Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου. Με την κλωνοποίηση και αλληλούχιση του HPV16

+ CaSki κυττάρων μικρή βιβλιοθήκη RNA, απομονώσαμε 174 miRNAs (συμπεριλαμβανομένου του μυθιστορήματος miR-193C), τα οποία θα μπορούσαν να ομαδοποιηθούν σε 46 διαφορετικά είδη miRNA, με miR-21, miR-24, ΜΙΚ 27α, και miR-205 είναι πιο άφθονα. Επιλέξαμε για περαιτέρω μελέτη 10 miRNAs ανάλογα με τη συχνότητα κλωνοποίησης τους και τα αντίστοιχα επίπεδα τους σε 10 αυχενική καρκινογόνες ή τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας που προέρχεται από κυτταρικές σειρές. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης τους με την παρουσία ή απουσία ενός ολοκληρωμένου ή επισωμικό γονιδιώματος HPV. Όλες οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν δεν περιείχε ανιχνεύσιμη miR-143 και miR-145. HPV λοίμωξη από κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν ένα διαφορετικό σύνολο των miRNAs όταν καλλιεργείται σε οργανοτυπική σχεδία καλλιεργήθηκαν σε σύγκριση με μονοστρωματική καλλιέργεια κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων έκφραση του miR-143 και miR-145. Αυτό υποδηλώνει μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs και τη διαφοροποίηση των ιστών. Χρησιμοποιώντας συστοιχία miRNA αναλύσεις για ίδιας ηλικίας κανονική του τραχήλου της μήτρας και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς, σε συνδυασμό με την επαλήθευση κηλίδα βόρεια, εντοπίσαμε σημαντικά απελευθερωμένη miRNAs στην αυχενική καρκινικούς ιστούς, με miR-126, miR-143 και miR-145 προς τα κάτω ρύθμιση και miR-15b , miR-16, miR-146a και miR-155 προς τα πάνω ρύθμιση. Λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι τόσο το miR-143 και miR-145 είναι κατασταλτική στην κυτταρική ανάπτυξη. Όταν εισάγεται εντός κυτταρικών γραμμών, miR-146a βρέθηκε να προάγει πολλαπλασιασμό κυττάρου. Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των miR-143 και miR-145 και προς τα πάνω ρύθμιση του miR-146a παίζουν ρόλο στην καρκινογένεση του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Wang Χ, Tang S, Le SY, Lu R, Rader JS , Meyers C, et al. (2008) ανώμαλη έκφραση των ογκογόνων και Όγκου-Κατασταλτικός Τα microRNAs στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 3 (7): e2557. doi: 10.1371 /journal.pone.0002557

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 10 Απρ 2008? Αποδεκτές: 13η Μάη 2008? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλη του 2008

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο έρευνας για τον Καρκίνο και με επιχορηγήσεις NIH CA 94141 και CA 95713to JSR και CA 79006 για να CM

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο, με εκτιμώμενη παγκόσμια επίπτωση των 470.000 νέες περιπτώσεις και περίπου 233.000 θανάτους ετησίως [1], [2]. Ο καρκίνος του τραχήλου είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε πολλές χώρες χαμηλού πόρων, όπου εκτεταμένη προβολή από εξέταση τραχηλικής βλέννας δεν είναι διαθέσιμη. Η συχνότητα είναι χαμηλότερη στις ανεπτυγμένες χώρες ως συνέπεια της του τραχήλου της μήτρας και των εν εξελίξει ενεργά προγράμματα αγωγής υγείας. Του τραχήλου της μήτρας τα ποσοστά καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες εκτιμάται ως 10.370 νέα κρούσματα και 3.710 θάνατοι το 2006 [3]. Η αιτιώδης σχέση μεταξύ του HPV υψηλού κινδύνου (HR-HPV) και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έχει τεκμηριωθεί καλά σε επιδημιολογικές και λειτουργικές μελέτες. HPVs υψηλού κινδύνου, όπως HPV16, HPV18, HPV31 και, έχουν ανιχνευθεί σε μέχρι και 99,7% του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα πλακωδών κυττάρων και 94% -100% του τραχήλου της μήτρας και αδενο- αδενοχοληδωτό καρκινώματα [4], [5]. Οι HPV ογκοπρωτεΐνες υψηλού κινδύνου, Ε6 και Ε7, συμβάλλουν στην αυχενική καρκινογένεση αδρανοποιώντας τον κυτταρικό ογκοκατασταλτικό πρωτεϊνών p53 και pRb, αντίστοιχα [6] – [8].

miRNAs ρυθμιστικά, μη-κωδικοποίησης RNAs περίπου τα 21-23 νουκλεοτίδια σε μήκος και που εκφράζονται σε συγκεκριμένα στάδια της ανάπτυξης ιστού ή κυτταρική διαφοροποίηση, και έχουν επιπτώσεις μεγάλης κλίμακας για την έκφραση μιας ποικιλίας γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Μέσω ζευγαρώματος βάσεων με στοχευμένες mRNAs του, ένα miRNA προκαλεί υποβάθμιση του RNA ή καταστολή της μετάφρασης των στοχοθετημένων μεταγραφές [9], [10]. Τα κυψελοειδή miRNAs μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ, εφόσον, ανώτατο όριο, πολυαδενυλιωμένο πρωτογενή miRNA (PRI-miRNA) μεταγραφές που φέρει μια δομή φουρκέτας στελέχους-βρόχου των -80-ων [11]. Ώριμη miRNAs προκύπτουν από την επεξεργασία των pri-miRNAs σε δύο διαδοχικά στάδια διάσπασης που διαμεσολαβείται από δύο ένζυμα RNase III, Drosha και Dicer [12]. Drosha, σε συγκρότημα με DGCR8, διασπά το PRI-miRNA σε μια καθορισμένη απόσταση (περίπου 11 bp) από το στέλεχος-μονόκλωνου RNA διασταύρωση στον πυρήνα για να δώσει ένα προ-miRNA μιας φουρκέτας -60-nt με 2-nt 3 ‘προεξοχή [13], [14]. Μετά την προ-miRNA εξάγεται στο κυτταρόπλασμα από exportin 5 [15], [16], είναι τότε αναγνωρίζεται από Dicer, σε συγκρότημα με dsRBD περιέχουν συνεργάτη πρωτεΐνη του ιού HIV-1 TAR RNA-δεσμευτικές (TRBP) [17], για να αφαιρέσετε το τερματικό βρόχο, αφήνοντας ένα δεύτερο 2-nt 3 ‘προεξοχή [18]. Οι προκύπτουσες 21- έως 23-nt προϊόντα miRNA περιέχουν προεξοχή ενός 2-nt 3 ‘σε κάθε σκέλος και να ενεργούν ως τα λειτουργικά ενδιάμεσα της RNAi ότι η άμεση διάσπαση του mRNA και της μεταφράσεως εξασθένηση. Αν και βιολογικές λειτουργίες τους παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι miRNAs συμβάλλουν στην ανάπτυξη διαφόρων καρκίνων [19] και η λειτουργία θα μπορούσε ως ένα σημαντικό συστατικό της φυσικής άμυνας του κυττάρου έναντι ιικής μόλυνσης [20] – [22]. Έχει προταθεί ότι ένα μοναδικό προφίλ έκφρασης miRNA για ένα συγκεκριμένο καρκίνο θα είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για τη διάγνωση του καρκίνου [23] και την πρόγνωση [24]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε διάφορες προσεγγίσεις για προφίλ έκφρασης miRNA από καρκίνο του τραχήλου καρκινικούς ιστούς και καρκίνος του τραχήλου της μήτρας που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές, καθώς και από HPV λοίμωξη από κολπική κερατινοκυττάρων. Έχουμε αποδείξει ότι ένα υποσύνολο των miRNAs είναι σημαντικά απορυθμίζεται σε καρκίνους του τραχήλου και προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις.

Αποτελέσματα

miRNA προφίλ έκφρασης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Για να διερευνηθεί η έκφραση προφίλ των miRNAs στην τραχηλική καρκινικά κύτταρα, απομονώσαμε το συνολικό κυτταρικό RNA από κύτταρα του τραχήλου που λαμβάνεται από καρκίνο CaSki C-2, τα οποία περιέχουν -500 αντίγραφα του γονιδιώματος HPV16 ανά κύτταρο. Τα κλασματωμένα RNAs με μεγέθη 15-30 nts κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν με βάση ένα δημοσιευμένο πρωτόκολλο [25]. Συνολικά, έχουμε κλωνοποιημένα συνολικά 174 miRNAs από 363 κλώνους cDNA που κατηγοριοποιούνται σε 46 διαφορετικά είδη miRNA (Πίνακας 1), με miR-21, miR-24, miR-27a, και miR-205 είναι πιο άφθονα. Αριθ HPV16 προερχόμενο miRNA κλωνοποιήθηκε σε αυτήν την διαλογή, όλα τα miRNAs ήταν κυτταρική. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ορισμένα αντίγραφα του το κλωνοποιημένο miR-21 και miR-205 είχε ετερογενείς 3 ‘άκρα, με ένα επιπλέον νουκλεοτίδιο C στο 3’ άκρο του 68% των miR-21 αντίγραφα και ένα επιπλέον U στο 3 ‘ άκρο του 33% των miR-205 αντίγραφα, πιθανώς προέρχεται από ταλάντευσης πέψη του προ-miRNAs με Dicer (Εικ. 1). Επιπλέον, ένα νέο υποείδος του miR-193, miR-193C (αριθμός πρόσβασης GenBank: EF100863), εντοπίστηκε τρεις φορές από τον έλεγχο και πιστοποιήθηκε με κηλίδωση Northern. Τα υποείδη miR-193C διαφέρει από miR-193b κατά ένα νουκλεοτίδιο στη θέση nt 21 και από την έλλειψη των τριών ΗΠΑ στο 3 ‘άκρο (miR-193b, 5′-aacuggcccucaaagucccgcuuu-3′? MiR-193C, 5’-aacuggcccucaaagucccga -3 ‘). Το προφίλ έκφρασης του πρόσφατα εντοπιστεί miR-193C το οποίο είναι 3-nt μικρότερο από miR-193b ήταν παρόμοια με εκείνη του miR-21 σε κύτταρα HeLa και 293 κύτταρα, αλλά λιγότερο άφθονο από miR-27a. HeLa και 293 κύτταρα που παράγονται ανιχνεύσιμη miR-205 ως διπλή, όπως φαίνεται στα κύτταρα CaSki (Εικ. 2Α).

Τα βέλη πάνω από την προ-miRNA δείχνουν ταλάντευση-πέψη sites στο προ-miR-21 στο Α και προ-miR-205 σε Β, που παράγει προϊόντα με επιπλέον νουκλεοτίδια στο άκρο 3 ‘. Οι αλληλουχίες που παρουσιάζονται στο κόκκινο αντιστοιχούν σε ώριμο miRNA, ενώ αυτό που φαίνεται στο μαύρο είναι το τμήμα της προ-miRNA που αφαιρείται κατά την επεξεργασία.

Η

Α. έκφραση του miR-193C στην CaSki, HeLa και 293 κύτταρα. CaSki και υποκλώνοι του κύτταρα C-2, C-V και [72] συγκρίθηκαν με HeLa (HPV18

+) και κύτταρα 293 (HPV

-) για έκφραση του miR-193C με κηλίδωση Northern. Ολικό RNA (30 μg) από CaSki, HeLa, και κύτταρα 293 διαχωρίζεται σε ένα αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 15%, στυπώθηκε σε μεμβράνη Gene Screen-Plus, και έπειτα ανιχνεύθηκαν χωριστά με μια αίσθηση (ες) ή αντιπληροφοριακό (ως) miR -193c καθετήρα. Ακολούθως, η μεμβράνη επανελέγχθηκε με αντινόημα διερευνητές για miR-21, miR-27a, miR-205, ή U6, αντίστοιχα. έκφραση Β miRNA σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που προέρχονται από κυτταρικές σειρές. Σύνολο κύτταρο RNA (30 μg) εκχυλίστηκε από διάφορες κυτταρικές σειρές, με ή χωρίς λοίμωξη από HPV. Κηλίδωση Northern χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει την έκφραση του 10 miRNAs από κυτταρικές γραμμές οκτώ καρκίνο, δύο W12 υποκλώνοι κυττάρων, τα κύτταρα HaCaT, φυσιολογικού τράχηλου και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς (Ambion). Γ Ελάττωση του miR-143 στην αυχενική καρκινικούς ιστούς. Ολικά RNAs από δύο ζεύγη κανονικής (ΝΤ) τραχήλου vs καρκίνου του τραχήλου (Ca) ιστούς από κλινικά δείγματα και ένα ζεύγος φυσιολογικού τράχηλου και του καρκίνου του τραχήλου που αγοράστηκαν από Ambion συγκρίθηκαν για την έκφραση του miR-143 με κηλίδωση Northern. U6 επίσης κηλιδώθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για τη φόρτωση του δείγματος στο πάνελ Α, Β και C.

Η

Με βάση αυτά τα αποτελέσματα κλωνοποίησης, μπορούμε περαιτέρω διαλογή αρκετές διαθέσιμες τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές, με ή χωρίς HPV λοίμωξη με κηλίδωση Northern για την έκφραση της 8ης miRNAs με σχετικά υψηλή συχνότητα κλωνοποίηση και 2 miRNAs (mIR-143 και miR-145), το οποίο δεν απομονώθηκαν σε κλωνοποίηση μας (Πίνακας 1). Οκτώ τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές? δύο απομονώσεις του W12 κυτταρική γραμμή (20,861 με ενσωματωμένο γονιδιώματα HPV16 και 20.863 με γονιδιώματα επισωματική HPV16) αρχικά απομονώθηκε από μια τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) βιοψία ιστούς [26] και τα κύτταρα HaCaT (μια αθανατοποιημένη HPV-αρνητική γραμμή κερατινοκυττάρων δέρματος) [27 ] εξετάστηκαν για την έκφραση των 10 miRNAs. Ένα αντιστοιχισμένο σύνολο RNAs από καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και του τραχήλου της μήτρας παρακείμενων ιστών κανονική εμπορικώς λαμβάνονται από Ambion συγκρίθηκαν επίσης. Όλες οι κυτταρικές σειρές και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς έδειξε ένα παρόμοιο προφίλ έκφρασης των miRNAs. Αυτό το προφίλ miRNA διέφερε από την κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς με μειωμένη έκφραση του miR-27a, miR-143 και miR-145 (Εικ. 2Β). Σε αντίθεση, το τραχηλικό καρκινικό ιστό και οι κυτταρικές σειρές, εκτός SiHa (HPV16

+), HeLa (HPV18

+), και τα κύτταρα C33A (HPV

-), είχαν αυξημένη έκφραση του miR-205, όταν σε σύγκριση με το φυσιολογικό τραχηλικό ιστό (Εικ. 2Β). SiHa, HeLa και κύτταρα C33A δεν έχουν καμία έκφραση του miR-205. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές, η έκφραση του miR-143 και -145 ήταν μικρότερη από ό, τι παρατηρήθηκε στον ιστό καρκίνου του τραχήλου. Παρά την παρουσία κάποιων διαφορές στην έκφραση των ατομικών miRNA από μια κυτταρική γραμμή στην άλλη, ήμασταν σε θέση να καθορίσετε ένα προφίλ έκφρασης αυτών ανιχνεύονται miRNAs σε συσχετισμό με την παρουσία ολοκληρωμένων ή επισωματικά γονιδιώματα HPV. Η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-143, το οποίο προέρχεται από το ίδιο πρόδρομο miRNA του miR-145 [28], επιβεβαιώθηκε περαιτέρω να είναι ειδική για τον καρκίνο με σύγκριση της έκφρασής του σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς σε κανονική τράχηλο (Σχ. 2C).

miRNA προφίλ έκφρασης σε φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας

από προσέγγιση κλωνοποίησης μας έχει έναν περιορισμό στην απομόνωση της χαμηλής άφθονη miRNAs και βόρεια κηλίδωση περιορίζεται από τον ανιχνευτή που επιλέγεται, οι δύο μέθοδοι μπορεί να μην είναι η καλύτερα να διακρίνει τη διαφορά από μία κυτταρική σειρά στην άλλη σε προφίλ έκφρασης miRNA. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς, συλλέξαμε πέντε ζεύγη των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του τραχήλου της μήτρας ίδιας ηλικίας και σε σύγκριση με τα προφίλ τους έκφραση, χρησιμοποιώντας μια ανάλυση της σειράς των miRNAs που περιέχει 455 miRNAs. Μόνο τέσσερα ζευγάρια δείγμα προκρίθηκε στην τελική ανάλυση ομαδοποίησης, όπως καθορίζεται από τις αναλύσεις της συνέπειας του δείγματος. Μια ανάλυση αφθονία έκφραση, με βάση την πυκνότητα του σήματος ≥20,000, έδειξε ότι και οι δύο φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του τραχήλου της μήτρας είχαν άφθονη έκφραση του miR-23a, miR-23b, ας-7α, ας-7c, και αφήστε-7δ, ενώ υψηλή έκφραση του miR-26a, miR-29a, miR-99a, miR-100, miR-125b, miR-143, miR-145, miR195 και miR-199α παρατηρήθηκε μόνο στην κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς, και υψηλή έκφραση του miR-16, miR-21, miR-205, και αφήστε-7f παρατηρήθηκε μόνο σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς, παρά το ότι τα σχετικά χαμηλά επίπεδα της miR-16 και miR-21 είχαν παρατηρήσει από έναν ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων σε ορισμένες κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Β). Η έκφραση του miR-143 και miR-145 έδειξε περισσότερο από 2,7 φορές μείωση στην αυχενική καρκινικούς ιστούς. Χρησιμοποιώντας ανάλυση συσταδοποίησης, παρατηρήσαμε μια σημαντική αυξημένη έκφραση του 18 miRNAs στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και 15 miRNAs σε φυσιολογικό τράχηλο (Ρ & lt? 0,05, t-test) (σχήμα 3Α, miRNAs σε κόκκινο χρώμα.). Για επαλήθευση, ένα σύνολο επιλεγμένων ανιχνευτών miRNA χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει μια ανάλυση κηλίδος Northern για δύο κανονικές και δύο δείγματα καρκίνου. Ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει ότι οι ιστοί του καρκίνου είχαν μειωμένη έκφραση του miR-126 και miR-424, και αυξημένη έκφραση του miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155 και miR-223 (Σχ. 3Β και 3C), μετά ατομικό επίπεδο miRNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε ποσοτικά και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση U6.

Ολικό RNA (5 μ§) που απομονώθηκε από φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς αντίστοιχης ηλικίας (ΝΤ) και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς (Ca) αναλύθηκαν με ανάλυση συστοιχία miRNA. Ο ιστός καρκίνος 1, 3, και 5 μολύνθηκαν με HPV16 και ο ιστός του καρκίνου 4 μολύνθηκε με HPV45. A. Ένα γράφημα ομαδοποίηση δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας μια ιεραρχική μέθοδο από τις miRNAs με πυκνότητα σήμα πάνω από 1000 και δείχνει αυξημένη (κόκκινο) ή μειωμένη (πράσινο) έκφραση (P & lt? 0,05) των επιμέρους miRNA από 4 ηλικίας κανονικά και καρκινικά του τραχήλου της μήτρας ιστούς (Πίνακας S1). Η επικεφαλίδα της στήλης δείχνει επιμέρους δείγμα κώδικα στην δοκιμασία. Κάθε σειρά παρουσιάζει το πρότυπο έκφρασης των ατομικών miRNA ως αναλογία έκφρασης log2 μετασχηματισμένη, με την πιο στενή σχέση της έκφρασης ενώνονται από ένα κλαδί και συγκεντρωμένα κατά μέσο όρο που συνδέονται με τον αλγόριθμο. μήκη υποκατάστημα αντανακλούν βαθμούς ομοιότητας μεταξύ των προτύπων έκφρασης των miRNAs. χρωματική κλίμακα στην κορυφή του πίνακα αντιπροσωπεύει το βαθμό της έκφρασης βασίζεται σε μια βαθμονομημένη αναλογία. Το πράσινο υποδεικνύει χαμηλότερη έκφραση σε σύγκριση με τη μέση τιμή (μηδέν), το μαύρο υποδεικνύει έκφραση ίση με την μέση τιμή, και το κόκκινο υποδεικνύει υψηλότερη έκφραση σε σύγκριση με το μέσο όρο. B. Επαλήθευση των miRNA προφίλ έκφρασης με κηλίδωση Northern. Σύνολο κύτταρο RNA (30 μg) απομονώνεται από κάθε ιστό επεσημάνθη με επιμέρους αντινοηματικό ολίγο σε κάθε υποδεικνύεται miRNA. Μια πρόσθετη μπάντα σε κάθε κηλίδα δείχνει μια ταλάντωση προϊόν από την πέψη Dicer. Γ Bar γραφήματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα των εξεταζόμενων miRNAs ρυθμίζεται σύμφωνα με U6 RNA σε κάθε ιστό στον πίνακα Β

Η

miRNA προφίλ έκφρασης σε HPV-μολυσμένα, κερατινοκύτταρα που προέρχονται από ιστούς σχεδία

για να διερευνήσουν κατά πόσον οι παρατηρούμενες υπογραφές miRNA στην αυχενική καρκινικούς ιστούς είναι ειδικά για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, εξετάσαμε την έκφραση miRNA σε προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις. Η έλλειψη των συμβατικών καλλιεργειών κυττάρων για τον HPV πολλαπλασιασμού έχει περιοριστεί σε μεγάλο βαθμό η κατανόηση του κύκλου ζωής του HPV και την παθογένεση. Ωστόσο, οι μολυσματικές HPVs έχουν παραχθεί επιτυχώς από σχεδία καλλιέργειες που προέρχονται από ανθρώπινα κερατινοκύτταρα [29], [30] και την επαγωγή του προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις σε σχεδία ιστούς με λοίμωξη HPV με τη μορφολογία παρόμοια με εκείνη της τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας [31] καθιστά αυτό σύστημα μεγάλο πλεονέκτημα για τις μελέτες μας. Χρησιμοποιώντας σειρά miRNA αναλύσεις, συγκρίναμε τα προφίλ έκφρασης των 455 ανθρώπινα miRNAs σε HPV18 μολυσμένα πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του κόλπου (HVKs) σε καλλιέργειες μονοστιβάδας και στρωματοποιημένη και διαφοροποιημένη ιστούς σχεδία. Μια ανάλυση αφθονία έκφρασης, που βασίζεται σε μια πυκνότητα σήμα ≥20,000, έδειξε ότι το miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26a, miR-205, αφήστε-7c, και αφήστε-7Ρ εκφράζεται σε αφθονία HVKs τόσο σε μονοστρωματική κουλτούρες και πολιτισμούς σχεδία. Τρεις miRNAs άφθονα εκφράζεται μόνο σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας (miR-24, miR-29a, και miR-221) και 11 miRNAs εκφράζεται σε αφθονία μόνο στα στρωματοποιημένη και διαφοροποιημένη πολιτισμών σχεδία (miR-27a, miR-27b, miR-200b, ΜΙΚ 200c, miR-203, miR-638, αφήστε-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7δ, αφήστε-7ε, και αφήστε-7g). Χρησιμοποιώντας ανάλυση συσταδοποίησης, διαπιστώσαμε ότι 16 miRNAs ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω (Σχ. 4Α, σχεδία σε κόκκινο) και 25 miRNAs ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (Σχ. 4Α, σχεδία σε πράσινο) στις καλλιέργειες σχεδία σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης στο αντίστοιχο μονοστιβάδα καλλιέργειες (Ρ & lt? 0,05, t-test). Για την επιβεβαίωση των παρατηρήσεων, οι ζευγαρωμένα δείγματα αναλύθηκαν για έκφραση miRNA με κηλίδωση Northern χρησιμοποιώντας ένα σύνολο ειδικών ανιχνευτών miRNA (Σχ. 4Β και 4C). Η ποσοτικοποίηση του κάθε επιπέδου miRNA σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε προς έκφραση U6. Επιβεβαιώσαμε ότι η έκφραση του miR-26b, miR-195 και miR-200c αυξήθηκε στις καλλιέργειες σχεδία, αλλά η έκφραση του miR-143 και miR-145 μειώθηκε (Σχ. 4Β και 4Γ). Η αυξημένη αφθονία του miR-200c δείχνει 67% περισσότερα έκφραση σε σχεδίες από ό, τι σε μονοστιβάδες (P & lt? 0,08) από την ανάλυση της σειράς πιστοποιήθηκε με κηλίδωση Northern. Αν και παρατηρήθηκαν αυξητική ρύθμιση του miR-15a και miR-223 και προς τα κάτω ρύθμιση του miR-218 και miR-424 τόσο στα σχεδίες (προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις) και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς, η πλειονότητα των υπογραφών έκφρασης miRNA δεν έδειξε συσχέτιση μεταξύ της δύο ιστοί (σύγκρινε Σχ. 4Α στο Σχ. 3Α). Ωστόσο, προς τα κάτω ρύθμιση miR-146a παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες σχεδία όχι την προς τα πάνω ρύθμιση φαίνεται στην αυχενική καρκινικούς ιστούς και περαιτέρω επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Northern (Εικ. 5), υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση προς τα πάνω της έκφρασης miR-146a είναι ειδική για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Σε αντίθεση, παρατηρήθηκε μία μικρή αύξηση της έκφρασης του miR-21 και miR-26b παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις προ-νεοπλαστικές αλλοιώσεις (HPV λοίμωξη από σχεδίες) και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς και έτσι δεν εμφανίζεται έκφραση τους ειδική για τον καρκίνο (Εικ. 5).

Σχεδία ιστούς (καλλιέργειες), με μόλυνση HPV18 προήλθαν από ανθρώπινα κολπικά κερατινοκύτταρα (HVKs) σε καλλιέργειες μονοστιβάδας με HPV18 DNA διαμόλυνση. Σύνολο κύτταρο RNA (5 μα) που εξάγονται από κάθε τύπο κυττάρων συγκρίθηκε παράλληλα για έκφραση miRNA χρησιμοποιώντας αναλύσεις συστοιχίας miRNA. A. Ένα γράφημα ομαδοποίηση δημιουργήθηκε από μια ιεραρχική μέθοδο από εκείνες τις miRNAs με πυκνότητα σήμα πάνω από 1000 ελήφθη από τρεις ανεξάρτητες επιμολύνσεις σε κάθε ομάδα (Πίνακας S2). Το γράφημα δείχνει μειωμένη (πράσινο) ή αυξημένη (κόκκινο) έκφραση (p & lt? 0,05) των επιμέρους miRNAs από αδιαφοροποίητα HVKs σε μονοστιβάδες (Mono) έναντι στρωματοποιημένη και διαφοροποιημένη HVKs σε σχεδίες. Δείτε άλλες λεπτομέρειες στο Σχ. 3Α. B. Έλεγχος της έκφρασης των miRNAs από αδιαφοροποίητα HVKs σε μονοστοιβάδες και στρωματοποιημένη και διαφοροποιημένη HVKs σε σχεδίες με κηλίδωση Northern. Σύνολο κύτταρο RNA (30 μg έκαστο) απομονώθηκε από διαφοροποιημένα ή αδιαφοροποίητα HVKs επεσημάνθη με επιλεγμένα ανιχνευτές miRNA. Γ Bar γραφήματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα των εξεταζόμενων miRNAs ρυθμίζεται σύμφωνα με U6 RNA σε κάθε δείγμα στον πίνακα Β Μ = μονοστρωματική καλλιέργεια, R = σχεδία.

Η

Α. Ολικά RNAs από HVKs σε δύο σχεδίες και δύο μονοστοιβάδας (Mono) καλλιέργειες σε σύγκριση με δύο καρκίνο του τραχήλου (Ca) ιστών για την έκφραση του miR-146a με κηλίδωση Northern. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 και miR-26b εξετάστηκαν ως μάρτυρες miRNA. Μικρές πυρηνική RNA U6 επίσης κηλιδώθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για τη φόρτωση του δείγματος. Β Bar γραφήματα δείχνουν τα σχετικά επίπεδα των εξεταζόμενων miRNAs ρυθμίζεται σύμφωνα με U6 RNA σε κάθε δείγμα στον πίνακα Α Μ = μονοστρωματική καλλιέργεια, R = σχεδία.

Η

Μειωμένη miR-143 και miR-145 στην τραχηλικών βλαβών και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας είναι κατασταλτικά του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

Έχοντας επιδείξει μια σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των miR-143 και miR-145 σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις, ερευνήσαμε αν αυτή η προς τα κάτω ρύθμιση είναι σημαντική για την ανάπτυξη της Καρκίνος του τραχήλου της μήτρας. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, συνθετικά miR-143 και miR-145 πρόδρομοι επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα HeLa και η επίδραση της υπερέκφρασης του ώριμου miRNAs τους στην ανάπτυξη των κυττάρων HeLa εκτιμήθηκε με μέτρηση κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, τόσο miR-143 και miR-145 βρέθηκαν κατασταλτική (p & lt? 0,005 για miR-143 και ρ & lt? 0.008 του miR-145,

t-test

) για την ανάπτυξη των κυττάρων HeLa. Αυτή η κατασταλτική δράση στην ανάπτυξη των κυττάρων δεν ήταν μια άμεση απάντηση κύτταρο? μάλλον, χρειάστηκαν δύο διαδοχικές επιμολύνσεις κυττάρου με κάθε miRNA σε διάστημα 48 ωρών. Τα δεδομένα δείχνουν ότι τόσο το miR-143 και miR-145 πρέπει πιθανώς να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα του τραχήλου για την εξέλιξη του όγκου.

Α. miR-143 και miR-145 είναι κατασταλτικά για την ανάπτυξη των κυττάρων HeLa. Τα βέλη δείχνουν τα χρονικά σημεία, όταν τα κύτταρα έλαβαν ένα συγκεκριμένο miRNA (30 nM) επιμόλυνση. Τα βιώσιμα κύτταρα σε κάθε ομάδα μετρήθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD δύο πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. B. Σχετικά επίπεδα του miR-143 και miR-145 σε κύτταρα HeLa σε 96 ώρες μετά την πρώτη παροδική επιμόλυνση. Σύνολο κύτταρο RNA που εκχυλίζεται εξετάσθηκε με ανίχνευση προσδέσεως miRNA. Ένα επίπεδο tRNA σε κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Αυξημένη miR-146a σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Θεωρώντας ένα 6-πλάσια αύξηση της έκφρασης miR-146a σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς, υποθέσαμε ότι ένα υψηλό επίπεδο miR-146a θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην αυχενική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Η αρχική μας προσέγγιση με τη χρήση αναστολέων αντι-miR-146a ή χρησιμοποιώντας ένα morphonino-ολιγο να εμποδίσει την ωρίμανση miR-146a να γκρεμίσουμε την έκφραση του miR-146a σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές απέτυχε να προκαλέσει μια φαινοτυπική επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προς έκπληξή μας, βρήκαμε ότι όλοι τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν δεν εξέφρασε ανιχνεύσιμα miR-146a (Σχ. 7Α). Στη συνέχεια, miR-146a εισήχθη με παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα HeLa, ένα HPV18

+ καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή, και τα κύτταρα HCT116, μία ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική γραμμή (Σχ. 7Β). Μια αργή, αλλά σημαντικά ενισχυμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και των δύο HeLa (ρ & lt? 0.009,

t

-τεστ) και HCT116 (Ρ & lt? 0.019,

t

-τεστ) κύτταρα παρατηρήθηκε με την παρουσία εξωγενείς miR-146a. Με υπολογισμό από τις κυτταρικές μετρήσεις από κάθε ομάδα, αποδείξαμε ότι και οι δύο κύτταρα HeLa και κύτταρα HCT116 που περιέχουν miR-146a είχε ένα χρόνο διπλασιασμού 2-3 ώρες ταχύτερα από εκείνη των κυττάρων με miR-ελέγχους (Σχ. 7C και 7D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-146a λειτουργεί ως παράγων ανάπτυξης σε καρκίνο του τραχήλου.

A. Αριθ έκφραση του miR-146a σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας που προέρχονται από κυτταρικές γραμμές και σε μια ανθρώπινη γραμμή κερατινοκυττάρων του δέρματος που προέρχεται από τα κύτταρα HaCaT. Σύνολο κύτταρο RNA εκχυλίστηκε από επιμέρους κυτταρική γραμμή και εξετάστηκαν για miR-146a και miR-21 έκφρασης με κηλίδωση northern. U6 σε κάθε δείγμα χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης δείγματος. B. Σχετικό επίπεδο του miR-146a σε κύτταρα HeLa και HCT116 σε 96 ώρες μετά την πρώτη διαμόλυνση. Σύνολο κύτταρο RNA που εκχυλίζεται από κάθε ομάδα εξετάσθηκε με κηλίδωση Northern. Γ και Δ miR-146a προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα βέλη δείχνουν τα χρονικά σημεία, όταν τα κύτταρα έλαβαν επιμόλυνση με miR-146a ή miR-ελέγχου (30 nM). Τα βιώσιμα κύτταρα σε κάθε ομάδα μετρήθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD δύο πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε προφίλ έκφρασης miRNA στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και HPV λοίμωξη που προκαλείται από προ- νεοπλασματικές αλλοιώσεις σε σχεδία ιστούς. Παρά το γεγονός ότι τόσο τραχήλου καρκινικούς ιστούς και HPV-μολυσμένους ιστούς σχεδία με προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις παρουσίασαν αυξητική ρύθμιση του miR-15a και miR-223 και προς τα κάτω ρύθμιση του miR-143, miR-145, miR-218, και miR-424, η πλειοψηφία των η έκφραση miRNA δεν έδειξε συσχέτιση μεταξύ των δύο ιστών και θα μπορούσε να οριοθετηθούν την εξέλιξη της νόσου. Ωστόσο, ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης miR-146a βρέθηκε να είναι καρκίνο του τραχήλου-ειδική καθώς η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω, τόσο σε φυσιολογικούς ιστούς και σε HPV-μολυσμένους ιστούς σχεδία με προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις.

Διαπίστωση προς τα κάτω ρύθμιση του miR-143 και miR-145 και προς τα πάνω ρύθμιση του miR-146a σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν ιδιαίτερα ελκυστικό για δύο λόγους: (1) miR-143 και miR-145 εκφράζονται από τον ίδιο πρόδρομο miRNA [28] και μειωτικά επίσης σε HPV-επαγόμενη προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις, στην περίπτωσή μας σε HPV-μολυσμένους ιστούς σχεδία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση τους λαμβάνουν χώρα σε ένα πρώιμο στάδιο, πριν την ανάπτυξη του καρκίνου. Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-143 και miR-145 έχει βρεθεί σε αρκετούς άλλους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος [32], λέμφωμα Β-κυττάρου [33], και πρόσφατα στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [34], [35]. Έτσι, το εύρημα μας είναι σημαντική για την κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους εμπλέκονται miR-143 και miR-145 στην καρκινογένεση. Αναστολή από miR-143 και miR-145 της κυτταρικής ανάπτυξης HeLa σημαίνει ότι το miR-143 και miR-145 πρέπει πιθανώς να ρυθμίζεται προς τα κάτω, προκειμένου για την ανάπτυξη του καρκίνου. (2) Προς τα πάνω ρύθμιση miR-146a σε καρκινικούς ιστούς του τραχήλου της μήτρας, αλλά όχι σε HPV-επαγόμενη προ-νεοπλασματικές αλλοιώσεις ή σε καρκίνο που προέρχεται από κυτταρικές σειρές υποδεικνύει ότι miR-146 έκφραση είναι ειδική για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Διάφορες μελέτες δείχνουν ότι το miR-146a είναι ένα NF-κΒ-εξαρτώμενη γονίδιο [36] – [38]. Η έκφραση του miR-146a φαίνεται να ποικίλλει σε διαφορετικούς ιστούς του καρκίνου στην οποία παρατηρήθηκε ένα αυξημένο επίπεδο του miR-146a σε σειρές λεμφώματος Burkitts ‘με EBV-LMP1 (λανθάνουσα πρωτεΐνη μεμβράνης 1) έκφραση [37], [38], αλλά μειωμένη επίπεδο ορμόνης-ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη [39] και θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [40]. Στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miR146a φαίνεται άσχετη με οποιαδήποτε από τις γονιδιακής έκφρασης HPV αφού η έκφραση της ήταν ακόμα μειωμένη σε παραγωγικά HPV-μολυσμένους ιστούς σχεδία. Είναι ενδιαφέρον ότι, όλες οι τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές και μια γραμμή κερατινοκυττάρων δέρματος εξετάστηκαν δεν περιέχει ανιχνεύσιμο miR-146a, υποδηλώνοντας ότι miR-146a σε τραχήλου καρκινικούς ιστούς ρυθμίζεται αυξητικά από έναν παράγοντα που λείπει σε ένα ομογενή πληθυσμό κυττάρων ή εκφράζεται από ένα άλλο τύπο κυττάρων στον καρκίνο ιστούς. Έτσι, συμπεραίνουμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miR-146a σε καρκίνο του τραχήλου είναι επωφελής για την ανάπτυξη του καρκίνου ως εισαγωγή του miR-146a σε καρκινικά κύτταρα αυξημένο χρόνο διπλασιασμού των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προωθούνται.

Περίπου 800 ανθρώπινα miRNAs έχουν προβλεφθεί . Από αυτά, περισσότερα από 450 (https://microrna.sanger.ac.uk/sequences, 2006) έχουν ήδη εντοπιστεί στο ανθρώπινο [41], [42] [43], τα [44], και οι λειτουργίες τους αρχίζουν να διευκρινιστεί [45]. Σε αυτή τη μελέτη, κλωνοποιήθηκε και ταυτοποιήθηκε 174 miRNAs που ομαδοποιήθηκαν σε 46 διαφορετικά είδη miRNA. Μια νέα υποείδη του miR-193, miR-193C, επίσης κλωνοποιήθηκε και ταυτοποιήθηκε από miRNA διαλογή βιβλιοθήκη μας. Διαλογή των 10 κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από καρκίνο του τραχήλου ή CIN ιστούς για έκφραση του 10 miRNAs πρότεινε ότι η παρουσία ή η απουσία ολοκληρωμένων ή επισωμικό γονιδιώματα HPV δεν έχει καμία επίδραση επί της έκφρασης αναλύθηκε miRNAs. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ένα ενιαίο HPV16 που προέρχονται miRNA από HPV16

+ CaSki κύτταρα με αυτή την προσέγγιση, αν και άλλοι ιοί πυρηνικό DNA κάνουμε κωδικοποιούν miRNAs [46], συμπεριλαμβανομένων των EBV [47]? KSHV [48] – [50]? HSV-1 [51], [52]? και SV40 [53]. Ένα αρνητικό κλωνοποίησης για miRNAs HPV16 που προέρχονται υποδηλώνει ότι το ολοκληρωμένο γονιδίωμα HPV16 σε κύτταρα CaSki δεν φαίνεται να εκφράζουν ιικά miRNAs. Μια άλλη μελέτη με τη χρήση διαφοροποιημένων HPV31

+ LKP1 κύτταρα που περιέχουν περίπου 50 αντίγραφα του γονιδιώματος επισωμικό HPV31 ανά κύτταρο επίσης απέτυχε να εντοπίσει miRNAs προέρχονται από τον ιό [54].

Πρόσφατες εκθέσεις έχουν δείξει ότι miRNAs συμβάλει σε μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών [41] και εμπλέκονται στην ανάπτυξη των καρκίνων του ανθρώπου [19]. Για παράδειγμα, miR-32 ελέγχει κύτταρο ανθεκτικότητα σε ένα ρετροϊικής μόλυνσης [55]. Ένα σύμπλεγμα έξι miRNAs στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 13 ρυθμίζεται από το c-myc, και η c-Myc-ρυθμιζόμενη miR-17-5p και miR-20a ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του E2F1, έναν παράγοντα μεταγραφής [56]. miRNAs έχουν επίσης χαρακτηρίζεται πρόσφατα ως πιθανοί ογκογονίδια που προάγουν την ανάπτυξη του ανθρώπινου Β-κυτταρικού λεμφώματος (miR-17-92 cluster) [57] και ο πολλαπλασιασμός και η ογκογένεση των πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων (miR-372 και miR-373) με την εξουδετέρωση p53 μεσολάβηση της CDK αναστολή [58]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-17-5p, miR-20a, miR-21, miR-92, miR-106a και miR-155 θα μπορούσε να θεωρηθεί ως miRNA υπογραφή των στερεών καρκίνου [59]. Στην έκθεση αυτή, 18 miRNAs ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και 15 miRNAs ήταν προς τα κάτω σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς. Η αυξημένη έκφραση του miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155, και miR-223 που παρατηρήσαμε στην αυχενική καρκινικούς ιστούς έχει επίσης ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη άλλων ανθρώπινων καρκίνων: miR-15 και miR-16 ρυθμίζουν την απόπτωση με στοχοθέτηση BCL2 [60] και μετάλλαξης τους έχει συσχετιστεί με τη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [61]? miR-16 συμμετέχει επίσης στον έλεγχο των κυτοκινών RNA αστάθειας [62]? επίπεδα miR-146b είναι ιδιαίτερα αυξημένη στο θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [40]? miR-155 έχει πρόσφατα ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη του λεμφοβλαστική λευχαιμία /υψηλής ποιότητας λέμφωμα [63] και τον καρκίνο του πνεύμονα [24] και στη ρύθμιση της ανθρώπινης αγγειοτενσίνης ινοβλαστών έκφραση του υποδοχέα II τύπου 1 [64]? miR-223, μαζί με τους παράγοντες μεταγραφής C /EBPa και ΒΑΛ-Α, συμμετέχει στη ρύθμιση της κοκκιοκυτταρικής διαφοροποίηση καταστέλλοντας τη μεταγραφή της ΒΑΛ-Α mRNA [65].

Αν και ώριμη miRNAs προέρχονται από πρωτογενή μεταγραφές τους μέσω Drosha και Dicer πέψη σε δύο ξεχωριστές κόψιμο αντιδράσεις περιέχει προεξοχή ενός 2-nt 3 ‘σε κάθε σκέλος, Dicer πέψη του προ-miRNA δεν γίνεται πάντα με ακρίβεια. Αυτό αντανακλάται στην miR-21 και miR-205 απομονώθηκε σε αυτή τη μελέτη. Βρήκαμε ότι περισσότερο από το 68% του miR-21 απομονώθηκε από κύτταρα CaSki είχε ένα επιπλέον C στο 3 ‘άκρο και 33% του miR-205 απομονώθηκε περιείχε μία επιπλέον U στο 3’ άκρο, αλλά όχι επιπλέον νουκλεοτίδιο ήταν ποτέ προσδιορίζονται από το 5 ‘άκρα είτε miRNA. Σε σύγκριση με την αντίστοιχη αλληλουχία προ-miRNA, η πρόσθετη C στο miR-21 και το U στην miR-205 βρέθηκαν να προέρχεται απευθείας από το νουκλεοτίδιο 3 ‘προς την θέση διάσπασης, υποδεικνύοντας ότι Dicer πέψη έχει μια ταλάντωση μηχανισμό . Αυτή η παρατήρηση από μικρές κλωνοποίηση RNA μπορεί να επαληθευτεί περαιτέρω ως διπλό ζώνες για miR-21 (Σχ. 5Α και Σχ. 7Α) και για miR-205 (Σχ. 2Α και 2Β) σε αναλύσεις κηλίδος Northern. Τα ευρήματά μας συμφωνούν με άλλες αναφορές που προέρχονται από βιοχημικές αναλύσεις που Dicer χρησιμοποιεί ένα κανόνα καταμέτρησης 3 ‘άκρο και μετρά μια απόσταση ~ 22 nt από το 3’-άκρο για να διασπάσει τα δύο σκέλη του RNA, με βάρδιες 1- έως 2-nt σε η θέση προτιμάται διάσπασης [18], [66].

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα, ιστούς και πολιτισμών σχεδία

Οκτώ καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις : HPV16

+ CaSki και SiHa, HPV18

+ HeLa και C4II, HPV68

+ ΜΕ180 [67], και HPV31

+ CIN612 6Ε και 9E κύτταρα. Δύο HPV16

+ W12 υποκλώνους (20861 και 20863) αρχικά απομονώθηκε από μια χαμηλού βαθμού ιστολογικά του τραχήλου της μήτρας βλάβη διαγνώστηκαν ως CIN Ι [26] χρησιμοποιήθηκαν επίσης για σύγκριση. Μεταξύ αυτών των κυτταρικών γραμμών, 20863 και 9Ε κύτταρα περιέχουν μια επισωματική μορφή του γονιδιώματος HPV, και 20.861 και 6Ε κύτταρα έχουν μια ολοκληρωμένη HPV γονιδιώματος [68], [69].