Αφηρημένο

BAD, ένα προ-αποπτωτική πρωτεΐνη της οικογένειας Bcl-2, έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ολοκληρωτής αρκετών οδών αντι-αποπτωτική σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Έτσι, η ενεργοποίηση του EGFR, GPCRs ή μονοπάτι ΡΙ3Κ οδηγεί σε φωσφορυλίωση της Bad και η αναστολή της απόπτωσης. Αυξημένα επίπεδα BAD σε καρκινώματα του προστάτη έχουν επίσης αναφερθεί. Φαίνεται αντιφατικό το γεγονός ότι αντί να περιορίσει την έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, κύτταρα καρκίνου του προστάτη επιλέγουν να αυξήσουν τα επίπεδα της κακής ενώ διατηρώντας υπό αυστηρό έλεγχο φωσφορυλίωση. Ανάλυση της επίδρασης της BAD επί ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη έχει δείξει ότι η αυξημένη έκφραση Bad ενισχύει την ανάπτυξη του όγκου, ενώ knockdown του BAD έκφρασης με shRNA αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου. Πειράματα καλλιέργειας ιστού κατέδειξε ότι η αυξημένη έκφραση Bad διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη έκφραση του BAD παρέχει ένα πολλαπλασιαστικό πλεονέκτημα σε όγκους του προστάτη, ενώ η κακή αποφωσφορυλίωση αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε απόπτωση. Συνδυασμός πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικών ιδιότητες ζητά κυττάρων καρκίνου του προστάτη να «εθισμένοι» σε αυξημένα επίπεδα φωσφορυλιωμένου BAD. Έτσι, κινάσες που φωσφορυλιώνουν BAD είναι εύλογες θεραπευτικοί στόχοι? ενώ η παρακολούθηση BAD φωσφορυλίωση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης του όγκου σε θεραπείες

Παράθεση:. Smith AJ, Karpova Υ, D’Agostino R Jr, Willingham Μ, Kulik G (2009) Έκφραση του Bcl-2 πρωτεΐνη BAD προωθεί προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου. PLoS ONE 4 (7): e6224. doi: 10.1371 /journal.pone.0006224

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 10 Μάρτη του 2009? Αποδεκτές: 11, Ιουνίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουλίου, 2009

Copyright: © 2009 Smith et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση ΝΙΗ /NCI R01 CA118329, Υπουργείο άμυνας του προστάτη Cancer Research πρόγραμμα επιχορήγησης PC073548, επιχορηγήσεις από την Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου και WFUSM Ενδιάμεση Χρηματοδότηση για την GK? AS υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ Βραβείο T32CA079448. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Επί του παρόντος, δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για ανδρογόνο-ανεξάρτητες προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [2]. Οι μηχανισμοί που επιτρέπουν τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, προκειμένου να αποφύγει την απόπτωση μπορεί να συμβάλλει στην θεραπευτική αντίσταση. Έτσι, τα αυξημένα επίπεδα αρκετών αυξητικών παραγόντων, περιλαμβανομένων των FGF, EGF, IL-6 και αγωνιστές GPCR που ενεργοποιούν οδούς αντι-αποπτωτική σηματοδότηση, έχουν αναφερθεί σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη [3] – [7]. Αντι-αποπτωτικά σήματα θα μπορούσαν είτε μετα-μεταφραστικά τροποποιήσετε ρυθμιστικές πρωτεΐνες απόπτωση ή να αλλάξετε τα επίπεδα έκφρασής τους. Πράγματι, η αυξημένη έκφραση του αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, καθώς και ως αναστολείς πρωτεϊνών απόπτωσης (ΙΑΡ) σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη, έχει αναφερθεί [8], [9]. Επίσης, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, η προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 BAD παίζει ένα μοναδικό ρόλο ως σημείο σύγκλισης πολλών μονοπατιών αντι-αποπτωτική σηματοδότηση που περιλαμβάνουν ουσιαστικά δραστική ΡΙ3Κ, ενεργοποιημένα EGFR και GPCR [6].

BAD, Bcl-xL /bcl-2- ανταγωνιστής που προκαλεί θάνατο των κυττάρων, ταυτοποιήθηκε αρχικά σε ένα ζυμομύκητα δυο υβριδίων που αλληλεπιδρούν με Bcl-2 ή ΒοΙ-χι [10]. BAD είναι ένα μοναδικό ΒΗ3-μόνο μέλος της οικογένειας στο ότι η ρύθμιση του είναι κατά κύριο λόγο με τη μεσολάβηση συντηρημένες θέσεις φωσφορυλίωσης της (σερίνες 112, 136, και 155 με βάση την ακολουθία του ποντικιού) [11], [12]. Η φωσφορυλιωμένη BAD αποτυγχάνει να δεσμεύσει πρωτεΐνες Bcl-XL ή Bcl-2, και έχει θεωρηθεί ένας φρουρός απόπτωσης αδρανοποιείται με αντι-αποπτωτικών σημάτων. Μετά την απόσυρση της επιβίωσης παράγοντες BAD γίνεται αποφωσφορυλιωμένο, μετατοπίζει την ισορροπία της προ- και αντι-αποπτωτικών Bcl πρωτεΐνες που προκαλεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, SMAC και ΟΕΕ από τα μιτοχόνδρια και στη συνέχεια οδηγεί σε απόπτωση [12]. Με αυτόν τον τρόπο, δεν θα ήταν έκπληξη αν τα καρκινικά κύτταρα να μειώσει BAD έκφρασης.

Μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι η κακή έκφραση είναι αυξημένη σε καρκινώματα του προστάτη σε σύγκριση με χαμηλή έκφραση στο φυσιολογικό προστατικό επιθήλιο [13]. Φαίνεται αντιφατικό ότι τα κύτταρα του προστάτη θα αφιερώσουμε επιπλέον πόρους για τη διατήρηση BAD φωσφορυλίωση αντί για την εξάλειψη της έκφραση. Είναι πιθανό ότι εκτός από τη ρύθμιση της απόπτωσης, BAD μπορεί να διαδραματίσει θετικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη.

Εδώ αναφέρουμε ότι η αυξημένη έκφραση Bad διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε ιστοκαλλιέργεια και την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη

in vivo

. Ταυτόχρονα, BAD αποφωσφορυλίωση αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε απόπτωση. Αυτός ο συνδυασμός των πολλαπλασιαστικών και αποπτωτικών ιδιότητες δημιουργεί τις συνθήκες για καρκινικά κύτταρα προστάτη «εθισμός» σε αυξημένα επίπεδα φωσφορυλιωμένου BAD. Έτσι, κινάσες που φωσφορυλιώνουν BAD είναι εύλογες θεραπευτικοί στόχοι.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, LNCaP και C4-2, ήταν δώρα από τον Dr. Leland Chung (Πανεπιστήμιο Emory, Ατλάντα GA). κύτταρα C4-2BADLuc δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση C4-2 κυττάρων με άγριου τύπου BAD (ΗΑ-BAD-pTRE2hygro) και λουσιφεράση πυγολαμπίδας (pGL3), ενώ pTRE2hygro και λουσιφεράση πυγολαμπίδας (pGL3) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα C4-2 για να δημιουργήσει C4-2Luc . LNCaP κύτταρα διατηρήθηκαν με T-μέσο συμπληρωμένο με 5% εμβρυϊκό βόειο ορό, και τα κύτταρα C4-2 διατηρήθηκαν με RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C

Αντισώματα και άλλα αντιδραστήρια

Τα αντισώματα ελήφθησαν από τις ακόλουθες πηγές:. BAD, φωσφο-ειδικό BAD (σερίνες 112 , 136, 155) από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ)? ERK από Zymed Laboratories (South San Francisco, CA)? συζευγμένο με υπεροξειδάση αντισώματα δευτερογενούς χρένο χρησιμοποιείται για κηλίδες Western από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Όλα τα άλλα χημικά (εκτός εάν ορίζεται) αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). αντιδραστήρια καλλιέργειας ιστών αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

shRNA πειράματα

A φορέα λεντοϊού (pLL3.7) [14] χρησιμοποιήθηκε με ένα shRNA ένθετο συγκολλημένων ολιγονουκλεοτιδίων. Το κακό ακολουθίες DNA στόχου που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-TGAAGGGACTTCCTCGCCCGT-3 ‘και 5’ GGCTTGGTCCCATCGGAAG-3 ‘. κύτταρα ΗΕΚ 293 επιμολύνθηκαν με φορέα pLL3.7 περιέχουν οποιαδήποτε από αυτές τις αλληλουχίες ή ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία 5’-GGTACGGTCAGGCAGCTTCT-3 ‘, σε συνδυασμό με φορείς συσκευασίας (VSVG, RSV-REV, και pMDL g /p RRE). Μετά από 48 ώρες, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν από αυτά τα κύτταρα και χρησιμοποιούνται για να μολύνουν LNCaP ή C4-2 κυττάρων [6]. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για επόμενα πειράματα

Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

Οι μετρήσεις κυττάρων έγιναν από τα ακόλουθα:. 2 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε έξι πιάτα cm για κάθε πειραματική ομάδα. Η αρχική μέτρηση κυττάρων ήταν 24 ώρες μετά τα κύτταρα είχαν συνδέονται με τα πιάτα (Ημέρα 1). Δύο επιπλέον μετρήσεις έγιναν τρεις ημέρες αργότερα (ημέρα 4) και έξι ημέρες αργότερα (Ημέρα 7) και, στη συνέχεια, σε σύγκριση με την αρχική καταμέτρηση κυττάρων. Οι απαριθμήσεις έγιναν από θρυψίνη και συλλέγοντας τα κύτταρα σε μέσο, ​​τότε το χέρι καταμέτρηση σε ένα αιματοκυτταρόμετρο. προσδιορισμοί ΜΤΤ έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του κιτ (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) σε κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες σε διάφορες πυκνότητες. Εις τριπλούν φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε σημείο δεδομένων.

Ανοσοϊστοχημεία

χρώση αντισώματος πραγματοποιήθηκε σε ιστολογικές τομές ξενομοσχευμάτων όγκου προστάτη μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με πλακίδια θέρμανση στους 95 ° C σε 10 mM ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0) για 60 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο ως εξής: 1) επωάζεται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 2% για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης? 2) επωάστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού: 1% BSA, 0,1% Tween20 εντός PBS (30 λεπτά, 25 ° C)? 3) επωάζονται με πρωτεύοντα αντισώματα, Ki-67 από Abcam Inc. (Cambridge, ΜΑ) αραιωμένο 1:25-1:200 σε διάλυμα αποκλεισμού (όλη τη νύκτα, 4 ° C)? πρωτογενή αντισώματα ακολούθησαν αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (10 μg /ml, σε διάλυμα μπλοκαρίσματος, 30 λεπτά, 25 ° C) και αποκαλύφθηκαν με 3-3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) ως του χρωμογόνου. Μεταξύ των βημάτων, τα δείγματα πλύθηκαν με PBS 3 φορές.

Η υποδόρια εμφυτεύσεις

Γυμνά ποντίκια (BALB /cAnNCrj-nu από Charles River) έλαβε τέσσερις υποδόριες ενέσεις των 2 × 10

6 κύτταρα με Matrigel. Οι ενέσεις έγιναν χρησιμοποιώντας μία σύριγγα ινσουλίνης και μία βελόνα 27 gauge. Όλοι οι χειρισμοί με ζώα διεξήχθησαν σε ανθρώπινο τρόπο, με αυστηρή προσήλωση με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από θεσμικούς ACUC, η οποία σχεδιάστηκε για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων.

Η φωταύγεια Imaging

Η ανάπτυξη του όγκου αναλύθηκε με Xenogen IVIS® 100 σύστημα οπτικής απεικόνισης (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ). Τα ζώα ακινητοποιήθηκαν για ένεση υπόστρωμα και απεικόνισης μέσω ενός συνημμένο σύστημα αναισθησίας αερίου που αποτελείται από 2% ισοφλουρανίου /O

2. Για να ληφθεί υπόψη για το φόντο και μη ειδική φωταύγεια, οι ποντικοί απεικονίστηκαν πριν από την ένεση του λουσιφεράσης. Τα ζώα εγχύθηκαν με 100 μΙ του πυγολαμπίδας λουσιφερίνη υπόστρωμα λουσιφεράσης (3,5 mg /ml σε PBS) και απεικονίστηκαν 15 λεπτά αργότερα σε πρηνή και ύπτια θέση (5 λεπτά το καθένα). εικόνων ολόκληρου του σώματος λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Living Image® παρέχεται με σύστημα απεικόνισης. Μια φωτογραφική εικόνα γκρι κλίμακας και η βιοφωταύγειας έγχρωμη εικόνα σε υπέρθεση να παρέχουν ανατομική καταγραφή του φωτεινού σήματος. Μια περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) ήταν το χέρι που επιλέγεται από το σήμα φωταύγειας, και η ένταση καταγράφηκε ως φωτόνια /δευτερόλεπτο μέσα σε ένα ROI.

Η στατιστική ανάλυση

Για να προσδιοριστεί εάν οι διαφορές μεταξύ των συνόλων δεδομένων ήταν στατιστικά σημαντική, ανάλυση έλεγχος τ (two-tailed διανομής? δύο δειγμάτων άνισης διακύμανσης). εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Excel

Αποτελέσματα

Bad έκφραση διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη

Εκθέσεις σχετικά με την αυξημένη έκφραση του BAD στον καρκίνο του προστάτη μας οδήγησε να προτείνουμε ότι προστάτη καρκινικά κύτταρα μπορούν να επωφεληθούν από τη διατήρηση BAD έκφρασης. Για την αντιμετώπιση του πιθανού ρόλου της αυξημένης έκφρασης BAD, εξετάσαμε πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη που υπερεκφράζουν BAD. Για το σκοπό αυτό, συγκρίναμε τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν εκτοπικά BAD και κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα. Τα κύτταρα με αυξημένα επίπεδα της κακής χαρακτηρίστηκαν από αυξημένο πολλαπλασιασμό σε καλλιέργεια ιστού (Σχ. 1Α, Β). Να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι η αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που εκφράζουν σταθερά BAD οφείλεται σε κλωνική παραλλαγές, συγκρίναμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παροδικά είτε με κακή ή κενό φορέα. Αυτά τα πειράματα έδειξαν αυξημένο πολλαπλασιασμό σε αρκετές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν παροδικά BAD (Εικ. 1 C).

(Α) ΗΑ-BAD έκφραση σε C4-2LucBAD κλώνο. (Β) C4-2LucBAD κύτταρα πολλαπλασιάζονται με ταχύτερο ρυθμό από ό, τι τα κύτταρα C42. C4-2LucBAD κύτταρα ή C4-2Luc κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν 6 πιάτα cm. Τις ημέρες 1 και 4 μετά την επίστρωση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. Αποτελέσματα σε 4 ημέρες ήταν σημαντικά διαφορετική με μια τιμή ρ

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύτταρα που εκφράζουν BAD πολλαπλασιάζονται πιο γρήγορα? Ωστόσο, μηχανιστικές λεπτομέρειες σχετικά με το πόσο κακό προάγει τον πολλαπλασιασμό αποκλίνουν. Μια πιθανότητα είναι ότι BAD παρέχει ένα αντίβαρο για αυξημένα επίπεδα BclXL και Bcl-2 που είναι γνωστό ότι επιβραδύνουν τον πολλαπλασιασμό [22]. Εάν αυτό το σενάριο είναι σωστό, οποιαδήποτε προ-αποπτωτικών ανταγωνιστή Bcl2 /BclXL αναμένεται να έχουν μια κακή-σαν αποτέλεσμα. Ωστόσο, αν η έκφραση μιας τέτοιας ανταγωνιστής είναι συστατικός, θα νικήσει το σκοπό της αυξημένης έκφρασης /BclXL Bcl-2 με την αύξηση της ευαισθησίας της απόπτωσης. Δεδομένου ότι το ποσοστό των επισφαλών που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ετεροδιμερή με αντι-αποπτωτική ομολόγους εξαρτώνται από την κατάσταση φωσφορυλίωσης, BAD μπορεί να είναι μοναδικά κατάλληλος για το ρόλο του διαμορφωτή της BCL2 /BClXL, η διαθεσιμότητα των οποίων έχει μικροσυντονιστεί από πρωτεϊνικές κινάσες. Είναι επίσης δυνατό ότι με την αύξηση του ποσοστού χρησιμοποίησης γλυκόζης, BAD έκφραση παρέχει ανταγωνιστικό πλεονέκτημα στα κύτταρα σε υποξικά όγκους που εναλλαγή από οξειδωτική φωσφορυλίωση σε γλυκόλυση [23].

Ο ακριβής μηχανισμός του τρόπου με Bcl πρωτεΐνες ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό είναι σκοτεινός. Απομένει να καθοριστεί αν ένα ενιαίο μηχανισμό διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο ή BAD-εξαρτώμενη διέγερση του πολλαπλασιασμού των διαμεσολαβείται μέσω διαφόρων μηχανισμών ταυτόχρονα, και αν BAD εντοπισμός σε ένα συγκεκριμένο οργανίδιο (π.χ. μιτοχόνδρια, ER, πυρηνικό φάκελο) είναι σημαντική. Επίσης, αυτή η θετική επίδραση στην κυτταρική διαίρεση δεν μπορεί να εκδηλωθεί ομοιόμορφα σε όλα τα καρκινικά κύτταρα. Έτσι, BAD αναστέλλει φέρεται G1 στην S μετάβαση σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού [24]. Μέχρι τα αποτελέσματα της κακής στον πολλαπλασιασμό τεμαχίζεται σε μοριακό επίπεδο, παραμένουμε με την έννοια ότι τα αποτελέσματα της κακής έκφρασης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων είναι τύπου-εξαρτώμενη.

Συμπεράσματα

Ανεξάρτητα από τον ακριβή μηχανισμό ότι επιτρέπει BAD για την τόνωση της ανάπτυξης του όγκου, αυτή η ικανότητα μπορεί να παρέχει επιλεκτική πίεση για την αύξηση της BAD έκφραση σε όγκους. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν BAD δημιουργεί μια ανεκτική κατάσταση στην αυξημένη έκφραση των κακών. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η υψηλή έκφραση Bad πρέπει να κάνει αυτοί οι όγκοι όλο και περισσότερο ευαίσθητο σε αναστολείς των οδών που ελέγχουν BAD σηματοδότησης. Εάν ναι, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί υψηλά επίπεδα φωσφορυλιωμένης BAD για τον εντοπισμό ασθενών οι οποίοι θα ωφεληθούν από τη θεραπεία με τέτοιους αναστολείς. Οι μελλοντικές μελέτες σε ζωικά μοντέλα και ανάλυση των δεδομένων κλινικών δοκιμών σε σχέση με την έκφραση Bad /φωσφορυλίωση απαιτείται για να προσδιοριστεί η μεταγραφική αξία των εκτεταμένων προσπαθειών που δαπανώνται μελετώντας πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν BAD.

Ευχαριστίες

είναι ευγνώμονες προς τον James Wood για ανάλυση FACS, και να Karen Klein για επεξεργασία.