα κατώτατα όρια απόσυρση πέλματος που είναι παρόμοια με τα ζώα ελέγχου (Εικ. 4β). Κίνηση-προκλητά πόνου προσδιορίστηκε με βαθμολογία τη χρήση των άκρων κατά την κανονική περιπατητική κίνηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Ποντίκια ένεση με κύτταρα PC3N-Α6-WT αναπτυχθεί κυκλοφορία που προκαλείται από τον πόνο, ενώ τα ποντίκια ένεση με κύτταρα PC3N-Α6-RR έδειξε καμία κίνηση που προκαλείται από τον πόνο, με βαθμολογίες χρήση άκρων η ίδια με ζώα ελέγχου (Εικ. 4γ).

(Α) Αυθόρμητη πόνο όπως μετράται από flinching του ομόπλευρου hindlimb προσδιορίστηκε σε ψευδή εγχυθεί ζώα (έλεγχος) ή εκείνα που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν τον άγριο τύπο ιντεγκρίνης (PC3N-A6-WT) ή εκείνα που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν την μεταλλαγμένη ιντεγκρίνη (PC3N-Α6-RR). Υψόμετρο στη flinching συμπεριφορά είναι ενδεικτική μιας αυξημένης αντίδραση του πόνου. (Β) Απτική αλλοδυνία όπως μετράται με απόσυρση πέλματος από νοη Frey νημάτια σε ψευδή εγχυθεί ζώα (ελέγχου) ή εκείνα που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν τον άγριο τύπο ιντεγκρίνης (PC3N-A6-WT) ή εκείνα που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το μεταλλαγμένο ιντεγκρίνης (PC3N-Α6-RR). Μία μείωση του ορίου απόσυρσης είναι ενδεικτική μιας αυξημένης απόκρισης πόνου. (Γ) Κίνηση προκλητών πόνος παρατηρήθηκε σε ψευδή εγχυθεί ζώα (έλεγχος) ή εκείνα που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν τον άγριο τύπο ιντεγκρίνης (PC3N-A6-WT) ή εκείνα που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το μεταλλαγμένο ιντεγκρίνης (PC3N-A6-RR) .

η

Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η διάσπαση της ιντεγρίνης A6 επηρέασαν την ανάπτυξη της cancerinduced αυθόρμητη και προκάλεσε τον πόνο που σχετίζεται με την απώλεια οστού και καταγμάτων. Πρόληψη διάσπαση ιντεγκρίνης A6 μείωσε δραματικά την απώλεια οστού και την ανάπτυξη του cancerinduced πόνου. Σε αντίθεση, η έκφραση της διασπώμενης ιντεγκρίνης A6 αυξημένη cancerinduced οστική απώλεια και κατάγματα με ταυτόχρονη αύξηση της συμπεριφοράς του πόνου.

Συζήτηση

Στην εργασία αυτή αξιοποιείται άμεσα μοντέλο των οστών ένεση για να τοποθετήσει συγκεκριμένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη απευθείας στο φυσιολογικώς και κλινικώς σχετικό περιβάλλον οστό, πλούσια σε λαμινίνη 332 και 511. Αυτό μας επέτρεψε να καθοριστεί εάν το κλείδωμα παραγωγή ενός υποδοχέα λαμινίνης (A6pB1) θα μετέβαλε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να μεταναστεύουν ή να τροποποιεί το περιβάλλον στο εσωτερικό το οστό και το κατά πόσον αυτή η λειτουργική σημασία που πραγματοποιήθηκε από την άποψη του πόνου των οστών.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τροποποίηση της παραγωγής του υποδοχέα A6pB1 λαμινίνης στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου μπορεί να παρεμποδίσει σημαντικά τη μετανάστευση εντός του οστού. Το μοντέλο άμεσου ψεκασμού επιτρέπει την ακριβή τοποθέτηση των γνωστών αριθμών των κυττάρων του όγκου εντός του οστού. Δεδομένου ότι τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται εξίσου καλά ανεξάρτητα από την κατάσταση της ιντεγκρίνης [13], [27] (και τα δύο σε ιστοκαλλιέργεια και ως ανθρώπινων όγκων σε ποντίκια), τα δεδομένα δείχνουν ότι η κατανομή των καρκινικών κυττάρων εντός του οστού μπορεί να είναι ένα βασικό στοιχείο που επηρεάζει τον καρκίνο που προκαλείται πόνος στα οστά. Η ανικανότητα των κυττάρων του όγκου να φτάσει στην περιοχή επίφυσης του οστού λόγω της ιντεγκρίνης κατάσταση συνέπεσε με αξιοσημείωτη μείωση από τρεις διακριτές μετρήσεις της συμπεριφοράς του πόνου. Ενώ είναι άγνωστο προς το παρόν αν θέση των κυττάρων όγκου εντός των οστών και του πόνου των οστών που συνδέονται λειτουργικά με άλλες αναφορές έχουν δείξει ότι εντός των οστών, μικροπεριβάλλοντα είναι επαρκώς διακριτές ώστε να δικαιολογεί τη δυνατότητα αυτή [28].

Είναι πιθανό ότι η μειωμένη οστικό πόνο οφείλεται στην αδυναμία του ιντεγκρίνης που πρόκειται να διασπαστεί, ανεξάρτητα από τη θέση των κυττάρων όγκου εντός του οστού. Οι ιντεγκρίνες και καντερίνες σχισμένα ή να ρίξει σε καρκινικό κύτταρο επιφάνειες [29] – [32]. Οι απελευθερωμένες θραύσματα υποδοχέων που υποβάλλονται σε διάσπαση εξωτομέα είναι βιολογικώς δραστικά και μπορεί να συμβάλει στην επαγόμενη από καρκίνο πόνου των οστών [33]. Περαιτέρω πειράματα θα γίνεται διάκριση μεταξύ αυτών των δυνατοτήτων.

Αν και οστικές μεταστάσεις είναι παραδοσιακά πιστεύεται ότι είναι είτε οστεολυτικές ή οστεοβλαστική, μορφολογικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι, στους περισσότερους ασθενείς, οστικές μεταστάσεις έχουν τόσο οστεολυτικές και οστεοβλαστικές στοιχεία [38]. Σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, μεταστάσεων στα οστά δείχνουν συχνά περισσότερο οστεοβλαστική φαινότυπο, αν και ορισμένοι ασθενείς έχουν οστεολυτικές βλάβες παρόμοιες με εκείνες που παρατηρούνται σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού [38]. Αυτή η έρευνα επικεντρώθηκε σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη που παράγονται ως επί το πλείστον οστεολυτική ανάπλαση οστού στο οστό του ποντικιού. Η αδυναμία της ιντεγκρίνης που πρόκειται να διασπασθεί κατέληξε σε μειωμένη οστική απώλεια και κάταγμα. Δεδομένου ότι τα περισσότερα απώλεια οστού και καταγμάτων παρατηρούνται στο περιφερικό άκρο του οστού, η ανικανότητα των κυττάρων του όγκου να φτάσει η περιοχή επίφυσης του οστού μπορεί να έχει μειώσει την απώλεια οστικής μάζας και κατάγματος στην εν λόγω περιοχή. Οι μελλοντικές μελέτες σχετικά με το ρόλο των ιντεγκρινών επί οστεοβλαστικών ανάπλαση οστού θα χρειαζόταν να καθοριστεί αν μεταβάλλουν τη λειτουργία ιντεγκρίνης θα μεταβάλλει επίσης οστεοβλαστική αντιδράσεις στο οστό.

Τέλος σημειώνουμε ότι η καταστροφή που προκαλείται καρκίνος των οστών συνδέεται με σοβαρά μειωμένη ποιότητα του ζωή οι οποίες προκύπτουν από επιπλοκές όπως υπερασβεστιαιμία, κάταγμα οστού και ανικανότητα πόνο. Οι πρόοδοι στην ανίχνευση και θεραπεία του καρκίνου επεκτείνοντας το προσδόκιμο ζωής των ασθενών με καρκίνο και αυξάνοντας την εστίαση στη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Τόσο η χρήση του νέου μοντέλου ποντικού ξενομοσχεύματος για τη μελέτη της πρόληψης του καρκίνου του επαγόμενης πόνο στα οστά και τη στόχευση υποδοχέων προσκόλλησης στην επιφάνεια του κυττάρου του όγκου για το οστό θα πρέπει να επηρεάσουν σημαντικά την ποιότητα ζωής των ασθενών με μεταστατική νόσο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινου προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές

Τα κύτταρα PC3N επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που περιέχουν είτε το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο Α6 ιντεγκρίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Οι σταθεροί κλώνοι (PC3N-A6-WT εκφράζουν άγριου τύπου Α6 ιντεγκρίνης και PC3N-A6-RR που εκφράζουν το μη-διασπάσιμο ιντεγκρίνης Α6) απομονώθηκαν και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. PC3N-A6-WT και PC3N-A6-RR κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Iscove κατά Dulbecco (ΙΜϋΜ) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) συν 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε παρουσία 6 g /ml Blasticidin ( Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) και 1 g /ml ζεοκίνη (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)

αντισώματα και Χημικά

Τα αντισώματα είχαν ως εξής:. J1B5, αρουραίος μονοκλωνικά αντι- A6 ιντεγκρίνης (Δρ Caroline Damsky, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, στο Σαν Φρανσίσκο, ΗΠΑ) [34]? αντι-A6 ιντεγκρίνης AA6A κουνελιού πολυκλωνικό [13] και ΑΙΙΒ2, μονοκλωνικά αρουραίου αντι B1 ιντεγκρίνης [35] (American Type Culture Collection). Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη EGF αγοράστηκε από την Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA. Η ουροκινάση αγοράστηκε από την Chemicon (Temecula, CA, USA).

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή και μετά πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό HEPES και λύθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό RIPA συν αναστολείς πρωτεάσης (PMSF , 2 mM? λευπεπτίνη και απροτινίνη, 1 g /ml). Τα προϊόντα λύσης για λίγο σε υπερήχους επί πάγου προτού εναιωρείται σε 2 χ μη-αναγωγικό ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Τα δείγματα έβρασαν για 5 λεπτά, και μετά από μια γρήγορη ψύχρα επί πάγου, τα προϊόντα φορτώθηκαν 7.5% SDS-PAGE. Πρωτεΐνες επιλυθεί στο γέλη ηλεκτρομεταφέρθηκαν να Millipore μεμβράνη Immobilon-P πολυβινυλιδένιο φθορίδιο (PVDF) (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA), επωάστηκαν με Western αντισώματα κηλίδωση συν δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανιού και οπτικοποιούνται με χημειοφωταύγεια (ECL Western Blotting Detection System , Amersham, Arlington Heights, IL, USA).

Δοκιμασία Matrigel μετανάστευση

Έξι φρεατίων επικαλύφθηκαν με 1 ml Matrigel (BD Biosciences, Bedford, ΜΑ) και συμπληρωμένο με λαμινίνη 332 περιέχει συσκευασμένων μέσο από κύτταρα HaCaT σε 2:01 αναλογία και αφέθηκε να στερεοποιηθεί. Ένα αποστειρωμένο κυκλική καλυπτρίδα τοποθετήθηκε στο κέντρο. Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε πλάκες και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 2 ώρες στους 37 βαθμούς C. Οι μη προσκολλημένα κύτταρα αφαιρέθηκαν και στη συνέχεια καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν αφήνοντας μια σαφή ζώνη στο κέντρο της πλάκας. Η περιφέρεια αυτής της ζώνης σημαδεύτηκε. Άνευ ορού μέσο ή μέσο ελεύθερο ορού με ανασταλτικό αντίσωμα προστέθηκε στα κύτταρα και αφέθηκαν να επωαστούν στους 37 βαθμούς C για 18 ώρες. 1 ng /ml EGF προστέθηκε στα μέσα μαζικής ενημέρωσης για την πρόκληση της μετανάστευσης. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου Zeiss Axiovert (2,5 × μεγέθυνση) και οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μια κάμερα CCD.

Χειρουργική

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα είχαν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο της Αριζόνα ιδρυματική φροντίδα των ζώων και η επιτροπή χρήση, IACUC πρωτόκολλο # 06-081. Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη /xylacine και ένα αθροτομή έκθεση των κονδύλων του μηριαίου οστού. Μία οπή διανοίχθηκε στον μηριαίο οστούν, και η βελόνα εισήχθη εντός της οπής. ΡθχϊΙγοπ εικόνες ελήφθησαν στις 2 αεροπλάνα να ελέγξει την τοποθέτηση της βελόνας στο εσωτερικό του χώρου ενδομυελική του μηριαίου οστού. PC3N-A6-WT, ή PC3N-A6-RR κύτταρα, 10

6 σε 5 υΐ διηθείται ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), ή 5 μΙ διηθείται ΜΕΜ που περιέχει 1% BSA μόνο (έλεγχος) εγχύθηκε εντός του χώρου ενδομυελική του μηριαίου οστού ποντικού της δεξί πόδι και το σημείο της ένεσης σφραγίστηκε με οδοντιατρικό αμάλγαμα. Για τα ακόλουθα πειράματα 12 ζώα έλαβαν PC3N-A6-WT, 12 έλαβαν κύτταρα PC3N-A6-RR, και 12 ζώα έλαβαν ελεύθερο κυττάρων ορού (έλεγχος).

Behavioral Pain Μέτρα [26]

Κίνημα που προκαλείται πόνος

. Το ποντίκι τοποθετήθηκε σε ένα άδειο τηγάνι ποντίκι και παρατηρείται, ενώ το περπάτημα σε όλη την κατσαρόλα σε μια συνεχή κίνηση. Χωλότητα ή /και φύλαξη συμπεριφορά του δικαιώματος (καρκίνος ένεση) hindlimb βαθμολογήθηκε στην ακόλουθη κλίμακα: 0 = πλήρης έλλειψη χρήσης, 1 = μερική μη χρήση, 2 = χωλότητα και η φύλαξη, 3 = χωλότητα, 4 = κανονικό περπάτημα.

Η αυθόρμητη πόνο

. Για να εκτιμηθεί flinching και φύλαξη της συμπεριφοράς, τα ζώα τοποθετήθηκαν σε ανέκυψαν θαλάμους πλεξιγκλάς με σύρμα πάτωμα πλέγματος για την παρατήρηση των flinching και φύλαξη του δικαιώματος hindlimb. Τα ποντίκια αφέθηκαν να εγκλιματιστούν στο θάλαμο για 20 λεπτά. Κιγκλιδώματα και flinching συμπεριφορές κάθε ποντικού μετρήθηκαν για 2 λεπτά. Ο αριθμός των συσπάσεων απαριθμήθηκε, και ο χρόνος που δαπανάται φύλαξη του ποδιού (το πέλμα ανυψώνεται μακριά του πατώματος) μετρήθηκε.

Η απτική υπερευαισθησία (αλλοδυνία)

. Paw όρια απόσυρσης από νοη Frey νημάτια προσδιορίστηκαν με τον τρόπο που περιγράφεται από τους Chaplan et al. Κατώφλι [36] απόσυρσης του ποδιού προσδιορίστηκε σε απόκριση προς ανίχνευση με βαθμονομημένο νημάτια νοη Frey. Τα ποντίκια διατηρούνται σε εναιώρηση κλουβιά με σύρμα δάπεδα πλέγματος και το νημάτιο νοη Frey εφαρμόστηκε κάθετα προς την πελματιαία επιφάνεια του ποδιού του ποντικιού μέχρι να λύγισε ελαφρώς, και κρατήθηκε για 3-6 δευτερόλεπτα. Μία θετική απόκριση υποδείχθηκε από μια απότομη απόσυρση του πέλματος. Το ανώτατο όριο απόσυρσης ποδιού του 50% προσδιορίστηκε με την μη-παραμετρική μέθοδος Dixon [37]. Μια αρχική ανιχνευτής αντιστοιχεί σε 2 g εφαρμόστηκε και αν η απάντηση ήταν αρνητική, ο ερέθισμα σταδιακά αυξάνεται μέχρις ότου ελήφθη μια θετική απάντηση, στη συνέχεια μειώθηκε μέχρις ότου ελήφθη αρνητικό αποτέλεσμα. Αυτή η μέθοδος πάνω-κάτω επαναλήφθηκε μέχρις ότου προσδιορίστηκαν 3 αλλαγές στη συμπεριφορά, και συνοψίστηκε το σχέδιο των θετικών και αρνητικών απαντήσεων. Το ανώτατο όριο απόσυρσης ποδιού του 50% προσδιορίστηκε ως (10

[Xf + k *]) /10000, όπου Xf = η τιμή της τελευταίας νημάτιο νοη Frey που χρησιμοποιείται, k value = Dixon για το θετικό /αρνητικό μοτίβο, και * = η μέση (log) διαφορά μεταξύ ερεθισμών. Όλες οι δοκιμασίες πόνου πραγματοποιήθηκαν σε κάθε ζώο με την ακόλουθη σειρά, κίνηση που προκαλείται από τον πόνο, αυθόρμητος πόνος (μετά την περίοδο εγκλιματισμού 20 λεπτά), και απτική υπερευαισθησία.

Προσδιορισμός της καταστροφής των οστών

Οι ακτινογραφίες ελήφθησαν πριν από την ένεση των καρκινικών κυττάρων (βασική γραμμή, BL) και 21 ημέρες μετά την επαγωγή του καρκίνου των οστών χρησιμοποιώντας μία μηχανή Faxitron MX-20 σε 7 um ονομαστική ανάλυση με ένα ρεύμα ακτίνων Χ 300 μΑ και μια τάση 26 kV (Faxiton ακτίνων Χ Corp., Wheeling, IL). Ψηφιακές ακτινογραφίες ελήφθησαν μετά από συμπεριφοράς δοκιμές σε 12 ζώα ανά συνθήκη θεραπείας. Εικόνες συνελήφθησαν από μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή και μεταφέρεται στον υπολογιστή και αποθηκεύονται σε ψηφιακή μορφή αποχρώσεις του γκρι (TIFF). Η οστική απώλεια βαθμολογήθηκε σύμφωνα με την ακόλουθη 4 σημείο κλίμακα:. 0 = κανονική, 1 = απώλεια οστού, όχι κάταγμα, 2 = πλήρους πάχους μονού μανδύα απώλεια οστού υποδεικνύοντας μονού μανδύα κάταγμα οστού, 3 = πλήρους πάχους διφλοιώδεις απώλεια οστού υποδεικνύοντας διφλοιώδεις κάταγμα οστού

Στατιστικές αναλύσεις

οι στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων θεραπείας έγιναν χρησιμοποιώντας ANOVA. Κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με t-test του Student, πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με χρήση Newman-Keuls πολλαπλών συγκριτική δοκιμή. Για την δοκιμασίες αξιολόγησης, χρήση των άκρων και απώλεια οστού, στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση μη-παραμετρική ανάλυση με τη δοκιμασία Mann-Whitney. Για όλες τις αναλύσεις, σημαντικότητας ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Η ιστολογική ανάλυση του όγκου μέσα στο οστό

Την ημέρα 21 μετά τη χειρουργική επέμβαση, τα ποντίκια βαθιά αναισθησία με κεταμίνη και διαποτίζονται ενδοκαρδιακά με 25 ml 0.1 Μ PBS που ακολουθείται από 25 ml 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Η ομόπλευρη μηριαία απομακρύνθηκαν από 6 ζώα ανά συνθήκη και μετασταθεροποιήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη. Μηριαία ξεπλύθηκαν σε νερό για την απομάκρυνση φορμόλη πριν από την κυκλοφορία στην Decal διάλυμα (RDO-Apex, Aurora, IL), για μια ώρα για να επιτευχθεί απασβέστωση. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη διάλυμα πριν προσεκτικά ενσωμάτωση σε παραφίνη. Είχαν προσανατολισμένο έτσι ώστε ολόκληρο το μήκος του μηρού θα μπορούσε να τομή κατά μήκος. Ενότητες 3 um παχύ βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για να απεικονίσει την κανονική στοιχεία μυελού και τα καρκινικά κύτταρα κάτω από φωτεινό μικροσκόπιο πεδίου. Τα δείγματα παρατηρήθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon (10 × μεγέθυνση) και εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μία κάμερα CCD.

RT-PCR ανάλυση των κυττάρων PC3N-A6-RR στο χώρο ενδομυελική του μηριαίου οστού

<