Αφηρημένο

Ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδεικνύει ότι το miR-149 μπορεί τόσο να καταστείλει και να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου, ανάλογα με ο τύπος του όγκου. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-149 στην εξέλιξη του γαστρικού καρκίνου (GC) παραμένει άγνωστη. Εδώ αναφέρουμε ότι το miR-149 είναι ένα ογκοκατασταλτικό στον ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου. έκφραση miR-149 μειώνεται σε κυτταρικές σειρές GC και κλινικά δείγματα, σε σύγκριση με την κανονική γαστρικού επιθηλιακών κυττάρων και των ιστών, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-149 συσχετίζονται επίσης με το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων και των ιστών GC. Επιπλέον, έκτοπη έκφραση του miR-149 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης από κάτω ρύθμιση

ZBTB2

, ένας ισχυρός καταστολέας της οδού ARF-HDM2-p53-p21, με μια πιθανή θέση δέσμευσης για miR-149 στην 3’UTR του mRNA της. Βρίσκεται επίσης ότι οι αυξήσεις έκφραση ZBTB2 στα κύτταρα και τους ιστούς GC σε σύγκριση με φυσιολογικά γαστρικού επιθηλιακών κυττάρων και των ιστών, αντίστοιχα. Αποσιώπηση του

ZBTB2

οδηγεί σε καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και διακοπή κύκλου κυττάρου σε G0 /G1 φάση, υποδεικνύοντας ότι ZBTB2 μπορεί να δράσει ως ένα ογκογονίδιο σε GC. Επιπλέον, η επιμόλυνση του miR-149 μιμείται σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα επάγει μειωτική ρύθμιση του ZBTB2 και HDM2, και προς τα πάνω ρύθμιση του ARF, ρ53, και ρ21 σε σύγκριση με τους ελέγχους. Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-149 λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων στο ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο από, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω, στοχεύοντας

ZBTB2

Η

Παράθεση:. Wang Υ, Zheng Χ, Ζανγκ Ζ, Zhou J, Zhao G, Yang J, et al. (2012) microRNA-149 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και Κύκλου Κυττάρου Πρόοδος μέσω της στόχευσης των

ZBTB2

στην Ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10.1371 /journal.pone.0041693

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Μαρτίου του 2012? Αποδεκτές: 25 του Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 30872966 και αρ. 31071135), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 81000864, ​​αρ. 81172290, αρ. 91129723, αρ. 81090270 και αρ. 81090273) , και η κινεζική Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Science (αρ. 20100471776). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο (GC) είναι ένας από τους συχνότερους καρκίνους και οι κυριότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως, ιδιαίτερα στην Ανατολική Ασία, σύμφωνα με την τελευταία παγκόσμια εκτίμηση που δημοσιεύθηκε το 2011 [1]. Παρά τη σημαντική μείωση της συχνότητας εμφάνισης GC στα περισσότερα μέρη του κόσμου, υπάρχει ακόμα ένα μεγάλο βάρος από τον μεγάλο αριθμό των περιπτώσεων GC και θανάτους σε όλο τον κόσμο. Η καρκινογένεση του GC είναι μια πολύ περίπλοκη διαδικασία [2] – [5] που αφορούν την απορύθμιση πολλαπλών γονιδίων [6] – [8], συμπεριλαμβανομένων ογκογονιδίων [9] – [14] και του όγκου καταστολείς [15] – [18]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που απαιτούνται για την ανάπτυξη του GC και εξέλιξη θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια ομάδα ενδογενώς εκφράζονται, μη-κωδικοποίησης μικρά RNAs (20-25 νουκλεοτίδια σε μήκος) είναι γνωστό ότι αρνητικά ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω καταστολής της μετάφρασης ή μειώνοντας την σταθερότητα των mRNA με άμεση σύνδεση προς την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του mRNA που στόχο [19], [20]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, το μεταβολισμό, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και απόπτωση. Επιπλέον, παρεκκλίνουσα μετα-μεταγραφική ρύθμιση των mRNAs από miRNAs σχετίζεται με ογκογένεση [21]. Οι Ανώμαλη προφίλ έκφρασης του miRNAs έχουν ανιχνευθεί σε διάφορους τύπους ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα [22], του μαστού [23], του προστάτη [24], το ήπαρ [25], του παχέος εντέρου [26], και γαστρικού καρκίνου [27]. Επιπλέον, ορισμένες miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων με τη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων στόχων που παίζουν σημαντικούς ρόλους στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, ή τον πολλαπλασιασμό. miR-22 [28], miR-101 [29], και miR-7 [30] έχουν όλα δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε δείγματα όγκου και λειτουργούν ως καταστολείς όγκων? miR-17 [31] και miR-21 [32], έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε δείγματα όγκου και λειτουργία ως ογκογονίδια. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η κακή ρύθμιση του miRNAs συχνά εμπλέκονται στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου.

Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι miR-149 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε διάφορες παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της εξέλιξης των κακοηθών όγκων. miR-149 έχει δειχθεί να λειτουργεί τόσο ως καταστολέας όγκου [33] και ένα ογκογονίδιο [34] στην ανάπτυξη πολλαπλών τύπων συμπαγών όγκων. Για παράδειγμα, η απώλεια του miR-149 οδηγεί σε αύξηση της λειτουργίας ορισμένων ογκογονιδίων και συσχετίζονται με το βαθμό του όγκου σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [35], αστροκυτώματα [36], και το καρκίνωμα του προστάτη [37]. Η έκτοπη έκφραση του miR-149 προκαλεί απόπτωση των νευροβλαστώματος και HeLa κύτταρα [33]. Αυξημένα έκφραση του miR-149 έχει αναφερθεί ότι είναι σημαντική στην εξέλιξη του καρκινώματος του ρινοφάρυγγα [38] και της μετάστασης μελανώματος [34]. Επιπλέον, απορύθμιση του miR-149 εμπλέκεται επίσης σε ορισμένους μη νεοπλασματικών νόσων. Για παράδειγμα, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης miR-149 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του πρωτογενούς μυελοΐνωση, αληθής πολυκυτταραιμία, βασική θρομβοκυτταραιμία και [39], και την απώλεια της miR-149 μπορεί να καταστείλει τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) RNA αφθονία [40]. Ωστόσο, το πρότυπο έκφρασης και ο ρόλος του miR-149 στην ανάπτυξη του GC παραμένει ασαφής.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι miR-149 είναι σημαντικά προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές GC και κλινικά δείγματα, σε σύγκριση με το φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακών κυττάρων και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου, αντίστοιχα. Η έκτοπη έκφραση του miR-149 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την G0 /G1 σύλληψη του AGS και SGC7901 κυττάρων

in vitro

στοχεύοντας

ZBTB2

. Επιπλέον, η εξάντληση των

ZBTB2

με siRNA οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού κύκλου σύλληψης. Το πρότυπο έκφρασης του miR-149 και ZBTB2 σε κυτταρικές γραμμές GC και κλινικά δείγματα συσχετίζεται αντίστροφα, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι

ZBTB2

είναι ένα γονίδιο στόχος του miR-149. Εισαγωγή miR-149 οδηγεί σε αλλαγές στην έκφραση του p53, p21, ARF, και HDM2, τα μέλη του μονοπατιού ΤΑΠ-HDM2-p53-p21 η οποία ρυθμίζεται από ZBTB2. Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι miR-149 ρυθμίζεται μειωτικά σε κύτταρα GC και κλινικών δειγμάτων και υποδηλώνουν ότι miR-149 λειτουργεί ως καταστολέας του γαστρικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με αναστολή του πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού κύκλου εξέλιξης.

Αποτελέσματα

η έκφραση του miR-149 ρυθμίζεται μειωτικά σε κυτταρικές γραμμές και GC κλινικά δείγματα

για να αξιολογηθεί ο ρόλος του miR-149 στην καρκινογένεση του GC, χρησιμοποιήσαμε την πρώτη ποσοτική RT-PCR για να μετρηθεί η έκφραση του miR-149 σε ανθρώπινες κυτταρικές GC γραμμές (ΜΚΝ45, GC9811, AGS, SGC7901, και ΜΚΝ28) και διαπίστωσε ότι miR-149 προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές GC σε σύγκριση με ένα φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, GES-1 (Σχ. 1Α). Ειδικότερα, το επίπεδο έκφρασης του miR-149 συσχετίστηκε θετικά με το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων GC. Δηλαδή, το επίπεδο έκφρασης του miR-149 σε ελάχιστα διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές, όπως ΜΚΝ45, GC9811, και AGS, είναι σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε καλά διαφοροποιημένα κυτταρικές σειρές μέτρια και. Η έκφραση του miR-149 σε μέτρια διαφοροποιημένα κύτταρα, SGC7901, είναι χαμηλότερη από ότι στο καλά διαφοροποιημένο κυτταρική γραμμή, ΜΚΝ28 (Εικ. 1Α).

Α. έκφραση miR149 σε 5 ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε σχέση με το φυσιολογικό ανθρώπινο γαστρικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, GES-1, μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR (Οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, η = 3, t-test, *, p & lt? 0,05? *** p & lt? 0.001). B. έκφραση miR149 σε 44 ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κλινικά δείγματα σε σχέση με ζευγαρωμένα δείγματα κανονικού τους μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR (Οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, η = 3, t-test, ** ρ & lt? 0,01). Γ σύγκριση της σχετικής έκφρασης των miR149 σε φτωχά, μέτριας και υψηλής διαφοροποιούνται ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κλινικά δείγματα. (Οι τιμές δείχνουν τη μέση τιμή ± SEM, n = 3, One-way ANOVA ανάλυση, F = 65,391, *** p & lt? 0.001).

Η

Για να προσδιοριστεί εάν τα επίπεδα του miR-149 επίσης συσχετίζονται με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων εξετάσαμε την έκφραση του miR-149 σε 44 κλινικά δείγματα ανθρώπινης GC, συμπεριλαμβανομένων 13 κακώς, 16 μετρίως, και 15 καλά διαφοροποιημένο δείγματα. Βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-149 σε γαστρικών όγκων είναι αξιοσημείωτα χαμηλότερη από την κανονική συμφωνημένα γειτονικούς ιστούς (Εικ. 1Β). Επιπλέον, η έκφραση του miR-149 στην πιο διαφοροποιημένη όγκους ήταν υψηλότερη από ό, τι σε λιγότερο διαφοροποιημένη όγκους (Σχήμα 1C, F = 65.391,

σ

& lt?. 0.001). Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση του miR-149 συσχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα (*

σ

= 0.046) και το στάδιο ΤΝΜ (**

σ

= 0,0011) (Πίνακας 1).

έκτοπη έκφραση του miR-149 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την G0 /G1 σύλληψη στο AGS και SGC7901 κύτταρα

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-149 σε κύτταρα GC, χρησιμοποιήσαμε καλά και μέτρια διαφοροποιημένα GC κυτταρικές σειρές, AGS και SGC7901, αντίστοιχα. AGS και SGC7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με eithermature miR-149 μιμείται, αναστολέα, ψευδο-διαμολυσμένα ή miR-NC. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, 2D, ποσοτικά αποτελέσματα RT-PCR δείχνουν ότι η έκφραση του miR-149 μιμείται ή αναστολείς σημαντικά upregulate ή ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του miR-149, αντίστοιχα, στο AGS και SGC7901 κύτταρα από την πρώτη έως πέμπτη ημέρα μετά την διαμόλυνση (Σχ . 2Α, F = 8.429,

p = 0,003

? σχ. 2D, F = 8.595,

σ

= 0,003) σε σύγκριση με το NC και κοροϊδεύει τους ελέγχους

& amp.? ΡΕ. Το επίπεδο της miR149 μετρήθηκε με ποσοτική PCR σε καθορισμένο χρόνο (μονόδρομη ανάλυση ANOVA, οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, σχήμα 2Α, F = 8.429, p = 0.003?. Εικ. 2D, F = 8.595, p = 0,003 ). B & amp? Ε. κύτταρα GC επιμολυσμένα με miR-149 μιμείται και του αναστολέα υποβάλλονται σε δοκιμασία ΜΤΤ ημερησίως για 6 ημέρες (Αμφίδρομο ANOVA ανάλυση, σχήμα 2Β, F = 27,47, ρ & lt?. 0.001? Σχ. 2Ε, F = 44,061, ρ & lt? 0.001). C & amp? F. κύτταρα GC κύτταρα επιμολυσμένα με miR-149 μιμείται και αναστολέα συλλέχθηκαν για ανάλυση FACS μετά από 72 ώρες (Οι τιμές δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, η = 3, One-way ANOVA, σύκο 2C, F = 134.177, ρ & lt?. 0.001? Εικ . F, F = 58,792, p = 0,003).

η

AGS και SGC7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-149 μιμείται και αναστολείς έδειξαν σημαντικά χαμηλότερα και υψηλότερα επίπεδα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αντίστοιχα, από το NC ή εικονικές ομάδες όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 2Β, F = 27,47, ρ & lt?. 0.001? Σχ. 2Ε, F = 44,061, ρ & lt? 0.001). Η επιμόλυνση των AGS και SGC7901 κυττάρων με miR-149 μιμείται οδηγεί σε σημαντική σύλληψη G1 φάση σε σύγκριση με το NC και ψευδο ελέγχους (

ρ

& lt? 0,05). Επιπλέον, η θεραπεία με miR-149 αναστολείς οδήγησε σε λιγότερες AGS και SGC7901 κύτταρα σε G1 σύλληψη σύγκριση με NC και ψευδο ελέγχους (

ρ

& lt? 0,05). (Σχήμα 2C, F = 134.177,

ρ

& lt? 0.001?. Σχ. 2F, F = 58.792,

σ

= 0,003)

ZBTB2

είναι ο στόχος του miR-149

Προηγούμενα δεδομένα δείχνουν ότι miR-149 μπορεί να είναι ένας καταστολέας της κυτταρικής αύξησης GC με τη στόχευση γονιδίων που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (33-34) (38). Έτσι, ψάξαμε για επιπλέον πιθανών στόχων του miR-149 από τη βάση δεδομένων TargetScanHuman. Εμείς εντοπίστηκαν πολλές πιθανές γονιδίων στόχων miR-149, συμπεριλαμβανομένων των

ZBTB2

, ένας παράγοντας ΠΟΚ οικογένεια μεταγραφή και ισχυρός καταστολέας της οδού ΤΑΠ-HDM2-p53-p21 (41).

ZBTB2

βρέθηκε να έχει θέσεις δέσμευσης υποθετική miR-149 εντός 3’UTR (Εικ. 3Α) του. Λουσιφεράσης δημοσιογράφο έγιναν για να ελέγξει αν

ZBTB2

είναι ένας άμεσος στόχος του miR-149, χρησιμοποιώντας AGS και SGC7901 κύτταρα. Είμαστε συν-επιμολυσμένα AGS και SGC7901 κύτταρα αντίστοιχα με φορέα psiCHECK-2 που περιέχουν είτε 3’ΙΙΤΡ για ZBTB2 ή μεταλλαχθεί 3’ΙΙΤΡ για ZBTB2, και μιμείται του miR-149 ή αναστολείς του miR-149. Άγριου-τύπου και μεταλλαγμένες ZBTB2-3’UTR περιέχει την υποθετική θέση συνδέσεως του miR-149 κλωνοποιήθηκαν σε φορέα psiCHECK-2 προς τα κάτω από λουσιφεράσης γονίδιο (Εικ. S1). Εισαγωγή miR-149 μείωσε σημαντικά τη δραστικότητα της λουσιφεράσης από τον φορέα ρεπόρτερ ZBTB2 3’UTR (Σχήμα 3Β-3C,

ρ

& lt?. 0.001), αλλά δεν επηρέασε τη δραστικότητα της λουσιφεράσης από το μεταλλαγμένο ZBTB2-3 «φορέα αναφοράς UTR. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το miR-149 ρυθμίζει άμεσα

ZBTB2

επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον, δεν υπάρχει σημαντική μείωση στην σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-149 αναστολέα ή 3’UTR-ZBTB2 /φορέα psiCHECK-2 (Σχ. 3Β-3C). Είναι ίσως λόγω της έλλειψης αλληλεπίδρασης μεταξύ 3’UTR του ZBTB2 και ενδογενών miR-149, ως εκ τούτου, μειωμένη miR-149 έκφραση δεν αύξησε δραστικότητα λουσιφεράσης από την ZBTB2-3’UTR φορέα αναφοράς. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν επίσης ότι το miR-149 καταστέλλει την έκφραση ZBTB2 με στόχο την 3′-UTR του

ZBTB2

mRNA.

Α. Το σχηματικό διάγραμμα δείχνει το κατασκεύασμα του Luc-ZBTB2 3’UTR και Luc-ZBTB2 3’Mut UTR.Both Luc-ZBTB2 3’UTR και Luc-ZBTB2 3’Mut UTR κλωνοποιήθηκαν σε ένα πλασμίδιο pmirGLO κατάντη της πυγολαμπίδας περιοχής κωδικοποίησης λουσιφεράσης μεταξύ των θέσεων PmeI και XbaI. B & amp? C. κύτταρα AGS (Β) ή SGC7901 κύτταρα (C) συν-επιμολύνθηκαν με τα psiCHECK-2 κατασκευάσματα περιέχουν είτε ZBTB2 3’UTR ή ZBTB2 3’Mut UTR και είτε τον αναστολέα miR-149 ή ΜΙΚ-149 μιμείται για 48 ώρες. Οι τιμές δείχνουν τη σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης μετά από κανονικοποίηση για δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla (Οι τιμές δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, η = 3, μονόδρομη ANOVA ανάλυση, ** ρ & lt? 0,01).

Η

miR-149 και η έκφραση ZBTB2 συσχετίζεται αρνητικά σε κύτταρα GC και κλινικά δείγματα

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ miR-149 και ZBTB2, εξετάσαμε την έκφραση του σε κύτταρα ZBTB2 GC χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και σε ιστούς GC χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα GC έχουν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης του ZBTB2 από την κανονική γαστρικού επιθηλιακού κυττάρου, GES-1 (Σχήμα 4Α a-b F = 167.843,

ρ

& lt?. 0.001). ZBTB2 έκφραση συσχετίζεται αρνητικά με το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων GC? κακώς διαφοροποιημένους ιστούς GC έδειξε ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης ZBTB2 από καλά διαφοροποιημένους ιστούς GC και συμφωνημένα φυσιολογικό γαστρικό ιστούς (Εικ S2A-B, F = 117.280,

σ

& lt?. 0.001).

ZBTB2

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA συμπίπτουν με τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 4Β ένα, F = 283.355,

σ

& lt?. 0.001). Επιπλέον, η έκφραση του miR-149 και ZBTB2 συσχετίζεται αντίστροφα (Εικ. 4Β b,

σ

= 0,033, R = -0,908). Στη συνέχεια μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του miR-149 και

ZBTB2

χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR σε 5 κυτταρικές γραμμές GC (ΜΚΝ45, GC9811, AGS, SGC7901, και ΜΚΝ28) (Σχ. 4C α) και 18 GC κλινική δείγματα (6 ανεπαρκώς, 6 μέτρια, και 6 καλά διαφοροποιημένο δείγματα) (Εικ. 4C β). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι το επίπεδο του mRNA της

ZBTB2

συσχετίζεται αρνητικά με miR-149 έκφρασης (Σχήμα 4C α,

σ

= 0,033, R = -0,847?. Σχ. 4C β,

σ

& lt? 0,001, R = -0,908). Επιπλέον, AGS (Εικ. 4D) και SGC7901 κύτταρα (Σχ. 4Ε) επιμολυσμένα με miR-149 μιμείται έχουν μειωθεί σημαντικά έκφραση των ZBTB2 στα επίπεδα πρωτεΐνης (πάνελ Α-Β) και τα επίπεδα mRNA (Πίνακας C) σε σύγκριση με ψευδο ή NC κύτταρα (

σ

& lt? 0.001). Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το miR-149 μπορεί να ρυθμίζει άμεσα την έκφραση του

ZBTB2

.

Α. Έκφραση ZBTB2 σε κύτταρα GC και της κανονικής γαστρικού επιθηλιακού κυττάρου εξετάστηκαν με κηλίδωση Western (α) και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM (b, κανονικοποιημένη σε ακτίνη, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, F = 167.843, *** ρ & lt? 0.001) . B. Έκφραση ZBTB2 και έκφραση του miR-149 στο γαστρικό κύτταρα (α, οι τιμές δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, F = 283.355, ρ & lt? 0.001) και κλινικά δείγματα (β) αναλύεται με ποσοτική PCR ( t-test, οι τιμές δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, *, p & lt? 0,05? ** p & lt? 0,01? *** p & lt? 0.001). οικόπεδα C. Scatter που δείχνει την αρνητική γραμμική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του mRNA του ZBTB2 και εκείνη του miR-149 σε γαστρικά κύτταρα: ΜΚΝ45, GC9811, AGS, SGC7901 και ΜΚΝ28 (α) και σε 18 γαστρικό κλινικά δείγματα (β) (Ρ: ανεπαρκώς διαφοροποιημένη? M: μετρίως διαφοροποιημένων? W: καλά διαφοροποιημένο). D. Έκφραση ZBTB2 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western (α, β: οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, κανονικοποιημένη προς ακτίνη, One-Way ANOVA ανάλυση, F = 682.839, *** ρ & lt? 0.001) και ποσοτική PCR (c, το τιμές δείχνουν τη μέση τιμή ± SEM, F = 1420.125, *** p & lt? 0.001) μετά τη θεραπεία με miR-149 μιμείται το AGS κύτταρα. Ε Έκφραση ZBTB2 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western (α, β: οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, κανονικοποιημένη προς ακτίνη, One-Way ANOVA ανάλυση, F = 2459,400, *** ρ & lt? 0.001) και ποσοτική PCR (c, το τιμές δείχνουν τη μέση τιμή ± SEM, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, F = 925.875, *** p & lt?. 0.001) μετά από θεραπεία με miR-149 μιμείται το SGC7901 κύτταρα

η

miR-149 καταστέλλει GC πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με τη στόχευση

ZBTB2

η

στη συνέχεια, επιβεβαίωσε ότι το miR-149-μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα GC απαιτεί στόχευση του

ZBTB2

.

ZBTB2

έκφραση χτυπήθηκε-κάτω με siRNAs στο AGS και SGC7901 κύτταρα. Κηλίδωση Western (Εικ. 5Α, a-c) και ποσοτική ανάλυση PCR έδειξε ότι η εξάντληση των

ZBTB2 από

siRNA διαμόλυνση μπορούσε να αντισταθμιστεί σημαντικά με αναστολέα miR-149 και αξιοσημείωτη αύξηση του ZBTB2 παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-149 αναστολείς (Σχήμα 5Β,

σ

& lt?. 0.001). ΜΤΤ δοκιμασία δείχνει ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων επιμολυσμένων με siRNA-ZBTB2 κατεστάλη και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με αναστολείς miR-149 αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-NC (έλεγχος) και siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Σχ. 5C ). Επιπλέον, η αναστολή της

ZBTB2

έκφραση προάγει G0 /G1 σύλληψη και καταστέλλει την G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου που επάγεται από miR-149 θεραπεία αναστολέα σε AGS και SGC7901 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου NC (Σχ. 5D-5Ε,

σ

& lt? 0.001). Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το miR-149 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου αναστέλλοντας

ZBTB2

έκφρασης.

Α. Έκφραση των ZBTB2 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western (a-c, κανονικοποιημένη σε ακτίνη, οι τιμές δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, για AGS, F = 3163.690,

σ

& lt? 0.001? Για SGC7901 , F = 3979.861,

σ

& lt? 0.001). Β Έκφραση των ZBTB2 εξετάζονται από ποσοτική PCR (οι τιμές δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, για AGS, F = 3785.817,

σ

& lt? 0.001? Για SGC7901, F = 7392.941,

σ

& lt? 0.001). κύτταρα C. GC σε επεξεργασία με siRNA-NC, siRNA-ZBTB2, miR-149 αναστολέας + siRNA-ZBTB2, ή miR-149 αναστολέα υποβάλλονται σε δοκιμασία ΜΤΤ ημερησίως για 6 ημέρες (οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, διπλής κατεύθυνσης ανάλυση ANOVA , για AGS, F = 18.553,

σ

& lt? 0.001? για SGC7901, F = 24.857,

σ

& lt? 0.001). κύτταρα D. GC επιμολυσμένα κύτταρα κατεργασμένα με siRNA-NC, siRNA-ZBTB2, miR-149 αναστολέας + siRNA-ZBTB2, ή miR-149 αναστολέα συλλέχθηκαν για ανάλυση FACS μετά από 72 ώρες (οι τιμές δείχνουν την μέση ± SEM, η = 3 , *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001)

Η

Εισαγωγή miR-149 μεταβάλλεται η έκφραση του ZBTB2 και του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται με πρωτεΐνες

ZBTB2 έχει αναφερθεί ότι είναι ένας ισχυρός καταστολέας της οδού ARF-HDM2-p53-p21, η οποία είναι σημαντική σε κυτταρικό κύκλο κανονισμού (41). Για να διερευνηθεί η ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών με miR-149 σε κύτταρα GC, επιμολύναμε AGS και SGC7901 κυττάρων με miR-149 μιμείται ή miR-NC και εκτελέστηκε RT-PCR και κηλίδωση Western ανάλυση για ZBTB2 γονιδίων στόχων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α-6Β, έκτοπη έκφραση της miR-149 ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση της ZBTB και HDM2, και ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του ARF, ρ53, και ρ21 (

ρ

& lt? 0.001). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με τη λειτουργία του ZBTB2 σε καταστολή της μεταγραφής του ARF, ρ53, και ρ21 και την ενεργοποίηση της έκφρασης του HDM2 (41). Επιπλέον, έκτοπη έκφραση της ZBTB2 με επιμόλυνση ανέστρεψε την miR-149 με τη μεσολάβηση μείωση στην έκφραση HDM2 και αύξηση του ARF, ρ53, και ρ21 έκφραση σε AGS και SGC7901 κύτταρα (Σχ. 6Α-Β). . Έκτοπη έκφραση ZBTB2 επιβεβαιώθηκε σε επιμολυσμένα AGS και SGC7901 κύτταρα (Σχ S3, SGC7901 κύτταρα, F = 806.365,

σ

& lt? 0.001? Κύτταρα AGS, F = 1436.300,

σ

& lt? 0.001). ARF, ρ53 και ρ21 προωθούν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση τους από την έκφραση του miR-149 μιμείται εξηγεί τη σύλληψη φάση G0 /G1 στο AGS και SGC7901 κύτταρα.

Α, Έκφραση ZBTB2 (F = 629.069,

σ

& lt? 0.001), HDM2 (F = 869.909,

σ

& lt? 0.001), ΤΑΠ (F = 1425.913,

σ

& lt? 0.001), ρ53 (F = 6608.889,

σ

& lt? 0.001) και p21 (F = 1818.737,

σ

& lt? 0.001) σε SGC7901 κυττάρων εξετάστηκαν με κηλίδωση Western (α) και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM ( b, κανονικοποιημένη προς ακτίνη, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, η = 3, ***

ρ

& lt? 0.001). Β, έκφραση της ZBTB2 (F = 527.382,

σ

& lt? 0.001), HDM2 (F = 631.259,

σ

& lt? 0.001), ΤΑΠ (F = 1517.081,

p

& lt? 0.001), p53 (F = 1753.000,

σ

& lt? 0.001) και p21 (F = 2751.400,

σ

& lt? 0.001) στο AGS κυττάρων εξετάστηκαν από τη δυτική κηλίδας (α) και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM (b, κανονικοποιημένη σε ακτίνη, μονόδρομη ανάλυση ANOVA, η = 3, ***

ρ

& lt? 0.001).

η

Συζήτηση

αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου [21]. έχουν αλλαγμένη επίπεδα έκφρασης miRNA έχουν εμπλακεί στην έναρξη και την ανάπτυξη των όγκων? διαφοροποίησης των miRNAs που λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές της ογκογονιδίων ή καταστολέων όγκου αποτελέσματα για την προώθηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη [28] – [32]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο ρόλος του miR-149 στην εξέλιξη των διαφόρων τύπων των όγκων είναι αμφιλεγόμενη [33] – [36], [38]. Το μοτίβο και τους στόχους του miR-149 έκφρασης ποικίλουν σε διαφορετικούς τύπους όγκων. έκφραση miR-149 ρυθμίζεται μειωτικά σε μερικούς όγκους, που λειτουργεί ως καταστολέας όγκου με στόχευση ογκογονίδια σε ορισμένες μορφές καρκίνου. Για παράδειγμα, σε σαφή καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων miR-149 ρυθμίζεται προς τα κάτω και την πιθανή τους στόχους της, διαπιστώθηκε ότι KCNMA1 και LOX (35). Επιπλέον, miR-149 είναι επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος και έχει προταθεί να δρα ως καταστολέας όγκου με στόχευση RAP1B, CD47, CCN1, και NXF1 [36]. Σε αντίθεση, miR-149 μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου με στόχευση ορισμένων ογκογονιδίων. Ανίχνευση προφίλ έκφρασης miRNA σε διαφορετικά κλινικά στάδια του ρινοφαρυγγικού καρκινώματος (NPC) και NPC μετάσταση λεμφαδένα δείχνει ότι η έκφραση του miR-149 ρυθμίζεται αυξητικά σε NPC και την έκφραση του γονιδίου-στόχου του,

Smad2

, μειώνεται με η εξέλιξη της NPC [38]. Μια παρόμοια ογκογόνο ρόλο για miR-149 παρατηρήθηκε επίσης σε μελάνωμα στην οποία προς τα πάνω ρύθμιση του miR-149 προκαλεί προς τα κάτω ρύθμιση της GSK3-α και προς τα πάνω ρύθμιση του Mcl-1, με αποτέλεσμα αποπτωτικό αντίσταση [34]. Μέχρι στιγμής, λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του miR-149 σε γαστρικό καρκίνο. Εδώ, αναφέρουμε ότι η έκφραση miR-149 είναι σημαντικά μειωμένη σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και κλινικά δείγματα σε σύγκριση με το κανονικό γαστρικό επιθηλιακών κυττάρων και να συνδυαστούν παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, αντίστοιχα. Είναι σημαντικό ότι, το επίπεδο της έκφρασης miR-149 συνδέεται με το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων GC και δείγματα? φτωχά διαφοροποιημένα κύτταρα GC ή δείγματα έχουν χαμηλότερη έκφραση του miR-149 σε σύγκριση με καλά διαφοροποιημένο δείγματα. Η έκτοπη έκφραση του miR-149 αναστέλλει πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με τη στόχευση

ZBTB2

στο AGS και SGC7901 κύτταρα. miR-149 και έκφραση ZBTB2 συσχετίζονται αρνητικά στα κύτταρα GC και κλινικά δείγματα, και η υπερέκφραση του miR-149 προκαλεί αρνητική ρύθμιση των

ZBTB2

. Η εξάντληση των ZBTB2 αποτέλεσμα αναστολή AGS και SGC7901 κύτταρα πολλαπλασιασμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι ZBTB2 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο στην ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η εισαγωγή του miR-149 σε κύτταρα GC επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-149 στόχοι μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. ZBTB2 είναι ένας παράγοντας οικογένεια μεταγραφής ΠΟΚ η οποία μπορεί να καταστείλει την ΤΑΠ-HDM2-p53-p21 μονοπάτι [41]. ARF, ένας καταστολέας όγκων [42], μπορεί να προκληθεί από παρατεταμένη μιτογονική διέγερση και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση ρ53 ανεξάρτητα και τον έλεγχο της σταθερότητας της ρ53 μέσω της αλληλεπίδρασης με HDM2 [43], ένας σημαντικός ρυθμιστής της ρ53. Το ογκοκατασταλτικό ρ53 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης των κυττάρων μέσω επαγωγής διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε στρεσογόνους παράγοντες, όπως η υποξία, βλάβη του DNA, και η δυσλειτουργία του τελομερούς [44]. ρ21, ένα γονίδιο στόχος p53, μεσολαβεί κύκλου κυττάρου φάση G1 μέσω δεσμεύει και να αναστέλλει τη δραστικότητα της κυκλίνης-CDK2 ή συμπλοκών CDK1 [45]. ZBTB2 μπορεί καταστέλλουν τη μεταγραφή του ARF, ρ53, και ρ21, και επάγουν την έκφραση HDM2 [41]. Για να επικυρώσετε το αν τα αποτελέσματα του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από την έκφραση του miR-149 διαμεσολαβείται από ZBTB2 απώλεια, εξετάσαμε την έκφραση του HDM2, ARF, ρ53 και ρ21 του AGS και SGC7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-149 μιμείται. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-149 οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του ARF, ρ53, και ρ21 και μειωμένη έκφραση HDM2 και ZBTB2. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι το miR-149 ασκεί το ρόλο της παρεμπόδισης κύτταρα GC πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με τη στόχευση

ZBTB2

διαμορφώνοντας έτσι την έκφραση των κατάντη ρυθμιστές της προόδου του κυτταρικού κύκλου.

Εν ολίγοις , τα δεδομένα μας δείχνουν ότι miR-149 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκων σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα και παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αναστολή

ZBTB2

. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση miR-149 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και GC εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ZBTB2 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Ωστόσο, με δεδομένο το γεγονός ότι κάθε miRNA μπορεί να ρυθμίζει πολλά γονίδια-στόχους που μπορούν να επηρεάσουν την καρκινογένεση με διάφορους τρόπους, οι περισσότερες μελέτες για να διερευνήσει άλλες miR-149 στόχους που μπορεί να έχει κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση GC. Η παρούσα μελέτη παρέχει επίσης νέα εικόνα του ρόλου του miR-149 σε ανθρώπινο γαστρικό εξέλιξη του καρκίνου και υποδεικνύει ότι miR-149 μπορεί να χρησιμεύσει ως θεραπευτικό στόχο για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Για τα δείγματα ιστού, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς. Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και ήταν σύμφωνη με τη δήλωση του Ελσίνκι, και με την τοπική νομοθεσία.

Οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Η γαστρική γραμμές καρκίνου AGS, ΜΚΝ28, ΜΚΝ45 αγοράστηκαν από την AGCC, και κυτταρικές σειρές GC9811 και SGC7901 ελήφθησαν από το Πεκίνο Ινστιτούτο Ογκολογίας. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ινστιτούτο μας σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που συνιστά. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα .

Ανθρώπινα δείγματα

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για όλα τα ασθενή samples.Human δείγματα γαστρικού καρκίνου (n = 44) και συμφωνημένα δίπλα δείγματα μη-όγκου ελήφθησαν από ασθενείς σε Xijing Νοσοκομείο Νοσημάτων Πεπτικού, η τέταρτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, με ενημερωμένη συγκατάθεση από τον κάθε ασθενή.

καθαρισμό RNA, σύνθεση cDNA, και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

Ολικό RNA των καλλιεργημένων κυττάρων εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις πρωτόκολλο και RNAs του κατασκευαστή φυλάχθηκαν στους -80 ° C πριν από την ανάλυση qRT-PCR. έκφραση ώριμης miR-149 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας mirVana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), με U6 ως εσωτερικός έλεγχος. ZBTB2 έκφραση ανιχνεύθηκε με εκκινητές F: 5’ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ‘, R: 5’ ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ‘, και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε μια γέλη αγαρόζης 1,5% με βρωμιούχο αιθίδιο και χρωματίστηκαν ορατή με UV.

διαμόλυνσης κυττάρων

Το ανθρώπινο miR-149 duplex μιμούνται και αναστολέα (MIR-149) και έναν αρνητικό μάρτυρα ολιγονουκλεοτιδίων διπλής όψης μιμούνται (miR-NC) έχουν σχεδιαστεί και παρέχονται από Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Κίνα). Το μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) για ZBTB2 και το αρνητικό RNA ελέγχου (siRNA-NC) συντέθηκαν και καθαρίστηκαν με Genepharma (Σαγκάη, Κίνα). miRNAs, siRNAs και ZBTB2 cDNA πλασμίδιο (FulenGen Co. Κίνα) διαμολύνθηκαν με το αντιδραστήριο LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ZBTB2 siRNA ακολουθία: F: 5 ‘GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3’, R: 5 ‘AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3′? Η ακολουθία NC siRNA: F: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ‘, R: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3’

miRNA πρόβλεψη στόχο

Για να βρείτε το δυναμικό γονίδια-στόχους των miRNAs, ιστοσελίδα TargetScanHuman (. https://www.targetscan.org/) χρησιμοποιήθηκε, η σύνδεση ελεύθερη ενέργεια υπολογίστηκε και περιμένοντας περιοχές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid ιστοσελίδα.

Vector κατασκευάσματα αναφοράς λουσιφεράσης και προσδιορισμός

Για να κατασκευαστεί ZBTB2-3’UTR πλασμίδιο, ένα άγριου τύπου 3′-UTR θραύσμα ανθρώπινου mRNA ZBTB2 (1238-1244 nt, ένταξη Genbank ηο. NM_020861.1) που περιέχει τον υποτιθέμενο αλληλουχία πρόσδεσης miR-7 ενισχύθηκε με RT-PCR και κλωνοποιήθηκε στη θέση μεταξύ Xho Ι και Not Ι καθοδικά του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης του φορέα psiCHECK ™ (Promega, USA). Μια μετάλλαξη της ενιαίας θέσης πρόσδεσης miR-7 (5′-GAGCCAG-3 ‘σε 5′-ACCGCGC-3′) στην 3’-UTR της ZBTB2 περιλήφθηκε με κατευθυνόμενη Mutagenesis Kit (SBS Genetech, Πεκίνο, Κίνα ). Άγρια και μεταλλαγμένα είδη των φορέων pmirGLO-ZBTB2-UTR επικυρώθηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA

Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των εκκινητών για ZBTB2-3’UTR (MT) κλώνος:. MutZBTB2F: 5’GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 ‘mutZBTB2R: 5’