Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα υδροξυλιωμένα παράγωγα της χοληστερόλης, όπως τα οξυστερολών, παίζουν σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων. Συγκεκριμένα, 25-υδροξυχοληστερόλης (25HC) έχει ενοχοποιηθεί σε μια ποικιλία μεταβολικών γεγονότων συμπεριλαμβανομένης της ομοιόστασης χοληστερόλης και της αρτηριοσκλήρυνσης. 25HC είναι ανιχνεύσιμη στο ανθρώπινο πλάσμα μετά την κατάποση ενός γεύματος πλούσιο σε οξυστερόλες και μετά από μια διαιτητική πρόκληση χοληστερόλη. Επιπλέον, τα επίπεδα του οξυστερόλες, συμπεριλαμβανομένων 25HC, έχουν βρεθεί να είναι αυξημένα σε υπερχοληστερολαιμικούς ορό.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι ο υποδοχέας οιστρογόνου (ER) α μεσολαβεί αλλαγές έκφραση γονιδίων και αποκρίσεις ανάπτυξης που προκαλείται από 25HC σε καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών κύτταρα. Επιπλέον, 25HC επιδεικνύει την ΕΚα εξαρτώμενη ικανότητα σαν 17β-οιστραδιόλη (Ε2) να αναστέλλουν την αυξητική ρύθμιση του HIF-1α και του παράγοντα αυξητικού από υποξικές συνθήκες σε καρδιομυοκύτταρα και παρασκευάσματα καρδιάς αρουραίου και για την πρόληψη της υποξία-επαγόμενη απόπτωση.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Η δράση που ασκείται από τα οιστρογόνα 25HC μπορεί να θεωρηθεί ως ένα επιπλέον παράγοντας που εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών. Επιπλέον, τα οιστρογόνα-όπως δραστηριότητα του 25HC προκάλεσε στο καρδιαγγειακό σύστημα μπορεί να παίξει ένα ρόλο κατά υποξικό περιβάλλον

Παράθεση:. Lappano R, Recchia AG, De Francesco EM, Angelone Τ, Cerra MC, Picard D, et al. (2011) Η χοληστερόλη μεταβολίτης 25-υδροξυχοληστερόλης Ενεργοποιεί υποδοχέα οιστρογόνων α-σηματοδότηση μέσω στα καρκινικά κύτταρα και Καρδιομυοκύτταρα. PLoS ONE 6 (1): e16631. doi: 10.1371 /journal.pone.0016631

Επιμέλεια: Vincent Laudet, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 7 Σεπ 2010? Αποδεκτές: 27 Δεκ 2010? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιαν 2011

Copyright: © 2011 Lappano et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, έργο ν 8925/2009.) (https://www.airc.it/) και Ministero dell’Università e Ricerca Scientifica e Tecnologica (MIUR) (http: //www.istruzione.it/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας οιστρογόνου (ER) α και β ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων παραγόντων μεταγραφής συνδέτη επαγόμενο [1]. Η σύνδεση του 17β-οιστραδιόλη (Ε2) να ERs επάγει ομοδιμερισμό υποδοχέα και αλληλεπίδραση με συγκεκριμένα οιστρογόνα αποκριτικά στοιχεία (Eres) που βρίσκεται εντός των ρυθμιστικών περιοχών των γονιδίων στόχων [2]. Δύο ξεχωριστές περιοχές ενεργοποίησης μεσολαβούν την ER-εξαρτώμενη μεταγραφική δραστηριότητα: τη λειτουργία ενεργοποίησης (AF) -1 βρίσκεται στο αμινο-τελικό άκρο και την ορμόνη-εξαρτώμενη AF-2 που βρίσκεται στο πεδίο σύνδεσης συνδετήρα (LBD) [3]. Η πρόσδεση των προσδεμάτων ER επάγει τον σχηματισμό ενός υδρόφοβου θύλακα AF-2, η οποία ρυθμίζει την πρόσληψη συμπαραγόντων και σημαντικότερο φαρμακολογία των υποδοχέων [4] – [5]

Προηγούμενα αποτελέσματα που λαμβάνονται και στις δύο κυτταρικές καλλιέργεια και ζωικά μοντέλα. έχουν δείξει ότι ΕΚα παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διαμεσολάβηση τις επιδράσεις των οιστρογόνων σε μαστικού αδένα και ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού εξέλιξη [6] – [7]. Επιπλέον, τα οιστρογόνα έχει δειχθεί ότι εμποδίζει δυσλειτουργία αγγειακής και της ζημίας σε ένα ER-εξαρτώμενο τρόπο [8] – [10], για να μειωθεί υπερτροφία των καρδιομυοκυττάρων [11] και για να μειωθεί το μέγεθος του εμφράγματος και μυοκυττάρων απόπτωση σε ζωικά μοντέλα με απόφραξη της στεφανιαίας [12] . Οι διάφορους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην προστατευτική δράση που ασκείται από Ε2 σε καρδιομυοκύτταρα. Οξειδωτικό στρες και η επακόλουθη παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) πιστεύεται ότι πυροδοτούν καρδιομυοκυττάρων απόπτωση [13], ενώ η ικανότητα του E2-ενεργοποιημένων ER για την εξουδετέρωση αυτών των οξειδοαναγωγικών ενδιάμεσα είναι πολύ πιθανό ένας βασικός παράγοντας της συνολικής καρδιοπροστασία. Το κύτταρο απόκριση στα χαμηλωμένα περιβάλλον οξυγόνου εμπλέκει την υποξία παράγοντα-1 (HIF-1), η οποία ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων, όπως το matricellular πρωτεΐνη που ονομάζεται Συνδετικού ιστοειδικού αυξητικού παράγοντα (CTGF) που ανήκει στην οικογένεια CCN ρυθμιστών ανάπτυξης (

CYR61

, CTGF και

Νοέμβριος

) [14]. Τα επίπεδα του CTGF είναι πάνω ρυθμισμένα κατά τη διάρκεια της αποκατάστασης τραύματος [15], φλεγμονή [16], ινωτικών διαταραχών [17], η ανάπτυξη του όγκου [18] – [19] και την αγγειογένεση [18], [20]. Συσσωρευμένα στοιχεία που έχει επίσης προταθεί ότι CTGF ασκεί καθοριστικό ρόλο στην καρδιακή ινωτικές διαδικασίες, αναφέροντας το ως μια πιθανή βιοδεικτών και εν δυνάμει υποψήφιας για θεραπευτική παρέμβαση [21].

Οι οξυστερολών υδρολυομένα παράγωγα της χοληστερόλης που παίζουν σημαντικές λειτουργίες μεταβολισμό των λιπιδίων [22]. 25-υδροξυχοληστερόλης (25HC), το οποίο συντίθεται από τη χοληστερόλη από μία ειδική υδροξυλάση [23], δρα ως ισχυρός αναστολέας της βιοσύνθεσης χοληστερόλης σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [24]. 25HC ανιχνεύθηκε στο πλάσμα αρουραίου μετά την κατάποση ενός γεύματος πλούσιο σε οξυστερόλες και μετά από μια διαιτητική χοληστερόλη πρόκληση [25]. Ομοίως, τα επίπεδα οξυστερόλες, συμπεριλαμβανομένων 25HC, ήταν υψηλότερα σε υπερχοληστερολαιμικά ορού σε σύγκριση με εκείνα που βρέθηκαν σε ορθοχοληστεριναιμικά ορό [26]. Στη συνέχεια, οι ποντικοί με ανεπάρκεια του ενζύμου oxysterol-καταβολισμού oxysterol 7α-υδροξυλάσης (Cyp7b) έδειξε αυξημένες συγκεντρώσεις τόσο 25HC και 27HC, υποδηλώνοντας ένα ρυθμιστικό ρόλο που προκαλείται από Cyp7b επί αυτών των υδροξυλιωμένων παραγώγων χοληστερόλης [27].

ο παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι 25HC προκαλεί οιστρογονικές επιδράσεις ενεργοποίησης ΕΚα μεσολάβηση σηματοδότησης είτε σε κύτταρα του μαστού και των ωοθηκών ή σε καρδιομυοκύτταρα. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν επιβεβαιώθηκαν, τουλάχιστον εν μέρει, σε απομονωμένες διαποτισμένες καρδιές και αρουραίου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

17β-οιστραδιόλη (Ε2), 25-υδροξυχοληστερόλης (25HC), χλωριούχο κοβάλτιο (COCI

2), ΡΟ98059 (PD), SB202190 (SB) και ακτινομυκίνη D αγοράσθηκαν από την Sigma-Aldrich, Inc., Μιλάνο, Ιταλία. Τα πειράματα εκτελούνται χρησιμοποιώντας 25HC από την Sigma-Aldrich, Inc., Μιλάνο (Ιταλία) επιβεβαιώθηκαν με 25HC αγοράστηκαν από Research Plus, Inc., Barnegat, NJ. ICI 182,780 (ICI) λήφθηκε από Tocris Chemicals. Όλες οι ενώσεις διαλυτοποιήθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), εκτός και Ε2 PD, που διαλύθηκαν σε αιθανόλη.

Cell Culture,

Ο καρκίνος του μαστού MCF7 και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα Hek293 διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ με ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 10% FBS. Μαστού SKBR3 και ωοθηκών BG-1 καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI1640 και DMEM, αντίστοιχα, χωρίς ερυθρό φαινόλης συμπληρωμένο με 10% FBS. Η καρδιακών-όπως κυτταρική σειρά ποντικού HL-1 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. William C. Claycomb (Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Λουιζιάνα μέλος, Νέα Ορλεάνη, LA). HL-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με το δημοσιευμένο πρωτόκολλο [28] σε μέσο Claycomb (JRH Biosciences, Sigma-Aldrich, Inc., Μιλάνο, Ιταλία) συμπληρωμένο με 10% FBS (JRH Bioscience, Sigma-Aldrich, Inc., Μιλάνο, Ιταλία), 100 μg /ml πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη, 0.1 νορεπινεφρίνη (Sigma-Aldrich, Inc., Μιλάνο, Ιταλία) και 2mM

l

-γλουταμίνη (Invitrogen, Μιλάνο, Ιταλία). Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε ένα επωαστήρα 37 ° C με 5% CO

2. Για HL-1 κύτταρα υποξικά διέγερση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CoCl

2 ή καλλιεργήθηκαν παρουσία χαμηλής έντασης οξυγόνου (2% O

2) σε μία συσκευή επώασης HeraCell (ThermoScientific-Heraeus, Μιλάνο, Ιταλία). Όλες οι κυτταρικές σειρές να υποβληθούν σε επεξεργασία για ανοσοστύπωμα και προσδιορισμούς RT-PCR μεταφέρθηκαν σε μέσο χωρίς ορό και ερυθρό φαινόλης 24 ώρες πριν από τις κατεργασίες.

Οι επιμολύνσεις, δοκιμασίες λουσιφεράσης και πειράματα γονιδιακής σίγησης

Πλασμίδια και λουσιφεράσης οι δοκιμασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [29] – [32]. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιούνται φορείς έκφρασης που κωδικοποιεί την πλήρους μήκους Ετα και Ετβ τη φόρμα που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη 485 aa [29] – [32]. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 10 cm, διατηρούνται σε μέσο άνευ ορού για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνονται για επιπλέον 24 ώρες πριν από θεραπείες που χρησιμοποιούν Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Μιλάνο, Ιταλία) και κατάλληλων φορέων ελέγχου. Τα πλασμίδια SureSilencing ™ shRNA για ποντίκι HIF-1α και αντίστοιχα αρνητικά πλασμίδια ελέγχου (shRNA) αγοράστηκαν από SuperArray Bioscience Corporation (Frederick, MD, USA) και χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Cat. KM03799P). Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 10 cm, και στη συνέχεια επιμολύνονται σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες πριν από τις κατεργασίες με ένα μίγμα που περιέχει το αντιδραστήριο 15 μΐ /πλάκα Fugene6 και 5 μg /ελέγχου πλάκα shRNA ή shRNA HIF-1α (shHIF-1α) πλασμίδιο. Για HIF-1α σίγησης, ο κατασκευαστής παρέχει 4 ξεχωριστά μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) προσχεδιασμένες ακολουθίες για τον ίδιο γονίδιο, συσκευασμένα σε 4 ξεχωριστά πλασμίδιο ραχοκοκαλιές (αριθμημένη ως 1-4). Στα πειράματά μας, μια ενιαία ανεξάρτητη ακολουθία πλασμίδιο shRNA (Ν.3) ήταν αρκετή για να φιμώσουν τη γονιδιακή έκφραση του HIF-1α. Ο έλεγχος shRNA είναι μια ομελέτα τεχνητή αλληλουχία η οποία δεν ταιριάζει με κανένα ανθρώπινο γονίδιο, ποντίκι ή αρουραίο.

ΕΡα δοκιμασίες σύνδεσης

Η ικανότητα της 25HC να ανταγωνίζονται με [3Η] Ε2 ως προς τη δέσμευση Ετα αξιολογήθηκε είτε σε κύτταρα MCF7 ή χρησιμοποιώντας κυτταρολύματα Hek293 σε παρουσία ή απουσία δύο picomoles καθαρισμένης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ανθρώπινης ΕΚα αγοράστηκε από την PanVera, Invitrogen Srl Μιλάνο, Ιταλία. κύτταρα MCF7 απογυμνώθηκαν οποιασδήποτε οιστρογόνων, κρατώντας τους σε μέσο χωρίς ορό για 2 ημέρες, στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με 1ηΜ [2,4,6,7-3H] Ε2 (89 Ci /mmol? GE Healthcare, Μιλάνο, Ιταλία) και αυξανόμενες συγκεντρώσεις μη επισημασμένου Ε2 ή 25HC για 2 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα /5% CO2. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS /0.1% μεθυλοκυτταρίνη δύο φορές, συλλέχθηκαν με απόξεση και φυγοκέντρηση, και λύθηκαν με 100% αιθανόλη, 500 μΙ ανά τρυβλίο 60 mm, για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου [33]. Η ραδιενέργεια των εκχυλισμάτων μετρήθηκε με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού. Δοκιμασία σύνδεσης εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας λύματα ολόκληρων κυττάρων Hek293. Τα κύτταρα απογυμνωθεί από κάθε οιστρογόνου, κρατώντας τους σε μέσο χωρίς ορό για 2 ημέρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5? 100mM NaCl? 0,5% Nonidet Ρ-40? 0.5mM EDTA) σε παρουσία από ένα μείγμα αναστολέων πρωτεάσης που περιέχουν 1,7 mg /ml απρωτινίνη, 1 mg ml λευπεπτίνη, 200 mmol /λίτρο φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 200 mmol /λίτρο sodiumorthovanadate και 100 mmol /λίτρο φθοριούχο νάτριο /. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Bradford σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Sigma-Aldrich, Inc., Μιλάνο, Ιταλία). Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος ολικού πρωτεΐνη επωάστηκαν απουσία ή παρουσία δύο picomoles του ανασυνδυασμένου ΕΚα και επωάζονται με 1 ηΜ [3Η] Ε2 και αυξανόμενες συγκεντρώσεις μη επισημασμένου Ε2 ή 25HC για 2 ώρες στους 4 ° C. Bound και ελεύθερα ραδιοπροσδέματα διαχωρίστηκαν σε Sephadex G-25 PD-10 στήλες. Η ποσότητα του υποδοχέα δεσμευμένο [3Η] Ε2 προσδιορίστηκε με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) και Re-chip δοκιμασίες

κύτταρα MCF7 αναπτύχθηκαν σε τρυβλία 10 cm σε 70 -80% συρροή, μετατοπίζεται σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη και υπερηχήθηκε. Τα υπερκείμενα immunocleared με επεξεργασία με υπερήχους DNA σολωμού /πρωτεΐνης Α αγαρόζης (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, ΝΥ) και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-αντίσωμα ΕΚα ή μη ειδική IgG (Santa Cruz Biotechnology, DBA, Μιλάνο, Ιταλία). Τα σφαιρίδια πλύθηκαν, εκλούσθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα που αποτελείται από 1% SDS και 0,1 mol /L NaHCO3, και υπέστη πέψη με πρωτεϊνάση Κ DNA λήφθηκε με εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο και καταβυθίστηκε με αιθανόλη. Ένας όγκος 4 μΙ από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για να ενισχύσει μια περιοχή ERE περιέχουν βρίσκεται στον προαγωγέα pS2 με πραγματικού χρόνου PCR (Applied Biosystems, Μιλάνο, Ιταλία). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3 ‘(PS2 εμπρός) και 5′-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAGCG-3’ (PS2 αντίστροφο). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στην είσοδο για την ανοσοκαταβύθιση. Σε πειράματα Re-chip, σύμπλοκα εκλούστηκαν με επώαση επί 30 λεπτά σε ρυθμιστικό Re-ΠΕ (0,5 mM διθειοθρεϊτόλης, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl ρΗ 8,1, 150 mM NaCl) και υποβλήθηκε σε η διαδικασία ChIP, χρησιμοποιώντας αντι-SRC-1, SRC-3 και CBP αντισώματα (όλα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, DBA, Μιλάνο, Ιταλία).

η αντίστροφη μεταγραφή και PCR πραγματικού χρόνου

η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Για PS2, PR, καθεψίνη D, κυκλίνη Α, κυκλίνη D1, HIF-1α, CTGF, FAS, SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1 και τα ριβοσωμική πρωτεΐνη 18S, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου για να ληφθεί κανονικοποιημένες τιμές, οι εναρκτήρες ήταν: 5 «-GCCCCCCGTGAAAGAC-3 ‘(pS2 προς τα εμπρός) και 5′-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA-3′ (pS2 αντίστροφη)? 5’-GAGTTGTGAGAGCACTGGATGCT-3 ‘(προς τα εμπρός PR) και 5′-CAACTGTATGTCTTGACCTGGTGAA-3′ (αντίστροφης PR)? 5’-CTGGATCCACCACAAGTACAACA-3 ‘(Καθεψίνη D προς τα εμπρός) και 5′-CGAGCCATAGTGGATGTCAAAC-3′ (καθεψίνη D αντίστροφη)? 5’-TGCACCCCTTAAGGATCTTCCT-3 ‘(κυκλίνης Α προς τα εμπρός) και 5′-GTGAACGCAGGCTGTTTACTGT-3′ (κυκλίνης Α αντίστροφη)? 5’-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3 ‘(κυκλίνης D1 προς τα εμπρός) και 5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′ (κυκλίνης D1 αντίστροφη)? 5’-TGCATCTCCATCTTCTACCCAAGT-3 ‘(HIF-1α προς τα εμπρός) και 5′-CCGACTGTGAGTGCCACTGT-3′ (HIF-1α όπισθεν)? 5’-CATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCAT-3 ‘(CTGF προς τα εμπρός) και 5′-TGCAGCCAGAAAGCTCAAACT-3′ (CTGF αντίστροφη)? 5’-CGCTCGGCATGGCTATCT-3 ‘(FAS προς τα εμπρός) και 5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′ (FAS αντίστροφη)? 5’-CCCGGATCGTCTTTGAGAAG-3 ‘(SERPINF1 προς τα εμπρός) και 5′-TCCAGAGGTGCCACAAAGCT-3′ (SERPINF1 αντίστροφη)? 5’-CCGTGCCAGCCTATTTCAAT -3 ‘(HSPA1L προς τα εμπρός) και 5′-AGCAATCACACCTGCATCCTT-3′ (HSPA1L αντίστροφη)? 5’-GCAGCGCCATGAGATTGTG-3 ‘(SELENBP1 προς τα εμπρός) και 5′-CGGATCTCCAAGGGAATAAGC-3′ (SELENBP1 αντίστροφη), και 5’-GGCGTCCCCCAACTTCTTA-3 ‘(18S προς τα εμπρός) και 5′-GGGCATCACAGACCTGTTATT-3’ (18S αντίστροφη), αντίστοιχα .

ανοσοαποτύπωσης

κυτταρολύματα και δοκιμασίες ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Τα αντισώματα έναντι ΕΡα (F-10), η κυκλίνη D1 (Μ-20), CTGF (L-20), φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 (Ε-4) και ERK2 (C-14), β-ακτίνη (C-2) και β-τουμπουλίνης (H-235 – 2) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (DBA, Μιλάνο, Ιταλία). Ετβ και HIF-1α αγοράστηκαν από την R &? D Systems, Inc. (Μιλάνο, Ιταλία). Φωσφο-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) και p38MAPK αγοράσθηκαν από τη Cell σηματοδότηση Technology, Inc. (Μιλάνο, Ιταλία).

Δοκιμασίες

Πολλαπλασιασμός και TUNEL

Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί πολλαπλασιασμού έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],32]. HL-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου Lab-Tek® II 2-καλά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 18 ώρες. Μετά την απομάκρυνση μέσου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη παραφορμαλδεϋδη (ρΗ 7.4) για 30 λεπτά. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν δύο φορές σε PBS, ρΗ 7.4. Ένα

in situ

κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (αδιέξοδο ™, φθορομετρικής TUNEL System, Promega Corp, Μιλάνο, Ιταλία) στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την εκτέλεση του DNA 3′-υδροξυλίου τέλος επισήμανση από ΤΟΥΝΕΛ (τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης (TdT) – μεσολάβηση dUTP-X Nick End Επισήμανση) δοκιμασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Επισήμανση των κυττάρων δείχθηκε να συσχετίζεται με τυπικά μορφολογικά κριτήρια της απόπτωσης. DNA σημάνθηκε στο 3′-άκρα με φλουορεσκεΐνη-dUTP με επώαση στους 37 ° C με ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης που περιέχει TdT σε υγροποιημένο θάλαμο για 1 ώρα. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS, κατάτμηση DNA αποπτωτικών ανιχνεύτηκε άμεσα από την απεικόνιση των επισημασμένων DNA χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού. Για αρνητικό έλεγχο, slides επωάστηκαν χωρίς TdT? για να ληφθεί θετικός έλεγχος, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg DNAse Ι /ml για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν την έκθεση σε φθορεσκεΐνη dUTP και TdT.

Απομονωμένα και διαποτίστηκαν παρασκευάσματα καρδιά

εγκρίθηκαν Όλες πειραματικών πρωτοκόλλων από την επιτροπή για τη χρησιμοποίηση των ζώων του Τμήματος Φαρμακο-Βιολογίας στο Πανεπιστήμιο της Καλαβρίας (ID έγκρισης 110 /2000A). Οι διαδικασίες που ακολουθούνται στη μελέτη ήταν σύμφωνα με τα πρότυπα της Ευρωπαϊκής Κοινότητας σχετικά με τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων και με το

Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου κυκλοφόρησαν από τις ΗΠΑ Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH δημοσίευση Νο 85-23, αναθεωρήθηκε το 1996). Ενήλικοι αρσενικοί αρουραίοι (Wistar, 220-280g, Harlan, Udine, Ιταλία) αναισθητοποιήθηκαν με i.p. ένεση καρβαμικού αιθυλεστέρα (2 g /kg σωματικού βάρους). Οι καρδιές στη συνέχεια αποκόπηκαν και συνδέεται με μια συσκευή Langendorff δια έκχυση με ένα διάλυμα Krebs-Henseleit (KHS) που αποτελείται από (σε mM) ΝαΟΙ 113, ΚΟΙ 4.7, NaHCO3 25, MgSO4 1,2, CaCl2 1,8, ΚΗ2ΡΟ4 1,2, γλυκόζη 11, μαννιτόλη 1.1, Na-πυροσταφυλικό 5 και αεριζόμενο με 95% O

2-5% CO

2 (ρΗ 7,4, 37 ° C). KHS παραδόθηκε σε μια σταθερή ταχύτητα ροής 12 ml /min. Για τη μέτρηση της καρδιακής δραστηριότητας, ένα υδατο-μπαλόνι λάτεξ, που συνδέεται με έναν μετρητή BLPR (WRI, Inc. USA), εισήχθη μέσω της μιτροειδούς βαλβίδας στην αριστερή κοιλία για να επιτρέψει υπό σταθερό όγκο συστολές και να καταγράφει συνεχώς μηχανικών παραμέτρων. Το μπαλόνι προοδευτικά γεμάτη με νερό για να ληφθεί μία αρχική αριστερή κοιλιακή τελική διαστολική πίεση 5 έως 8 mmHg [35]. Όλες οι καρδιές διαποτίστηκαν για μία περίοδο εξισορρόπησης 15 λεπτών. Μετά την περίοδο εξισορρόπησης, οι καρδιές (η = 3) τυχαιοποιήθηκαν σε μία από τις ακόλουθες ομάδες: Ομάδα 1 (έλεγχος): ΚΗ διοχετεύεται αέριο με 95% O

2-5% CO

2? Ομάδα 2: KH αεριζόμενο με 95% O

2-5% CO

2 συν 1 ηΜ Ε2? Ομάδα 3: KH αεριζόμενο με 95% O

2-5% CO

2 συν 100ηΜ 25HC? Ομάδα 4: KH αερίζονται με 50% O

2-45% N

2-5% CO

2? Ομάδα 5: KH αερίζονται με 50% O

2-45% N

2-5% CO

2 συν 1 ηΜ Ε2? Ομάδα 6: KH αεριώθηκε με 50% O

2-45% Ν

2-5% CO

2 συν 100ηΜ 25HC

Όλες οι καρδιές διαχύθηκαν για 60 λεπτά για να διερευνηθεί το αποτέλεσμα. κάθε ένωσης και των διαφορετικών επιπέδων οξυγόνου για τις αλλαγές του CTGF και έκφρασης του mRNA HIF-1α. Διάλυμα που περιέχει θεραπείες ήταν φρεσκομαγειρεμένο πριν από τα πειράματα. Αριστερής κοιλιακής πίεσης, του καρδιακού ρυθμού και της ροής της στεφανιαίας παρακολουθήθηκαν καθ ‘όλη τη πρωτόκολλο έγχυσης. Στο τέλος των διαχύσεις, κοιλίες αποκόπηκαν και αμέσως σε επεξεργασία για εξαγωγή RNA.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας ANOVA που ακολουθείται από τη δοκιμή Newman-Keuls ‘για να προσδιορισθούν οι διαφορές σε μέσα. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

25HC ενεργοποιεί ΕΡα σε καρκινικά κύτταρα

Αρχίσαμε να αξιολογηθεί κατά πόσον 25HC είναι σε θέση να μετενεργοποιήσει ένα παροδικά επιμολυσμένα γονίδιο αναφοράς ER in. κύτταρα καρκίνου του μαστού (MCF7), τα οποία εκφράζουν ΕΚα και ΕΚβ όχι όπως κρίνεται με RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Είναι ενδιαφέρον, 25HC ενεργοποιείται ΕΡα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αν και με χαμηλότερη αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με Ε2 (Εικ. 1Α). Εμείς επόμενη αξιολογηθεί αν 25HC μπορούσε να ανταγωνίζεται τη μεταγραφική ενεργοποίηση που προκαλείται από Ε2. κύτταρα MCF7 μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή ταυτόχρονα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις τόσο 25HC και Ε2, ωστόσο τα μεταγραφικά αποκρίσεις ήταν παρόμοιες με εκείνες που λαμβάνονται χρησιμοποιούνται Ε2 μόνο του (Σχ. 1Α). Αντιθέτως, η δραστικότητα της λουσιφεράσης που επάγεται από 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC καταργήθηκαν χρησιμοποιώντας αυξανόμενες δόσεις της ICI ανταγωνιστή ER (Σχ. 1Β), προτείνοντας ότι ΕΚα μεσολαβεί στην μεταγραφική ενεργοποίηση κατά την έκθεση σε κάθε ένωση. Να παράσχει περαιτέρω στοιχεία σχετικά με την ικανότητα των 25HC να ενεργοποιήσετε ΕΡα και να αξιολογήσει κατά πόσον ΕΚβ θα μπορούσε επίσης να ανταποκρίνονται στην 25HC, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα ER-αρνητικά κύτταρα Hek293 με το γονίδιο αναφοράς ER μαζί με την κωδικοποίηση ΕΡα φορέα έκφρασης ή ΕΚβ. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μόνο ΕΡα έκφρασης επιτρέπεται 1 μΜ 25HC να επάγει την δραστηριότητα της λουσιφεράσης, η οποία καταργήθηκε με 10μΜ ICI (Εικ. 1Γ-Δ). Να παράσχει περαιτέρω στοιχεία σχετικά με την ικανότητα των 25HC να ενεργοποιήσετε ΕΡα αλλά δεν ΕΚβ, στραφήκαμε σε ένα εντελώς ετερόλογη συστήματος. Σε κύτταρα ΗΕΚ293 1 μΜ 25HC ενεργοποιείται μία χιμαιρική πρωτεΐνη που αποτελείται από τον τομέα δέσμευσης DNA (DBD) του παράγοντα μεταγραφής ζυμομύκητα Gal4 και η LBD του Ετα αλλά όχι ΕΚβ (Σχ. 1Ε-Ρ). Και πάλι, η τρανσενεργοποίηση του ΕΚα καταργήθηκε με 10μΜ ICI (Σχ. 1Ε-Ρ). Για να επιβεβαιωθούν τα προαναφερθέντα ευρήματα, διαπιστώσαμε πόσο 25HC θα μπορούσε να προκαλέσει την έκφραση των γονιδίων στόχων ΕΚβ SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1, οι οποίες αναφέρθηκαν να ανταποκριθούν στη θεραπεία Ε2 [36]. Χρησιμοποιώντας ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο έκφρασης ΕΚβ, η μεταγραφή αυτών των γονιδίων διεγείρεται από την Ε2 αλλά όχι από 25HC (Εικ. S1). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι 25HC ενεργοποιεί ΕΡα με εκλεκτικό τρόπο και δείχνουν ότι ΕΚα LBD-είναι επαρκής για τη μεταγραφική απόκριση.

(Α) κύτταρα MCF7 διαμολύνθηκαν με ένα γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης ER, μαζί με την εσωτερική έλεγχος επιμόλυνσης Renilla λουσιφεράσης και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (λογαριθμική κλίμακα) της Ε2 και 25HC. Επιπλέον, τα κύτταρα κατεργάστηκαν ταυτόχρονα με παρόμοιες δόσεις της κάθε ένωσης. Οι κανονικοποιημένες τιμές δραστικότητα λουσιφεράσης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με όχημα (-) καθορίστηκαν ως 1-πλάσια επαγωγή, πάνω στην οποία υπολογίστηκε η δραστικότητα που επάγεται από θεραπείες. κύτταρα (Β) MCF7 διαμολυσμένα με το γονίδιο ανταποκριτή ER υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC μόνο και σε συνδυασμό με την αύξηση της συγκέντρωσης του ανταγωνιστή ER ICI, όπως υποδεικνύεται. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. κύτταρα (C-F) Hek293 επιμολύνθηκαν με το γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης ER (EREluc) και Ετα (C) ή Ετβ (D) πλασμίδια έκφρασης, με Gal4 γονιδίου αναφοράς GK1 και τις πρωτεΐνες σύντηξης Gal4 που κωδικοποιεί την Ligand Binding Domain Name (LBD) του ΕΚα (GalERα) (Ε) ή Ετβ (GalERβ) (F) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC μόνο και σε συνδυασμό με ανταγωνιστή 10μΜ ER ICI, όπως υποδεικνύεται. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν.

Η

Με βάση τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε πειράματα επιμόλυνσης, ζητήσαμε αν 25HC θα μπορούσε να συμπεριφερθεί ως συνδέτη και να ανταγωνίζονται με Ε2 για την δέσμευση σε ΕΚα. Σε ένα προσδιορισμό δέσμευσης ολόκληρων κυττάρων με κύτταρα MCF7 25HC μετατοπίζεται το ραδιοεπισημασμένο Ε2 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α). Ομοίως, όταν ανασυνδυασμένη ΕΚα προστέθηκε σε ένα λύμα Hek293 κύτταρο, η οποία από μόνη δεν δεσμεύει Ε2, 25HC ανταγωνίστηκε αποτελεσματικά έναντι του ιχνηθέτη Ε2 (Σχ. 2Β-C). Τα αποτελέσματα αυτών των προσδιορισμών δέσμευσης είναι συμβατά με την ιδέα ότι 25HC δεσμεύει ΕΚα άμεσα, αλλά περαιτέρω πειράματα θα είναι απαραίτητο να καθοριστεί η λειτουργία της δράσης αδιαμφισβήτητα.

Τα γραφήματα δείχνουν υπολειμματική πρόσδεση του ραδιενεργού ιχνηθέτη με την παρουσία του αυξανόμενες συγκεντρώσεις μη σημασμένου Ε2 και 25HC σε κύτταρα MCF7 (Α), στα κυτταρολύματα Hek293 παρουσία (Β) ή απουσία ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ΕΚα (C). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από τρία ξεχωριστά πειράματα. Σημειώστε ότι η ποσότητα ιχνηθέτη που δεσμεύεται απουσία ανταγωνιστή χαρακτηρίστηκε αυθαιρέτως ορίζεται σε 100% και ότι οι υποκείμενες απόλυτες τιμές διαφέρουν μεταξύ των τριών πλαισίων.

Η

25HC επάγει την πρόσληψη ΕΚα προς την αλληλουχία προαγωγού pS2 σε MCF7 κύτταρα

με βάση τις προαναφερόμενες διαπιστώσεις, αξιολογήσαμε εάν 25HC θα μπορούσε να προκαλέσει την πρόσληψη Ετα σε στοχευμένες ΕΡΕ που περιέχουν DNA περιοχή εντός της ακολουθίας υποκινητή pS2. Την εκτέλεση μιας δοκιμασίας χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) κατά κύτταρα MCF7, 1 θεραπεία με 1 μΜ 25HC που προκαλείται από την πρόσληψη της Ετα στον υποκινητή pS2 όπως παρατηρείται χρησιμοποιώντας 10ηΜ Ε2 (Εικ. 3Α). Επιπλέον, για να εξακριβώσει αν 25HC μπορεί να προσλαμβάνει συν-ενεργοποιητών με τον υποκινητή pS2, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό Re-chip χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι SRC-1 και SRC-3, τα οποία ανήκουν στην στεροειδούς υποδοχέα συν-ενεργοποιητή (SRC) οικογένειες και κατά CBP ( πρωτεΐνη CREB δέσμευσης) [37]. Όλα τα συν-ενεργοποιητές είχαν προσληφθεί αποτελεσματικά με τον προαγωγό pS2 έκθεση των κυττάρων MCF7 προς 10ηΜ Ε2, ωστόσο 1μΜ 25HC έδειξαν μία μικρή αποτελεσματικότητα (Σχ. 3Α). Ως εκ τούτου, Ε2 και 25HC εμφανίσει μια διαφορετική ικανότητα στην πρόσληψη συν-ενεργοποιητών, που συμβάλλουν στην αγωνιστική δραστικότητα των υποκαταστατών.

(Α) Ε2 και 25HC επάγει την πρόσληψη της Ετα στην ιστοσελίδα της ΕΡΕ που βρίσκεται στον υποκινητή pS2 ακολουθία σε κύτταρα MCF7. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με όχημα, Ε2 (10 ηΜ) ή 25HC (1 μΜ) και υποβάλλονται στην διαδικασία της χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας αντι-ΕΡα ή μη ειδικής IgG αντι-αντισώματα. Για προσδιορισμούς Re-chip, αντι-SRC-1, SRC-3 και αντισώματα CBP χρησιμοποιήθηκαν. Οι ενισχυμένες αλληλουχίες αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. (Β-Ο) αξιολόγηση της έκφρασης του mRNA της pS2, υποδοχέας προγεστερόνης (PR), καθεψίνη D, κυκλίνη Α και κυκλίνη D1 με πραγματικού χρόνου PCR σε MCF7 και κύτταρα BG-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με 10 ηΜ Ε2 και 1 μΜ 25HC. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ομαλοποιήθηκαν για έκφραση 18S και εμφανίζονται ως φορές μεταβολής έκφρασης RNA σε σύγκριση με κύτταρα σε αγωγή με φορέα. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν. (•), (°), (▪), (□) (♦) δείχνουν

σ

& lt?. 0.05 για τα κύτταρα που έλαβαν όχημα (-) έναντι θεραπείες

Η

ρυθμίζει 25HC η έκφραση των γονιδίων στόχων ΕΚα σε κύτταρα MCF7 και BG-1

Αξιολογήσαμε επόμενο του δυναμικού των 25HC να ρυθμίζουν την έκφραση γνωστών γονιδίων στόχων ΕΚα, όπως pS2, PR, καθεψίνη D, κυκλίνη Α και κυκλίνη D1 σε MCF7 μαστού και BG-1 κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. Όπως προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου RT-PCR, 24 h έκθεση σε 1 μΜ 25HC επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του mRNA όλων των γονιδίων που εξετάστηκαν, παρόμοια με την αγωγή με 10 ηΜ Ε2 (Σχ. 3Β-C). Για περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων, ερευνήσαμε την ικανότητα των 25HC να ρυθμίζουν την έκφραση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΕΚα και Κυκλίνη D1 σε κύτταρα MCF7 και κύτταρα όγκου BG-1. Μέχρι σήμερα, η ρύθμιση προς τα κάτω των ΕΚα από τα οιστρογόνα έχει θεωρηθεί ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης του υποδοχέα [38], ενώ η προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1 από την Ε2 έχει εκτενώς αναφερθεί [39]. Συγκεκριμένα, μια 24 h έκθεση σε 1 μΜ 25HC κάτω ρυθμισμένα επίπεδα πρωτείνης ΕΚα (Εικ. 4Α-Β). Αντιθέτως, μια θεραπεία 24 ώρες με 1 μΜ 25HC επάνω ρυθμισμένη έκφραση πρωτεΐνης Κυκλίνη D1, το οποίο καταργήθηκε με 10μΜ ICI (Σχ. 4C-D). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι 25HC είναι σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων ΕΚα σαν Ε2.

ανοσοστυπώματα του ΕΚα (Α, Β) και Κυκλίνη D1 (C, D) από MCF7 και κύτταρα BG-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με όχημα (-), 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC και παρουσία 10 μΜ ER-ανταγωνιστής ICI, όπως υποδεικνύεται. β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. 25HC επάγει πολλαπλασιαστικές επιδράσεις σε MCF7 και κύτταρα BG-1 (Ε-Η). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή επί 5 ημέρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (λογαριθμική κλίμακα) της Ε2 και 25HC και μετρήθηκαν την ημέρα 6 (Ε, Ζ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC και σε συνδυασμό με 10 μΜ ER-ανταγωνιστής ICI και μετρήθηκαν την ημέρα 6 (F, Η). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που λαμβάνουν οχήματος ορίστηκε ως 100% επί της οποίας υπολογίσθηκε ανάπτυξη των κυττάρων που προκαλείται από θεραπείες. Κάθε σημείο δεδομένων είναι ο μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (•), (°) δείχνουν

σ

& lt?. 0.05 για τα κύτταρα που έλαβαν όχημα (-) έναντι θεραπείες

Η

25HC προκαλεί πολλαπλασιαστικές επιδράσεις στην MCF7 και κύτταρα BG-1

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να αξιολογηθεί η βιολογική ομόλογό του τις προαναφερθείσες επιδράσεις που ασκούνται από 25HC. δοκιμασίες ανάπτυξης εκτελούνται σε MCF7 και BG-1 καρκινικών κυττάρων έδειξαν ότι 25HC είναι ικανή να διεγείρει πολλαπλασιαστική δράση κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο (Σχ. 4Ε και 4G). Στη συνέχεια, οι αποκρίσεις ανάπτυξης σε 10ηΜ Ε2 και 1 μΜ 25HC καταργήθηκαν με 10μΜ ICI (Σχ. 4F και 4Η), γεγονός που υποδηλώνει ότι ΕΚα μεσολαβεί πολλαπλασιασμός κυττάρων που προκαλείται κατά την έκθεση σε αμφότερες τις ενώσεις.

μιμείται 25HC τα αποτελέσματα της Ε2 έναντι υποξία-επαγόμενη απόπτωση σε καρδιομυοκύτταρα

για να αξιολογήσει περαιτέρω τις οιστρογονική ιδιότητες των 25HC, στραφήκαμε σε ένα εντελώς διαφορετικό πρότυπο σύστημα, όπως τα HL-1 καρδιομυοκύτταρα [28], οι οποίες εκφράζουν ΕΡα και πολύ χαμηλά επίπεδα Ετβ όπως κρίνεται από RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Έχει αναφερθεί ότι Ε2 προστατεύει τα κύτταρα από υποξία σε διαφορετικά πλαίσια κυττάρου [40] – [42]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε εάν Ε2 και 25HC θα μπορούσε να προστατεύσει HL-1 καρδιομυοκύτταρα από την απόπτωση που επάγεται από το γνωστό υποξία-μιμητικός παράγων CoCl

2 [43] – [44]. Προσδιορισμός αποδόμηση του DNA με τη δοκιμασία TUNEL, περίπου 70% των κυττάρων HL-1 είχε σαν αποτέλεσμα θετικό για χρώση TUNEL μετά από έκθεση σε CoCl

2 (Εικ. 5 και Σχ. S2). Αξίζει να σημειωθεί ότι το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε παρουσία είτε 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC (Εικ. 5 και Σχ. S2). Τα προστατευτικά αποτελέσματα που ασκείται από τις δύο ενώσεις καταργηθεί χρησιμοποιώντας 10μΜ ICI, η οποία από μόνη της δεν επήγαγε απόπτωση (Σχ. 5 και Σχ. S2). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται υποδεικνύουν ότι Ε2 και 25HC μπορεί να προστατεύσει καρδιομυοκύτταρα από υποξία-επαγόμενη απόπτωση σε ένα ER-εξαρτώμενο τρόπο.

Τα αποπτωτικά αλλαγές ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας TUNEL (σε πράσινο) και οι πυρήνες βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο ( ΡΙ, σε κόκκινο), όπως υποδεικνύεται. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες μετά από θεραπεία 18 ώρες με όχημα και 100 μΜ CoCl2, 10ηΜ Ε2, 1 μΜ 25HC μόνος, ή σε συνδυασμό των 100μΜ CoCl2 με 10ηΜ Ε2 παρουσία ή απουσία 10 μΜ ICI, 100μΜ CoCl2 με 1 μΜ 25HC σε παρουσία ή απουσία 10 μΜ ICI.

Ε2 και 25HC αποτρέψει την υποξία-επαγόμενη έκφραση του HIF-1α και CTGF σε καρδιομυοκύτταρα

έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι HIF-1α μεσολαβεί έκφραση CTGF διεγείρεται από την υποξία σε διαφορετικά πλαίσια κυττάρου [ ,,,0],45] – [47]. Ενώ το δυναμικό ρύθμιση της HIF-1α με Ε2 έχει προταθεί σε ορισμένα μοντέλα [48] – [49], η ικανότητα των οιστρογόνων να επηρεάζουν την υποξία έκφραση που προκαλείται από CTGF στο καρδιαγγειακό σύστημα παραμένει να διερευνηθεί. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, διαπιστώσαμε ότι HIF-1α και CTGF είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω και στα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο από 100 μΜ CoCl

2 σε HL-1 κύτταρα (Σχ. 6Α, C) . Παρόμοιες αποκρίσεις παρατηρήθηκαν επώαση HL-1 κύτταρα σε παρουσία χαμηλής έντασης οξυγόνου (2% O

2) (Εικ. 6Β, D). Στη συνέχεια, η υποξία-επαγόμενη έκφραση του HIF-1α και CTGF καταργήθηκε με τη χρήση του αναστολέα της σύνθεσης RNA DNA-γεμάτοι ακτινομυκίνη D (Σχ. S3), γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταγραφική μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για την αυξητική ρύθμιση τόσο της HIF-1α και CTGF . Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε ότι η αποσιώπηση του HIF-1α καταργεί την επαγωγή του CTGF παρατηρούνται είτε κατά την έκθεση σε CoCl

2 ή υποξικές συνθήκες (2% O

2) (Σχ. 6Ε-F), υποδεικνύοντας ότι HIF-1α μεσολαβεί η αυξητική ρύθμιση του CTGF από υποξία σε κύτταρα HL-1. Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν Ε2 και 25HC θα μπορούσε να επηρεάσει HIF-1α και την έκφραση του CTGF. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι είτε 10 ηΜ Ε2 ή 1 μΜ 25HC εμποδίζει την προς τα πάνω ρύθμιση του HIF-1α και CTGF είτε με CoCl

2 ή χαμηλή τάση οξυγόνου (2% O

2) τόσο σε mRNA (σχ. S4) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχ. 7Α-Β). Ωστόσο, αυτή η ικανότητα των Ε2 και 25HC καταργήθηκε χρησιμοποιώντας 10μΜ ICI (Σχ. 7Α-Β και Εικ. S4), γεγονός που υποδηλώνει ότι η δράση των δύο ενώσεων περιλαμβάνει ένα μηχανισμό ER-μεσολάβηση.