Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν βρεθεί να απορυθμίζεται σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) και μπορεί να λειτουργήσει είτε ως ογκοκατασταλτικά γονίδια (ΟΚΓ) ή ως ογκογονίδια. Υπερμεθυλίωση miRNA σιωπές τη λειτουργία καταστολής όγκου ενός miRNA ή υπερμεθυλίωση ενός ΕΠΙΠ ρύθμιση που miRNA (ή το αντίστροφο) οδηγεί σε απώλεια της λειτουργίας. Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της ανώμαλης microRNA-125β (miR-125b) έκφραση σε διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά στο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και η σύνδεσή της με την ανώμαλη μεθυλίωση των πολλών ΕΠΠΕ. Είμαστε εγγεγραμμένοι 70 νέα κρούσματα του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών, καταγράφεται το κλινικό ιστορικό τους και 70 υγιείς εθελόντριες. Ορός miR-125b επίπεδα προσδιορίστηκαν με ποσοτική αντίστροφη αλύσου πολυμεράσης μεταγραφής αντίδραση (qRT-PCR) και η κατάσταση μεθυλίωσης των διαφόρων ΟΚΓ διερευνήθηκε με μεθυλίωση ειδική PCR. καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν για να εκτιμηθεί η διαγνωστική και προγνωστική χρησιμότητα του miR-125b. Η μέθοδος Kaplan-Meier εφαρμόστηκε σε σύγκριση καμπυλών επιβίωσης. Η έκφραση του miR-125b βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σημαντικά (ρ & lt? 0,0001) σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Το επίπεδο έκφρασης του miR-125b βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με το στάδιο της νόσου, λεμφαδένες και απομακρυσμένες μετάσταση. Καμπύλη ROC για διαγνωστικούς δυναμικό απέδωσε σημαντικά AUC με ισότιμη ευαισθησία και ειδικότητα. ROC καμπύλες για την πρόγνωση απέδωσε σημαντική AUCs για ιστολογική βαθμό, άπω μετάσταση, την κατάσταση των λεμφαδένων και η επιβίωση. Η έκφραση του miR-125b συσχετίζονται επίσης σημαντικά με την υπερμεθυλίωση της ΕΠΠΕ. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το DNA υπερμεθυλίωση μπορούν να συμμετέχουν στην αδρανοποίηση του miR-125b και miR-125b μπορεί να λειτουργήσει ως ένα δυναμικό ανεξάρτητο βιοδεικτών για την κλινική έκβαση σε ΕΓΚ

Παράθεση:. Zuberi Μ, Χαν Ι, Mir R, Γκάντι G, Ray PC, Saxena Α (2016) Χρησιμότητα του ορού miR-125b ως διαγνωστικοί και προγνωστικοί Δείκτης και τη συμμαχία της με ένα πάνελ ογκοκατασταλτικά γονίδια στο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 11 (4): e0153902. doi: 10.1371 /journal.pone.0153902

Επιμέλεια: Ratna B. Ray, πανεπιστήμιο του Saint Louis, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 4η Φεβρουαρίου, 2016? Αποδεκτές: 5 Απρίλη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 19 Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Zuberi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένων έχει συμπεριληφθεί εντός της Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία των θανάτων σε όλο τον κόσμο που σχετίζονται με τον καρκίνο. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας μπορεί να οφείλεται σε δυσκολίες στη διάγνωση σε πρώιμο στάδιο και την έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών για τους ασθενείς με προχωρημένο ή υποτροπιάζουσα νόσο [1]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια κρίσιμη προϋπόθεση για την ανάπτυξη προγνωστικά και προγνωστικά δείκτες για να ανιχνεύει έγκαιρα και να βοηθήσει τη βελτιστοποίηση της θεραπείας.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών μη κωδικοποίησης-μόρια RNA που θα μπορούσε να προκαλέσει μετα-μεταγραφική σίγηση γονιδίων στόχων αλληλεπιδρώντας με 3′-UTR τους (μη μεταφραζόμενη περιοχή), ρυθμίζοντας έτσι πολλές σημαντικές βιολογικές διεργασίες, όπως η ανάπτυξη των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [2]. Λαμβάνοντας υπόψη τις σημαντικές ρυθμιστικές ρόλους miRNA παίζουν στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί για τον εντοπισμό των miRNAs ως πιθανούς βιοδείκτες για τη διάγνωση του καρκίνου, την πρόγνωση και την εξατομικευμένη θεραπεία [3].

έκφραση παρεκκλίνουσα miRNA έχει επανειλημμένα παρατηρείται σε διάφορους τύπους ανθρώπινων όγκων. Μελέτες δείχνουν ότι τα miRNAs μπορεί να λειτουργήσει είτε ως ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΕΠΠΕ) ή ογκογονίδια [4]. Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν απορύθμιση του miR-125b σε διάφορους καρκίνους [5,6]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο miR-125b συμβάλλει σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC), δεν έχει τεκμηριωθεί και εξακολουθεί να είναι σχετικά ασαφής. Υψηλή έκφραση του miR-125 είχε παρατηρηθεί στα γλοιώματα και τον καρκίνο του προστάτη [7,8], ενώ τα επίπεδα miR-125 είχαν δει να μειώνονται σε μαστού και καρκίνο του στομάχου [9,10]. Μέχρι σήμερα, το επίπεδο έκφρασης της miR-125b σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών δεν είναι ακόμη σαφής. Σύμφωνα με την υποθετική περιοχή, ο υποκινητής του miR-125b είναι ενσωματωμένο στο νησί CpG [11].

Λαμβάνοντας υπόψη τα ανωτέρω συμπεράσματα, εξετάσαμε την έκφραση του miR-125β στον ορό των ασθενών με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών να διευκρινίσει χρησιμότητα του ως διαγνωστικού /προγνωστικού δείκτη. Αναλύσαμε επίσης το πρότυπο μεθυλίωσης σε ένα πάνελ των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως DAPK1, p16, RASSF1A, PTEN, BRCA1 και Ρ14 και να διερευνηθεί η σύνδεσή της με την ανώμαλη έκφραση του miR-125b.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ασθενών

δείγματα αίματος που προμηθεύονται από την κλινική διάγνωση ασθενών επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Οι ασθενείς (n = 70) είχαν προσληφθεί από το Τμήμα Γυναικολογίας και Μαιευτικής, Lok Nayak Νοσοκομείο, Νέο Δελχί μεταξύ Ιουνίου 2012 και Οκτωβρίου 2014 Ίδιος αριθμός (n = 70) των γυναικών εθελοντές (ηλικίας συμφωνημένα) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Ο ορός διαχωρίστηκε με φυγοκέντρηση. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -70 ° C και αποψύχθηκε αμέσως πριν από τη δοκιμασία. λήφθηκε πλήρη κλινικά δεδομένα και τις τρέχουσες σχέδιο θεραπείας. Ο σκοπός της δειγματοληψίας εξηγήθηκε σε όλους τους ασθενείς και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε πριν από την εγγραφή. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Δεοντολογίας σε Maulana Azad Medical College, Νέο Δελχί, Ινδία.

DNA Extraction

Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από δείγματα αίματος των ασθενών και των ελέγχων με τη χρήση του DNA Geneaid Κιτ απομόνωσης (Ταϊβάν) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα και η ακεραιότητα του DNA από αυτούς τους ιστούς ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 1% αγαρόζης, ποσοτικοποιείται φασματοφωτομετρικά, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -20 ° C για περαιτέρω χρήση.

τροποποίηση όξινου θειώδους του DNA

κατεργασία όξινου θειώδους διεξήχθη με τη χρήση του BisulFlash DNA Τροποποίηση Kit (Epigentek, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η διαδικασία αυτή τροποποιεί μη μεθυλιωμένη κυτοσίνες σε ουρακίλη νουκλεοτίδια, αλλά δεν τροποποιεί μεθυλιωμένα νουκλεοτίδια κυτοσίνη. Διθειώδες μετατροπή του DNA διεξήχθη στους 95 ° C για 20 λεπτά κατά τη διάρκεια της οποίας μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες μετατράπηκαν σε ουρακίλη εντελώς. Αυτό ακολουθήθηκε από την μετατροπή DNA καθαρισμό και αποθήκευση στους -80 ° C πριν από τη χρήση.

μεθυλίωσης-ειδική PCR

μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) είναι ευαίσθητη και ειδική για μεθυλίωση του σχεδόν κάθε μπλοκ CpG θέσεων εντός μιας CpG νησίδας. Η συχνότητα των CpG θέσεων σε νησίδες CpG καθιστά την τεχνική αυτή χρήσιμο και εξαιρετικά ευαίσθητο για τις περιοχές αυτές. Κατεργασμένο με όξινο θειώδες DNA ενισχύθηκε με ειδικούς εκκινητές PCR (S1 Πίνακα) που διακρίνουν μεθυλιωμένου και μη μεθυλιωμένου DNA. Αυτά τα εναύσματα ενισχύουν διαφορετικού μεγέθους προϊόντα για DAPK1, ρ16, RASSF1A, ΡΤΕΝ, BRCA1 και Ρ14 (για μεθυλιωμένο και μη μεθυλιωμένων αλληλουχιών) όπως φαίνεται στο συμπληρωματικό αρχείο (S1 Εικ). PCR διεξήχθη σε ένα μίγμα 25 μL που περιέχει 10 μι Dream Taq Master Mix (Fermentas) που περιέχει το βελτιστοποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα, 4 mM MgCl

2, ανασυνδυασμένη Taq DNA πολυμεράση, 0.4 mM από κάθε dNTP, 0.6 μΜ του κάθε εκκινητή, και 4.0 μι κατεργασμένου με όξινο θειώδες ϋΝΑ εκμαγείο.

RNA Extraction, πολυαδενυλίωσης και σύνθεση cDNA

RNA

από δείγματα ορού απομονώθηκε με τη μέθοδο ΤπζοΙ και αποθηκεύονται σε ελεύθερη σωλήνες RNase στους -70 ° C. Η ποιότητα και η ακεραιότητα του RNA προσδιορίστηκε με την

260/280 λόγος Α. Το Poly-A ουράς διεξήχθη χρησιμοποιώντας Poly μια πολυμεράση ενζύμου και rATP (Agilent, Cat # 600036). Αντίστροφη μεταγραφάση και άλλα απαραίτητα αντιδραστήρια για σύνθεση cDNA προστέθηκαν στη συνέχεια για να μετατρέψει το πολυ (Α) ουρά miRNAs σε cDNA χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή προσαρμογέα ολιγο-άΤ που παρέχεται με το κιτ. Ο εκκινητής προσαρμογέας έχει μία μοναδική αλληλουχία στο 5 ‘άκρο του η οποία επιτρέπει την ενίσχυση του cDNA σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR αντιδράσεων.

ανίχνευση miRNA με qPCR

Σχετική ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR ) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η έκφραση του miRNA. qPCR διεξήχθη επί ενός ρότορα Gene (Qiagen), χρησιμοποιώντας Maxima SYBR Green qPCR βασικού μείγματος (Fermentas), miR-125b ειδικών προς τα εμπρός εκκινητή (Qiagen) (Πίνακας 1), ένα κοινό καθολικό αντίστροφο έναυσμα και snU6 σαν ενδογενές ελέγχου. 100 ng του προϊόντος cDNA ενισχύθηκε στο στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής παραπάνω προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε όγκο αντίδρασης 20 μΐ χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα ενίσχυσης: DNA

Taq πολυμεράση

ενεργοποίησης στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους ενίσχυσης από μετουσίωση στους 95 ° C για 10 s, ανόπτηση στους 61 ° C για 20 s, και επιμήκυνση στους 72 ° C για 10 s. Τέλος, μια καμπύλη τήξης δημιουργήθηκε με τη λήψη μετρήσεων φθορισμού κάθε 0,5 ° C για 25 s από 50 ° C μέχρι 95 ° C για να εξασφαλιστεί ένα ενιαίο προϊόν PCR. Τα πειράματα πραγματικού χρόνου PCR επαναλήφθηκαν atleast τρεις φορές.

Η

Οι τιμές Ct της καθαριότητας U6 snRNA και να δοκιμάσουν mir-125β χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του δέλτα Ct (ΔΟΙ) τιμές μεταξύ γονιδίων δοκιμής και αναφοράς και στις δύο φυσιολογικούς υγιείς μάρτυρες και ασθενείς τεστ. Ct (ΔΔCt) τιμές δέλτα δέλτα μεταξύ υγιών μαρτύρων και ασθενών με βάση την διαφορά στις τιμές ΔCt μεταξύ των δύο συνόλων. Αυτό χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η εκθετική διαφορά με βάση 2

-ΔΔCt. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν και εκφράζεται σε όρους φορές έκφρασης σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες.

Στατιστική Ανάλυση

Οι συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και των κλινικών και παθολογικών παράμετροι αναλύθηκαν με Chi -πλατεία δοκιμή ή Fisher ανάλυση ακριβής πιθανότητα. Η διαφορά των επιπέδων έκφρασης miR-125b μεταξύ ασθενών και μαρτύρων επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών εξετάστηκε από Φοιτητών

t-test

. καμπύλες ROC κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό XLSTAT. ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Kaplan-Meier οικόπεδα και δοκιμασία log-rank (Mantel-Cox). Η ανάλυση των δεδομένων για qPCR διεξήχθη με τη μέθοδο συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (Ct). Κάθε δείγμα εξετάστηκε εις τριπλούν και οι ποσότητες των προϊόντων PCR που παράγονται κανονικοποιήθηκαν προς τους εσωτερικούς ελέγχους. Γονίδιο και τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ελήφθησαν από σχετική ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας το

2 – μέθοδος (ΔΔCt). Εκτίμηση μεγαλύτερο ή μικρότερο από το 1 θεωρήθηκαν για να υποδείξει υπερέκφραση ή υποέκφραση, αντίστοιχα. Όλες οι τιμές ήταν τυποποιημένη σε σχέση με τις κανονικές τιμές ελέγχου, οι οποίες εκπροσωπήθηκαν ως τιμή 1. Η σχέση του miR-125b και την κατάσταση μεθυλίωσης των ΕΠΠΕ εξετάστηκε από Mann-Whitney

U

δοκιμή. SPSS έκδοση 16.0 για Windows (SPSS Inc, IL, USA) και GraphPad Prism 6 για Windows (Έκδοση 6.05) χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση. Τα αποτελέσματα θεωρούνται σημαντικές όταν

σ

ήταν & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών

Κλινική-παθολογικά χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, η ιστολογική βαθμό και τον τύπο , το μέγεθος του όγκου, εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, το στάδιο της νόσου, την κατάσταση των λεμφαδένων, τα επίπεδα CA125 κλπ φαίνονται στον πίνακα 2. για να διευκρινιστεί η έκφραση του miR-125b για την έναρξη του καρκίνου, οι ασθενείς επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, ≤ 45 ετών (57,1%) και & gt? 45 ετών (42.8%). Περιπτώσεις χωρίστηκαν ανάλογα με την σταδιοποίηση ΦΥΓΩ του ΕΓΚ και ιστοπαθολογικών τύπους.

Η

Κατανομή των miR-125b μοτίβο έκφρασης σε περιπτώσεις και τους ελέγχους

Ο Πίνακας 3 απεικονίζει την κατανομή των miR έκφρασης αλλαγή φορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Υπήρξε σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,0001) που παρατηρήθηκε με ορό miR-125b έκφραση σε επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. One-δείγμα t-test χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η έκφραση miRNA μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων. Το επίπεδο έκφρασης miR στους ελέγχους ορίστηκε σε ένα και στη συνέχεια υπολογίζεται η έκφραση miR σε αντίστοιχα δείγματα καρκίνωμα των ωοθηκών. Η έκφραση του miR-125b ορό βρέθηκε να είναι 5 πτυχώσεις λιγότερο στους ελέγχους από την αντίστοιχη επιθηλιακό ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών (Πίνακας 3).

Η

Η έκφραση του miR-125b και διαγνωστικών δυνατοτήτων του σε επιθηλιακά ωοθηκών καρκίνο

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση σχετική ποσοτικοποίηση έδειξε περισσότερο από 5 φορές αύξηση στον ορό miR-125b έκφρασης μεταξύ των ασθενών επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών από τους υγιείς μάρτυρες (Πίνακας 3). αναλύσεις καμπύλη ROC διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η προβλεπτική ικανότητα του miR-125b για κακοήθη καρκίνο των ωοθηκών και απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Σχετικά έκφραση του ορού miR-125b θα μπορούσε να διακρίνουν τους ασθενείς με κακοήθη καρκίνο των ωοθηκών από υγιείς ελέγχους, με AUC δύναμη του 0.728 ( 95% CI = 0,64 – 0,81) με ευαισθησία 62,3% και ειδικότητα 77,1% από ένα cut-off βαθμολογία 3,76.

(Α) Dot γραφική παράσταση που δείχνει τη σχετική έκφραση των miR-125b σε ασθενείς και ελέγχου (Β) της καμπύλης ROC για miR-125b εμφανίζουν διαγνωστικές δυνατότητές της στον επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών.

η

miR-125b ρύθμιση προς τα πάνω σε σχέση με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά

ο πίνακας 2 απεικονίζει τη συσχέτιση μεταξύ miR -125b έκφρασης και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά των ασθενών με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Περίπου 64% των ασθενών της & gt? 45 ετών έδειξε υψηλή έκφραση του miR-125b. Σχεδόν το 70% των ασθενών που έχουν μέτριο όγκο βαθμό παρουσίασαν αυξημένη έκφραση του miR-125b, εκτός από το 48% των ασθενών με καλά διαφοροποιημένο όγκου και 32% ελάχιστα διαφοροποιημένο όγκου. Αυξημένη έκφραση του miR-125b παρατηρήθηκε σε περίπου 65% των ασθενών ορώδες αδενοκαρκίνωμα και περίπου 50% των ασθενών με βλεννώδες αδενοκαρκίνωμα. Όταν συσχετίζεται με το μέγεθος του όγκου, υψηλή έκφραση του miR-125b παρατηρήθηκε όταν όγκου ήταν στο αρχικό του στάδιο, δηλαδή & lt? 10 εκατοστά

3. Επιπλέον, όλοι οι ασθενείς σε πρώιμο στάδιο (στάδιο Ι και ΙΙ) έδειξε υψηλή έκφραση του miR-125b. Οι ασθενείς που δεν έχουν μετάσταση δηλαδή, με τη συμμετοχή τους ασθενείς σε πρώιμο στάδιο, συνόψισε σχεδόν το 67% των ασθενών με αυξημένη έκφραση του miR-125b σε σύγκριση με ασθενείς (5%) με μεταστατική νόσο. Ομοίως, το 65% των ασθενών χωρίς μετάσταση στους λεμφαδένες έδειξαν υψηλότερη έκφραση του miR-125b. Εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, nulliparity, τα επίπεδα CA125 στον ορό και η συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (Hb) δεν συνδέουν σημαντικά με την έκφραση του miR-125b. Το Σχήμα 2 καταδεικνύει τη σημαντική σχέση σε σχέση με το στάδιο, μετάσταση λεμφαδένα και μακρινό κατάσταση μετάσταση με την έκφραση του miR-125b σε ασθενείς επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών.

Η

miR-125b σε σχέση με το στάδιο του επιθηλιακού ωοθηκικού του καρκίνου.

Ένα συνειδητό οριοθέτηση παρατηρήθηκε σε σχέση με την έκφραση του miR-125b και το ΦΥΓΩ στάδια επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Όλοι οι ασθενείς στο στάδιο Ι και ΙΙ που παρουσιάζονται υψηλότερη έκφραση του miR-125b ενώ οι ασθενείς στο στάδιο ΙΙΙ και IV υπολογίζονται μόνο το 10% και το 5% των ασθενών με αυξημένη έκφραση αντίστοιχα (Σχήμα 2Α).

miR-125b είναι υπερεκφράζεται σε μη μετάσταση των όγκων.

Μια στατιστικά σημαντική (p = 0,002) συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της κατάστασης μετάσταση των ασθενών με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και miR-125b έκφρασης. Έκφραση του miR-125b βρέθηκε να αυξηθεί ειδικά σε ασθενείς χωρίς μετάσταση (σχήμα 2Β).

miR-125b υπερεκφράζεται σε ασθενείς χωρίς μετάσταση στους λεμφαδένες.

Όπως και με μακρινή μετάσταση , οι ασθενείς χωρίς μετάσταση λεμφαδένα έδειξε στατιστικά σημαντική (ρ = 0,001) συσχέτιση με την έκφραση του miR-125b (Σχήμα 2C).

η έκφραση του miR-125b και προγνωστικές δυναμικό της επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών

miR-125b αναλύθηκε για την εξέλιξη της νόσου, προγνωστική σημασία της και το αποτέλεσμα επιβίωσης σε ΕΓΚ. miR-125b αξιολογήθηκε για την εξέλιξη της νόσου από την ένωση της έκφρασης του με τα στάδια ΦΥΓΩ και διάφορα άλλα κλινικοπαθολογικών παραμέτρων του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. Η προγνωστική σημασία έχει διευκρινιστεί από τις καμπύλες ROC. Για να χρησιμοποιήσετε την ανάλυση της καμπύλης ROC, τα κλινικά και τα όγκου χαρακτηριστικά έγιναν δυαδικό και επομένως διαχωρίστηκαν μεταξύ τους. Σκηνή διαχωρίστηκαν μεταξύ τους ως νωρίς (I + II) ή αργά (III + IV), ο βαθμός του όγκου τόσο χαμηλά (G1 + G2) ή υψηλή (G3), η συμμετοχή του κόμβου καθώς δεν συμμετοχή των λεμφαδένων ή οποιαδήποτε εμπλοκή των λεμφαδένων, μακρινή μετάσταση όπως παρόντος ή απουσιάζει, την επιβίωση, όπως ο θάνατος οφείλεται σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών ή άλλα (λογοκριμένη /ζωντανοί)

Η έκφραση του miR-125b και ιστολογική βαθμό απέδωσε ένα σημαντικό AUC του 0,676 (95% CI: 0,558 – 0,793). με μια ευαισθησία 66.7% και ειδικότητα 62,6% από μια βέλτιστη τιμή αποκοπής του 3,91 (σχήμα 3Α) (Πίνακας 4). καμπύλη ROC για μακρινή μετάσταση απέδωσε μια AUC των 0.891 (95% CI: 0,838 έως 0,944) με ευαισθησία και ειδικότητα του 94,1% και 70,5% αντίστοιχα σε μια βέλτιστη τιμή αποκοπής 4,34 (σχήμα 3Β). Ένα AUC του 0,773 (95% CI: 0,658 έως 0,887) ελήφθη σε καμπύλη ROC σε σχέση με μετάσταση λεμφαδένα και σε μια βέλτιστη τιμή αποκοπής του 5,85, η ευαισθησία ήταν 73.7% και η ειδικότητα ήταν 80.8% (Σχ 3C). Καμπύλη ROC για την επιβίωση έδωσε μια AUC των 0.660 (95% CI: 0,564 – 0,756) με ευαισθησία 64,3% και ειδικότητα 67,0% στο βέλτιστο αποτέλεσμα αποκοπής του 3.91 (Σχήμα 3D)

Η

Η ανάλυση επιβίωσης έγινε από την καμπύλη Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank (Σχήμα 4Α). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του miR-125b έκφραση και τη συνολική επιβίωση των ασθενών με ≤1 φορές έκφραση του miR-125b. Ωστόσο, όταν η ιστολογική υποομάδες εκτιμήθηκαν για την επιβίωση χωριστά, διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς με βλεννώδες histotypes είχε ένα χρόνο επιβίωσης 16 μήνες ενώ, οι ασθενείς με ορώδες histotypes εμφάνισαν χρόνο επιβίωσης 9 μήνες (Εικόνα 4Β).

Η

Η έκφραση του miR-125b σε συνεργασία με υπερμεθυλίωση υποστηρικτής των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

Η σχετική έκφραση του miR-125b αξιολογήθηκε σε σχέση με την υπερμεθυλίωση προαγωγού γνωστών ογκοκατασταλτικών γονιδίων-DAPK1, p16, RASSF1A , PTEN, BRCA1 και Ρ14. Από αυτές, RASSF1A και τα γονίδια PTEN έδειξε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ανώμαλης υπερμεθυλίωση υποστηρικτής τους και τη σχετική έκφραση των miR-125b σε ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Ασθενείς με υπερμεθυλίωση RASSF1A υποκινητή έδειξαν υποστροφή του miR-125b έκφραση (p = 0,005) (Σχήμα 5). Παρομοίως, οι ασθενείς με υπερμεθυλίωση ΡΤΕΝ υποκινητή έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση του miR-125b έκφραση (p = 0.01). Κανένα άλλο ογκοκατασταλτικό γονίδιο παρουσίασαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το miR-125β έκφρασης.

(Α) DAPK1 (Β) p16 (C) RASSF1A (D) PTEN (Ε) BRCA1 (F) p14. Θετικά και αρνητικά απεικονίζει την παρουσία ή την απουσία υπερμεθυλίωση προαγωγού του καθορισμένου ογκοκατασταλτικό γονίδιο, αντίστοιχα.

Η

Συζήτηση

Η ανάπτυξη των επιθηλιακών καρκινογένεσης των ωοθηκών είναι μια πολλών σταδίων διαδικασία που συνεπάγεται την απορύθμιση των ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Σύγχρονη μελέτες έχουν αναφέρει ότι microRNA σχετιζόμενη γονιδιακής έκφρασης μεταγραφικά ρυθμίζεται παίζει κρίσιμο ρόλο στην έναρξη, την ανάπτυξη και την εξέλιξη του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών, κρατώντας ένα ρυθμιστικό έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και μετάσταση. miR-125b έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε πολλαπλές καρκίνους [12]. miR-125b λειτουργεί είτε ως ογκογονίδιο ή ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω και εμφανίζει ογκογόνο δυναμικό σε ορισμένους καρκίνους όπως ενεργοποιεί την κυτταρική διαίρεση, ενώ παρεμποδίζει την απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, είναι ανοικτά προς τα κάτω σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου. Η κατανόησή μας σε σχέση με τις αντιφατικούς ρόλους του miR-125b στην πληθώρα των καρκίνων είναι ακόμη περιορισμένη. Μια πτυχή της στόχος μας ήταν να διερευνήσει την παρεκκλίνουσα έκφραση του miR-125b σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με τα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Η άλλη πτυχή ήταν να δοκιμαστεί η έκφραση του miR-125b σε σχέση με τα ανώμαλα μεθυλιωμένων ΕΠΠΕ, προκειμένου να συνάψει έντονα τον πιθανό ρόλο τους είτε σε ρύθμιση ή να ρυθμίζεται από miR-125β.

miR-125b πιστεύεται ότι στοχεύουν τα χαρακτηριστικά του καρκίνου σε ένα ή τον άλλο τρόπο, για τη ρύθμιση πολλαπλά γονίδια που εμπλέκονται στην οδό, που οδηγεί στην ανάπτυξη του φαινοτύπου του καρκίνου. Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA έχει μια κρίσιμη έκβαση για επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών έναρξη και την εξέλιξη. Αρκετοί ερευνητές έχουν μελετήσει για την υπερμεθυλίωση προαγωγού miRNA σε διαφορετικές μορφές καρκίνου ως λόγος για την απενεργοποίηση του συγκεκριμένου miRNA και τονίζοντας το υποθετικό ρόλος των επιγενετικών αναστάτωση στην παραγωγή των παρεκκλίνουσα πρότυπα έκφρασης των miRNAs σε καρκινικά κύτταρα [13]. Αρκετές γραμμές αποδείξεων υποστηρίζουν την ιδέα ότι η απορύθμιση των miRNA μπορεί να οδηγήσει σε παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA στον καρκίνο και ότι miRNAs είναι σε θέση να ρυθμίσουν

DNMT

γονίδια φέρεται προς τα κάτω σε καρκίνο [14,15]. Οι miRNAs τα οποία δρουν ως καταστολείς όγκων έχουν βρεθεί να μεθυλιωθεί σε καρκινικά κύτταρα δείχνει την σημασία η μελέτη των δύο δυνάμεις μεταξύ τους-επιγενετική και miRNAs [16]. Επίσης, το προφίλ μεθυλίωσης του DNA των όγκων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια υπογραφή για τον ορισμό τύπο του όγκου, την κλινική πρόγνωση και την ανταπόκριση στη θεραπεία [17,18]. miRNAs μεταγράφεται από νησίδες CpG υφίστανται μεθυλίωσης του DNA που σχετίζεται με καταστολή με ένα παρόμοιο πλαίσιο χρωματίνη προς κωδικοποίησης γονιδίων, όπως πρόσδεση του μεταγραφικού καταστολέα μεθυλο-CpG-δεσμευτικές πρωτεΐνες χώρου [19,20]. Τέτοιες μελέτες γενετικής αποκάλυψης έχουν άνοιξε το δρόμο για τον προσδιορισμό των μηχανισμών που ευθύνονται για την πρόκληση του καρκίνου όλεθρο σε μοριακό επίπεδο. Βασισμένο σε παρόμοιες γραμμές, επιλέξαμε ένα πάνελ των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι επιρρεπείς σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών να διερευνηθεί κατά πόσον η έκτροπη μεθυλίωση τους επηρεάζει άμεσα ή έμμεσα την έκφραση του miR-125b η οποία με τη σειρά της οδηγεί στην ανάπτυξη του καρκίνου. Των υπό μελέτη ογκοκατασταλτικών γονιδίων, RASSF1A και PTEN γονίδια αναδειχθεί ως πιθανοί υποψήφιοι που θα μπορούσε να παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης του miR-125b. Poliseno et al. έχουν καταδείξει το ρόλο του PTEN μεταγραφές στην διαμόρφωση miRNA στοχεύει εξετάζοντας τα επίπεδα PTENP1 [21]. Ο προσδιορισμός και η επικύρωση των πολυάριθμων

PTEN

-targeting microRNAs δείχνει ότι μετα-μεταγραφική ρύθμιση διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στον καθορισμό PTEN αφθονία στα καρκινικά κύτταρα [22-25]. Κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα ακόμη και μικρή μείωση στα επίπεδα της PTEN, τονίζοντας τη σημασία της ρύθμισης PTEN microRNA-μεσολάβηση του καρκίνου [26]. RASSF1A είναι ένας καταστολέας όγκων που είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής στην οδό RAS-ΜΑΡΚ και έχει μειωμένη έκφραση σε διάφορους καρκίνους. Έχει προταθεί ότι RASSF1A συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση με τη ρύθμιση της οδού ΜΑΡΚ και έχει επιπτώσεις στην καρκινογένεση [27]. Μια άλλη μελέτη από Banno et al. ανέφεραν ότι η μειωμένη έκφραση του γονιδίου RASSF1A συμβαίνει με υπερμεθυλίωση ή καταστολή έκφρασης γονιδίου από miRNAs. Η έκφραση του ίδιου του miRNA μπορεί να αυξηθεί ή να μειωθεί με μεθυλίωση προαγωγού, με βάση τις διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων [28]. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας έχει παρέκταση των αποτελεσμάτων αυτών και θα μπορούσε να δώσει μια νέα κατεύθυνση για να εξετάσει την έκφραση του miR-125b σε μια νέα διάσταση.

Οι πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις έχουν βοηθήσει την ανίχνευση miRNAs σε βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα. κυκλοφορούν miRNAs εμφανίζονται ως πολλά υποσχόμενο διαγνωστικών βιοδείκτες για τον καρκίνο κι αν η χρησιμότητά τους για την ανίχνευση πρόωρη νεοπλάσματα παραμένει ασαφής. miR-125b έχει δειχθεί να στοχεύσουν πολλαπλά γονίδια τα οποία είναι περισσότερο ή λιγότερο σημαντική στο σχηματισμό όγκου σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. miR-125b ενεργεί ως κλασική ογκογονιδίου σε μία ποικιλία όγκων, όπου η υπερέκφραση του μπορεί να οδηγήσει στην καταστολή ενός γονιδίου καταστολής όγκου ή εμποδίζουν μηχανήματα αποπτωτικά της. Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από το εύρημα ότι τα miR-125b επίπεδα έκφρασης συσχετίστηκε με μειωμένο ποσοστά επιβίωσης [29,30]. Μια πρόσφατη μελέτη από Yamada et al. Έχει αναφερθεί επίσης ένα αυξημένο επίπεδο miR-125b σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Εντόπισαν miR-125b ως ένα πρώιμο βιοδείκτη ανίχνευσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου, λόγω της σημαντικής AUC (0.806) στην καμπύλη ROC [31]. Giray et al. βρήκε μια αύξηση της έκφρασης miR-125b στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και πρότεινε ότι θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια νέα, μη επεμβατική βιοδεικτών σε αυτόν τον καρκίνο [32]. Jiang και οι συνεργάτες του έδειξαν επίσης μία προς τα πάνω ρύθμιση miR-125b in vivo και in vitro σε καρκίνωμα του ενδομητρίου [33]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-125b έχει διερευνηθεί σε αρκετές καρκίνους όπως ο καρκίνος του παγκρέατος [34], του καρκίνου του προστάτη [35], του καρκίνου του μαστού [36,37], ο καρκίνος του πνεύμονα [38], γλοιοβλάστωμα [39], ολιγοδενδρογλοιακή καρκίνος [ ,,,0],7], μεταξύ άλλων καρκίνων. Αντιστρόφως, miR-125b έχει δειχθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ένα αριθμό όγκων, όπως ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης [40], καρκίνο του οισοφάγου [41], οστεοσάρκωμα [42], του καρκίνου του προστάτη [43], ο καρκίνος του ήπατος [44], του καρκίνου του μαστού [ ,,,0],45], μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [46], του καρκίνου του μαστού [47], γαστρικού καρκίνου [48], γλοιοβλάστωμα [49] κλπ στον καρκίνο των ωοθηκών, αντιφατικές μελέτες σχετικά με miR-125b έχουν μια αναγκαιότητα να γίνει ερευνούν το ρόλο του βαθιά. Lee et al. ανέφεραν ρύθμιση προς τα κάτω του miR-125b σε γραμμές καρκινικό ιστό και κυτταρικές ωοθηκών σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες [50]. Luo και οι συνεργάτες του έχουν επίσης αναφερθεί πρόσφατα μια ρύθμιση προς τα κάτω του miR-125b στις γραμμές ωοθηκικό ιστό του καρκίνου και κυττάρων [51]. Gadducci et al. Παρατηρήθηκαν επίσης παρόμοια αποτελέσματα [52]. He et al. πρότεινε μια νέα θεραπευτική προσέγγιση χρησιμοποιώντας miR-125b μιμούνται στην αγωγή του καρκίνου των ωοθηκών [53]. Guan et al. ανέφεραν ότι η υπερέκφραση του miR-125b ως αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού των ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων [54]. Από την άλλη πλευρά, Κονγκ και συνεργάτες ανέφεραν μία ρύθμιση προς τα πάνω του miR-125 στον καρκίνο των ωοθηκών και πρότεινε ότι πάνω ρύθμιση του miR-125b έκφραση συνεισφέρει στην σισπλατίνη αντίσταση μέσω καταστολής της έκφρασης Bak1 [55]. Διαφοροποιημένη έκφραση του miR-125b αναφέρθηκε στο ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών από Sorrentino et al [56].

Η ένωση του miR-125b με διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά αντικατοπτρίζει το γεγονός ότι το miR-125b μπορεί να λειτουργήσει ως ένα πρώιμο βιοδείκτη για τον καρκίνο των ωοθηκών. Η αυξημένη έκφραση στα πρώτα στάδια σε σύγκριση με το προχωρημένο στάδιο μιλά όγκους σημασία της στην υποδεικνύει την έναρξη της νόσου. Η έκφραση του miR-125b σε σχέση με την κατάσταση μακρινό κατάσταση μετάσταση και λεμφαδένων προτείνει πιθανές δυνατότητες στην έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών.

Συμπέρασμα

Αύξηση του αριθμού των μελέτες έχουν δείξει ότι το miR -125b διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες και πολλές ασθένειες, ειδικά καρκινώματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι λειτουργίες του miR-125b είναι αμφιλεγόμενη σε διάφορους τύπους καρκίνων. Ως εκ τούτου, οι αμφιλεγόμενες ιδιότητες του miR-125b σε διάφορους όγκους δείχνουν ότι το miR-125b έχουν διακριτές λειτουργίες στην παθογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου, ενώ οι υποκείμενοι μηχανισμοί για διαφορετικό πλαίσιο κύτταρο χρειάζεται περαιτέρω επικύρωση. Οι πρόοδοι που miR-125b κρατά σε κλινικές εφαρμογές χρειάζονται μια πιο προσεκτική ματιά για τη μελλοντική θεραπεία του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Ηλεκτροφορητική εικόνα μπάντα για υπερμεθυλίωση για ένα πάνελ των ογκοκατασταλτικών γονιδίων οπτικοποιούνται σε 2% πηκτή αγαρόζης υπό υπεριώδη ακτινοβολία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153902.s001

(EPS)

S1 πίνακα. Ακολουθία των εκκινητών με θερμοκρασίες ανόπτησης και το μέγεθος ταινία που χρησιμοποιείται για το MS-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0153902.s002

(RTF)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμων προς τον Δρ V Sreenivas για τη βοήθεια και τη συνεργασία του με τη στατιστική ανάλυση αυτού του χειρογράφου.