Αφηρημένο

Πρότυπο καρκινικές κυτταρικές σειρές δεν το μοντέλο της εντός του όγκου κατάσταση ετερογένεια επαρκώς. Κλωνική επιλογή οδηγεί σε μια ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων από γενετικής παρέκκλισης. Η ετερογένεια των κυττάρων του όγκου, ωστόσο, είναι ιδιαίτερα κρίσιμο για θεραπευτικά σχετικές μελέτες, δεδομένου ότι αποτελεί προϋπόθεση για την απόκτηση αντίστασης στα φάρμακα και επανεμφάνιση των όγκων. Εδώ, αναφέρουμε την απομόνωση ενός πολύ ογκογόνο πρωτογενές παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά, που ονομάζεται JoPaca-1 και λεπτομερή χαρακτηρισμό του σε πολλαπλά επίπεδα. Εμφύτευση τόσο λίγα όσο 100 JoPaca-1 κύτταρα σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς οδήγησε σε όγκους που είχαν ιστολογικά πολύ παρόμοια με τον πρωτογενή όγκο. Η υψηλή ετερογένεια JoPaca-1 εκφράστηκε με ποικίλες κυτταρικές μορφολογία και ένα σημαντικό αριθμό των χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Συγκριτική ανάλυση αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος του JoPaca-1 και BxPC-3 αποκάλυψε μεταλλάξεις σε γονίδια που μεταβάλλεται συχνά σε καρκίνο του παγκρέατος. Κατ ‘εξαίρεση υψηλή έκφραση των δεικτών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και ένα υψηλό κλωνογονικού δυναμικό

in vitro

και

in vivo

παρατηρήθηκε. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά κάνουν αυτό το κυτταρική σειρά εξαιρετικά πολύτιμο μοντέλο για τη μελέτη της βιολογίας και φαρμακευτικών συνέπειες για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Fredebohm J, Boettcher Μ, Eisen C, Γκάιντα MM, Heller Α, Keleg S, et al. (2012) Δημιουργία και Χαρακτηρισμός ενός ιδιαίτερα την εμφάνιση όγκων και του καρκίνου Stem Cell Εμπλουτισμένο καρκίνο του παγκρέατος Κυτταρικής Γραμμής ως ένα καλά καθορισμένο σύστημα μοντέλο. PLoS ONE 7 (11): e48503. doi: 10.1371 /journal.pone.0048503

Επιμέλεια: Nathan A. Ellis, του Πανεπιστημίου του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 26 Σεπτέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 12 Νοέμβρη, 2012

Copyright: © 2012 Fredebohm et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε οικονομικά από το γερμανικό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας (BMBF), ως μέρος της κοινοπραξίας NGFN PaCaNet (BMBF-01GS08117). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Jörg Hoheisel και Jörg Tost χρησιμεύσει ως συντάκτες για PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών ..

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο επιθετικές μορφές καρκίνου. Η θνησιμότητα είναι σχεδόν ταυτόσημη με συχνότητα. Με ένα ποσοστό πενταετούς επιβίωσης λιγότερο από 5%, είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στον ανεπτυγμένο κόσμο [1]. Οι λόγοι για την κακή πρόγνωση είναι η καθυστερημένη κλινική διάγνωση [2] και την αντίσταση του όγκου σε συνήθη χημειοθεραπεία [3]. Με περίπου 90% των περιπτώσεων, παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η πιο κοινή μορφή και είναι υπεύθυνη για την υψηλή θνησιμότητα? άλλα, σπάνια υποτύπους του καρκίνου, όπως η κυστική όγκοι, είναι λιγότερο θανατηφόρα. PDAC υποτίθεται ότι προκύπτει από επιθηλιακά κύτταρα του παγκρεατικού πόρου συστήματος [4]. Κατανομή των κυττάρων του όγκου εντός του κακοήθους ιστού είναι τυπικά διάχυτη και περιέχει περιοχές με ποικίλους βαθμούς ιστολογική διαφοροποίηση. Είναι, επίσης, χαρακτηρίζεται από ένα συνολικό πληθυσμό ετερογενών κυττάρων του όγκου (ενδοκαρκινική ετερογένεια) [5], [6].

Ένας σημαντικός αριθμός κυτταρικών σειρών PDAC των διαφορετικών χαρακτηριστικών έχουν καθιερωθεί και να προσφέρει μια κυτταρική πηγή για τη διερεύνηση μοριακών πτυχές αυτής της καταστροφικής νόσου (συνολικά επανεξετάζονται από Ulrich et al. [7]). Ωστόσο, καλλιέργεια κυτταρικές γραμμές υπό σαφώς καθορισμένες συνθήκες αναπόφευκτα οδηγεί στην επιλογή των υποπληθυσμών πάροδο του χρόνου. Έτσι, πρότυπο κυτταρικές σειρές δεν μοντελοποιήσουμε την κατάσταση των εντός του όγκου ετερογένειας, δεδομένου ότι κλωνική επιλογή έχει πραγματοποιηθεί εδώ και πολλά περάσματα

in vitro

. Αυτό οδηγεί σε μια ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων με γενετική παρέκκλιση [8]. Αντίθετα, οι πρωτογενείς κυτταρικές σειρές μοιάζουν πολύ στενά την ετερογένεια του πρωτογενούς όγκου και ως εκ τούτου παρέχει μια καλή πηγή για πειράματα καλλιέργειας κυττάρων.

Το

in vivo

ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων είναι ιδιαίτερα κρίσιμο για την πειράματα έλεγχο των επιδράσεων της χημειοθεραπείας, επειδή η ετερογένεια αποτελεί τη βάση για την επιλογή των ανθεκτικών υποπληθυσμών, που με τη σειρά αποτελεί τη βάση για επίκτητη αντίσταση φαρμάκου και επανεμφάνιση του όγκου [3], [9]. Μεταξύ του πληθυσμού των ανθεκτικών κυττάρων, καρκινικά βλαστικά κύτταρα παίζουν έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο, δεδομένου ότι έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση [3] και είναι σε θέση να ανασυστήσουν το όγκου στην πρωτογενή θέση ή να οδηγήσει σε σχηματισμό μετάστασης σε απομακρυσμένες θέσεις [10].

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα ή καρκινικά κύτταρα έναρξη που οδηγούν την εξέλιξη του όγκου έχουν λάβει πολλή προσοχή κατά τις τελευταίες δεκαετίες [11], [12], [13]. Για τον καρκίνο του παγκρέατος, αρκετές μοριακούς δείκτες έχουν προταθεί να είναι χαρακτηριστικό καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Μεταξύ αυτών είναι η έκφραση της τριπλέτας CD44, CD24 και ESA [14], η πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας CD133 (προμινίνη Ι) [15], [16], [17], και – πρόσφατα – αυξημένη δραστηριότητα της αφυδρογονάσης αλδεΰδης 1 (ΑΙ_ϋΗ1 ) [18]. Έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 έχει επίσης συσχετιστεί με την εισβολή και τη μετανάστευση καθώς και τα χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά του όγκου [19]. Επιπλέον, έχει συσχετιστεί με φτωχή συνολική επιβίωση. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, δύο αντικρουόμενες μελέτες δείχνουν ότι η υψηλή [19] ή χαμηλή [20] έκφραση του ΑΙ_ϋΗ1, έχει αρνητική επίδραση στην επιβίωση των ασθενών. Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα της έναρξης του όγκου είναι η ικανότητα να σχηματίσει σφαιροειδή ή σφαίρες όγκου σε εναιώρημα [21], [22]. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα πιστεύεται επίσης ότι συμβάλλουν στην ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου. Παράλληλα, έχει αποδειχθεί ότι το περιεχόμενο της CD133 κυττάρων που εκφράζουν μπορεί να εμπλουτιστεί με κατεργασία γεμσιταβίνη [23], [24], [25] προτείνοντας έναν κεντρικό ρόλο αυτού του δείκτη CSC στην αντίσταση γεμσιταβίνη.

Εδώ, αναφέρουμε την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ενός νέου πρωτογενούς κυτταρική σειρά που προέρχεται άμεσα από ένα δείγμα ανθρώπινου όγκου ασθενούς με πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. Αυτή η κυτταρική σειρά, που ονομάζεται JoPaca-1, παρουσιάζει μια υψηλή ποικιλία στη μορφολογία και φέρει πολλές χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Παθολογικά, ποντίκι-ξενομοσχεύματα και ο πρωτογενής όγκος έχει ένα υψηλό βαθμό ομοιότητας από την άποψη της διάχυσης διαφοροποίηση και διήθηση των γύρω του παγκρέατος και του μη-παγκρεατικό ιστό. κύτταρα JoPaca-1 εκφράζουν την mesothelin δείκτη όγκου και αρκετές κερατίνες. Εκτός από την υψηλή ετερογένεια της, ίσως το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό αυτής της νέας κυτταρικής γραμμής είναι υψηλή περιεκτικότητά του σε καρκινικά κύτταρα έναρξης όπως καταδεικνύεται από

in vivo

περιοριστική δοκιμασία αραίωσης και τα υψηλά επίπεδα έκφρασης των δεικτών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων. Εν όψει της στενής ομοιότητάς του με τον αρχικό όγκο και σε συνδυασμό με την λεπτομερή μοριακό χαρακτηρισμό, η κυτταρική σειρά παρέχει μια εξαιρετική πηγή για κάθε είδους με βάση κύτταρα και όχι ανάλυση ιστού που βασίζεται.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

ενημέρωση γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τον ασθενή. Δεοντολογική έγκριση ελήφθη από την επιτροπή δεοντολογίας της ιατρικής σχολής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Χαϊδελβέργης, στη Γερμανία. Όλα τα ζωικά φροντίδα και τις διαδικασίες που ακολουθούνται γερμανικές νομοθετικές ρυθμίσεις και είχαν προηγουμένως εγκριθεί από το κυβερνητικό συμβούλιο επισκόπηση της κατάστασης της Βάδης-Βυρτεμβέργης, της Γερμανίας.

απομόνωση των κυττάρων

Φρέσκα ιστού λήφθηκε από 46- χρονος ασθενής πάσχει από καρκίνο του παγκρέατος, ο οποίος υποβλήθηκε σε πυλωρού-διατήρηση pancreatecto-duodenectomy. Κατά τη λειτουργία, ένα δείγμα που λαμβάνεται από την καταργημένη όγκου και αποθηκεύονται απευθείας σε ισορροπημένο διάλυμα αλάτων Hank (HBSS, H6648, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) στους 4 ° C για 12 ώρες πριν από την περαιτέρω επεξεργασία. Το δείγμα ιστού ακολούθως κόβεται σε τεμάχια διαμέτρου περίπου 5 mm και μεταφέρθηκε σε μια φιάλη καλλιέργειας που περιέχει του Ham /F-12 Medium (21765-029, Life Technologies, Darmstadt, Γερμανία), συμπληρωμένο με αντιδραστήριο αντικατάσταση ορού (S0638, Sigma Aldrich) . Τα τεμάχια των ιστών συνδέονται με το υπόστρωμα και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν έξω μετά από μία εβδομάδα, σχηματίζοντας συστάδες γύρω από τα θραύσματα ιστού. Οι ινοβλάστες και αστεροειδή κύτταρα απομακρύνθηκαν με δύο γύρους σειριακή ενζυμική απόσπαση με 0,05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ (25.300.054, Life Technologies). Ο προκύπτων πληθυσμός των καρκινικών κυττάρων καταψύχθηκε στους αριθμός πέρασμα τέσσερα και αποθηκεύεται σε κλάσματα. Για τα πειράματα που περιγράφονται εδώ, JoPaca-1 κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε περάσματα 6 έως 19. Η αθανατοποίηση των απομονωμένων κυττάρων δεν ήταν αναγκαία.

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι καθιερωμένες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές MiaPaCa -2, MDAPanc-28, BxPC-3, AsPC-1, και Capan-1 ελήφθησαν από την ATCC (Rockville, MD, USA). Επιπλέον, FamPAC ήταν ευγενική προσφορά από τον καθηγητή Eisold [26] και τα κύτταρα HPDE C7 από τον καθηγητή Francisco Real (Ισπανικό Εθνικό Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, CNIO) [27]. BxPC-3 επικυρώνονται από την Συλλογή γερμανική Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία). Όλες οι κυτταρικές σειρές ήταν χωρίς μυκοπλάσματα, ιούς και μόλυνση κυτταρικής γραμμής όπως δοκιμάστηκε με PCR [28]

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πρότυπο μέσο και συμπληρώματα, τα οποία ελήφθησαν από την Life Technologies, Darmstadt, Γερμανία εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.: JoPaca-1 σε Ιδοεονε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Μέσο (IMDM), 10% ορό εμβρύου Calve (FCS) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (P /S) (Cat Νο 21056).? BxPC-3 στο Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640, 10% FCS και 1% PS (Cat Νο 21875.)? HPDE c7 σε κερατινοκυττάρων Serum-Free Medium (KSFM), 0,15 ng /ml υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, και 25 μg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης (Cat. Νο 17005075) [29]. Για τον σχηματισμό σφαίρα όγκου, JoPaca-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε /F12 θρεπτικό μέσο Ham συμπληρωμένο με 20 ng /ml παράγοντα βασικής ανάπτυξης ινοβλάστης (bFGF, F0291, Sigma Aldrich, Μόναχο, Γερμανία), 1 × B-27 συμπληρώματα (Cat. Αριθ . 0080085-SA), 2 mM L-γλουταμίνη (Cat. No. 25030024), και 1% Ρ /Σ σε χαμηλές πλάκες στερέωσης (Cat. No. 3473, η Corning, Άμστερνταμ, Ολλανδία). Τα κύτταρα χωρίστηκαν σε αναλογία 1 έως 10, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με γεμσιταβίνη (G6423, Sigma Aldrich) προσδιορίστηκε με δοκιμασία resazurine [30]. Για μακροχρόνια θεραπεία με γεμσιταβίνη, JoPaca-1 κύτταρα σε δίοδο 10 υποβλήθηκαν για μια περίοδο 72 h σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου: 10, 15, 20 και 25 ηΜ. Τα κύτταρα χωρίστηκαν 1/3 μετά από κάθε γύρο της θεραπείας και σε σύγκριση με ένα έλεγχο κατά τη δίοδο 13 για την έκφραση του CD133. Εικόνες της γονικής JoPaca-1 και των επιμέρους κλώνων στον πολιτισμό ελήφθησαν σε ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (DM IRBE, Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία) εξοπλισμένο με μια κάμερα CCD (Progressive Scan CV-M1, JAI, Φρανκφούρτη, Γερμανία). Ράβδοι κλίμακας προστέθηκαν στο ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA) με τον υπολογισμό μετριέται μεγέθη pixel

Κυτταρογενετική -. Πολύχρωμες φθορισμού

in situ υβριδισμού

(mFISH)

JoPaca -1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng /ml βινμπλαστίνη στους 37 ° C, 5% CO

2 για 4 ώρες για να τους συλλάβουν σε μετάφαση. Μεταφάσης αλείμματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τυπικά πρωτόκολλα [31]. Εν ολίγοις, αιωρούμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 75 mM KCl για 20 λεπτά στους 37 ° C και σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα παγωμένο Carnoy του (methanol:acetic οξύ = 3:01) σε τρία στάδια πλύσης. Το διάλυμα των σταθερών κυττάρων μειώθηκε από 1 μέτρο επάνω σε μια κεκλιμένη τσουλήθρα που είχαν προηγουμένως διαβραχεί με 70% αιθανόλη. mFISH έγινε με τη χρήση του πολυ-χρώμα σετ καθετήρα 24XCyte (Metasystems, Altlussheim, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι υβριδοποιημένες επάλειψη μετάφασης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας υποβοηθούμενη από υπολογιστή μικροσκόπιο φθορισμού (Axioplan 2, Zeiss, Göttingen, Germany) εφοδιασμένο με κατάλληλα σετ φίλτρων. Οι εικόνες που καταγράφονται με μια κάμερα CCD (Photometrics, Tucson, AZ, USA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας πειράγματα SpectraVysion Λογισμικό ™ (Vysis, τώρα διανέμεται μέσω Applied Imaging).

Κλωνογόνος δυνατότητες και tumourgeneity

In vitro

περιοριστική, δοκιμασία αραίωσης.

JoPaca-1 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε μια σειρά αραίωσης ένα-προς-ένα αρχίζοντας από 125 κύτταρα ανά φρεάτιο, κάθε αραίωση σε 16 αναπαράγει. Το μέσο δεν αλλάχθηκε να ενεργοποιήσετε αυτοκρινή σηματοδότηση. Μετά από 10 ημέρες, μετρήθηκαν τα φρεάτια που δείχνει διακριτές αποικίες. Μετά από 15 ημέρες, οι αποικίες που δείχνουν διαφορετικές μορφολογικά φαινοτύπους φωτογραφήθηκαν.

In vivo

περιοριστική, δοκιμασία αραίωσης.

Τα αρχικά πειράματα ξενομοσχεύματος έγιναν με ένεση 1 κύτταρα Mio σε NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NOD /SCID /γ ή NSG) ποντίκια. Για να αξιολογηθεί in vivo ογκογονικότητας JoPaca-1, 104, 103 και 102 κύτταρα, αντιστοίχως, εγχύθηκαν σε 70 μλ Matrigel (2 mg /ml) (BD, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) στο παγκρεατικό σώμα των ποντικών NSG. Επιτυχής μεταμόσχευση των όγκων και την επακόλουθη ανάπτυξη παρακολουθήθηκε με την τακτική ψηλάφηση της περιοχής εμφύτευσης.

Για την ποσοτικοποίηση κλωνογόνο δυναμικό και ογκογενή συχνότητα, τα δεδομένα αναλύθηκαν από έναν αλγόριθμο παλινδρόμησης-fit (ΕΛΔΑ) [32].

Η &? Ε χρώση και ανοσοϊστοχημεία των ξενομοσχευμάτων και πρωτογενών όγκων

εξαχθέντα καρκινώματα εγκλείστηκαν σε παραφίνη μπλοκ και τομές κόβονται σε πάχος 4 μm χρησιμοποιώντας μια μικροτόμο. Haematoxilin και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση καθώς και ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες. Εν συντομία, τα δείγματα ιστού αφαιρείται η παραφίνη χρησιμοποιώντας Roticlear (A538, ο Carl Roth, Karlsruhe, Germany) και ενυδατωμένο σε μια διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης. Το αντιγόνο ανάκτηση επιτεύχθηκε με θέρμανση σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.1). Διαφάνειες αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας μπλοκ εξουσίας (Biogenex, Fremont, CA, USA) και επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα: αντι-ΑΙ_ϋΗ1 (. Mat Νο 611194, BD Biosciences) που χρησιμοποιείται σε 1:1000? αντι-κυτοκερατίνης 19 που χρησιμοποιούνται στις 1:50? αντι-κυτοκερατίνης AE1 /AE3 (κωδικός M3515, DakoCytomation) που χρησιμοποιείται σε 1:300? αντι-CD133 /1 (AC133) (130-090-422, Miltenyi Biotech) που χρησιμοποιείται στις 1:50? και μια καθολική αρνητικό έλεγχο που περιέχει IgGs ποντικού (IS750, DakoCytomation) που χρησιμοποιούνται σε 1:02 αραίωση. Τα πλακίδια επωάστηκαν στους 4 ° C για 16 ώρες. Για την ανίχνευση του πρωτογενούς αντισώματος, ένα δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση (K4001, DakoCytomation) εφαρμόστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αντίδραση χρώματος με diaminobenzodine (DAB) ήταν αντίθετη χρώση με αιματοξυλίνη. Τέλος, διαφάνειες παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Αχίορίαπ 2 μικροσκόπιο και οι εικόνες που λαμβάνονται από μια φωτογραφική μηχανή AxioCam HRc CCD (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany). ράβδοι κλίμακας προσετέθησαν στο συνοδευτικό λογισμικό AxioVision 4.

ανοσοφθορισμού

Για ανοσοφθορισμό του mesothelin και κυτοκερατίνη 19, JoPaca-1, BxPC-3 και HPDE C7 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλακίδια καλλιέργειας (Cat . 354559, BD Biosciences), σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 για 5 λεπτά. Τα πλακίδια μπλοκαρίστηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό άλας (PBS) με 10% λευκωματίνη βόειου ορού (BSA) και επίτοπα ανακτηθεί με PBS συμπληρωμένο με 10% πρωτεϊνάση Κ IgG1 αντισώματα έναντι mesothelin K1 (αρ. SC-33672, Santa Cruz Biotechnology, Χαϊδελβέργη, Γερμανία ) και κυτοκερατίνη 19 (κλώνος RCK108, Κωδικός-Nr. Μ 0888, DakoCytomation, Αμβούργο, Γερμανία) καθώς και IgG1 ποντικού (MCA928, Serotec, Puchheim, Γερμανία) ως αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:50. Το δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor IgG1 488 κατσίκας αντι-ποντικού (Α-11001, Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:500. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν με υδατικό μέσο το οποίο περιέχει 4 ‘, 6-diamidin-2-φαινυλινδολ (DAPI) σε πυρήνες αντι-κηλίδα (SC-24941, Santa Cruz Biotechnology). Εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο ευρέως πεδίου εξοπλισμένο με μια φωτογραφική μηχανή AxioCam CCD (Zeiss κυττάρων Observer, ο Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany).

φθορισμού επικουρείται διαλογή κυττάρων (FACS)

Η έκφραση της CD133 ανιχνεύθηκε με FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, Heidelberg, Germany) με τη χρήση φυκοερυθρίνη συζευγμένο CD133 /2 (293C3) και CD133 /1 (AC133) αντισώματα (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Γερμανία). Δραστηριότητα της ΑΙ_ϋΗ1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Aldefluor αναστολέας υποστρώματος +/- ϋΕΑΒ (StemCell Technologies, Grenoble, Γαλλία). ΑίϋΗ φωτεινή κύτταρα (ALDH

br) ανιχνεύθηκαν στο κανάλι FITC και αντισταθμίζεται κατά φυκοερυθρίνη και αντίστροφα χρησιμοποιώντας ξεχωριστά επισημασμένα κύτταρα ως έλεγχοι. Έκφραση της τριπλέτας CD44 /CD24 /ESA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα από BD Biosciences: (Κατ. 347200) (Κατ. 560533) EpCAM (ESA) -APC, CD44-PE-Cy7, CD24-FITC (Cat 555427). . Η επώαση των κυττάρων με αντισώματα και υποστρώματα, μπλοκάροντας FcR και στάδια πλύσης έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ολόκληρο το γονιδίωμα αλληλούχιση

Γονιδιωματικό DNA από τις κυτταρικές γραμμές JoPaca-1 (δίοδος 8) και BxPC-3 εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα. Ολόκληρο γονιδιώματος και διαβάστε ευθυγράμμιση έγινε χρησιμοποιώντας ένα sequencer Illumina HighSeq 2000 στο Centre National de Génotypage (Evry, Γαλλία). Δεδομένα από τα κορυφαία 17 μη συνώνυμες κωδικοποίησης γονιδίων μεταλλάσσεται σε καρκίνο του παγκρέατος ελήφθη από τον κατάλογο Sanger Institute σωματικών μεταλλάξεων στον καρκίνο web site (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) [33]. Επιπλέον, τρία γονίδια συμπεριλήφθηκαν από τη βάση δεδομένων ΟΜΙΜ υπό τον όρο αναζήτησης «παγκρεατικό καρκίνο» (https://www.omim.org/entry/260350) [34]. Όλα αυτά τα γονίδια ελέγχονται για εξονικές μη συνώνυμες μεταλλάξεις στα BxPC-3 και JoPaca-1 (Πίνακας S2). Επιπλέον, μη-κωδικοποιητικές παραλλαγές που συνδέονται με τον καρκίνο του παγκρέατος λήφθηκαν από γονιδίωμα μελέτες ευρείας σύνδεσης (GWAS) (Πίνακας S3). Η απαρίθμηση των μεταλλαγμένων και άγριου τύπου διαβάζει έγινε με το χέρι χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα περιήγησης Ensembl γονιδίωμα [35] και ολοκληρωμένων θεατή γονιδίωμα [36] μετρώντας κάθε χαρτογραφημένες διαβάσει.

Sanger αλληλούχισης του

KRAS

Η

Η περιοχή γύρω από το κωδικόνιο 12 του

KRAS

ενισχύθηκε από cDNA που παράγονται από τις κυτταρικές σειρές με πρότυπη PCR χρησιμοποιώντας Phusion πολυμεράσης (F-530, Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία) και οι παρακάτω εκκινητές : KRAS-F (5′-CCC CGC CAT TTC GGA CTG GG-3 ‘) και KRAS-R (5′-ACT ΚΔ CTT GAC CTG CTG TGT CG-3’). Τα προϊόντα της PCR αλληλουχία από GATC (Constance, Γερμανία) χρησιμοποιώντας αστάρι KRAS-F.

Αποτελέσματα

JoPaca-1 κύτταρα προέρχονται από φτωχά διαφοροποιημένο πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος

Για την απομόνωση των κυττάρων του πρωτογενούς όγκου, φρέσκο ​​ιστός λαμβάνεται από ένα 46 ετών άρρεν ασθενής που πάσχει από καρκίνο του παγκρέατος, ο οποίος υποβλήθηκε σε πυλωρού συντηρητικά pancreatecto-duodenectomy (λειτουργία pp-Whipple). Πέθανε πέντε μήνες μετά την επέμβαση. Η ιστοπαθολογική εξέταση του ιστού αποκάλυψε μια πτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του πόρου του παγκρέατος, με διείσδυση όγκου του δωδεκαδάκτυλου, την ενδοπαγκρεατική χοληφόρου πόρου και της ΠΕΡΙΠΑΓΚΡΕΑΤΙΚΟ μαλακού ιστού. Περινευρική, λυμφογενή και αιματογενή διείσδυση του όγκου θα μπορούσε να βρεθεί, καθώς και δύο μεταστάσεις λεμφαδένα σε 22 περιφερειακούς λεμφαδένες. Το στάδιο TNM ήταν ρΤ3, ρΝ1 (2/22), G3. Κλινικά, δεν υπήρχε εμφάνιση μεταστάσεων μακρινό οργάνων. Η κύρια κυτταρική γραμμή JoPaca-1 απομονώθηκε από τον εκτομή καρκινικού ιστού, όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο τμήμα των μεθόδων. Ο προκύπτων πληθυσμός των καθαρών κυττάρων όγκου καταψύχθηκε μετά από τέσσερις διόδους ανάπτυξης. Για τα πειράματα που αναφέρονται παρακάτω, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα από 6 έως 19 περάσματα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πρότυπο ΙΜϋΜ μέσο κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FCS και 1% PS.

υποκλώνοι των JoPaca-1 αποκαλύπτουν φαινοτυπικά ετερογένεια των γονικών πληθυσμού

Ενιαία κύτταρα του JoPaca-1 αναπτύχθηκαν σε πλήρη απομόνωση δημιούργησε αποικίες που παρουσίασαν ποικίλες μορφολογία (Εικ. 1). Τυπικά, θα μπορούσε να παρατηρηθεί δύο μορφές της ανάπτυξης: κοντά σχηματισμό επαφή το νησί και την εξάπλωση μη-επαφής (Σχήμα 1Β, Γ.). Κυτταρική ετερογένεια αντανακλάται επίσης από το φάσμα των διαφορετικών σχημάτων των κυττάρων που παρατηρήθηκαν. Γύρος και φυσαλιδώδη κύτταρα συνέβη όπως έκανε και ένα αδράχτι-όπως φαινότυπο. Επίσης, ο σχηματισμός της μακράς pseudopods θα μπορούσε να δει (Εικ. 1 D-F). Και οι δύο, διαφορετικά χαρακτηριστικά ανάπτυξης και τα διάφορα σχήματα των κυττάρων θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί στο γονικό πληθυσμό (Εικ. 1Α) που δείχνει καλή αναπαράσταση της από τα απομονωμένα υπο κλώνων.

Οι εικόνες αντίθεσης φάσης παρουσιάζονται από JoPaca-1 γονικά κύτταρα και υποκλώνοι δείχνει διαφορετικά χαρακτηριστικά της ανάπτυξης και της μορφολογίας. Α JoPaca-1 γονικού κυτταρικού πληθυσμού. Π.Χ. Δύο διαφορετικά χαρακτηριστικά αύξησης μπορεί να παρατηρηθεί: στενή επαφή σχηματισμό νησιού (Β) και διάδοση μη-επαφής (C). D-F. παρατηρήθηκαν τρεις διαφορετικές μορφές κυττάρων:. γύρο και φυσαλιδώδους (D), ατρακτοειδόμορφα (Ε), και ψευδο-pod που σχηματίζουν τα κύτταρα (F)

Η

κύτταρα JoPaca-1 είναι τετρα- έως pentaploid και γονιδίωμά ασταθή

JoPaca-1 συνελήφθη στη μετάφαση να μελετήσει τις καρυότυπος και χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Μετάφαση spreads της 26ης κύτταρα αναλύθηκαν. Θα εμφανιστεί ένα τετρα- να pentaploidic καρυότυπο με πέντε παρατηρείται συνήθως χρωμοσωμικές εκτροπές (Εικ. 2). Αυτές είναι οι μεταθέσεις t (17? 5) (5? 17), t (7? 4), t (13? 12), και t (2? 9) και μία αντιστροφή του χρωμοσώματος 13 (I13). Συνολικά, 47 διαφορετικές εκτροπές παρατηρήθηκαν στις 26 karyograms. Αλλά για τις σχετικά συχνές εκτροπές του ανωτέρω, τα περισσότερα (38) παρατηρήθηκαν μόνο μία φορά. Τρεις άλλες μεταθέσεις βρέθηκαν δύο ή τρεις φορές (Πίνακας S1). Ο Υ-χρωμόσωμα χάθηκε σε 20 από τις 26 karyograms.

Ένας εκπρόσωπος karyogram της JoPaca-1 παρουσιάζεται εδώ. JoPaca-1 είναι ένα τετρα- έως πεντα-ploidic κυτταρική γραμμή. Κάτω από την επισκόπηση της εικόνας, οι πέντε πιο συχνά παρατηρούνται αποκλίσεις σε 26 karyograms παρουσιάζονται. Μεταθέσεις θα μπορούσαν να προσδιοριστούν με υβριδισμό του διαφορετικού χρώματος ανιχνευτών με αποτέλεσμα την dual-χρωματιστό χρωμοσώματα. Αντιστροφή του χρωμοσώματος 13 (I13) είναι η συγχώνευση των δύο q όπλα στο κινητοχώρου. Ο Υ-χρωμόσωμα συχνά χάνεται σε καρκινικά κύτταρα, όπως είναι σε αυτήν την παράσταση.

Η

JoPaca-1 δείχνει αυξημένη αντίσταση σε γεμσιταβίνη πάνω BxPC-3

JoPaca-1 κύτταρα σε σύγκριση να BxPC-3 στην απάντησή τους στην gemcitabine, το πρότυπο πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτική αγωγή του καρκίνου του παγκρέατος. Εν τη απουσία του φαρμάκου, ο χρόνος διπλασιασμού ήταν 28 h για JoPaca-1 και 19 ώρες για BxPC-3. Κατά τη διάρκεια μιας περιόδου ανάπτυξης 72 h, αυτό αντιστοιχεί σε 3,79 κυτταρικές διαιρέσεις του BxPC-3 και 2.57 του JoPaca-1. Για να διαιρέσει 3,79 φορές, JoPaca-1 θα απαιτήσει 106 ώρες. Κατά συνέπεια, μια παρατεταμένη επώαση με γεμσιταβίνη είχε ισχυρότερη επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα JoPaca-1 (Σχ. 3Α). Σε σύγκριση με BxPC-3, JoPaca-1 έδειξε μία σημαντικά υψηλότερη ανοχή σε γεμσιταβίνη με IC

50 από 28 ηΜ έναντι 11 ηΜ για BxPC-3, ακόμη και μετά το ήμισυ του πληθυσμού των κυττάρων υποβλήθηκαν σε ένα επιπλέον γύρο της μίτωσης (3.79+ 0.49 = 4.28 κυτταρικές διαιρέσεις = 120 ώρες) (Σχ. 3Β). Ως εκ τούτου, η αυξημένη αντίσταση των JoPaca-1 είναι ανεξάρτητο από το ρυθμό πολλαπλασιασμού.

BxPC-3 και JoPaca-1 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης για 72, 96, και 120 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς μη κατεργασμένα δείγματα αναφοράς. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν μέσο όρο των αποτελεσμάτων των έξι επαναληπτικών πειραμάτων με σταθερές αποκλίσεις που υποδεικνύεται από ράβδους σφάλματος. A. Η αύξηση του χρόνου επώασης με αποτέλεσμα gemcitabine σε αυξημένη κυτταροτοξικότητα για JoPaca-1. B. Η βιωσιμότητα των κυττάρων συγκρίθηκε μεταξύ 3,79 και 4,28 κυτταρικές διαιρέσεις για BxPC-3 και JoPaca-1, αντίστοιχα. JoPaca-1 δείχνει μεγαλύτερη ανοχή έναντι γεμσιταβίνης από BxPC-3, ακόμη και μετά από παρατεταμένη επώαση των 0,49 κυτταρικές διαιρέσεις.

Η

κύτταρα JoPaca-1 είναι πολύ ογκογόνο και έχουν αυξηθεί κλωνογονικού δυναμικό

Για να καθιερώσει κλωνογόνο δυναμικό των JoPaca-1, τα κύτταρα σε δίοδο 10 μετρήθηκαν και σπάρθηκαν σε 1 έως 1 αραίωση σειρά σε δύο πλάκες 96 φρεατίων ξεκινώντας από 125 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Κάθε αραίωση έγινε 16 φορές. Μετά από 15 ημέρες επώασης, μετρήθηκαν φρεάτια που περιείχαν ξεχωριστές αποικίες. Υπολογιστική ανάλυση των μετρήσεων αποικίας χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο «Extreme LDA» [32] έδειξε ότι ένα κύτταρο σε 48 (~ 2%) ήταν σε θέση να σχηματίσουν μια αποικία (Εικ. 4Α). Αυτό κλωνογόνο δυναμικό είναι δέκα φορές υψηλότερη από εκείνη της καθιερωμένης κυτταρικής γραμμής Capan-1 με 0,2% [19].

Κλωνογόνος δυναμικού και tumourgenicity του JoPaca-1 προσδιορίστηκαν με περιοριστική αραίωση δοκιμασιών

in vitro

και

in vivo

. Α Αραίωση των κυττάρων σε μία πλάκα 96 φρεατίων και καταμέτρηση κυττάρων αποικίας που περιέχουν μετά από 10 ημέρες να οδηγήσει σε κλωνογόνο δυναμικό των 1 κύτταρο σε 48, όπως υπολογίζεται από ΕΛΔΑ [32]. ένεση Β ορθοτοπική των 10.000, 1.000 και 100 JoPaca-1 κύτταρα σε 6 NOD.Cg-

Prkdc

SCID Il2rg

tm1Wjl

ποντίκια κάθε αποτέλεσμα το σχηματισμό των όγκων που αποκόπτονται, σταθμισμένων και φωτογραφηθεί. Οι μέσες μάζες όγκου εμφανίζονται.

Η

Για να καθοριστεί το tumourgenicity της JoPaca-1

in vivo

, τρεις ομάδες των έξι ανοσοκαταστολή NOD.Cg-

Prkdc

scid Il2rg

tm1Wjl

ποντίκια ενέθηκαν ορθοτοπικώς με 10

4, 10

3, και 10

2 κύτταρα, αντίστοιχα. Μετά από 100 ημέρες, όλοι οι ποντικοί ήταν ακόμη ζωντανά. Συνολικά, 11 ποντίκια που είχαν σχηματίσει όγκους: 6/6 για τα ζώα με 10

4 κύτταρα, 4/6 με 10

3 κύτταρα και 1/6 με 10

2 κύτταρα (Σχήμα 4Β.). συχνότητα των όγκων-κίνηση εκτιμήθηκε από τον αλγόριθμο ΕΛΔΑ σε 1 κύτταρο σε 831 με ένα κάτω και άνω όριο του 1 στα 2114 και 1 στις 327, αντίστοιχα. Οι όγκοι αποκόπηκαν και σταθμίζονται. Το βάρος του όγκου συσχετίζεται άμεσα με τον αριθμό των εγχυθέντων κυττάρων. Με 10

4 κύτταρα, το μέσο βάρος του όγκου ήταν 927 mg? επαγωγή με 10

3 κύτταρα προκάλεσε όγκους των 618 mg κατά μέσο όρο. Το ενιαίο όγκο που προκύπτει από τις 10

2 κύτταρα είχαν 300 mg.

JoPaca-1 κύτταρα διηθούν τον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό και δείχνουν μεταστάσεις δυναμικό in vivo

Ο κύριος όγκος είχε εισβάλει λείο μυϊκό ιστό της το εγγύς δωδεκαδάκτυλο (Εικ. 5Α). Ξενομοσχεύματος όγκοι δεν capsulated? Επιπλέον αυτοί αποκάλυψε ένα επεμβατική εμπρός με περιοχές διηθητικής επέκταση του όγκου στην παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παγκρέατος (σχ. 5Β) Μεταστάσεις μπορεί να παρατηρηθεί σε ένα από τα τρία ποντίκια κατά τη διάρκεια της αρχικά πειράματα, αλλά δεν αναλύθηκαν περαιτέρω (Σχ. 5C).

εδώ φαίνονται H & amp? Ε λεκέδες του ξένου μοσχεύματος (Β) φέτες ιστού πρωτογενή (Α) και. A. λείο μυϊκό ιστό του δωδεκαδακτύλου ήταν μολυσμένο από καρκινικά κύτταρα του πρωτογενούς όγκου. Β Επεμβατική μπροστά όγκων ξενομοσχεύματος με περιοχές διηθητική επέκταση του όγκου στον παρακείμενο φυσιολογικό πάγκρεας ιστό (βέλος κεφάλια). Γ Ένας στους τρεις NSG ποντίκια ανέπτυξαν μετάσταση κατά τη διάρκεια της αρχικά πειράματα, όταν 1 κύτταρα εκατ ενέθηκαν ορθοτοπικώς (αιχμές βελών).

Η

Πρωτοβάθμια και ξενομόσχευμα όγκων που αντλήθηκαν από JoPaca-1 έχουν πολύ παρόμοια ιστολογία

Ιστοπαθολογικά, οι ξενομοσχεύματος όγκοι παρουσιάζουν υψηλό βαθμό ομοιότητας με την πρωτογενή όγκο. πρότυπα κυτταρική μορφολογία και η ανάπτυξη συνολικής ελάχιστα διαφοροποιούνται χαρακτηρίζεται από ενιαίο κυτταρική ή σταθερή ανάπτυξη. Ωστόσο, οι περιοχές του μικροθηλωματώδης μοτίβα ανάπτυξης και σωληνίσκων σχηματισμοί βρέθηκαν σε τόσο πρωτογενή και ξενομοσχεύματος ιστού (Σχ. 6Α). Επιπλέον, μεταναστευτικά και επεμβατική συμπεριφορά παρατηρήθηκε σε παρόμοιο βαθμό. Πρωτοβάθμια και ξένου μοσχεύματος ιστών έδειξε περινευρικό διείσδυση και την εισβολή στο λεμφικό και τα αιμοφόρα αγγεία (Εικ 6Β, CII και 11C.)

Εδώ φαίνονται H & amp?. Ε λεκέδες της πρωτοβάθμιας και ξενομοσχεύματος όγκων. Α Πρωτοβάθμιας και όγκους ξενομοσχεύματος δείχνουν παρόμοια φαινότυποι διαφοροποίησης που κυμαίνονται από τη συνολική κακή διαφοροποίηση (-) πάνω από μικροθηλωματώδης ανάπτυξης (x) σε πιο διαφοροποιημένες σωληνίσκων σχηματισμούς (*). Β περινευρωνικές εισβολή μπορεί να παρατηρηθεί σε τόσο της πρωτοβάθμιας όσο και ξενομοσχεύματος όγκους (αιχμές βελών). Γ Εμφανίζεται εδώ είναι περιοχές νέκρωσης όγκου, οριοθετείται από τα ουδετερόφιλα κοκκιοκύτταρα (C i, αστερίσκους) και διήθηση του όγκου των λεμφικών αγγείων (Γ ΙΙ, κεφαλή βέλους). Δ Κατανομή στρώμα (S) στην πρωτοβάθμια και ξενομοσχεύματος ιστού του όγκου. Τα όγκου κύτταρα και των δύο δειγμάτων ενσωματωμένα σε δεσμοπλαστικού στρώματος του όγκου. Ενώ στρώμα στον πρωτογενή όγκο διασπείρεται σε όλο τον όγκο, είναι πιο εντοπισμένη στο ξενομοσχεύματος.

Η

χαρακτηριστικά λόγω της ανοσολογικά χαρακτηριστικά ήταν φυσικά πιο έντονη στον πρωτογενή όγκο σε σχέση με το ξενομόσχευμα οι ποντικοί NSG είναι ανίκανα να συναρμολογήσεως μια έμφυτη ή προσαρμοστική ανοσοαπόκριση. Αυτά τα ανοσολογικά χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν περιοχές νέκρωσης όγκου που οριοθετείται από ουδετερόφιλα κοκκιοκύτταρα (Εικ. 6Ci) καθώς επίσης και διηθητικά φλεγμονώδη κύτταρα, κυρίως λεμφοκύτταρα και κοκκιοκύτταρα. Στην πρωτογενή όγκο, τα κύτταρα ενσωματωμένα σε δεσμοπλαστικό στρώμα του όγκου. Ξενομοσχεύματος όγκοι είναι εν μέρει διανθίζονται με στρωματικό ιστό, καθώς και. Εδώ, οι περιοχές αυτές εντοπίζονται και όχι ως πανταχού παρών, όπως στην πρωτογενή όγκο (Εικ. 6D).

JoPaca-1 εκφράζει κυτοκερατίνες και ο δείκτης όγκου mesothelin

Η ανοσοϊστοχημεία των κυτοκερατίνες πραγματοποιήθηκε σε πρωτογενή και ξενομοσχεύματος όγκου φέτες ιστού. Και οι δύο, πρωτοβάθμιας και ξενομοσχεύματος όγκων χρωματίστηκαν θετικά για τις παν-κυτοκερατίνης κλώνους AE1 και AE3. Έκφραση κυτοκερατίνες στον πρωτογενή όγκο ήταν ελαφρώς μεγαλύτερη διασπορά σε σύγκριση με τα ξενομοσχεύματα, όπου σαφώς βάφονται τα επιθηλιακά κύτταρα που επικαλύπτουν την πλευρά του αυλού των αγωγών. Πιο συγκεκριμένα, η έκφραση της κυτοκερατίνης 19 ήταν ακόμη πιο χαρακτηριστικά πορογενές και στις δύο ιστούς. Ισοτύπου μάρτυρες ήταν αρνητικά (εικ. 7). Ανοσοφθορισμός επιβεβαιώνει την έκφραση του κυτοκερατίνη 19 σε απομονωμένα κύτταρα JoPaca-1. Cytokeratin 19 είναι ένα ενδιάμεσο πρωτεΐνη πυράκτωσης και εκφράστηκε από JoPaca-1 στην καλλιέργεια μπροστά από ένα αποικίας κυττάρου (Εικ. 8Α). Επιπλέον, JoPaca-1 δοκιμάστηκε για έκφραση του mesothelin δείκτη όγκου. Η καθιερωμένη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή BxPC-3, και η κανονική παγκρεατικού πόρου κυτταρική γραμμή HPDE C7 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα. Η έκφραση του mesothelin μπορούσε να ανιχνευθεί σε JoPaca-1 και κύτταρα BxPC-3, αλλά όχι κατά τη συνήθη κύτταρα παγκρεατικού αγωγού HPDE C7. Ισοτόπου έλεγχοι ήταν αρνητικοί (Εικ. 8Β).

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε στην πρωτοβάθμια και ξενομοσχεύματος φέτες όγκου. Κερατίνες AE1 /AE3 και πιο συγκεκριμένα κυτοκερατίνη 19 εκφράστηκαν σε πορογενές δομές της πρωτοβάθμιας και ξενομοσχεύματος όγκους (καφέ). έλεγχοι ισοτόπου ήταν αρνητικές.

Η

Οι εικόνες αντίθεσης φάσης παρουσιάζονται που δείχνουν mesothelin και κυτοκερατίνη 19 όπως ανιχνεύεται σε πάγια JoPaca-1, BxPC-3 και τα κύτταρα C7 HPDE. Αμφότερες οι πρωτεΐνες σημειώνονται με πρωτογενή και ΡΙΤΟ-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα (πράσινο). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). έλεγχοι ισοτύπου ήταν αρνητικές. A. Cytokeratin 19 εκφράζεται στην αυξανόμενη μέτωπο των κυττάρων JoPaca-1. B. JoPaca-1 και η καθιερωμένη κυτταρική γραμμή BxPC-3 και οι δύο εκφράζουν mesothelin ενώ η κανονική C7 παγκρεατικού πόρου κυτταρική γραμμή HPDE δεν το κάνει.

Η

κύτταρα JoPaca-1 είναι εντόνως εμπλουτισμένα σε δείκτες καρκίνου των βλαστικών κυττάρων

τα Αυτο-ανανέωση καρκινικά βλαστικά κύτταρα πιστεύεται ότι είναι η κινητήρια δύναμη πίσω από την εξέλιξη του όγκου και υπεύθυνη για την αντίσταση κατά της χημειοθεραπείας.