Οι

Αφηρημένο

Ιστορικό

Τ κύτταρα είναι γνωστό ότι συμμετέχουν στην απόκριση σε καρκινικά κύτταρα και αντιδρούν με κυτταροτοξικότητα και την απελευθέρωση κυτοκινών. Ταυτόχρονα όγκοι καθοριστεί ευέλικτο μηχανισμούς για φίμωση των ανοσολογικών αποκρίσεων. Η αλληλεπίδραση είναι πολύ από το να κατανοηθεί πλήρως. Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε επαφές μεταξύ καρκινικών κυττάρων και τα λεμφοκύτταρα που αποκαλύπτουν νέα χαρακτηριστικά στην αλληλεπίδραση των κυττάρων Τ και τα καρκινικά κύτταρα με τρόπο που δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως.

Είναι

μέθοδοι /Εκτίμηση

Πειράματα με βάση την χρήση ενός υδρόφιλου φθορίζουσα χρωστική που εμφανίζεται ελεύθερο στο κυτταρόπλασμα και έτσι μεταφορά του φθορίζοντος κυτοσόλιο από το ένα κύτταρο στο άλλο μπορεί να παρατηρηθεί με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Καρκινικά κύτταρα από κυτταρικές σειρές διαφορετικών κυττάρων πρωτογενές ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) προέλευση ή επωάστηκαν με λεμφοκύτταρα από άνθρωπο και ποντικούς. Αυτή η έκθεση προκάλεσε μια επαφή εξαρτώμενη πρόσληψη προέρχονται όγκου κυτοσολίου από λεμφοκύτταρα – ακόμη και σε CD4

+ Τ κύτταρα και τα Β κύτταρα ποντικού – η οποία δεν μπορούσε να ανιχνευθεί μετά την επώαση των λεμφοκυττάρων με τα υγιή κύτταρα. Η αλληλεπίδραση ήταν άμεσος, δεν απαιτεί την παρουσία βοηθητικών κυττάρων, αλλά ανεξάρτητα από την κυτταροτοξικότητα και δέσμευση TCR.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκαλύπτεται 100-200nm μεγάλα κενά στις κυτταρικές μεμβράνες των συνδεδεμένων κυττάρων, τα οποία χωρίζονται βιώσιμη και αποκάλυψε εκπληκτικό αποτέλεσμα. Ενώ τα λεμφοκύτταρα επάγονται να πολλαπλασιασθούν σε μια μακροπρόθεσμη μόδας, τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε προσωρινή διακοπή της κυτταρικής διαίρεσης. Η

in vitro

αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν

in vivo

χρήση ενός ποντικού οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ALL) μοντέλο. Η σύλληψη του πολλαπλασιασμού του όγκου είχε ως αποτέλεσμα σημαντική παρατεταμένη επιβίωση των προκληθέντων ποντικών.

Συμπεράσματα

Οι αναφερόμενες κυττάρου-κυττάρου επαφές αποκαλύπτουν νέα χαρακτηριστικά δηλαδή η δυνατότητα του κυτταρόπλασμα ροής μεταξύ των κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των βιολογικών δραστικών πρωτεϊνών που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο και βιολογική συμπεριφορά των κυττάρων δεκτών. Αυτό προσθέτει μια εντελώς νέα διάσταση στον όγκο που προκαλείται από την ανοσολογία

Παράθεση:. Hardtke-Wolenski M, L Kraus, Βελόνια C, Trautewig Β, Noyan F, Vondran FWR, et al. (2013) Ανταλλαγή Κυτοσολικά Περιεχομένου μεταξύ Τ κύτταρα και κύτταρα όγκου Ενεργοποιεί CD4 Τ κύτταρα και εμποδίζει την ανάπτυξη του καρκίνου. PLoS ONE 8 (10): e78558. doi: 10.1371 /journal.pone.0078558

Επιμέλεια: R. Lee Mosley, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30η Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 19 Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 24 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Hardtke-Wolenski et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από τη Novartis Pharma GmbH και τη χορήγηση Hilf του Hannover Medical School. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο χρηματοδοτείται από την επιχορήγηση Hilf του Hannover Medical School και Novartis Pharma. Ωστόσο, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι όπως απόκρυψη-και-επιδιώκει μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και την ανοσολογική απόκριση . Το ανοσοποιητικό σύστημα όταν προκαλούνται από τον καρκίνο, ωστόσο, είναι αντιμέτωπη με το πρόβλημα που πρέπει να ελέγχονται σε κακοήθεια τους MHC αυτο-εκφράζοντα κύτταρα. Παρ ‘όλα αυτά, ο διακόπτης των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα συνοδεύεται από την έκφραση του όγκου ειδικών πεπτιδίων μπορούν να ενεργοποιήσουν τα Τ κύτταρα (ανασκόπηση από [1]). Τα περισσότερα από αυτά τα πεπτίδια κατέβηκε από πρωτεΐνες που δεν παράγονται αποκλειστικά από κύτταρα όγκου, αλλά τροποποιημένα στη δομή τους. Η απόκριση των κυττάρων Τ κρατά τον όγκο σε ένα σταθερό ή λανθάνουσα κατάσταση [2,3]. Έχει μια αποδεκτή υπόθεση ότι οι περισσότερες από τις αποκρίσεις κατά των όγκων προκαλούνται από CD8

+ Τ κύτταρα και CD4

+ Τ κύτταρα περιορίζονται είτε σε βοηθήσει CD8

+ Τ κύτταρα για την αποτελεσματική κυτταροτοξικότητα [4, 5] ή προνομιακή δενδριτικά κύτταρα (DC) για να ενισχύσει την απόκριση των CD8

+ Τ κυττάρων [6,7].

Σε αντίθεση με αυτό το δόγμα πρόσφατες εκθέσεις αποκάλυψαν τη συμμετοχή των CD4

+ Τ κύτταρα ως ισχυρό ενεργά κύτταρα με ικανότητα για άμεση δράση εναντίον των καρκινικών κυττάρων που οδηγεί σε υποχώρηση του όγκου [8-10]. Έχει δειχθεί ότι η μεταφορά του ογκο-αντιγόνου ειδική CD4

+ Τ κύτταρα σε αμφισβήτηση, αλλά ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια μπορεί να προκαλέσει πλήρη υποχώρηση του όγκου, χωρίς την ανάγκη του CD8

+ Τ κυττάρων, κυττάρων ή Β βοήθεια κυττάρων ΝΚ [10 ]. Ωστόσο, το τεκμήριο για όλα περιγράφονται ισχυρό αποκρίσεις Τ κυττάρου είτε ένα διαγονιδιακό ειδικότητα του υποδοχέα Τ κυττάρου (TCR) κατά γνωστό όγκο αντιγόνα ή απομόνωση και επέκταση των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο (ΤΙΤ).

Έτσι, η ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης μπορεί να παρατηρηθεί, αλλά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου παρατηρείται μια επεξεργασία της ανοσολογικής απόκρισης. Αυτό περιλαμβάνει εξισορρόπησης και τελικά ανοσοποιητικού διαφυγή των κυττάρων του όγκου με επαγωγή ανθεκτικότητας [11]. Αυτή η αποτελεσματική ανοσολογική φοροδιαφυγή των όγκων οφείλεται στη δημιουργία ενός μικροπεριβάλλον που προσελκύει κατασταλτικό μυελοειδή κύτταρα προερχόμενα και ρυθμιστικά Τ κύτταρα. Επιπλέον, η κυτοκίνη και σύνθεση χημειοκίνης καθώς επίσης και η έκφραση ορισμένων προσδεμάτων σε κύτταρα όγκου μπορεί να μετατρέπει κύτταρα τελεστές σε ρυθμιστικά κύτταρα ή τους οδηγούν σε ανεργία και την απόπτωση (ανασκόπηση από [11,12]). Η γνώση αυτής της εμπρός και πίσω του ανοσοποιητικού συστήματος και καρκίνου

in vivo

εξακολουθεί να είναι γεμάτη από κενά έτσι κάθε επιπλέον αλληλεπίδραση των Τ κυττάρων με κύτταρα όγκου βοηθά να κατανοήσουμε την απάντηση και να ξεφύγουν μηχανισμών.

σε αυτή τη μελέτη αναφέρουμε ενός μέχρι σήμερα δεν περιγράφεται αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και κυττάρων Τ, και τα δύο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα. Αυτό περιλαμβάνει το σχηματισμό επαφή με διαφορετικά χαρακτηριστικά από το ανοσολογικό συνάψεων. Ο σχηματισμός των συνάψεων έχει ερευνηθεί εκτενώς και περιλαμβάνει διάφορα στάδια, συμπεριλαμβανομένων ψευδοπόδια, σχηματισμός μικροσωληνίσκων και συν-εντοπισμός των μιτοχονδρίων και ενδοπλασματικό δίκτυο [13]. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά που λείπουν στις επαφές που παρατηρήσαμε. Αντ ‘αυτού οι επαφές που οδηγούν στην κυτοσόλη ανταλλαγή μεταξύ λεμφοκυττάρων και κυττάρων όγκου

in vitro

και

in vivo

επάγουν ένα διάλειμμα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου. Σε αντίθεση με προηγούμενες αναφορές οι επαφές αυτές συμβαίνουν ανεξάρτητα από την παρουσία κυττάρων που παρουσιάζουν αντιγόνα. Ως συνέπεια αυτών των αλληλεπιδράσεων, της συνεχούς διαίρεσης των κυττάρων Τ επάγεται στα λεμφοκύτταρα τα οποία ενσωματώνουν παράγωγα του όγκου κυτοσόλιο. Αυτό το συγκεκριμένο φαινόμενο είναι μια νέα πτυχή της αλληλεπίδρασης μεταξύ του ανοσοποιητικού συστήματος με καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

Επικοινωνήστε με τον σχηματισμό των καρκινικών κυττάρων και τα Τ κύτταρα προκαλούν ροή κυτταρόπλασμα unassociated με cytotoxocicity

Μια σύντομη σημείωση: Τα πειράματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 δείχνουν την αλληλεπίδραση των ανθρώπινων PBMCs με τη γραμμή κυττάρων λευχαιμίας χοίρου Β L23. Αρχικά ζητήσαμε αν κύτταρα αυτής της κυτταρικής σειράς χοίρου είναι στόχοι για ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ και κυτταροτοξικά Τ και προορίζονται για την ανάλυση αυτή στην κυτταρομετρία ροής, όπως έχουμε ήδη εκτελεστεί χρησιμοποιώντας παράσιτα ως στόχοι για ΝΚ κύτταρα [14,15]. Ως σύμπτωση βρήκαμε την προσαρμογή του φθορισμού από τα Τ κύτταρα μετά από έκθεση σε κύτταρα L23. Περαιτέρω αποδείχθηκε ότι το αποτέλεσμα αυτό δεν είναι ένα ξενογενές ειδικό φαινόμενο αλλά μπορεί να παρατηρηθεί με την ανθρώπινη και ποντικού λεμφοκύτταρα και αρκετοί όγκοι διαφορετικής προέλευσης. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο αποκάλυψε τα πιο σημαντικά αποτελέσματα και ως εκ τούτου είναι πιο κατάλληλο για να ενσωματωθεί αυτή η νέα αλληλεπίδραση μεταξύ Τ κυττάρων και κυττάρων όγκου. Γνωρίζουμε του τεχνητού συστήματος δεδομένου ότι τα ανθρώπινα PBMCs και καρκινικά κύτταρα χοίρων είναι απίθανο να βρεθούν μαζί κάτω από φυσικές συνθήκες. Έτσι, περιορίζεται τα δεδομένα χρησιμοποιώντας κύτταρα χοίρου με το Σχήμα 1 και στη συνέχεια ενεργοποιείται σε ένα μοντέλο ποντικού.

(Α) 2×10

6 ανθρώπινα PBMCs ή CD4 καθαρίστηκε

+ Τ κύτταρα επωάστηκαν με 2×10

6 CMFDA-σημασμένο L23 κύτταρα για 4 ώρες, στη συνέχεια βάφτηκαν για CD3, CD4 και CD8 και αναλύθηκαν στην κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. Η έκθεση των λεμφοκυττάρων στα L23 κύτταρα οδήγησε σε μια συμπερίληψη του φθορισμού σε πολυάριθμα κύτταρα Τ.

(Β) Σύνοψη των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται όπως περιγράφεται παραπάνω. Η συχνότητα της πράσινης φθορίζουσας Τ κυττάρων σχετίζεται με την ογκώδη πληθυσμό PBMCs.

(C) PBMCs προεπωάστηκαν με 5πιΜ χλωριούχο στρόντιο για την επαγωγή αποκοκκίωση πριν από την έκθεση σε L23 κύτταρα. Adpation φθορισμού αξιολογήθηκε σε CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα.

(D) 2×10

6 καθαρισμένα Τ κύτταρα και 2×10

6 L23 επωάστηκαν για 4 ώρες μαζί ή διαχωρίζονται από transwells (TW), το σημασμένο L23 κύτταρα στο κάτω μέρος του στρογγυλού πυθμένος πλάκα 96 φρεατίων και τα κύτταρα Τ τοποθετούνται στις transwells.

(Ε) Καθαρισμένα CD4

+ Τ κύτταρα επωάστηκαν με κύτταρα L23 για 4 ώρες, σταθερό και προετοιμάστηκαν για ηλεκτρονική μικροσκοπία (ΕΜ). Σάρωση (i) και ΕΜ μετάδοσης (II-IV) απεκάλυψε έντονη επαφές. Στην μετάδοση ροής EM του κυτοσολίου οπτικοποιήθηκε από το ηλεκτρόνιο πυκνή κυτοσόλιο των λεμφοκυττάρων που διανέμονται από τη θέση των επαφών στο κύτταρο του όγκου (βέλη στο (ii) και (iii)). Στα υψηλότερα κενά μεγέθυνση στις κυτταρικές μεμβράνες θα μπορούσε να ανιχνευθεί (βέλη στο ίν). Τα κενά διαρραγεί μήκος έως 200nm επιτρέπει την ελεύθερη ροή των κυτταρόπλασμα και διαλυτών συστατικών, αλλά όχι των κυτταρικών δομών, π.χ. μιτοχόνδρια. Ωστόσο, η συνάθροιση των μιτοχονδρίων στην περιοχή του σχηματισμού επαφής μπορεί να είναι μια ένδειξη των διεργασιών που καταναλώνουν ενέργεια.

(F) CD4

+ Τ κύτταρα ταξινομήθηκαν μετά από επώαση με CMFDA-επισημασμένο λουσιφεράσης-transgeneic L23 κύτταρα σε πράσινη φθορίζουσα και της μη-φθορίζοντα κύτταρα Τ. 5×10

4 διαχωρίζεται Τ κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται σε μέσο συμπληρωμένο με 100 μg /ml λουσιφερίνης σε πλάκες 96 φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα. Η φωταύγεια αξιολογήθηκε μετά από 30 λεπτά επώασης χρησιμοποιώντας ανάλυση IVIS. 5×10

4 transgeneic L23 κύτταρα χρησίμευσαν ως έλεγχος της έντασης της φωταύγειας.

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες και σκέδασης-γραμμάρια ή συνοψίζει 4 ανεξάρτητα πειράματα ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Για φθορίζουσα σήμανση των κυττάρων που χρησιμοποιήσαμε CellTracker Green (5-χλωρο-methylfluorescin διοξική [CMFDA]). CMFDA αρχικά είναι ένα μη φθορίζον μόριο είναι σε θέση να περάσει την κυτταρική μεμβράνη. Σε βιώσιμα κύτταρα CMFDA διασπάται μέσα στο φθορίζον, έντονα υδρόφιλη μορφή οικοδόμηση ενός ογκώδη θήκη νερό. Αυτό αποτρέπει την απελευθέρωση του μέσα από την ανέπαφη κυτταρική μεμβράνη των ζωντανών κυττάρων. CMFDA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για τη βιωσιμότητα αφού στην περίπτωση κυτταροτοξικών λύσης, σημασμένα κύτταρα καθίστανται μη φθορίζουσα λόγω της απώλειας του CMFDA περιέχουν κυτοσόλιο [14]. Μια ανάλυση σε κυτταρομετρία ροής είναι εφικτή εάν τελεστή και στόχου κύτταρα διαφέρουν σημαντικά σε μέγεθος και ως εκ τούτου μπορούν να διακριθούν στο εμπρός-πλάι-σκέδασης (Σχήμα S1). Ωστόσο, αντί απώλεια φθορισμού παρατηρήσαμε μια απορρόφηση του φθορισμού από λεμφοκύτταρα μετά από συν-καλλιέργεια των κυττάρων όγκου με PBMCs υποδεικνύοντας μία μεταφορά μορίων CMFDA από το ένα κύτταρο στο άλλο (Σχήμα 1Α). Η προσαρμογή του φθορισμού περιορίζεται σχεδόν αποκλειστικά σε κύτταρα Τ αφού μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα του CD3

– κύτταρα κατέστησαν φθορισμού. Αξίζει να σημειωθεί ότι η παρατηρούμενη αλληλεπίδραση των Τ κυττάρων με κύτταρα όγκου που απαιτείται κανένα κύτταρα παριστάμενος όπως επεξηγείται με έκθεση των υψηλής καθαρότητας

+ Τ κύτταρα CD4 να L23 κύτταρα. Επίσης αυτή η ρύθμιση προκάλεσε μία έντονη αναλογία πράσινη φθορίζουσα κύτταρα (Σχήμα 1Α).

Καθώς η τελεία κηλίδα δείχνει, αυτή η αλληλεπίδραση αφορούσε ένα σημαντικό αριθμό κυττάρων Τ: Κατά μέσο όρο το 20% των CD4

+ και 7% των CD8

+ Τ κύτταρα μεταξύ των χύμα PBMCs έγινε πράσινο φθορισμού (Σχήμα 1Β). Το φαινόμενο αυτό μπορεί να εξηγηθεί μόνο από την πρόσληψη του κυτοσολίου που περιέχει τα μόρια CMFDA από το ένα κύτταρο στο άλλο. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα κύτταρα ΝΚ δεν αποκάλυψε σημεία συλλογής όγκου φθορισμού που προέρχεται κυτταρόπλασμα, αν και εμφανίζουν ισχυρή κυτταροτοξική δράση εναντίον των καρκινικών κυττάρων L23 (Εικόνα S2). Ωστόσο, η κυτταροτοξικότητα φαίνεται να είναι μια λογική εξήγηση για την παρατηρούμενη επίδραση. Δοκιμάσαμε την πιθανότητα κυτοτοξικότητας είναι υπεύθυνη για την ανταλλαγή κυτοσόλιο με κατεργασία PBMCs με χλωριούχο στρόντιο (SRCL

2), ένα αντιδραστήριο που διεγείρει εξωκυττάρωση των λυτικών κοκκίων [16]. Έτσι, η θεραπεία με SRCL

2 φύλλα κυτταροτοξικά κύτταρα αναποτελεσματική. Παρ ‘όλα αυτά, τα λεμφοκύτταρα εξακολουθεί αποκάλυψε μια πρόσληψη CMFDA (Σχήμα 1C). Αυτό εξηγεί τόσο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα τα οποία είναι μια ένδειξη ότι η κυτταροτοξικότητα δεν είναι ο παράγοντας για την ανταλλαγή κυτοσόλιο. Πράγματι, αν και μόνο ελαφρώς παρατηρήσαμε μια αύξηση του φθορισμού προσαρμογής μετά SRCL

2 θεραπεία και στους δύο πληθυσμούς των Τ κυττάρων. Ωστόσο, ο σχηματισμός επαφή ήταν υποχρεωτική για το φαινόμενο που παρατηρείται. Τ κύτταρα και κύτταρα όγκου επωάστηκαν είτε σε συν-καλλιέργεια ή διαχωρίζονται από transwells. Πράσινη φθορίζουσα Τ κύτταρα θα μπορούσαν να ανιχνευθούν μόνο μετά από άμεση έκθεση σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε καλλιέργειες transwell (Εικόνα 1D).

Κενά στις κυτταρικές μεμβράνες των κυττάρων του όγκου και αφελείς λεμφοκύτταρα επιτρέπουν τη μεταφορά των κυτταρόπλασμα συμπεριλαμβανομένων των μορίων υψηλού μοριακού βάρους και επάγουν τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων

Εμείς περαιτέρω εστιασμένη σχετικά με την αλληλεπίδραση των CD4

+ Τ κυττάρων με κύτταρα όγκου με απεικόνιση του σχηματισμού επαφής. Σάρωσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (SEM) αποκάλυψε την έντονη φύση των κυτταρικών επαφών οδηγεί στην πόλωση των αλληλεπιδρώντων εταίρων κυττάρου όγκου-λεμφοκυττάρων (Σχήμα 1Ε i). Επιπλέον, μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (ΤΕΜ) έδειξε, ακόμη και σε χαμηλή μεγέθυνση, μία ροή ηλεκτρονίων πυκνό κυτοσόλιο από το Τ κύτταρο μέσα στο κύτταρο όγκου που προέκυψε στο υψηλότερο μεγέθυνση να ενεργοποιηθεί από τα κενά στην κυτταρική μεμβράνη των δύο εταίρων (Σχήμα 1Ε II-IV). Αυτά τα κενά εκτεταμένες περιοχές μεταξύ 100-200nm και ως εκ τούτου θα πρέπει να επιτρέπει τη μεταφορά περισσότερων από τα συστατικά μόνο χαμηλού μοριακού βάρους του κυτταρόπλασμα, αλλά μόρια και με ενζυματική λειτουργία του υψηλού μοριακού βάρους. Κατά συνέπεια η δίοδος του λουσιφεράσης πρωτεΐνης 30kDa εκτιμήθηκε με συγκαλλιέργεια των PBMC με ρετροϊικό μετάγονται λουσιφεράσης που εκφράζουν L23 κύτταρα. κύτταρα που μετατρέπονται L23 σημάνθηκαν με CMFDA και Τ κύτταρα διαχωρίστηκαν μετά από έκθεση στα κύτταρα του όγκου να διακρίνει την πράσινη φθορίζουσα από τη μη φθορίζουσα CD4

+ Τ κύτταρα. Καθαρισμένα Τ κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με λουσιφερίνης για την αξιολόγηση ενζυματική δραστικότητα. Πράγματι, Τ κύτταρα με πρόσληψη CMFDA αποκάλυψε φωταύγειας ενώ τα μη-φθορίζοντα κύτταρα Τ ήταν αρνητικά για δραστικότητα λουσιφεράσης (Σχήμα 1 F). Αυτό έδειξε σαφώς τη μεταβίβαση του κυτοσολίου που σχετίζονται με την ανταλλαγή μορίων που υπέστησαν βιολογική δραστικότητα στο κύτταρο δέκτη. Έτσι, είναι ενδιαφέρον να παρακολουθήσει τις συνέπειες των επαφών για τους εταίρους, εάν του κυτταροπλάσματος συστατικά διατηρούν τη βιολογική τους λειτουργία. Βασικά κάναμε ότι στο μοντέλο ποντικού

in vitro

και

in vivo

αλλά βρήκε την υποστήριξη των δεδομένων και με ανθρώπινα λεμφοκύτταρα και τα κύτταρα του όγκου των χοίρων.

Εμείς χωρίζονται φθορισμού και μη φθορισμού CD4

+ Τ κυττάρων μετά από έκθεση σε CMFDA-επισημασμένα κύτταρα όγκου και απομονωμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς οποιαδήποτε περαιτέρω διέγερση σε μέσο για 5 ημέρες. Βρήκαμε έντονη πολλαπλασιασμό αυτών των Τ κυττάρων με ενσωμάτωση παραγώγων όγκου κυτοσόλης (Σχήμα S3). επέκταση κυττάρων Τ μπορεί να επάγεται από τον υποδοχέα Τ κυττάρων που εξαρτώνται και ανεξάρτητες οδούς. Έχει αναφερθεί ότι τα Τ κύτταρα εσωτερικεύουν το TCR μετά από έκθεση σε αντι CD3 μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) κλώνος ΟΚΤ3 υπό ορισμένες συνθήκες [17]. Έτσι, εφαρμόζεται το πρωτόκολλο στα πειράματά μας και επαλήθευσαν την εξαφάνιση του TCR από την κυτταρική επιφάνεια των Τ κυττάρων. Παρ ‘όλα αυτά, η πρόσληψη του φθορισμού δεν ακυρώθηκε από τη θεραπεία. Επιπλέον, το κλείδωμα των μορίων χοίρου MHC II με mAb MSA-3 έχουν το αποτέλεσμα των κυτοσόλιο μεταφοράς μεταξύ λεμφοκυττάρων και κυττάρων του όγκου σχεδόν ανεπηρέαστη. Τελευταίο αλλά όχι λιγότερο σημαντικό, για την πρόσληψη κυτταρόπλασμα τα λεμφοκύτταρα δεν πρέπει να προ-ενεργοποιηθεί. Παρθένα κύτταρα Τ αποκάλυψε την ικανότητα να υποστούν τις επαφές με τα καρκινικά κύτταρα τουλάχιστον στον ίδιο βαθμό όπως IL-2 ενεργοποιημένα ή ακτινοσκοπούνται L23 προ-εκτεθεί Τ κυττάρων (όλα τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα S3).

Ανταλλαγή κυτταρόπλασμα δεν περιορίζεται σε ένα ορισμένο είδος και τον τύπο των καρκινικών κυττάρων

Αλλαγή στο μοντέλο ποντικού, χρησιμοποιήσαμε ένα άκρως επιθετικό καρκινικό κύτταρο γραμμή BM185, απομονωμένες από ποντίκια BALB /c που πάσχουν από όλα τα [18], για την επικύρωση της οικουμενικότητας των παρατηρούμενων επαφές μεταξύ Τ κυττάρων και καρκινικών κυττάρων. Η επέκταση στο μοντέλο ποντικού προσφέρει επιπλέον τη δυνατότητα

in vivo

επαλήθευσης.

Η ηλεκτρονική μικροσκοπία και κυτταρομετρία ροής ανάλυση επιβεβαίωσε τις επαφές και τη μεταφορά του κυτοσολίου μεταξύ Τ κύτταρα ποντικού και κύτταρα BM185 (Σχήμα 2Α και Σχήμα S4). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε αντίθεση με τα ανθρώπινα PBMCs, μεταξύ χύμα σπληνοκύτταρα ποντικού ένας καλά ανιχνεύσιμο πληθυσμό CD3

– κυττάρων αποκάλυψε την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με κύτταρα όγκου με αποτέλεσμα κυτοσόλιο πρόσληψη. Πρόσθετες χρώση των σπληνοκυττάρων με CD19 προσδιορίζονται του πληθυσμού, όπως Β κύτταρα με περίφραξη στο CD3

– κύτταρα τα οποία ήταν σχεδόν εξ ολοκλήρου CD19

+ (Σχήμα 2Β), ενώ σύμφωνα με τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας τα ανθρώπινα κύτταρα, ΝΚ κύτταρα δεν ήταν εμπλέκονται στην κυτοσόλη μεταφοράς (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) 2×10

6 σπληνοκύτταρα επωάζονται με 2×10

6 CMFDA-επισημασμένα κύτταρα BM185 για 4 ώρες και αναλύθηκαν για πρόσληψη φθορισμό από τα Τ κύτταρα. Ομοίως με τα ανθρώπινα PBMCs το μοντέλο ποντικού απεκάλυψε πράσινη φθορίζουσα CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα. Επιπλέον, ένα καλά ανιχνεύσιμη πράσινη φθορίζουσα πληθυσμός επέκταση του πληθυσμού κυττάρων Τ θα μπορούσε να παρατηρηθεί εντός των σπληνοκυττάρων.

(Β) Χρώση σπληνοκυττάρων με CD3 και CD19 μετά από έκθεση σε καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται με τη μη Τ κυτταρικό πληθυσμό ικανή για κυτταρόπλασμα πρόσληψη ως Β κύτταρα.

(C) Περίληψη τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα επώαση των σπληνοκυττάρων με κύτταρα διαφορετικών κυτταρικών σειρών. κύτταρα BNL δεν είναι καρκινικά προέρχονται ενώ οι άλλες γραμμές είναι τα καρκινικά κύτταρα.

(D) Ανάλυση της έκφρασης MHC II των αντίστοιχων κυτταρικών σειρών BM185, KLN-205 και BNL CL.2. Το επίπεδο της έκφρασης δεν συσχετίζονται με το αποτέλεσμα της κυτταρόπλασμα μεταφοράς

(Ε) Σε αντίθεση με επηρεάζεται CD4

+ Τ κύτταρα (CMFDA

-)., CD4

+ Τ κύτταρα αποκαλύπτοντας η πρόσληψη του όγκου που προέρχεται κυτταρόπλασμα (CMFDA

+) έδειξαν σημάδια ενεργοποίησης σύμφωνα με την αυξημένη έκφραση του CD25 και στις αρχές του δείκτη ενεργοποίησης CD69, ενώ CD62L μειώθηκε ελαφρά. Τα κύτταρα επωάστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω (Α) με επακόλουθη χρώση των CD4 Τ κυττάρων και των δεικτών ενεργοποίησης. Το μοτίβο της ενεργοποίησης ήταν διαφορετική από την διέγερση με 2 μg /ml ConA.

(F) ανάλυση της διάδοσης των 1×10

4 καθαρίζεται Τ κύτταρα αποκαλύπτοντας πρόσληψη CMFDA μετά από 4 ώρες την έκθεση της σπλήνας σε σημασμένα κύτταρα BM185. Για τον έλεγχο καθαρισμένα CD4

+ Τ κύτταρα από παρθένα ποντίκια καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο όπως έγινε με τα ταξινομημένα κύτταρα Τ για 4 ημέρες και επιπλέον 16 ώρες με

θυμιδίνης 3Η πριν szintilization.

Τα αποτελέσματα φαίνονται ως αντιπροσωπευτικές scatter-γραμμάρια ή συνοψίζει τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Σε γενικές γραμμές, ποντικού Τ κύτταρα είχαν μια λιγότερο έντονη τάση να παρεμβαίνει με όγκο κύτταρα σε σύγκριση με ανθρώπινα Τ κύτταρα. Ακόμη και με L23 κύτταρα μόνο ένας μέσος όρος 10% CD4

+ Τ κυττάρων έγινε πράσινη φθορίζουσα και αυτό σε συνδυασμό με μια πολύ υψηλή τυπική απόκλιση. Παρ ‘όλα αυτά τα κύτταρα L23 επάγεται την υψηλότερη πρόσληψη CMFDA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, άλλες κυτταρικές σειρές ποντικού συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων KLN-205 πνεύμονα καρκίνωμα, εμβρυϊκά κύτταρα ήπατος BNL CL.2, κύτταρα mastcytoma Ρ815, κύτταρα μυελώματος J558L κύτταρο Β, κύτταρα μυελοειδούς όγκου C1498 και τις κυτταρικές σειρές όγκου ήπατος Hepa-1C1C7 και HepA- 1-6 δοκιμάστηκαν. Με την εξαίρεση των κυττάρων BNL, μεταβλητή αλλά καλά ανιχνεύσιμη μεταφορά CMFDA για τα διάφορα καρκινικά κύτταρα βρέθηκε (Σχήμα 2C). Είναι ενδιαφέρον, αν και σε μόνιμη βάση τη διαίρεση, τα κύτταρα BNL CL.2 δεν θεωρούνται ως κλασική καρκινικά κύτταρα [19]. Η αντίσταση των κυττάρων CL.2 BNL, προσφέρονται επίσης για το μοντέλο ποντικού την ευκαιρία να επικυρώσει τον ΤΟΚ της ανεξαρτησίας και του όγκου εξειδίκευση του αποτελέσματος. Αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης MHC II για τις διάφορες κυτταρικές σειρές. Αποδείχθηκε ότι BM185 και BNL CL.2 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα MHC II ενώ KLN-205 κύτταρα ήταν εντελώς αρνητικά για MHC II (Σχήμα 2D). Έτσι, η αλληλεπίδραση ΤΟΚ /MHC δεν φαίνεται να είναι υποχρεωτική για την ανταλλαγή κυτταρόπλασμα. Αυτό τονίζεται επίσης από τη μεταφορά του κυτταρόπλασμα που παρατηρείται μεταξύ Β κυττάρων και καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, εκτελέσαμε πειράματα χρησιμοποιώντας αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) -transduced κύτταρα BM185 και συγκρίθηκε το αποτέλεσμα του κυτοσολίου μεταφορά μετά από έκθεση σε άγριου-τύπου (wt) BALB /c και διαγονιδιακά ποντίκια 6.5. Το 6,5 ποντίκι έχει μια χαρακτηριστική πληθυσμό περίπου το 20% των CD4 Τ κυττάρων που εκφράζουν ένα ΗΑ-ειδικό TCR. Αμφότερα τα στελέχη αποκάλυψε μια τάση αυξημένης συχνότητας των κυττάρων που δείχνουν ανταλλαγής κυτοσόλιο μετά την έκθεση σε BM185-ΗΑ σε σύγκριση με τα κύτταρα BM185. Ωστόσο, σπληνοκύτταρα που προέρχονται από 6,5 ποντίκια δεν έδειξαν αύξηση της συχνότητας των κυττάρων που παρουσιάζουν ανταλλαγή κυτοσόλιο με τις ΗΑ-διαγονιδιακών κυττάρων BM185 (Σχήμα S5).

Ωστόσο, μετά την έκθεση σε κύτταρα όγκου Τ κύτταρα εμφάνισαν πρώιμα σημάδια ενεργοποίησης. Η επώαση των σπληνοκυττάρων με BM185 οδήγησε σε πάνω ρύθμιση του CD25 δεικτών ενεργοποίησης και CD69 και περιθωριακές μεταβολή της έκφρασης του CD62L σε Τ κύτταρα αποκαλύπτοντας μια πρόσληψη προέρχονται όγκου κυτοσολίου ενώ τα Τ κύτταρα χωρίς προσαρμογή του φθορισμού έδειξαν επίπεδα έκφρασης των δεικτών ενεργοποίησης συγκρίσιμο με Το μέσο που επωάστηκε λεμφοκύτταρα (Σχήμα 2Ε). Τα ανιχνευόμενα επίπεδα του CD25 σε μέσο επωάζεται και CMFDA

– Τ κύτταρα οφείλεται στην συστατική έκφραση CD25 επί ρυθμιστικά κύτταρα Τ έτσι τα επίπεδα αυξήθηκαν πάνω από αυτό το φόντο ήταν ενδείξεις ενεργοποίησης. Η αξιολόγησε ενεργοποίηση των Τ κυττάρων συνδυάζεται με τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων όπως μπορεί να παρατηρηθεί με ανθρώπινα κύτταρα Τ αλληλεπιδρούν με L23 κύτταρα (Σχήμα 2F).

Οι ανιχνεύσιμες μεταφορά κυτταρόπλασμα in vivo

Η επαλήθευση των κυτταρόπλασμα μεταφοράς

in vivo

είναι μεγάλου ενδιαφέροντος για αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι το κυτταρόπλασμα ανταλλαγή οφείλεται μόνο σε μια

in vitro

τεχνούργημα. Ως εκ τούτου, CMFDA-σημασμένα κύτταρα BM185 ενέθηκαν ενδοφλεβίως (ί.ν.) σε ποντικούς BALB /c και τα ποντίκια θανατώθηκαν 6 ώρες μετά. Ακολούθως σπλήνα, λεμφαδένες και μυελό των οστών ελέγχθηκαν για κύτταρα BM185 αλλά μόνο στο σπλήνα μπορούσε να ανιχνευθεί πολυάριθμα κύτταρα όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), το οποίο σε συνδυασμό με την εμφάνιση πράσινη φθορίζουσα CD4

+ Τ κύτταρα (Σχήμα 3Α) . Σύμφωνα με την

in vitro

αποτελέσματα, επίσης

in vivo

λεμφοκύτταρα με τη συγγένεια του κυτοσολίου πρόσληψης θα μπορούσε να βρεθεί στους πληθυσμούς των CD8

+ Τ κύτταρα και Β κύτταρα (Σχήμα 3Β ).

(Α) 1×10

7 CMFDA-επισημασμένο BM185 ενέθηκαν ενδοφλεβίως. 6 ώρες αργότερα τα ποντίκια θυσιάστηκαν και η σπλήνα, λεμφαδένες και μυελό των οστών ομογενοποιήθηκε. 5×10

7 κύτταρα χρωματίστηκαν για CD4 και μετρήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής και εκτιμήθηκε το ποσοστό της πράσινης φθορίζουσας λεμφοκυττάρων.

(β) αξιολόγηση του φαινοτύπου πράσινη φθορίζουσα σπληνοκύτταρα 6 ώρες μετά από ί.ν. εφαρμογή των 1×10

7 CMFDA-επισημασμένο BM185. Εκτός από CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα, και

στο

vivo

Β κύτταρα (Β220

+ κύτταρα) αποκάλυψε πρόσληψη CMFDA.

τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως εκπρόσωπος της διασποράς-γραμμάρια 3 ανεξάρτητα πειράματα.

η

τα καρκινικά κύτταρα σταματούν να πολλαπλασιάζονται μετά την πρόσληψη των Τ κυττάρων που προέρχονται κυτταρόπλασμα που οδηγεί σε παρατεταμένη επιβίωση των ποντικών

η ροή του κυτοσολίου δεν είναι ένας μονόδρομος, αλλά μπορεί να παρατηρηθεί και στις δύο κατευθύνσεις. Έτσι, όχι μόνο τα Τ κύτταρα έγινε πράσινη φθορίζουσα μετά από έκθεση σε CMFDA-επισημασμένα κύτταρα όγκου αλλά επίσης ένα μέρος των κυττάρων του όγκου έγινε πράσινη φθορίζουσα μετά από επώαση με σημασμένο CMFDA λεμφοκυττάρων (Σχήμα 4Α). Για να ακολουθήσει η μεταφορά των παράγωγων λεμφοκυττάρων κυτταρόπλασμα των κυττάρων BM185 επισημάνθηκαν με CellVue Maroon, μια χρωστική ουσία η οποία ενσωματώνεται στο λιπιδικό περιοχές των μεμβρανών με την τονισμένη παρατήρηση του κατασκευαστή ελάχιστη μη ειδική μεταφορά μεταξύ των κυττάρων. Μέσω έκθεσης των κυττάρων όγκου CellVue σημασμένο με λεμφοκύτταρα ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει ένα θετικό κλάσμα με CellVue επαγόμενη φθορισμού σε CD4

+ κύτταρα Τ υποδεικνύει τη μεταφορά των τμημάτων του κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων του όγκου στην επιφάνεια των λεμφοκυττάρων (Σχήμα 4Β ). Αυτό είναι πειστική επικύρωση της εντύπωση του σύντηξη κυτταρικών μεμβρανών, όπως καταδεικνύεται με ΤΕΜ (Σχήμα 2 και Σχήμα S4).

(Α) κύτταρο BM185 σημάνθηκαν με CellVue να διακρίνει τον πληθυσμό των κυττάρων του όγκου από CMFDA-επισημασμένο λεμφοκύτταρα. καρκινικά κύτταρα και σπληνοκύτταρα επωάστηκαν σε ίσο αριθμό για 4 ώρες και η πρόσληψη του CMFDA εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. . Στη συνέχεια, BM185 διαχωρίστηκαν με διαχωρισμό κυττάρου σε μη φθορίζουσα και φθοριζόντων κυττάρων

(β) αξιολόγηση της μεταφοράς των συστατικών μεμβράνης από CellVue επισημασμένο BM185 σε λεμφοκύτταρα μετά την έκθεση των κυττάρων σε ένα σιτηρέσιο 1: 1 για 4 h. CellVue ενσωματώνει σε λιπίδιο περιοχές των κυτταρικών μεμβρανών.

(C)

ενσωμάτωση 3Η θυμιδίνης των κυττάρων που εκτίθενται σε BM185 CMFDA-επισημασμένο σπληνοκύτταρα από BALB /c και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με FACS κυτταρική διαλογή σε κύτταρα όγκου τα οποία ανταλλάσσονται κυτοσόλιο με λεμφοκύτταρα ποντικού (CMFDA

+) ή εκείνες που παρέμειναν ανεπηρέαστα (CMFDA

-). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες σε τρυβλία 96 φρεατίων και 16 ώρες μετά την προσθήκη του ραδιενεργού θυμιδίνης.

(D) καμπύλη επιβίωσης των ποντικών BALB /c μετά από ί.ν. ένεση 1×10

4 κύτταρα BM185 (5 ποντικοί ανά ομάδα /πείραμα, η καμπύλη επιβίωσης αντιπροσωπεύει δύο ανεξάρτητα πειράματα, έτσι n = 10) με ή χωρίς πρόσληψη CMFDA μετά από έκθεση σε CMFDA-επισημασμένο σπληνοκύτταρα ποντικού. Η πορεία της BM185 προκάλεσαν λευχαιμία είναι εξαιρετικά επαναλήψιμη. Η επιβίωση των κυττάρων BM185 χωρίς την πρόσληψη προέρχεται λεμφοκυττάρων κυτοσόλιο αντιστοιχεί πλήρως με αυτή τη γνωστή πτώση του viablitiy. Σε αντίθεση, οι ποντικοί που ενέθηκαν με BM185 ενσωματωθεί σπληνοκυττάρων που προέρχονται κυτοσόλιο επέζησαν σημαντικά μεγαλύτερη (p ≤ 0,0042).

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως εκπρόσωπος της διασποράς-γραμμάρια ή συνοψίζει 2-4 ανεξάρτητα πειράματα ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Εμείς χωρίζονται κύτταρα BM185 σε φθορίζοντα και μη-φθορισμού μετά από έκθεση σε σπληνοκύτταρα ποντικού . Τα απομονωμένα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 4 ημέρες με μετέπειτα αξιολόγηση των

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης. Απροσδόκητα, μια δραστική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων BM185 μετά την απορρόφηση των παραγώγων λεμφοκυττάρων κυτοσολίου μπορούσε να μετρηθεί (Σχήμα 4C). Αυτή ήταν μόνο μια προσωρινή διακοπή του κυτταρικού κύκλου. 7 ημέρες καλλιέργειας αποκάλυψε επίσης ανιχνεύσιμη πολλαπλασιασμός ακόμη και των κυττάρων του όγκου που υποβλήθηκε σε μεταφορά του κυτοσολίου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η διακοπή της διαίρεσης των καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να έχει πιθανές συνέπειες για την επιβίωση των ποντικών BALB /c. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα κύτταρα BM185 είναι εξαιρετικά κακοήθη προκαλώντας μια επιθετική πορεία όλων. Ακόμη και μια μικρή δόση 10

4 κυττάρων οδηγεί σε θάνατο μέσα σε 20 ημέρες. BM185 κύτταρα που εμφανίστηκαν μη φθορίζουσα μετά από έκθεση σε σπληνοκύτταρα αποκάλυψαν μια εξαιρετικά αναπαραγώγιμη πορεία της θνησιμότητας. Σε αντίθεση, οι ποντικοί που ενέθηκαν με BM185 που περιλάμβανε κυτοσόλιο από κύτταρα σπλήνας επέζησαν σημαντικά (ρ ≤ 0,0042) μακρύτερο και το 20% των ποντικών (δύο από τους δέκα) ακόμη και επιβίωσαν της πρόκλησης με κύτταρα όγκου (Εικόνα 4D).

Τ κύτταρα ανταλλάσσουν κυτταρόπλασμα ειδικά με καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι με τα υγιή κύτταρα

Το θέμα παραμένει: Είναι αυτό μια αποκλειστική αλληλεπίδραση των Τ κυττάρων με τα καρκινικά κύτταρα; Και αν ναι: Είναι το φαινόμενο περιορίζεται σε κυτταρικές σειρές όγκων ή να κάνετε πρωτογενών κυττάρων όγκου επίσης να προκαλέσει αυτό το φαινόμενο; Το τελευταίο ερώτημα έχει ενδιαφέρον αφού κυτταρόπλασμα μεταφοράς με πρωτοπαθή καρκινικά κύτταρα θα επιβεβαιώσει την κλινική σημασία ειδικά αν λάβουμε υπόψη ότι το ανοσοποιητικό σύστημα ενεργοποιείται από τις κυτταρικές επαφές με καρκινικά κύτταρα και ο όγκος αποκαλύπτει μια προσωρινή σύλληψη στην κυτταρική διαίρεση.

Όπως εκτελείται με σπληνοκύτταρα ποντικού, τα πειράματα επαναλήφθηκαν με έκθεση διαφορετικών κυτταρικών γραμμών όγκου για ανθρώπινα PBMCs. Επιλέξαμε κύτταρα BM185 ως πρόσθετο ξενογενούς γραμμή όγκου, τα ανθρώπινα κύτταρα λεμφώματος Β κυττάρου και την κυτταρική γραμμή όγκου ήπατος HepG2. Σε σύγκριση με τα κύτταρα L23 το αποτέλεσμα ήταν λιγότερο έντονη σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Ωστόσο, μια σαφής πρόσληψη κυτοσολίου με CD4

+ Τ κυττάρων μετά από συν-καλλιέργεια με όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου μπορούσε να παρατηρηθεί (Εικόνα 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα BM185 επάγεται επίσης εντός ανθρώπινα PBMCs μια προσαρμογή του φθορισμού στο 5% των CD4

+ Τ κύτταρα από χύδην PBMC όπως με συγγενή σπληνοκύτταρα ποντικού. Έτσι, η διακριτή ανταλλαγή κυτταρόπλασμα με L23 κύτταρα δεν μπορεί να εξηγηθεί μόνο από την ξενογενή ρύθμιση.

(α) έκθεση του PBMCs σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές όγκου CMFDA σημασμένο, συμπεριλαμβανομένης της ξενογενή χοίρου L23 κύτταρα και κύτταρα ποντικού BM185 καθώς και το ανθρώπινο λέμφωμα Β κυττάρων T5.1 και Laz, κυτταρική γραμμή Jurkat Τ και ο κύτταρα ηπατοκαρκινώματος HepG2. Με όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές όγκου αξιολογήθηκε μεταβίβαση κυτοσολίου. Σε αντίθεση, ανθρώπινα PBMCs που εκτίθενται σε υγιή CMFDA-επισημασμένο PBMCs από τον ίδιο δότη αίματος (συγγενικό) ή διαφορετικό δότη αίματος (αλλογενείς) δεν έδειξε προσαρμογή του φθορισμού.

(Β) πρωτογενή ηπατοκύτταρα που προέρχονται από υγιή ιστό ή HCC και τα κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες σε τμήμα Παρουσιάσεις για να ληφθεί ένα χαλαρό μονοστοιβάδα κυττάρων. Τα ηπατοκύτταρα σημάνθηκαν με CMFDA και επωάστηκαν με 5×10

5 PBMCs για 4 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και ξηραίνεται στον αέρα με επακόλουθη χρώση για CD4 (κόκκινο? Μόνο HCC HepG2 και) και του πυρήνα (μπλε). Μικροσκοπία αποκάλυψε μια πρόσληψη πράσινου φθορισμού από λεμφοκύτταρα μόνο αν εκτεθεί σε καρκινικά κύτταρα. Πρόσθετη χρώση των CD4 επιβεβαίωσε ότι μερικές από τις συμμετέχουσες κύτταρα είναι CD4

+ Τ κύτταρα.

Τα αποτελέσματα φαίνονται ως αντιπροσωπευτικές εικόνες και σκέδασης-γραμμάρια ή συνοψίζει 3 ανεξάρτητα πειράματα ως μέση τιμή ± SEM (εκτός από την (Β ), η οποία συνοψίζει τουλάχιστον 6 πειράματα).

η

Έτσι, τα καρκινικά κύτταρα που προκαλείται από την ανταλλαγή κυτταρόπλασμα. Για τον έλεγχο εάν αυτό το αποτέλεσμα ήταν ειδικό για κύτταρα όγκου ανθρώπινα PBMCs επωάστηκαν με CMFDA επισημασμένο αλλογενή PBMCs ή αυτόλογα PBMCs που προέρχονται από υγιείς δότες αίματος. Δεν βρήκαμε πρόσληψη CMFDA συγκρίσιμων όταν χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα όγκου (Σχήμα 5Α). Αξίζει να σημειωθεί, σπληνοκύτταρα από αρουραίους Lewis εκτραφεί υπό καθορισμένες-ελεύθερες παθογόνων συνθήκες (SPF) δεν προκαλούν προσαρμογή του φθορισμού σε ανθρώπινα PBMCs, πολύ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να αποκλεισθεί η πιθανότητα ότι αυτό το αποτέλεσμα προκαλείται από κυτταρικές γραμμές όγκου που συχνά προκαλούνται και σταθεροποιούνται από ιούς (όπως για L23 κύτταρα, [20]) πρωτογενή κύτταρα όγκου που προέρχονται από ανθρώπινο HCC καλλιεργήθηκαν με αλλογενή PBMCs. Δεδομένου ότι αποκλείεται το ενδεχόμενο κυτοσόλιο μεταφοράς μεταξύ αλλογενή κύτταρα του δότη, τα παρατηρούμενα αποτελέσματα ερμηνεύονται να σχετίζεται με τα καρκινικά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας μικροσκοπικές τεχνικές έντονη πρόσληψη CMFDA μετά την έκθεση των PBMCs σε κύτταρα HCC ήταν ορατή. Ως έλεγχος, υγιής πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα επωάστηκαν με PBMCs που δεν επάγουν μία μεταφορά του φθορισμού (Σχήμα 5Β).