Abstract

Ιστορικό

γονίδια που κωδικοποιούν τις δεσατουράσες λιπαρού οξέος (FADS1, 2, 3) που εντοπίζεται στο καρκίνο γονιδιωματική hotspot είναι 11q13 locus απαιτούνται για τη βιοσύνθεση της 20 άνθρακα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA), τα οποία είναι άμεσα εικοσανοειδών προδρόμων ουσιών. Σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές, FADS2 κωδικοποιημένα Δ6 και Δ8 αποκορεσμός δεν είναι λειτουργική.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Αναλύοντας MCF7 λιπαρά οξέα των κυττάρων με λεπτομερείς φασματομετρία μάζας διαρθρωτικές, δείχνουμε ότι, ελλείψει δραστηριότητα FADS2, το FADS1 προϊόν Δ5-δεσατουράση λειτουργεί για την παραγωγή 5,11,14-20:3 και 5,11,14,17-20:4. Αυτά PUFA λείπει το 8-9 διπλό δεσμό της εικοσανοειδών σηματοδότησης πρόδρομοι αραχιδονικό οξύ (5,8,11,14-20:4) και το εικοσαπεντανοϊκό οξύ (5,8,11,14,17-20:5). Ετερόλογη έκφραση του FADS2 αποκαθιστά δραστηριότητας Δ6 και Δ8-δεσατουράσης και φυσιολογική σύνθεση εικοσανοειδών προδρόμων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η απώλεια των δραστηριοτήτων FADS2-κωδικοποιημένα σε καρκινικά κύτταρα κλείνει την κανονική βιοσύνθεση PUFA, διαγράφοντας το ενδογενή προμήθεια εικοσανοειδών και των προδρόμων κατάντη docosanoid, και την αντικατάστασή τους με ασυνήθιστη βουτυλένιο-διακοπεί λιπαρά οξέα. Αν ανακεφαλαιωθούν

in vivo

, η κανονική εικοσανοειδών και docosanoid κυτταρική σηματοδότηση περιβάλλον θα πρέπει να εξαντληθεί και να μεταβληθεί λόγω της μείωσης και την υποκατάσταση της κανονικής υποστρώματα με ασυνήθιστες υποστρώματα, με απρόβλεπτες συνέπειες για την κυτταρική επικοινωνία.

Παράθεση : Πάρκο WJ, Kothapalli KSD, Lawrence P, Brenna JT (2011) FADS2 Λειτουργία Απώλεια κατά την Καρκίνου Hotspot 11q13 Locus Εκτροπές λιπιδίων Σηματοδότησης Προδρόμου Σύνθεση σε Ασυνήθιστο εικοσανοειδών λιπαρών οξέων. PLoS ONE 6 (11): e28186. doi: 10.1371 /journal.pone.0028186

Επιμέλεια: Daniel Τομέ, το Παρίσι Ινστιτούτο Τεχνολογίας για τη Ζωή, Τροφίμων και Περιβαλλοντικών Επιστημών, Γαλλία

Ελήφθη: 16 του Σεπτεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 2 Νοέμ 2011? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αρκετές μελέτες της ανθρώπινης κυτταρογενετική και πρόστιμο χαρτογράφηση έχουν Πίνδου μυτερό HSA 11q13 locus ως μείζον hotspot για έναν αριθμό ανθρώπινων καρκίνων [1], [2], [3], [4], [5]. Πολυάριθμες γενετικών μηχανισμών έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένων 11q13 διαγραφές, απώλεια ετεροζυγωτίας, μεταθέσεις και ενίσχυση αλληλόμορφων [3], [5]. Το σύμπλεγμα λιπαρών οξέων δεσατουράση (FADS), που κωδικοποιούνται από τα γονίδια

FADS1

,

FADS2

, και

FADS3

, εντοπίζονται σε μια περιοχή 100 kb σε ανθρώπινο χρωμόσωμα 11q12-13.1 [ ,,,0],6], [7]. FADS2 και FADS1 κωδικοποιούν κρίσιμα ένζυμα για πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (LCPUFA) βιοσύνθεση μακριάς αλυσίδας, εισάγοντας διπλούς δεσμούς μεταξύ συγκεκριμένων ατόμων άνθρακα. Ωμέγα-3 (ω3 ή ω-3) και ωμέγα-6 (ω6 ή η-6) PUFA είναι βασικά θρεπτικά συστατικά που συνδέονται με τις περισσότερες από τις ασθένειες των ανθρώπων, ειδικά των καρδιαγγειακών (CVD), ο καρκίνος, ο διαβήτης και το μεταβολικό σύνδρομο, και είναι το κλειδί δομικά συστατικά του νευρικού ιστού [8], [9]. Η LCPUFA DGLA (20:3n-6), ARA (20:4n-6), ΕΡΑ (20:5n-3) και DHA (22:6n-3) είναι πρόδρομοι για εικοσανοειδών σηματοδότηση των κυττάρων και την τροποποίησή τους με την αναστολή της βιοσυνθετικής κατάντη μεταβολισμού είναι πολύ πολύτιμη στόχων φαρμάκων, για τους αναστολείς παράδειγμα, κυκλοοξυγενάσης και λιποξυγενάσης, και πιο πρόσφατα docosanoids που είναι υποψήφια φάρμακα [10].

η FADS2 κωδικοποιείται Δ6-αποκορεσματάση καταλύει το πρώτο και περιοριστικό του ρυθμού στάδιο στην βιοσύνθεση των LCPUFA. Σε αρκετές καρκινικά κύτταρα αποκορεσμού δεν συμβεί, η οποία μπορεί να οφείλεται στην αδρανοποίηση της δεσατουράσης ή του ανάντη (παραγωγή π.χ. CoA) ή προς τα κάτω (π.χ. ακυλτρανσφεράση) βήματα. Ο λόγος για αυτό το ελάττωμα έχει προταθεί ότι οφείλεται σε εκτεταμένη χρωμοσωμική διαγραφές, αλλά όχι μοριακή υπάρχουν διαθέσιμες αποδείξεις [11], [12]. Τα υποστρώματα Δ8-αποκορεσμού 20:2n-6 και 20:3n-3 συχνά ανιχνεύονται, υποδηλώνοντας έτσι ότι το βήμα επιμήκυνσης είναι λειτουργική [12], [13]. Μέχρι πρόσφατα, τα υποστρώματα Δ8-αποκορεσμού 20:2n-6 και 20:3n-3 είχαν ευρέως θεωρηθεί αδιέξοδες προϊόντων, ακόμη και αν αυτές βρίσκονται στο ανθρώπινο πλάσμα και ερυθρά αιμοσφαίρια, καθώς και άλλους ιστούς. Δείξαμε την πρώτη μοριακή απόδειξη ότι FADS2 καταλύει Δ8-αποκορεσμός για τα δύο αυτά υποστρώματα, που αντιπροσωπεύει μια εναλλακτική διαδρομή για τη βιοσύνθεση LCPUFA στα θηλαστικά, όπου μετατρέπονται σε εικοσανοειδών προδρόμων LCPUFA [14]. Αυτή η οδός μπορεί να είναι διαθέσιμες όταν δραστικότητα Δ6-δεσατουράσης είναι σε κίνδυνο.

Η ασυνήθιστη απώλεια δραστικότητας δεσατουράσης PUFA σε αρκετές καρκινικά κύτταρα μας ώθησε να υποθέσει ότι η κύρια ελάττωμα έγκειται στο ίδιο το δεσατουράσης, και όχι αλλού, όπως σε η ενεργοποίηση των PUFA με σύνθεση ή τη σύνθεση των φωσφογλυκερίδια ως αποδέκτες της εκκολαπτόμενη LCPUFA CoA. Επιβεβαιώσαμε ότι τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF7 δεν διαθέτουν καμία ικανότητα για τη βιοσύνθεση του LCPUFA λόγω της απουσίας της δραστικότητας Δ6-αποκορεσματάσης [12]. Εδώ δείχνουμε την αποκατάσταση αυτού του μεταβολικού ελαττώματος με ετερόλογη έκφραση του FADS2, απόδειξη νέων εξειδίκευση υποστρώματος για FADS1, και τον ανταγωνισμό μεταξύ FADS1 και FADS2 για τα ίδια υποστρώματα, που οδηγεί στην παραγωγή των ασυνήθιστων LCPUFA που δεν είναι υποστρώματα για την παραγωγή εικοσανοειδών.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

FADS2 και FADS1 παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα MCF7 διερευνήθηκαν για την απόδειξη της βιοδραστικότητας προς 18:2n-6 και 18:3n-3. FADS2 επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν δραστικότητα έναντι τόσο των υποστρωμάτων? αέριας χρωματογραφίας-ομοιοπολικό προϊόν προσθήκης χημικού ιονισμού διαδοχική φασματομετρία μάζας (GC-CACI-MS /MS) επιβεβαίωσαν τα νέα κορυφές να 18:3n-6 και 18:4n-3 αντίστοιχα (Σχήμα 1). Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν παρατηρήθηκαν προϊόντα όταν είτε 18:2n-6 ή 18:3n-3 επωάστηκαν με το FADS1 και τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν την πρώτη σαφή μοριακή απόδειξη ότι το μεταβολικό ελάττωμα σε αυτά τα κύτταρα μπορεί να αποκατασταθεί με την αντικατάσταση του ρυθμού περιοριστικό ένζυμο Δ6-αποκορεσματάση κωδικοποιείται από FADS2

Α:. Κανένα προϊόν δεν παρατηρείται σε κύτταρα επιμολυσμένα FADS1. Β: FADS2 επιμολυσμένα κύτταρα Δ6-αποκορεσμός 18:2n-6 → 18:3n-6 (9,12-18:2 → 6,9,12-18:2) και 18:3n-3 → 18:4n-3 (9,12,15-18:3 → 6,9,12,15-18:4).

Η

Όταν FADS1-επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν με 20:2n-6 και 20:3n -3, CACI-MS /MS δείχνει κέρδος συνθετικών συνάρτηση για να παράγει δύο νέα βουτυλενίου-διακόπτονται PUFA κορυφές: 5,11,14-20:3 και 5,11,14,17-20:4, αντίστοιχα (Σχήμα 2) . Αυτά τα δύο LCPUFA είναι ανάλογα προς το αραχιδονικό οξύ (5,8,11,14-20? 4) και το εικοσαπεντανοϊκό οξύ (5,8,11,14,17-20:5), αντίστοιχα. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι με την ουσιαστική απουσία της δραστικότητας Δ8-δεσατουράσης (FADS2), η Δ5-δεσατουράση (FADS1) λειτουργεί σε 20:2n-6 και 20:3n-3. Δ6-αποκορεσμού (FADS2) είναι συνήθως περίπου 10 φορές πιο δραστικό από Δ5-αποκορεσμού (FADS1), ως εκ τούτου είναι εύλογο ότι η δραστηριότητα FADS1 μετασχηματισμό κατά τη διάρκεια των κυττάρων θα επιμείνει όταν FADS2 είναι ανενεργός. Ωστόσο, τα προτιμώμενα υποστρώματα για FADS1 δεν είναι απαραίτητα λιπαρά οξέα (18:2n-6 και 18:3n-3), αλλά η επιμήκυνση των προϊόντων τους 20:2n-6 και 20:3n-3. FADS1 ενεργούν για αυτά τα υποστρώματα δημιουργεί ασυνήθιστες βουτυλενίου-διακεκομμένο προϊόντα άνθρακα και τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτά τα σπάνια λιπαρά οξέα μπορούν να παραχθούν σε καρκινικά κύτταρα. Αυτή είναι η πρώτη μοριακή στοιχεία που αποδεικνύουν τα νέα FADS1 εξειδίκευση υποστρώματος για 20:2n-6 και 20:3n-3 λιπαρά οξέα. Επιπλέον, FADS2-επιμολυσμένα κύτταρα καταδεικνύουν σαφώς ότι ο

FADS2

γονιδιακού προϊόντος Δ8-Αφαιρεί τον κορεσμό 20:2n-6 και 20:3n-3 έως 20:3n-6 (DGLA) και 20:4n-3 (ETA ) αντίστοιχα, που ισοδυναμεί με τα αποτελέσματά μας σε ετερόλογα μεταμορφωμένο ζυμομύκητα [14]

Α:. FADS1-επιμολυσμένα κύτταρα Δ5-αποκορεσμός 20:2n-6 → 5,11,14-20:3 και 20:3n- 3 → 5,11,14,17-20:4. Β: FADS2 επιμολυσμένα κύτταρα Δ8-αποκορεσμός 20:2n-6 → 20:3n-6 και 20:3n-3 → 20:4n-3

Η

Επιπλέον, ενώ είναι γνωστό ότι και τα δύο. n-3 και n-6 PUFA υποστρώματα ανταγωνίζονται για ίδια ένζυμα, τα τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν FADS1 και FADS2 ανταγωνίζονται για τις ίδιες υποστρώματα (Σχήμα 2). Το καθαρό αποτέλεσμα είναι η υποκατάσταση του ανενεργού 5,11,14-20:3 και 5,11,14,17-20:4 για ARA (5,8,11,14-20:4) και EPA (5, 8,11,14,17-20? 5), αντίστοιχα, με απρόβλεπτες συνέπειες για εικοσανοειδών μεσολάβηση σηματοδότηση κυττάρου-κυττάρου παρακρινούς. Δυσλειτουργία της σηματοδότησης εικοσανοειδές συνδέεται με την ανάπτυξη του όγκου, της αγγειογένεσης και της μετάστασης σε ζωικά μοντέλα [15]. Ένας διπλός δεσμός στη θέση 8 είναι απαραίτητη για κυκλοοξυγενάσης (COX), λιποξυγονάση (LOX) και θρομβοξάνης βιοσύνθεση, και έτσι η απουσία του διπλού δεσμού στη θέση 8 καθιστά 5,11,14-20:3 και 5,11,14, 17-20:4 ανενεργό ως υποστρώματα για τη βιοσύνθεση των περισσότερων εικοσανοειδών [16], [17], [18]. Επιπλέον, η πιθανή δράση του βουτυλενίου-διακοπεί PUFA ως ανταγωνιστικοί αναστολείς της εικοσανοειδών βιοσυνθετικών ενζύμων είναι άγνωστη, όπως είναι η δραστηριότητα των άλλων βασικών εικοσανοειδών συνθετικά ένζυμα (π.χ. κυτόχρωμα Ρ450) των οποίων οι δράσεις για την κανονική μέρη των ασυνήθιστων λιπαρών οξέων θα έχει ως αποτέλεσμα προϊόντα με άγνωστη Δραστηριότητα (ες).

μανίες γονιδίων, που κωδικοποιούν ένζυμα που απαιτούνται για βιοσύνθεση PUFA προέκυψε εξελικτικά από τα γεγονότα διπλασιασμό γονιδίου. Παρά καίρια σημασία του FADS2 και την απώλεια της λειτουργίας του σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, οι μοριακές λεπτομέρειες και συνέπειες της απώλειας FADS2 δεν έχει περιγραφεί ή διερευνηθεί. FADS2 είναι γνωστό ότι έχει δράση έναντι τουλάχιστον επτά υποστρώματα (18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6, 20:3n-3, 24:4n-6, 24:5n-3, 16: 0). Η απώλεια των δραστηριοτήτων FADS2 κωδικοποιούνται σε καρκινικά κύτταρα κλείνει τελείως τις κλασικές και εναλλακτικές οδούς PUFA, εξαλείφοντας εικοσανοειδών και πρόδρομο βιοσύνθεσης docosanoid από το φυτό που βασίζεται PUFA λινολεϊκό και λινολενικό οξύ και περιορίζοντας έτσι σηματοδότηση κυττάρου-κυττάρου (Σχήμα 3). Πολλές μελέτες έχουν βρει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου μέσα στο σύμπλεγμα FADS γονιδίου και πολύπλοκες φαινοτύπους που σχετίζονται με χρόνια νόσο, όπως επίσης και με τα επίπεδα του PUFA μακράς αλυσίδας [19], [20]. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να κατανοήσει πλήρως τις συνέπειες της απώλειας λειτουργίας FADS γονίδιο ή /και διαφοροποίηση με βάση SNPs στο νεόπλασμα. Πρώιμες μελέτες έδειξαν ότι μικρο-μεσολάβηση κυττάρων μεταφορά HSA11 σε κύτταρα MCF7 μειωμένη ογκογονικότητα, υποδηλώνουν δυνητικών ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε αυτό το χρωμόσωμα [21].

Δ6- και τα βήματα Δ8-αποκορεσμού είναι απούσα σε MCF7, οδηγώντας σε Δ5-αποκορεσμό της 11,14-20:2 να 5,11,14-20:3 όταν FADS1 είναι λειτουργική. Οι ανάλογες πορείες για n-3 LCPUFA μετατρέπουν 11,14,17-20:3 → 5,11,14,17-20:4 (δεν φαίνεται). FADS2 πιστεύεται επίσης ότι εμπλέκεται στην βιοσύνθεση C22 LCPUFA (δεν φαίνεται).

Η

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι μια κύρια μοριακή ελάττωμα σε κύτταρα MCF7 κείται εντός του γονιδίου FADS2 προκαλώντας απώλεια FADS2 κωδικοποιούνται Δ6-αποκορεσματάση δραστηριότητα. Αντιστάθμιση για λειτουργία FADS2 με FADS1 οδηγεί στην παραγωγή του 5,11,14-20:3 και 5,11,14,17-20:4, αμφότερα κυρίως αδιέξοδη προϊόντα λιπαρών οξέων που δεν μπορεί να είναι πρόδρομες ουσίες για τα περισσότερα εικοσανοειδή και πιθανό να είναι ανταγωνιστικοί αναστολείς. Η φυσιολογική σημασία του βουτυλενίου διακόπτεται PUFA στα καρκινικά κύτταρα εκκλήσεις για περαιτέρω λεπτομερή έρευνα. παρόντα αποτελέσματα μας παρέχουν μια ώθηση για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των δεσατουρασών λιπαρών οξέων, ειδικά FADS2 ως καταστολέας των όγκων σε νεοπλασματικές παθήσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδιο φορέα κατασκευής

Η ακολουθίες κωδικοποίησης του FADS1 (GenBank # EF531577) και FADS2 (GenBank # EU780003) πρωτεΐνη κλωνοποιήθηκαν σε φορέα έκφρασης pcDNA3.1 χρησιμοποιώντας cDNA από νεογνό μπαμπουίνου ηπατικό ιστό. Το cDNA λήφθηκε από αποθηκευμένα δείγματα που ελήφθησαν από μια μελέτη εγκεκριμένη από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπής Πανεπιστήμιο Cornell (IACUC, πρωτόκολλο # 02-105). Ανάλυση και σύγκριση της ακολουθίας αμινοξέων του μπαμπουίνου FADS1 έδειξε 95% ταυτότητα και 97% θετικά με την ανθρώπινη FADS1 (AF084558), ενώ, μπαμπουίνους FADS2 έδειξε 98% ταυτότητα και 99% θετικά με την ανθρώπινη FADS2 (NM_004265). Νωρίτερα, δείξαμε νέα λειτουργία Δ8-αποκορεσμού χρησιμοποιώντας μπαμπουίνους FADS2 [14].

πολιτισμό MCF7 κυττάρων και των λιπαρών οξέων συμπληρώματα

Για τα πειράματα επιμόλυνσης τα κύτταρα MCF7 αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ-α media με 10 %-μείωση λιπιδίων FBS (media και ορό που λαμβάνονται από Hyclone) στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο περιβάλλον με 5% CO

2. Ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MCF7 κύτταρα (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) ήταν το είδος δώρο του Dr. Rui Hai Liu, Πανεπιστήμιο Cornell. Τα κατασκευάσματα FADS1 και FADS2 διαμολύνθηκαν σε κύτταρα MCF7 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα MCF7 συμπληρώθηκαν με 100 μΜ αλβουμίνης δεσμεύεται 18:2n-6, 18:3n-3, τα οξέα 20:2n-6 και 20:3n-3 λιπαρών οξέων και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες.

λιπαρών οξέων ανάλυση

Μετά την επώαση με λιπαρά οξέα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1 χ PBS και απομακρύνθηκαν με τρυψινοποίηση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και το κυτταρικό ίζημα σε επεξεργασία για την εκχύλιση λιπιδίων. Λιπαρά παρασκευή μεθυλεστέρα διεξήχθη με τη χρήση μίας τροποποιημένης μεθόδου ενός σταδίου από Garces και Μάντσα [22]. Η ανάλυση έγινε με αέρια χρωματογραφία-φλόγας ανίχνευση ιονισμού (GC-FID) [8] και η κορυφή ταυτοποίηση επιβεβαιώθηκε με GC-ομοιοπολικούς ιονισμού παράλληλα προϊόντος προσθήκης χημικών φασματομετρία μάζας (GC-CACI-MS /MS) [14], [23].