Αφηρημένο

Ιστορικό

Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι μια ετερογενής ομάδα διαταραχών με έναν αριθμό γενετικών και πρωτεομικής αλλοιώσεις. c-CBL είναι ένα Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης και προσαρμογέα μόριο σημαντικό για την κανονική ομοιόσταση και τον καρκίνο. Έχουμε καθορίσει τις γενετικές παραλλαγές C-

CBL

, σχέση με κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (EGFR και ΚΟΑ), και η λειτουργικότητα σε NSCLC.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας αρχειακό φορμόλη στερεωμένου παραφίνη ενσωματωμένα (FFPE) εκχυλίζεται γενωμικού DNA, δείχνουμε ότι το c-CBL μεταλλάξεις συμβαίνουν σε σωματικά μόδας για καρκίνους του πνεύμονα. γ-CBL μεταλλάξεις δεν ήταν αμοιβαία αποκλειόμενα της ΚΟΑ ή EGFR μεταλλάξεις? ωστόσο, ήταν ανεξάρτητη της ρ53 και KRAS μεταλλάξεις. Στην κανονική ανάλυση /κατά ζεύγη όγκου, υπήρχε σημαντική απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) για την C-

CBL

locus (22%, n = 8/37) και κανένα από αυτά τα δείγματα αποκάλυψαν καμία μετάλλαξη στο υπόλοιπο αντίγραφο του c-CBL. Το C-

CBL

LOH επίσης συσχετίζεται θετικά με EGFR και μεταλλάξεις ΜΕΤ παρατηρήθηκε στα ίδια δείγματα. Χρησιμοποιώντας επιλέξτε c-CBL σωματικές μεταλλάξεις, όπως S80N /H94Y, Q249E και W802 * (που λαμβάνεται από του Καυκάσου, της Ταϊβάν και της Αφρικής και της Αμερικής δείγματα, αντίστοιχα) επιμολυσμένα σε κυτταρικές σειρές NSCLC, υπήρχε αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων και την κυτταρική κινητικότητα.

Συμπεράσματα

Λαμβάνοντας το συνολικό ποσοστό μετάλλαξης του c-CBL να είναι ένας συνδυασμός ως σωματική μετάλλαξη παρανοηματική και LOH, είναι σαφές ότι η C-CBL είναι εξαιρετικά μεταλλαγμένη σε καρκίνους του πνεύμονα και μπορεί να παίζει ουσιαστικό ρόλο στην πνευμονική ογκογένεση και τη μετάσταση

Παράθεση:. Tan Υ-HC, Krishnaswamy S, Nandi S, Kanteti R, Βόρα S, Onel K, et al. (2010) CBL συχνά μεταβάλλεται σε Καρκίνοι του πνεύμονα: η σχέση του με μεταλλάξεις στο ΚΟΑ και EGFR κινασών της τυροσίνης. PLoS ONE 5 (1): e8972. doi: 10.1371 /journal.pone.0008972

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Οκτωβρίου 2009? Αποδεκτές: 9η Ιανουαρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιανουαρίου, 2010

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) Επιχορηγήσεις: 5RO1CA125541-03, 3RO1CA125541-03S109 , 5RO1CA129501-02, 3RO1CA129501-02S109, 1R21CA140003-01, MARF, V-Ίδρυμα, Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο και η αμερικανική Αναπνευστικό Σύλλογος Υγείας της Αμερικής (RS) και να χορηγήσει NSC96-2628-B-006-048-my3 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο , Ταϊβάν. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι agenices χρηματοδότηση είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Στις ΗΠΑ μόνο, κάθε χρόνο, περίπου οι 219.400 άνθρωποι διαγιγνώσκονται με καρκίνο του πνεύμονα, από τα οποία περισσότερα από 145.000 από αυτούς υποκύψει στην ασθένεια [1]. Αυτός ο αριθμός είναι κατά προσέγγιση ισοδύναμο με τις συνδυασμένες ποσοστά θνησιμότητας των καρκίνων του μαστού, του προστάτη, του παχέος εντέρου, του ήπατος, των νεφρών και μελάνωμα [1]. Επιπλέον, η πρόγνωση είναι συνήθως κακή και το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι μικρότερο από 15%. Υπάρχουν, επίσης, σημαντικές εθνικές διαφορές για τον καρκίνο του πνεύμονα, και το αποτέλεσμα είναι χειρότερο για τους μαύρους σε σύγκριση με τους λευκούς. οι διαφορές μεταξύ των φύλων είναι επίσης εντυπωσιακή με τις γυναίκες που έχουν σημαντικά καλύτερη πρόγνωση σε σύγκριση με τους άνδρες. Υπάρχει ένας αριθμός από γενετικές αλλαγές που μπορεί να συμβούν στον καρκίνο του πνεύμονα. Ως παράδειγμα, σε NSCLC, μεταλλάξεις στο KRAS, ρ53, EGFR και ΜΕΤ έχουν ταυτοποιηθεί. Πολλά από αυτά τα μονοπάτια, ειδικά υποδοχέα κινασών τυροσίνης (RTKs) ελέγχονται από c-CBL.

CBL

(Casitas Β-γράμμωσης λέμφωμα) είναι ένα γονίδιο θηλαστικού που βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 11q23.3 [2] και εμπλέκεται στην κυτταρική σηματοδότηση και πρωτεΐνη ουβικιτινίωση [3]. CBL πρωτεΐνες ανήκουν στην κατηγορία ΔΑΧΤΥΛΙΔΙ δάχτυλο του λιγασών ουβικουϊτίνης (Ε3) και υπάρχουν τρεις ομόλογες

c-CBL

,

CBL-b

,

CBL-3

[4 ]. Η

c-CBL

και

CBL-β

γονίδια εκφράζονται παντού με τα υψηλότερα επίπεδα σε αιμοποιητικά ιστούς [5].

γ

-CBL αποτελείται από τέσσερις περιοχές που κωδικοποιούν για λειτουργικά διακριτές περιοχές της πρωτεΐνης: δεσμευτική η Ν-τερματική κινάση τυροσίνης (TKB) περιοχή, την περιοχή συνδετήρα, τον τομέα καταλυτική RING δάκτυλο, την περιοχή πλούσια σε προλίνη και το c τερματική ουμπικουϊτίνης-συνδέονται (UBA) τομέα που επικαλύπτει επίσης με έναν τομέα φερμουάρ λευκίνης (LZ) [3]. Δύο τομείς TKB και RING δάχτυλο είναι απαραίτητα για επάγεται με συνδέτη ουβικιτινίωση RTKs [6], [7], [8], [9]. Ο τομέας δακτύλου RING απαιτείται για την πρόσληψη της Ε2 ένζυμα ουμπικουϊτίνης-σύζευξη. Ο τομέας TKB περιλαμβάνει δέσμη τεσσάρων ελίκων (4Η), ένα ασβέστιο biding EF χέρι, και ένα τροποποιημένο τομέα SH2, το οποίο συνδέεται με τα κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης [3], [10], [11], [12]. Επιπλέον, η πλούσια σε προλίνη περιοχή του c-CBL μπορεί να συνδεθεί με την περιοχή SH3 της Grb2, το οποίο μπορεί να προσλάβει έμμεσα c-CBL προς RTKs μέσω της πρωτεΐνης προσαρμογέα GRB2 [7], [13], [14].

c-CBL συνδέεται επίσης με EGFR και ενεργεί ως Ε3 που στοχεύει EGFR για ουβικιτινίωση και υποβάθμιση. Επιπλέον, CBL desensitizes σηματοδότηση EGF και αντιτίθεται κυτταρικό πολλαπλασιασμό που προκαλείται από το ΕΤΠ [15]. ενεργοποίηση EGF φαίνεται επίσης να ενεργοποιήσει την κινάση της τυροσίνης SRC, η οποία φωσφορυλιώνει c-CBL και τη σειρά του ενεργοποιεί την ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του EGFR [16], [17], [18]. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι τα ελαττωματικά ενδοκυττάρωση του EGFR χαρακτηρίζεται από μια μετάλλαξη διαγραφής και το L858R σημειακή μετάλλαξη, οπότε η σύνδεσή της με c-CBL και επακόλουθη ουβικιτινίωση είναι μειωμένη [19]. Πρόσφατα, τα πρώτα ανθρώπινα μεταλλάξεις c-CBL αναφέρθηκαν σε μυελοειδή λευχαιμία (AML) ασθενείς με οξύ [20]. Η R420Q μετάλλαξη αναστέλλει FMS-όπως τυροσινικής κινάσης 3 (FLT3) εσωτερίκευσης και ουβικιτινίωση [20].

Όχι μόνο μπορεί δραστικότητα Ε3 είναι σημαντικές στην ογκογένεση, c-CBL έχει διπλή αλλά ξεχωριστή λειτουργία σαν ένα μόριο μεταγωγής σήματος . Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το c-CBL είναι σημαντική στην δέσμευση CRKL και BCR /ABL σε αιμοποιητικά κύτταρα. Επίσης, μπορεί να δεσμεύσει και διαμορφώνουν τις λειτουργίες του κυτταροσκελετού με δέσμευση σε πρωτεΐνες όπως Talin και παξιλλίνη. Ο τομέας TKB είναι σημαντική στην δέσμευση με έναν αριθμό μορίων, και στη συνέχεια να λειτουργήσει στη μεταγωγή σημάτων.

Δεδομένου κρίσιμο ρόλο της CBL στην κανονική ομοιόσταση και καρκίνου, υποθέσαμε ότι μπορεί να μεταλλαχθεί σε καρκίνους του πνεύμονα. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε τα νέα γ-CBL σωματικές μεταλλάξεις S80N /H94Y, Q249E και W802 * σε Καυκάσιους, οι ασθενείς της Ταϊβάν και της Αφρικής και της Αμερικής τον καρκίνο του πνεύμονα, αντίστοιχα. Εκφράζοντας αυτές τις μεταλλάξεις σε κυτταρικές σειρές NSCLC να οδηγήσει σε αυξημένο πολλαπλασιασμό και κυτταρική κινητικότητα. Θα δείξουμε ότι το c-CBL μεταλλάξεις συμβαίνουν με ή χωρίς ΚΟΑ ή μεταλλάξεις του EGFR, αλλά είναι αμοιβαία αποκλειόμενα της ΑΕ στο C-

CBL

τόπο. Επιπλέον, C-

CBL

ΑΕ συνδέεται είτε με καθεστώς οικονομίας της αγοράς ή μεταλλάξεις του EGFR. Εμείς έτσι υποθέτουν ότι οι μεταλλάξεις c-CBL θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ογκογόνο δυναμικό του ΚΟΑ και EGFR στον καρκίνο του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

γραπτή συγκατάθεση για κάθε έρευνας για την ανθρώπινη θέματα που έχει ληφθεί από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review, Πανεπιστήμιο του Σικάγο και καλύπτει όλες τις δραστηριότητες έρευνας που εκτελούνται στο εργαστήριο. Το παρακάτω είναι τα στοιχεία επικοινωνίας τους: Institutional Review Board, το Πανεπιστήμιο του Σικάγο, McGiffert Hall, 5751 S. Woodlawn Ave., 2ος όροφος, Chicago, IL 60637. Γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς των οποίων τα δείγματα ιστού χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη .

δείγματα ιστών

καρκινικού ιστού

πνεύμονα και σε συνδυασμό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα ελήφθησαν από 50 Καυκάσιοι, 29 Αφρο-Αμερικανοί και οι 40 ασθενείς Ταϊβάν NSCLC που προσλήφθηκαν στο Πανεπιστήμιο του Νοσοκομείου Σικάγο (Chicago , USA) (Καυκάσιοι και ασθενείς Αφρικής και της Αμερικής) και Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων της Ταϊβάν (ασθενείς Ταϊβάν) μετά από κατάλληλη άδεια Institutional Review Board και εν επιγνώσει συναίνεση από τους ασθενείς. Από 119 δείγματα, 77 ήταν άνδρες, 38 ήταν γυναίκες και 4 ήταν άγνωστες με την ηλικία κατά τη διάγνωση κυμαίνεται 47-90 χρόνια. Από την άποψη των τύπων όγκου, 53 ήταν αδενοκαρκίνωμα, 32 ήταν πλακώδες καρκίνωμα και 34 ήταν μεγάλο καρκίνωμα. 49 ήταν σταδίου Ι, 14 ήταν σταδίου ΙΙ, 34 ήταν σταδίου ΙΙΙ, και 13 ήταν σταδίου IV (Πίνακας S1).

Cell Culture

Ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα καρκινώματος Α549 και Η358 διατηρήθηκαν σε DMEM και RPMI-1640, αντίστοιχα. Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293Τ καλλιεργήθηκαν σε DMEM. Μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2.

C-

CBL

Gene ανάλυση μεταλλάξεων

Τα εξόνια 2 έως 16 του c –

CBL

γονίδιο μεμονωμένα ενισχύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Οι εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S2. Οι συνθήκες PCR ήταν 1 κύκλος των 95 ° C για 5 λεπτά? 35 κύκλοι των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 2 λεπτά? και ένας κύκλος 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε αγωγή με ExoSAP-IT (Corporation USB, Cleveland, ΟΗ) και η αλληλουχία του με Big Dye Terminator-Chemistry (Applied Biosystems, Foster City, CA). Αλληλούχιση διεξήχθη επί του προς τα εμπρός κωδικοποιητικό κλώνο με επιβεβαίωση του

c-CBL

μεταβολές εκτελούνται με αλληλούχηση του κλώνου ανάστροφη επίσης. Χρωματογραφήματα αναλύθηκαν για μεταλλάξεις χρήση Mutation Surveyor v2.61 (Softgenetics, State College, PA).

πλασμίδιο κατασκευάζει και Ιστοσελίδα-Directed Mutagenesis

Η άγριου τύπου C-

CBL

ένθετο cDNA υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pAlterMax χρησιμοποιώντας

Xho

Ι και

Sal

θέσεις ενζύμου περιορισμού (Promega, Madison, WI). Χρησιμοποιώντας αυτό το γονικό πλασμίδιο pAlterMax-C-

CBL

, η διπλή μετάλλαξη τομέα TKB (S80N /H94Y), η μετάλλαξη σημείο (Q249E), και το C-τελικό σημείο μετάλλαξης W802 * c-

CBL

δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-GCTGGCGCTAAAGAATAACCCACCTTATATCTTAGAC-3 ‘και 5′-CTACCAGATACCTACCAGTATCTCCGTACTATCTTGTC-3′ για την διπλή μετάλλαξη S80N /H94Y? 5’-CTTTACCCGACTCTTTGAGCCCTGGTCCTCTTTGC-3 ‘για Q249E, και 5′-CAGCTCCTCCTTTGGCTGATTGTCTCTGGATGGTGATC-3’ για W802 * μαζί με τα συμπληρωματικά εναύσματα τους χρησιμοποιώντας το κιτ QuickChange τοπο-Directed Mutagenesis XL (Stratagene, La Jolla, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι δομές επιβεβαιώθηκαν για τις σημειακές μεταλλάξεις από το πρότυπο της αλληλουχίας του DNA και των δύο κλώνων.

Απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) Ανάλυση

Πέντε μικροδορυφόρων στο χρωμόσωμα 11 (3 στο 11q στο ή στα 200 kb μέχρι ή κατάντη της C-

επιλέχθηκαν CBL

γονίδιο και 2 δείκτες ελέγχου 11ρ) για ανάλυση (Πίνακας S3). Ιδρύθηκε δείκτες μικροδορυφορικού και τις αντίστοιχες αλληλουχίες των εκκινητών επιλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων GeneLoc (https://genecards.weizmann.ac.il/geneloc/index.shtml, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Ισραήλ). Οι εκκινητές έθιμο σχεδιαστεί και κάθε προς τα εμπρός εκκινητής έχει επισημανθεί διά φθορισμού στο άκρο 5 ‘με FAM, PET, NED, ή VIC (Applied Biosystems). Primer θερμοκρασίες ανόπτησης και αμφίδρομη αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με το NIST Εργαλεία Primer (https://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do? Εθνικό Ινστιτούτο Προτύπων και Τεχνολογίας, Gaithersburg, MD). Οι εκκινητές ελέγχθηκαν με πραγματοποίηση PCR με DNA ελέγχου (που απομονώνεται από κύτταρα TK6) και την επίλυση των προϊόντων σε πήγματα αγαρόζης. Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν με ένα υπεριώδους. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από δείγματα όγκου και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό πνευμονικό ιστό. Οι εκκινητές ομαδοποιήθηκαν σε multiplex συνδυασμούς φαίνονται στον Πίνακα S4. Marker D11S929 υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος για να ελέγξει για τη συνοχή στην PCRs και των κορυφών από τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Multiplex PCR διεξήχθησαν σε ένα όγκο 10 μL που περιείχαν 1 μL γονιδιωματικού DNA (20-50 ng), 0.5 μΜ του κάθε εκκινητή (1,0 μΜ σύνολο για κάθε ζεύγος εκκινητή), 400 μΜ dNTPs, ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ PCR που περιέχει MgCl

2 και 0,2 U

Taq

DNA πολυμεράση. PCR πραγματοποιήθηκε στο ΑΒΙ GeneAmp 9700 PCR System υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 5 λεπτά στους 94 ° C? 30 κύκλοι των 30 sec στους 94 ° C, 1 λεπτό στους 60 ° C, 1 λεπτό στους 72 ° C? και 5 λεπτά στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν μέσω τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης σε μια DNA Analyzer ΑΒΙ 3130XL. Τα χρωματογραφήματα αναλύθηκαν με Peak Scanner 1.0 και 3.7 GeneMapper λογισμικό (Applied Biosystems) για αλληλικές μεταβολές. Η περιοχή των κορυφών που παράγονται από τα προϊόντα της PCR DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά για κάθε αλληλόμορφο. Η αναλογία των αλληλόμορφων περιοχών υπολογίστηκε για κάθε όγκο και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό δείγμα DNA. Όταν η (αλληλική λόγος για τις κορυφές του όγκου διαιρείται με τον λόγο των αλληλομόρφων ζεύγη κανονικό δείγμα) qLOH ήταν ≤0.5 ή ≥2.0 για C-

CBL

και τουλάχιστον ένα άλλο 11q δείκτη σε τουλάχιστον δύο ξεχωριστά πειράματα, το δείγμα θεωρείται ότι έχει ένα αλληλομόρφων ανισορροπία και να ερμηνευθεί ως ΑΕ. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν σε δύο τουλάχιστον ξεχωριστά πειράματα και τα δείγματα που δείχνουν υποψήφιους LOH στο C-

CBL

επαναλήφθηκε μία τρίτη φορά η οποία περιελάμβανε ένα νέο δείκτη ελέγχου στα

ΒΑΧ

locus (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) επί χρωμόσωμα 19 να επιβεβαιώσει την ακεραιότητα του DNA του δείγματος.

Η επιμόλυνση του C-

Cbl

Κατασκευάσματα

Η Α549 κυτταρική γραμμή επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας το Fugene HD (Roche, Nutley, NJ) αντιδραστηρίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οκτώ μg πλασμιδιακού DNA, που περιέχουν είτε δεν ένθετο (κενός φορέας), άγριου τύπου C-

CBL

, S80N /H94Y C-

CBL,

Q249E C-

CBL

ή W802 *

CBL

χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση σε μια πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν για έκφραση.

C-

CBL

Νοκ ντάουν

C-

CBL

νοκ ντάουν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση λεντοϊού μεταγωγή χρησιμοποιώντας ΑΠΟΣΤΟΛΗ σωματίδια μεταγωγή βραδέος ιού (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

5 Η358 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και μολύνθηκαν την επομένη με C-

CBL

βραδέος shRNA κατασκευάσματα. Για να παραχθούν σταθερές κυτταρικές σειρές knockdown c-CBL, τα κύτταρα επιλέγονται για 2 ημέρες με 1 μg /ml πουρομυκίνη. επίπεδα c-CBL προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας λύματα ολόκληρων κυττάρων με ανοσοστύπωμα με αντι-CBL αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω στο η δοκιμασία μορφομετατροπής. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας αποκλεισμού Trypan Blue.

Επούλωση Δοκιμασία

Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες μέχρι 100% συρροή . Το μέσο στη συνέχεια άλλαξε και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν, όπως περιγράφεται στη δοκιμασία μορφομετατροπής. Δώδεκα ώρες μετά την επιμόλυνση, μία ευθεία μηδέν έγινε σε όλη την κυτταρική στοιβάδα χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 1 ml. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν απαλά με 1 χ PBS για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων και το μέσο αντικαταστάθηκε. Ελήφθησαν φωτογραφίες της περιοχής του τραύματος κάθε 12 ώρες μέχρις ότου 48 ώρες.

Ανάλυση Western Blot

Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε 1Χ PBS, μετά λύθηκαν σε πάγο ψυχρού ρυθμιστικού λύσης (0,5Μ Tris-HCl με ρΗ 7,4, 1,5 Μ NaCl, 2,5% δεοξυχολικό οξύ, 10 mM EDTA, 10% ΝΡ-40, 0,5 mM DTT, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 5 μg /mL λευπεπτίνη και 10 μg /mL απροτινίνη) για 5 λεπτά. Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ° C, και περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη στο υπερκείμενο μετρήθηκε. Σύνολο κυτταρολύματα (50 μg /φρεάτιο) διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Whatman, Piscataway, NJ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο που περιέχει Tween-20 (PBST) (1Χ PBS, 0,1% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάζονται με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C διανυκτέρευση. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με PBST και ανιχνεύτηκαν με τους κατάλληλους υπεροξειδάση (HRP) δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν πάλι τρεις φορές σε PBST και ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα Western αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (BioRad, Valencia, CA) σε ένα σύστημα τεκμηρίωσης Chemidoc Gel (BioRad, Valencia, CA). Αντισώματα ελήφθησαν από Σάντα Κρουζ βιοτεχνολογίες και χρησιμοποιούνται στις ακόλουθες αραιώσεις (c-CBL, 1:5000? C-MET, 1:5000? EGFR, 1:5000? Ουβικιτίνης, 1:1000? ΗΑ, 1:5000 και β- ακτίνη, 1:10,000).

κυτταρομετρίας ροής

ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής. Περίπου 2 × 10

6 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα που περιέχουν 10% FBS. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη /ΕϋΤΑ, πλύθηκαν με 1Χ PBS τρεις φορές και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% για 2 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι με ψυχρό PBS και βάφτηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 25 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου, 200 μg /mL RNase Α, και 0.1% Triton Χ-100 για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ροή γκουάβα PCA-96 κυτταρόμετρο (γκουάβα Technologies, Millipore, Billerica, ΜΑ).

Ουμπικουϊτίνη Λιγκάσης Δραστηριότητα

293Τ κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10 % FBS και 1% πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL) επιμολύνθηκαν με 0.2 μg EGFR-pcDNA3 και 2 μg ΗΑ-tagged C-

CBL

κατασκευάσματα όπως υποδεικνύεται με τη χρήση φωσφορικού ασβεστίου σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (profection, Promega, Madison, WI). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 0,5% FBS, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς EGF (100 ng /ml) για 15 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο PBS που περιείχε 0.2 mM ορθοβαναδικό νάτριο, στη συνέχεια λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10 mM Tris HCI, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton Χ100, 10% Γλυκερόλη, 2 mM ορθοβαναδικό νάτριο και αναστολείς πρωτεάσης). Τα λύματα απαλλάχθηκε από συντρίμμια με φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. ανοσοκαταβυθίσεις EGFR πραγματοποιήθηκαν σε 200 μg εκκαθαριστεί λύματος χρησιμοποιώντας 250 ng του κουνελιού-αντι-EGFR και Protein A /G Plus Sepharose όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Καθιζήσεις πλύθηκαν 5 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πριν τη ζέση σε ρυθμιστικό Laemmli. Εκλούσεις ανοσοστυπώθηκαν με αντι-ουβικιτίνης και EGFR. Είκοσι μικρογραμμάρια εκκαθαρίζονται λύματος ανοσοστυπώθηκαν για κάθε ένα από τα c-

CBL

κατασκευάσματα χρησιμοποιώντας αντι-ΗΑ.

Στατιστική Ανάλυση

ρυθμούς μετάλλαξης μεταξύ των διαφόρων ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας Fisher είναι ακριβής δοκιμή. Για τις συνεχείς μεταβλητές, οι συγκρίσεις ομάδα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από προσαρμογή Sidak για πολλαπλές συγκρίσεις. Πειράματα που περιλαμβάνουν επαναλαμβανόμενες μετρήσεις σε βάθος χρόνου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ΑΝΟνΑ επαναλαμβανόμενων μετρήσεων με την προσαρμογή του θερμοκηπίου-Geisser στους βαθμούς ελευθερίας. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού STATA λογισμικού (v10.1) (Stata Corporation, College Station, TX).

Αποτελέσματα

C-

CBL

μεταλλάξεις γονιδίων στον καρκίνο του πνεύμονα

Για να διερευνήσουν το ρόλο του c

CBL

στον καρκίνο του πνεύμονα, αναλύσαμε γονιδιακό DNA του σε όγκο και σε συνδυασμό φυσιολογικά δείγματα που ελήφθησαν από πολλαπλές εθνικότητες. Τα δείγματα όγκων του πνεύμονα που αντιπροσωπεύεται Καυκάσιους (n = 50), αφρικανικός-Αμερικανοί (n = 29), και της Ταϊβάν (n = 40) ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Σχεδιάσαμε 12 ζεύγη εκκινητών για την αλληλουχία την κωδικεύουσα περιοχή του c-

CBL

γονίδιο που εκτείνεται εξώνια 2 έως 16 (Πίνακας S2). Εντοπίσαμε 8 μοναδικές σωματικές μεταλλάξεις στο C-

CBL εξώνια

μεταξύ 8 διαφορετικούς ασθενείς. Μια παραλλαγή L620F, μια γνωστή SNP (rs2227988) στο εξώνιο 11 ανιχνεύθηκε επίσης. Σημαντικά, οι οκτώ νέα μη συνώνυμες μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση αμφοτέρων των κλώνων του C-

CBL

γονιδιωματικό DNA που ελήφθη από δείγματα πνεύμονα όγκου (Πίνακας 1). Επιπλέον, καμία από τις 8 μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν στο αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό, υποδεικνύοντας ότι αυτά ήταν σωματικές μεταλλάξεις. Τέσσερις συνώνυμη μόνο παραλλαγές νουκλεοτιδίου (SNVs) έχουν επίσης εντοπιστεί, αλλά δεν χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω σε αυτή τη μελέτη.

Η

Τρία από τα 8 νέα, μη συνώνυμες μεταλλάξεις που βρίσκεται στην TKB (δεσμευτική τυροσινικής κινάσης) τομέα ( S80N, H94Y, και Q249E), μία στην περιοχή RING δακτύλου (V391I), ένα στην περιοχή πλούσια σε προλίνη (72515_72517 del ATG), και τρία στην C-τερματική περιοχή (W802 *, R830K και A848T) του c-CBL πρωτεΐνη (Σχήμα 1Α και το Σχήμα S1). Στο Σχήμα 1Β, δείχνουμε μοντέλο χρωματογραφήματα των αντιπροσωπευτικών δειγμάτων.

(Α) Σχηματική απεικόνιση των διαφόρων μεταλλάξεων c-CBL σε σχέση με τις διαφορετικές λειτουργικές περιοχές. Τρεις μεταλλάξεις: S80N, H94Y, Q249E βρίσκονταν στην περιοχή TKB? V391I βρισκόταν στην περιοχή RING δάχτυλο? 72515_72517 del ATG (ένα μη-μετατόπισης πλαισίου διαγραφή) και L620F (ένας γνωστός SNP, rs2227988) βρίσκονταν στο Pro-πλούσια περιοχή και W802 *, R830K και A848T βρέθηκαν στην Ο-τερματική περιοχή του c-CBL. Οι αριθμοί που δείχνονται αντιπροσωπεύουν θέσεις αμινοξέων. Σύνδεσμος c-CBL μεταλλάξεις μεταξύ διαφορετικών εθνοτικών πληθυσμών φαίνεται στον πίνακα (∧ γνωστό SNP). (Β) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα χρωματογραφημάτων αλληλουχίας της περιοχής μετάλλαξης σε κανονική (Ν) και του όγκου (Τ) δείγματα. Τα βέλη υποδεικνύουν την ετερόζυγη μετάλλαξη στο δείγμα όγκου. (Γ) απώλεια της ανάλυσης ετεροζυγωτίας (ΑΕ) του 37 του όγκου και σε συνδυασμό φυσιολογικά δείγματα από ασθενείς Ταϊβάν. Η τιμή του & lt? 0.5 δείχνει μια ΑΕ στο C-

CBL

τόπο. (Δ) Σχηματική του χρωμοσώματος 11 δείκτες που επιλέχθηκαν για την ανάλυση ΑΕ και αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της ανάλυσης χρωματογράφημα ΑΕ. Μετά την ενίσχυση χρησιμοποιώντας το χρωμόσωμα 11 ειδικούς εκκινητές μικροδορυφορικού, το προϊόν της PCR διαχωρίστηκε με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση και ζώνες ποσοτικά ανάλογα με την ένταση.

Η

11q ΑΕ του c

CBL

Gene

Αξιόπιστες όγκου πνεύμονα και φυσιολογικά δείγματα πνευμονικού ιστού από ασθενείς Ταϊβάν (n = 37) ερευνήθηκαν για ΑΕ. Οκτώ (21,6%) εμφάνισαν ΑΕ στο C-

CBL

θέση στο χρωμόσωμα 11, ενώ 29 δείγματα (78,4%) αποκάλυψε κανονική αλληλομόρφων εισφορά των δεικτών μικροδορυφορικού (Σχήματα 1C και D).

c-CBL Μεταλλάξεις σε διαφορετικές εθνοτικές ομάδες

το γ-CBL διπλά μεταλλαγμένο S80N /H94Y βρέθηκε στον ίδιο ασθενή και το συνολικό ποσοστό μετάλλαξης για c-CBL σε όγκους του πνεύμονα ήταν 6,7% (8/119). Η συχνότητα της μετάλλαξης c-CBL ήταν υψηλότερη σε μεγάλο καρκίνωμα (14,7%? 5 από 34 ασθενείς) που ακολουθείται από πλακώδες καρκίνωμα (6,3%? 2 από 32 ασθενείς) και η λιγότερο παρατηρήθηκε σε αδενοκαρκίνωμα (AD) (1,8%? 1 53 ασθενείς), παρόλο που τα ποσοστά αυτά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,292). ποσοστά μετάλλαξης ήταν 6,0% μεταξύ των Καυκάσιων (0 από 20 σε AD? 0 10 σε SQ? και 3 από 20 σε LC), 13,8% σε Αφροαμερικανοί (1 από 10 σε AD? 1 από 10 σε SQ? και 2 του 9 LC), και 2,5% (0 από 23 σε AD? 1 από 12 σε SQ? και 0 στα 5 κατά LC) στον πληθυσμό της Ταϊβάν. Επιπλέον δύο ασθενείς της Ταϊβάν με καρκίνο του πνεύμονα (ένα πλακωδών και ένα αδενοκαρκίνωμα) είχαν το γνωστό SNP L620F. Εθνοτικές διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές, ωστόσο η δύναμη για να ανιχνεύσει διαφορές ήταν χαμηλή.

Μεταλλάξεις στο

MET

και

EGFR

μπορεί να συν-Associated με c-CBL Αλλαγές

από την Ανατολική Ασία με καρκίνο του πνεύμονα έχουν μια υψηλότερη συχνότητα

EGFR

και

ΚΟΑ

μεταλλάξεις στους όγκους του πνεύμονα [21], [22], θα καθορίζεται επίσης μεταλλάξεις στο

EGFR

και

MET

στα ίδια δείγματα ομάδα της Ταϊβάν και συνέκριναν τα αποτελέσματα με τις παρατηρούμενες C-

CBL

αλλοιώσεις (ΑΕ ή /και μεταλλάξεις). Στις 37 δείγματα που ελέγχθηκαν, δεν βρήκαμε καμία επικάλυψη μεταξύ C-

CBL

μεταλλάξεις και C-

CBL

ΑΕ (Σχήμα 2). Από τις τρεις μεταλλάξεις c-CBL (συμπεριλαμβανομένου του γνωστού L620F SNP, rs2227988), ένα από τα δείγματα είχαν μια μετάλλαξη ΚΟΑ (N375S) και το άλλο είχε μία μετάλλαξη EGFR (L858R). Μεταξύ των 8 δείγματα που είχαν ΑΕ στο C-

CBL

θέση 5 είχε μια πρόσθετη μετάλλαξη στην ΚΟΑ (N375S) και 2 είχαν μια

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή. Είκοσι έξι δείγματα δεν είχε ούτε C-

CBL

μετάλλαξη ούτε C-

CBL

ΑΕ (3 ασθενείς είχαν ένα C-

CBL

μετάλλαξη αλλά δεν C-

CBL

ΑΕ). Μεταξύ αυτών των 26 δειγμάτων 9 είχαν μια μετάλλαξη ΚΟΑ (8 N375S, 1 L211W), 13 είχαν μία

EGFR

μετάλλαξη (7 εξόνιο 9 διαγραφή, 6 L858R) και 4 δεν είχε άλλη ΚΟΑ ή EGFR μετάλλαξη. Έτσι, το ποσοστό της ΚΟΑ ή EGFR μεταλλάξεις σε ασθενείς με LOH στο C-

CBL

τόπο (7 από 8) ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε ασθενείς χωρίς C-

CBL

μετάλλαξη ή ΑΕ ( 22 από τους 26 ασθενείς) (p = 0.99). Αυτές οι 4 ασθενείς με μη προσδιορίσιμη μετάλλαξη στο C-

CBL

,

MET

ή

EGFR

αντιπροσώπευαν το 10,8% των 37 ασθενών που αναλύθηκαν στην Ταϊβάν ομάδα ασθενών. Αντίθετα, το 89,2% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα Ταϊβάν έχουν ένα αναγνωρίσιμο μετάλλαξη είτε C-

CBL

,

MET

ή

EGFR

ή ένας συνδυασμός των τριών γονιδίων (Σχήμα 2) . Επιπλέον, προσδιορίσαμε

p53

και

KRAS

μεταλλάξεις σε αυτές τις ομάδες Ταϊβάν. Δύο

p53

και 1

KRAS

μετάλλαξη ανιχνεύθηκαν. Η ενιαία

KRAS

μετάλλαξη επικαλύπτονται με ένα

p53

μετάλλαξη. Αυτός ο ασθενής είχε επίσης η

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή, αλλά δεν είχε καμία C-

CBL

μετάλλαξη. Το άλλο

δείγμα p53

μετάλλαξη είχε C-

CBL

ΑΕ με ταυτόχρονη μετάλλαξη ΚΟΑ N375S. Έτσι, στα δείγματα που αναλύθηκαν από την Ταϊβάν,

p53 /KRAS

μεταλλάξεις και C-

CBL

μεταλλάξεις ήταν αμοιβαία αποκλειόμενα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

37 δείγματα Ταϊβάν αναλύθηκαν για μεταλλάξεις στο C-

CBL

,

MET

και

EGFR

και για την ανάλυση ΑΕ στο C-

CBL

τόπο. Τα στοιχεία δείχνουν 21,6% (8/37) είχαν LOH, ενώ 8% (3/37) είχαν μετάλλαξη c-CBL (συμπεριλαμβανομένου του γνωστού SNP L620F), αυτά τα δείγματα ήταν αλληλοαναιρούνται. Επιπλέον, 5 από 8 δείγματα ΑΕ, επίσης, είχε συναντήσει μετάλλαξη N375S και 2 είχαν

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή. Στα δείγματα που έχουν C-

CBL

μετάλλαξη, 1 επίσης είχε γνωρίσει μετάλλαξη N375S ενώ ένας άλλος είχε μετάλλαξη του EGFR L858R. Σε δείγματα που δεν τρέφουν καμία C-

CBL

μετάλλαξη (70%, 26/37), 22 είχαν είτε ένα

MET

ή

EGFR

μετάλλαξη και μόνο 4 δεν έχουν μια μετάλλαξη σε κάποιο από αυτά τα 3 γονίδια.

η

κυτταρικές λειτουργίες της C-

CBL

Μεταβολές στο πλαίσιο της πνεύμονα Ογκογένεση

Α. δραστηριότητα Ε3 είναι άθικτη στις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες γ-CBL.

Για να διερευνηθεί κατά πόσο οι διαφορετικές μεταλλάξεις c-CBL επηρεάζουν τη δραστηριότητα Ε3, EGFR επιλέχθηκε ως πρότυπο υπόστρωμα για τη λειτουργία C-CBL Ε3. Όλα τα μεταλλάγματα c-CBL δοκιμάστηκαν ενισχυμένη ουβικουϊτινίωση του ενεργοποιημένου EGFR παρόμοια με την αγρίου τύπου πρωτεΐνη c-CBL. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η καταλυτική δραστικότητα των μεταλλακτών c-CBL δεν μειούται όταν EGFR ήταν το υπόστρωμα. (Σχήμα 3Α).

(Α) c-CBL μεταλλάξεις δεν μεταβάλλουν ουβικουϊτινίωση του EGFR. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με EGFR και διαφορετικές μεταλλάξεις c-CBL διεγέρθηκαν με EGF, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΕΟΡΚ και στυπώθηκαν με αντι-ubiquitin αντισωμάτων. Ανοσοστυπώματος με αντι-ΕΟΡΚ αντίσωμα χρησίμευσε ως έλεγχος ΠΕ, ενώ η κηλίδα αντι-ΗΑ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου. βιωσιμότητας (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης και σε σύγκριση με το κενό φορέα ελέγχου. c-CBL άγριου τύπου (WT) και μεταλλάξεις S80N /H94Y, Q249E, και W802 * έδειξε 66,7%, 132,3%, 120,8% και% κυτταρική βιωσιμότητα 147,9 αντίστοιχα σε κύτταρα Α549 48h μετά την επιμόλυνση. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι μέσες δεδομένα εμφανίζονται. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση. επίπεδα (Γ) Η έκφραση πρωτεΐνης των διαφόρων μεταλλαγμάτων αναλύθηκαν με κηλίδες Western χρησιμοποιώντας c-CBL αντίσωμα. ανάλυση (D) του κυτταρικού κύκλου των διαφορετικών μεταλλάξεων c-CBL 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε κύτταρα Α549.

Η

Β. Επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα.

Το αποτέλεσμα μιας αντιπροσωπευτικής μεταλλαγμένου c-CBL από καθένα από τα τρία εθνικό υπόβαθρο στην κυτταρική βιωσιμότητα καρκίνου του πνεύμονα σε κυτταρικές γραμμές προσδιορίστηκε. S80N /H94Y διπλή μετάλλαξη, Q249E, και W802 * εντοπίστηκαν σε δείγματα πνεύμονα όγκου που λαμβάνονται από έναν Καυκάσου, Ταϊβάν και ένας Αφρο-Αμερικανός, αντίστοιχα. Όπως περιγράφεται στις μεθόδους, το C-CBL άγριου τύπου (WT) και τα παραπάνω τρία μεταλλάγματα εκφράστηκαν μετά την κλωνοποίηση τους σε φορέα pAlterMax σε κύτταρα Α549. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν σχετικώς χαμηλά βασικά επίπεδα του ενδογενούς c-CBL (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των διαφόρων ομάδων και ο αριθμός των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με C-

CBL

άγριου τύπου κατασκεύασμα ήταν περίπου 70% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με τον κενό φορέα. Κύτταρα επιμολυσμένα με /H94Y, Q249E και W802 * c-CBL κατασκευάσματα μεταλλαγμένο S80N οδήγησε σε αύξηση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων που ήταν 132,3%, 120,8% και 147,9% υψηλότερη αντίστοιχα, σε σχέση με τον μάρτυρα άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα και σημαντικά διαφορετικό από το φυσικό τους περιβάλλον -τύπου κατασκεύασμα (ρ = 0,022, ρ = 0,049 και ρ = 0,008, αντίστοιχα) (Σχήμα 3Β). Σχετικά επίπεδα του c-CBL πρωτεΐνη σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου παρασκευάζονται από δείγματα που λαμβάνονται από ένα παράλληλο πείραμα προσδιορίστηκε. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-CBL σε δείγματα που αντιπροσωπεύουν μη επιμολυσμένα και άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ήταν συγκρίσιμες και εκείνων που εκπροσωπούν το c-CBL WT και τα μεταλλαγμένα τρεις c-CBL ήταν συγκρίσιμες (Σχήμα 3C).

C. Επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου.

Για να διερευνηθεί εάν οι αυξήσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε διαφορετικές μεταλλάξεις c-CBL οφείλονται σε αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό, διεξήχθη μια ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με το c-CBL WT ή των τριών διαφορετικών μεταλλακτών: S80N /H94Y, Q249E και W802 *. Το κενό φορέα επιμόλυνσης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου διαμόλυνση διεξήχθη όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στο subG1, G1 ή η φάση S του κυτταρικού κύκλου μεταξύ των διαφόρων μεταλλακτών σε σύγκριση με το κατασκεύασμα WT (p = 0.64, ρ = 0.40, και ρ = 0,28, αντίστοιχα). Το G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου έδειξε αύξηση του αριθμού των κυττάρων για τις τρεις μεταλλάξεις, S80N /H94Y, Q249E και W802 *, σε σύγκριση με την WT, αλλά και πάλι η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (ρ = 0,25) (Σχήμα 3D ).

Δ. Επίδραση στην κυτταρική κινητικότητα.

Για να διερευνηθεί η επίδραση της έκφρασης των παραπάνω μεταλλάξεων τρία c-CBL στην κυτταρική μετανάστευση, διενεργήσαμε επούλωση πληγής δοκιμασία όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Το κλείσιμο του μηδέν ή η πληγή παρακολουθήθηκε στις 0, 12, 24, 36, και 48 ώρες. (Σχήμα 4Α). Σε όλα τα δείγματα, τα οποία αντιπροσωπεύονται τα κύτταρα επιμολυσμένα με μεταλλάκτες, το χάσμα τραύμα ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε στο δείγμα που αντιπροσώπευε κύτταρα επιμολυσμένα με c-CBL WT (ρ & lt? 0.001). Προσδιορίσαμε επίσης το ρυθμό κλεισίματος τραύματος για όλες τις πέντε ομάδες. Στις 48 ώρες, άγριου-τύπου c-CBL μορφομετατροπείς έδειξαν 61,1% ανοικτή πληγή ενώ οι /H94Y, Q249E και W802 * μεταλλάκτες S80N έδειξε 18,7%, 23,9% και 34,3% ανοικτή πληγή αντίστοιχα (ρ & lt? 0.001). (Σχήμα 4Β)

(Α) Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία διεξήχθη σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με WT c-CBL ή διαφορετικές μεταλλάξεις. Κενό φορέα (EV) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Αντιπροσωπευτικές εικόνες (φωτεινού και αντίθεσης φάσης) από κάθε χρονικό σημείο που φαίνεται.