Αφηρημένο

Μια αυξανόμενη λίστα των microRNAs (miRNAs) δείχνουν ανώμαλες μορφές έκφρασης στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), αλλά οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής. επεξεργασία του RNA καταλύεται από τα μέλη της απαμινάσης αδενοσίνης ενεργούν για την οικογένεια RNA (ADAR) θα μπορούσε να στοχεύσει τις πρόδρομες ουσίες των miRNAs και επηρεάζουν τη διαδικασία βιογένεση. Ως εκ τούτου, έχουμε ερευνήσει εάν επεξεργασίας του RNA θα μπορούσε να είναι ένας μηχανισμός που συμβάλλει στην απελευθέρωση συγκεκριμένων miRNAs στο HCC. Με υπερέκφραση μεμονωμένων ADARs σε κύτταρα ηπατώματος, επεξεργασία RNA επί των προδρόμων των 16 miRNAs συχνά απορυθμισμένη σε HCC σαρώθηκε με ένα ευαίσθητο πλατφόρμα τήξης υψηλής ανάλυσης. Τα αποτελέσματα προσδιορίζονται πρόδρομοι RNA του miR-214 και miR-122 ως πιθανοί στόχοι edited by ADAR2. Ένα υποσύνολο του HCC που δείχνουν αυξημένα ADAR2 επαληθεύονται οι μεγάλες editings προσδιορίζονται στο ARAR2 υπερεκφράζεται κύτταρα ηπατώματος, είτε με Α-προς-Ι ή U-to-C αλλαγές. Η ασυνήθιστη μοντάζ U-to-C σε συγκεκριμένα υπολείμματα καταδείχθηκε ως αποδίδονται με την Α-προς-Ι επεξεργασία επί των μεταγραφών RNA συμπληρωματικό προς το PRI-miRNAs. Η εκδήλωση επεξεργασία προκάλεσε μείωση της μεταγραφής RNA συμπληρωματικό προς pri-miR-214, η οποία οδήγησε στη μείωση των pri-miR-214 και miR-214 και είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης του νέου γονιδίου-στόχου Rab15 του. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη ανακάλυψε ADAR2 μεσολάβηση επεξεργασία των συμπληρωματικών αντίθετης φοράς μεταγραφές ως νέο μηχανισμό για τη ρύθμιση της βιογένεση των συγκεκριμένων miRNAs κατά τη διάρκεια ηπατοκαρκινογένεσης

Παράθεση:. Liu WH, Chen CH, Yeh KH, Li CL, Γου YJ, Chen DS, et al. (2013) ADAR2 Μεσολαβεί Επεξεργασία του miR-214 και miR-122 Προδρόμου και Antisense RNA μεταγραφές στο καρκίνων του ήπατος. PLoS ONE 8 (12): e81922. doi: 10.1371 /journal.pone.0081922

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 31 Ιουλ, 2013? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 27, Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα Έρευνας για Biopharmaceuticals, Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC102-2325-Β-002-032-), και το Εθνικό Δίκτυο Έρευνας Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν (NHRI-EX100-9832BI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενείς RNAs μη κωδικοποιητική αναγνωριστεί ως μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Αύξηση του αριθμού των miRNAs ήταν συχνά βρέθηκε να απελευθερωθεί το HCC, και μερικοί έχουν συμμετάσχει στην διαδικασία της καρκινογένεσης μέσω της στόχευσης συγκεκριμένων κυτταρικών γονιδίων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των όγκων, απόπτωση, και μετάσταση [1], [2].

Διάφοροι μηχανισμοί έχουν αναφερθεί συμβάλλουν στην ανώμαλη έκφραση του miRNAs σε όγκους. Εκτός από τις γονιδιωματικές ή επιγενετικές μεταβολές, ελαττώματα της διαδικασίας βιογένεσης miRNA εξετάστηκαν επίσης εμπλέκονται στην απορύθμιση, είτε μεταγραφικά από ειδικούς παράγοντες μεταγραφής ή μετα-μεταγραφικά από παράγοντες επεξεργασίας [3]. Αύξηση του αριθμού των παραγόντων που συμμετέχουν στο μετα-μεταγραφικό βήματα βιογένεσης έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων των γενικών παραγόντων για όλα τα miRNAs (όπως Drosha, DGCR8, και Dicer) [4] και οι ειδικοί παράγοντες για ένα υποσύνολο των miRNAs (όπως Ρ53, TRBP2, KSRP, ρ68 /ρ72, Lin28B, και άλλοι) [5], [6]. Εκτός από αυτούς τους παράγοντες, έχει θεωρηθεί ότι η επεξεργασία του RNA θα μπορούσε να είναι ένας άλλος μηχανισμός για μετα-μεταγραφικά τη ρύθμιση του επιπέδου miRNA σε όγκους.

επεξεργασία RNA έχει σαν αποτέλεσμα την αλλαγή της αλληλουχίας RNA, η οποία είναι διαφορετική από εκείνη που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα και συμβάλλει στην ποικιλομορφία των προϊόντων πρωτεΐνης [7]. Στους ανθρώπους, αυτό το γεγονός διαμεσολαβείται από ADAR ένζυμα, συμπεριλαμβανομένων ADAR1 και ADAR2, τα οποία καταλύουν την απαμίνωση της αδενοσίνης σε ινοσίνη (Α-προς-Ι) σε δίκλωνο RNA [8]. Εντοπίστηκαν δύο ADAR1 ισομορφών με εναλλακτική χρήση προωθητή που κωδικοποιούν ADAR1S και ADAR1L [7], [8].

Εκτός από τις κωδικοποιούν πρωτεΐνες γονίδια, τα ADARs θα μπορούσαν επίσης να στοχεύουν τις πρόδρομες ουσίες miRNA, είτε η πρωτοβάθμια ή προ-miRNAs, τα οποία περιέχουν τις δομές στελέχους-βρόχου ως ευνοϊκή υποστρώματα για τα μηχανήματα επεξεργασίας. Βοηθούμενος από την ανάλυση αλληλουχίας υψηλής απόδοσης, έχει υπολογιστεί ότι περίπου 20% του ανθρώπινου pri-miRNAs έχουν επεξεργαστεί [9]. Τέτοια γεγονότα επεξεργασίας έχουν τη δυνατότητα να επηρεάζουν τη λειτουργία του miRNAs, συμπεριλαμβανομένης της σταθερότητας των προδρόμων, η αποτελεσματικότητα κατά την διάρκεια επεξεργασίας βιογένεση, ή ακόμη και την επιλογή του γονιδίου-στόχου [10], [11]. Μια τέτοια δυνατότητα έχει ήδη καλά αποδειχθεί σε αρκετές συγκεκριμένες miRNAs. Για παράδειγμα, pri-miR-142 βρέθηκε edited by ADAR1 και ADAR2

in vitro

, η οποία οδήγησε στην καταστολή της επεξεργασίας του από Drosha. Ένα άλλο παράδειγμα ήρθε από την επεξεργασία των pri-miR-151 από ADAR1, η οποία αναστέλλει την προ να ωριμάσουν-miR-151 επεξεργασία από το κλείδωμα διάσπαση της από Dicer [12].

Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διερευνήσει κατά πόσον η επεξεργασία του RNA από ADARs συμβαίνει για τη ρύθμιση της επεξεργασίας των HCC που σχετίζονται με miRNAs. Ως πιλοτική μελέτη, περιμένουμε τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να βοηθήσουν να καταλάβουν αν τα γεγονότα επεξεργασίας του RNA να συμβάλει στην απελευθερωμένη έκφραση συγκεκριμένων miRNAs στο ηπατοκαρκινογένεσης.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδιο μορφώματα

Οι κλώνοι cDNA για ανθρώπινη ADAR1L και ADAR2 αγοράστηκαν από θηλαστικών Gene Collection (MGC, ΝΙΗ, USA), και το ADAR1S υποκλωνοποιήθηκε από ADAR1L κλώνο. Αυτά τα θραύσματα cDNA άλλαξαν σε φορέα pCMV.SPORT6 και στη συνέχεια προχώρησε περαιτέρω για την κλωνοποίηση στον φορέα λεντοϊού της pLenti6 /V5-DEST χρησιμοποιώντας Πύλη System ™ Technology (Invitrogen Life Technologies Inc.).

Η pLKO.1 -siLuc και pLKO-1-siGFP κατασκευάσματα κατευθύνεται από υποκινητή U6 λήφθηκε από το Μηχανισμό RNAi πυρήνα στην Academia Sinica, Ταϊβάν (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Επιπλέον, αρκετές πλασμίδια pLKO.1 φορέα με βάση το siRNA κατασκευάσθηκαν με εισαγωγή της αλληλουχίας ειδικού siRNA στο φορέα pLKO.1-siLuc στις θέσεις περιορισμού του AgeI και EcoRI. Οι αλληλουχίες για κάθε siRNA ένθετα εναντίον των με νόημα και αντινόημα μεταγραφές του miR-214 και miR-122 εισήχθηκαν ως ακολούθως. siRNA για miR-214: 5′-CCTTTGCTCATAGACAGATAC-3 ‘? siRNA για AS-miR-214: 5’-GTATCTGTCTATGAGCAAAGG-3 ‘? siRNA για miR-122: 5’-CCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ‘, siRNA για AS-miR-122: 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGG -3’. Οι λεπτομέρειες για την προετοιμασία των φακοϊών εκφράζουν ADARs ή ειδικές siRNAs ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

Για την κατασκευή των πλασμιδίων που εκφράζουν είτε την αίσθηση ή τις συμπληρωματικές αντίθετης φοράς μεταγραφές των pri-miR214 και pri-miR122 σε κύτταρα καλλιέργειας, έχουμε κλωνοποιημένα προϊόντα PCR ενισχύθηκαν από γονιδιωματικό DNA των κυττάρων Huh-7 στον φορέα pCMV.SPORT6. Τα σύνολα εκκινητών σχεδιάστηκαν για να περιλαμβάνουν τον πρόδρομο miRNA με -200 βάσεις που εκτείνονται σε αμφότερους τους 5 ‘και 3’ πλευρική αλληλουχία του κάθε miRNA. Οι μεταλλάξεις των συγκεκριμένων καταλοίπων σε αυτά τα κατασκευάσματα, συμπεριλαμβανομένου ενός-34G και A-27G για pri-AS-miR-214 και Α-7G για pri-miR-122, εισήχθησαν με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση χρησιμοποιώντας το QuickChange II τοπο-κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεση Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ο δημοσιογράφος κατασκευή pGL3-Rab15-3’UTR, που περιέχει 3’UTR του γονιδίου Rab15, κατασκευάστηκε με εισαγωγή του θραύσματος DNA κάλυψη nt. 1~714 του 3’UTR του γονιδίου Rab15 (nt. 1 του 3’UTR ως το πρώτο νουκλεοτίδιο μετά το κωδικόνιο λήξης του Rab15, στη ντ. Θέση 709 του Rab15 μεταγραφής, NM_198686) σε φορέα pGL3-Promoter (Promega, Madison, WI). Το ένθετο DNA ενισχύθηκε με PCR από το γονιδιωματικό DNA των κυττάρων Huh-7 με τους εκκινητές 5′-GGTCCGTCTAGACAGAGCTGGTGCTGCAGGCCCAT-3 ‘και 5′-GAAGGCTCTAGACGAGGCAGGGTGGAG GGTTCTTC-3’.

Υψηλής ανάλυσης τήξης (HRM) Ανάλυση

HRM είναι ένα ισχυρό εργαλείο που αναπτύχθηκε για το ευαίσθητο διαλογή παραλλαγή ακολουθίας, χρησιμοποιώντας την ιδιότητα του DNA του διαχωρισμού θερμότητας με την παρουσία των βαφών φθορισμού κορεσμού, όπως το High Resolution Melting Dye (Roche Diagnostics Applied Science, Mannheim, Γερμανία) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Οι ετεροδιπλό ϋΝΑ θραύσματα μπορούν να διακριθούν από τα ομόζυγα αυτά δείχνοντας ένα διαφορετικό σχήμα καμπύλης τήξης [14]. Αυτό επιτρέπει την ανίχνευση του ενιαίου αλλαγές ζευγών βάσεων στο DNA θραύσματα έως 400 bp από ανάλυση καμπύλης τήξης. ανάλυση HRM είναι έτσι κατάλληλο για μας, τον εντοπισμό των αλλαγών νουκλεοτιδίων που προκαλούνται από την επεξεργασία γεγονότα της προ-miRNAs (-100 μονάδες βάσης κατά μέσο όρο).

Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για κάθε miRNA με τη χρήση του Λογισμικού LightCycler Probe Σχεδιασμού, με τις ακολουθίες συνοψίζονται στον πίνακα S1. Τα μήκη των κάθε amplicon ήταν -200 μονάδες βάσης, το οποίο θα καλύπτει το σύνολο των προ-miRNAs με τουλάχιστον 50 μονάδες βάσης εκτείνεται σε 5 ‘και 3’ άκρα. Η ανάλυση ενίσχυση και HRM PCR διεξήχθη από το LightCycler® 480 (Roche Diagnostics Applied Science), με λεπτομέρειες όπως περιγράφεται [15].

Τα προϊόντα PCR που περιέχουν τα θραύσματα ετεροντούμπλεξ εντοπίστηκαν δείχνοντας τη σχετική διαφορά του σήματος της οι καμπύλες τήξης σε σύγκριση με εκείνα που ενισχύεται με την γονιδιωματικό DNA των κυττάρων Huh-7 (ως το πρότυπο άνευ επεξεργασίας), χρησιμοποιώντας το Gene λογισμικό σάρωσης (Roche Diagnostics Applied Science). Για να αποφευχθούν τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα που προκαλούνται από τις μεταβολές δοκιμασίας, έχουμε θέσει τις τιμές cut-off για κάθε αμπλικόνιο αναλύοντας τη σχετική διαφορά σήματος μεταξύ των προϊόντων PCR από 12 επαναλήψεις της αντίδρασης PCR με Hu-7 γενωμικό DNA ως μήτρα, η οποία ήταν & lt ? 3.5 σε όλες τις περιπτώσεις. Ως εκ τούτου, οι τιμές cut-off για τη σχετική διαφορά σήματος ορίστηκαν ως 5 στην ανάλυσή μας.

Θέματα Μελέτη

Οι ιστοί του ήπατος από σχετικές άνδρες ασθενείς HCC 20 HBV που συλλέγονται στην Ταϊβάν καρκίνου του ήπατος δίκτυο (TLCN) συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη αυτή. Το DNA και RNA από την αντιστοιχισμένη νεοπλασματική και των παρακείμενων nontumorous ήπαρ ιστοί από κάθε ασθενή χρησιμοποιήθηκαν για την αντίστροφη μεταγραφή και PCR αντιδράσεις. Στη συνέχεια, το προϊόν PCR υποβλήθηκε σε επεξεργασία για την ανάλυση της αλληλουχίας, με στόχο να εντοπίσει τα υπολείμματα με υποθετικό γεγονότα μοντάζ. Οι εκτομή χειρουργικά δείγματα γρήγορα διατηρούνται σε υγρό άζωτο μέχρι την εξαγωγή του DNA και του RNA. Το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Ταϊβάν Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου ενέκρινε τη χρήση αυτών των αρχειοθετούνται ιστούς, και όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή πληροφορημένη συγκατάθεση τους πριν από την εγγραφή.

Η ποσοτικοποίηση των Pri-miRNA και Ώριμη miRNAs

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Rezol C & amp? Τ, Protech, Taipei, Ταϊβάν) και στη συνέχεια σε επεξεργασία για την αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το Superscript III One-Step RT-PCR System (SuperScript® III First-Strand Synthesis System, Invitrogen, Carlsbad, CA), για την επακόλουθη ποσοτικοποίηση των pri-miRNA. Τα μίγματα για αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής περιείχε 1 μg RNA, 10 μΜ από ειδικό εκκινητή, 5′-ATATCAGATGAACCTTCTTGCTC-3 ‘για pri-miR122 και 5’-GGTTGTAGCTCTTGGTGTAGATG-3 για pri-miR-214, με τα στοιχεία της αντίδρασης όπως περιγράφεται [ ,,,0],13].

Η qPCR διεξήχθη από LightCycler FastStart DNA Δάσκαλος SYBR Green Ι Kit (Roche, Mannheim, Γερμανία) σε ένα μηχάνημα LightCycler PCR με λεπτομέρειες, όπως περιγράφεται [13]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ειδική ενίσχυση των pri-miR214 και PRI-miR122 απαριθμούνται ως ακολούθως. Pri-miR-214: 5′-GTATCTGTCTATGAGCAAAGGAAACC-3 ‘και 5′-GGTGTAGATGCTATGGTGTGAGGGC-3′? pri-miR-122: 5’-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ‘και 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3’

Η ποσοτικοποίηση των ώριμων miR-214 και miR-122 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το TaqMan Assay Kit miRNA (TaqMan® microRNA. Αντίστροφη Transcription Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. U6 RNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για τον προσδιορισμό του σχετικού επιπέδου έκφρασης των miRNAs με λεπτομέρειες, όπως περιγράφεται [13].

Strand Ειδικές qRT-PCR ανάλυση

Το σκέλος συγκεκριμένη qRT-PCR για την πρωτογενή απομαγνητοφώνηση των συμπληρωματικών αντίθετης φοράς οι μεταγραφές τους pri-miR-122 και pri-miR-214, και επίσης, διεξήχθησαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο όπως περιγράφεται από Ho

et al

[16]. Εν συντομία, 2.5 ug του RNA που εξάγεται από κύτταρα ή ιστούς υποβλήθηκε σε επεξεργασία για την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) με κλώνο ειδικό εκκινητή? και έπειτα ο κλώνος συγκεκριμένο προϊόν RT χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση qPCR. Οι ειδικές σκέλος εκκινητές που σχεδιάστηκαν για pri-miR-122 και pri-miR-214 είναι miR-122S: 5′-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ‘και miR-214S: 5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCTG-3′? και εκείνων που προορίζονται για τις συμπληρωματικές μεταγραφές είναι miR-122AS: 5’-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3 ‘και miR-214AS: 5′-AGGCTGGGTTGTCATGTGACTG-3’. Η ίδια ομάδα εκκινητών για το σκέλος ειδική αντίδραση RT χρησιμοποιήθηκε για την επακόλουθη ανάλυση qPCR με λεπτομέρειες, όπως περιγράφεται [13].

ΤΑ Cloning και Sequencing Analysis

Τα προϊόντα RT-PCR από το Lenti -ADAR2-μολυσμένα κύτταρα καθαρίστηκαν με εκχύλιση γέλης και κλωνοποιήθηκε στο YT & amp? ένας φορέας (Yeastern Biotech Co. Ltd., Taipei, Ταϊβάν) από την τΑ κλωνοποίησης. Οι θετικοί κλώνοι που περιέχουν ένθετα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση προσδιορισμού αλληλουχίας για τον εντοπισμό των μεταβολών νουκλεοτιδίου, σε σύγκριση με την αλληλουχία από τα δείγματα ελέγχου χωρίς ADAR2 υπερέκφραση.

Cell Culture, επιμόλυνση, λουσιφεράσης Δοκιμασία, και Ανάλυση Western Blot

Δύο κυτταρικές σειρές ηπατώματος, HepG2 και Huh-7 κύτταρα, αγοράστηκαν από BCRC (Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο, την Ταϊβάν, https://www.bcrc.firdi.org.tw). Ο γονότυπος αυτών των δύο κυτταρικές σειρές έχει κυρωθεί από BCRC χρησιμοποιώντας κιτ ενίσχυσης AmpFI STR Identifiler PCR της Applied Biosystems για εκτενή ανάλυση του DNA STR PCR, με τα προφίλ ταυτόσημα με τα δεδομένα ATCC. Οι λεπτομέρειες για τη συντήρηση των κυττάρων, επιμόλυνση, δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης, και ανάλυση στυπώματος Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση κηλίδος Western που περιλαμβάνονται αντι-ADAR2, αντι-GUTL1, αντι-IGF-1 R, και αντι-Rab15 (Santa Cruz Biotechnology, CA), αντι-ADAR1 (Abnova, Taoyuan), και αντι-β-ακτίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ).

Αποτελέσματα

Επεξεργασία του miR-214 και miR-122 πρόδρομες ουσίες σε Huh-7 κύτταρα με υπερέκφραση του ADAR2

Για να εξετάσει εάν επεξεργασίας RNA συμβάλλει στην ανώμαλη έκφραση συγκεκριμένων miRNAs στο ηπατοκαρκινογένεσης, 16 miRNAs επαναλήψιμα αναφερθεί ως απελευθερωμένη στο HCC (Πίνακας S1) επιλέχθηκαν για τις δοκιμές μας αν ήταν υποστρώματα edited by ADARs. Πήραμε την προσέγγιση με υπερέκφραση επιμέρους lenti-ADARs σε κύτταρα Huh-7, συμπεριλαμβανομένων ADAR1S, ADAR1L, και ADAR2, και στη συνέχεια εξετάστηκε εάν επεξεργασίας RNA που προκαλούνται οποιεσδήποτε αλλαγές νουκλεοτιδίων στους προδρόμους αυτών των miRNAs. Η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης των μεμονωμένων ADARs επαληθεύτηκε πρώτα με ανάλυση Western Blot (Σχ. 1Α). Το RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν μεμονωμένων ADARs για RT-PCR και εν συνεχεία ανάλυση HRM.

(Α) Τα κύτταρα μη μολυσμένα (mock), μολύνθηκαν με lenti-sh-luc (αρνητικός έλεγχος), ή μολύνθηκαν με η lenti-ADAR1S, ADAR1L και ADAR2 ξεχωριστά. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για κηλίδωση Western με ανίχνευση με Abs όπως υποδεικνύεται στο κάτω μέρος κάθε πίνακα. Τα αποτελέσματα HRM για miR-214 (Β) και miR-122 (C). Τα ακατέργαστα δεδομένα για τα σχετικά σήματα φαίνονται στο άνω φύλλο? και η διαφορά της σχετικής σήματος με σύγκριση με το πρότυπο «όχι μοντάζ» φαίνονται στο κάτω πάνελ. Οι δομές βρόχου μίσχου για προ-miR-214 (D) και προ-miR-122 (Ε) απεικονίζεται σχηματικά, με τα νουκλεοτίδια που αντιστοιχούν στις ώριμες Mirs σημασμένο με πράσινο. Οι θέσεις των νουκλεοτιδίων άλλαξε από υπερέκφραση ADAR2 σημειώνονται με κόκκινο χρώμα, με τους αριθμούς που δείχνουν τις θέσεις τους σε σχέση με το πρώτο νουκλεοτίδιο του ώριμου Mirs (όπως θέση αρ. 1). Τα συνοπτικά αποτελέσματα των νουκλεοτιδικών αλλαγών σε προδρόμους αυτών των δύο miRNAs φαίνονται στη δεξιά πλευρά, με αλληλούχιση του 100 κλώνων από ΤΑ κλωνοποίηση των RT-PCR προϊόντων που ενισχύονται από τον RNA από lenti-ADAR2 μολυσμένα κύτταρα.

το PCR προϊόν που ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό DNA των κυττάρων Huh-7, το οποίο προφανώς δεν είναι ο στόχος της ADARs, χρησίμευσε ως πρότυπο «όχι επεξεργασίας» για την ανάλυση HRM. Με τη σύγκριση με ένα τέτοιο πρότυπο, οι σχετικές βαθμολογίες σήματος για κάθε μία από τις 16 miRNAs από κύτταρα μολυσμένα με μεμονωμένες lenti-ADARs υπολογίστηκαν, με τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα S2. Οι παρεκκλίνουσα καμπύλες τήξης, που δείχνει τη σχετική βαθμολογία σήμα & gt? 5, εντοπίστηκαν τα RT-PCR προϊόντα ενισχύθηκαν με pri-miR-214 και pri-miR-122 πρόδρομο RNA που εξάγεται από lenti-ADAR2 μολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 1Β για miR. -214 και το Σχ. 1C για miR-122). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ADAR2 υπερέκφραση μπορεί να γίνουν και κάποιες αναντιστοιχίες στις μεταγραφές των pri-miR-214 και pri-miR-122, υποδεικνύοντας τις πρόδρομες ουσίες θα μπορούσαν να είναι τα υποστρώματα για ADAR2.

Για να προσδιοριστούν περαιτέρω τα συγκεκριμένα υπολείμματα στο πρωτογενείς μεταγραφές των δύο αυτών miRNAs edited by ADAR2, τα προϊόντα RT-PCR από τους lenti-ADAR2-μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για TA-κλωνοποίηση, και η επακόλουθη ανάλυση αλληλούχισης διεξήχθη σε 100 κλώνους για κάθε pri-miRNA. Αρκετές επαναλαμβανόμενες αλλαγές νουκλεοτιδίων ταυτοποιήθηκαν να είναι διαφορετικά από την αλληλουχία των δειγμάτων χωρίς ADAR2 υπερέκφραση. Σύκο. 1D (για pri-miR-214) και Σχ. 1Ε (για PRI-miR-122) απεικονίζεται σχηματικά τις θέσεις τους σε σχέση με την ώριμη Mirs, η οποία συνοψίζεται επίσης το ποσοστό αυτών των αλλαγών νουκλεοτιδίων στα αλληλουχία κλώνων. Οι πιο συχνές αλλαγές συνέβησαν με την απλότυπος της U-28C /U-37C για pri-miR-214 (σε περίπου 50% των κλώνων) και με την απλότυπος του A-7G για pri-miR-122 (σε ~ 30% των κλώνοι).

ADAR2 Υψόμετρο συσχετίζονται με τις νουκλεοτιδικές αλλαγές σε συγκεκριμένα υπολείμματα των Pri-miRNAs στο HCC οι ιστοί

στη συνέχεια, εξετάσαμε αν οι ADAR2-διαλογίστηκε επαναλαμβανόμενες νουκλεοτιδικές αλλαγές εντοπίζονται στα κύτταρα Huh-7 επίσης, εμφανίστηκαν σε κλινικά δείγματα. Το cDNA από 20 ζεύγη HCCs και τα αντίστοιχα γειτονικά nontumorous ιστούς τους αναλύθηκαν με άμεση αλληλούχιση του προϊόντος τους RT-PCR από τις πρωτογενείς μεταγραφές των pri-miR-122 και PRI-miR-214. Τρεις ιστοί HCC παρουσίασε σαφή αλλαγές νουκλεοτιδίων (Σχ. 2, κανένας ασθενής. 11, 13, και 20), με U-to-C αλλαγών σε -37 και -28 του pri-miR-214 (Σχ. 2Α, αποκαλύπτεται ως -να-G αλλαγές με αλληλούχιση με τον αντίστροφο εκκινητή), και μια αλλαγή Α σε G σε -7 από pri-miR-122 (Εικ. 2Β, αποκαλύπτεται ως-προς-G αλλαγές με αλληλούχιση με τον πρόσθιο εκκινητή) . Τέτοιες αλλαγές δεν συνέβη επί του προϊόντος PCR από γονιδιωματικό DNA των ίδιων ιστών HCC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτές οι αλλαγές νουκλεοτιδίων ήταν τα ίδια ως σπουδαιότερα προσδιορίζονται στις ADAR2-υπερεκφράζεται κύτταρα Huh-7 (Σχ. 1 D, 1Ε), υποστηρίζοντας αυτά τα γεγονότα επεξεργασίας θα μπορούσε επίσης να συμβεί σε κλινικά δείγματα. Ήταν αξιοσημείωτο ότι αυτές οι ειδικές νουκλεοτιδικές αλλαγές σημειώθηκαν κυρίως στους όγκους, αλλά λίγο στα γειτονικά nontumorous ιστούς των ασθενών αυτών (Εικ. 2Α και 2Β, ΝΤ vs. Τ), γεγονός που υποδηλώνει αυτό ως ένα γεγονός προτίμηση συμβαίνουν σε όγκους.

τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα αλληλούχισης για miR-214 (Α) και miR-122 (Β), με τις RT-PCR προϊόντων από τέσσερα ζεύγη των ιστών HCC όπως υποδεικνύεται. Τα υπολείμματα νουκλεοτιδίων με μεταβολές στα νεοπλασματικής (Τ) ιστούς, σε σύγκριση με εκείνες των αντίστοιχων nontumorous (ΝΤ) ιστούς, σημειώνονται με κόκκινα βέλη. Οι θέσεις σε σχέση με εκείνο των ώριμων miRNAs υποδεικνύονται πάνω από τα βέλη. (Γ) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA ADAR2 σε αυτούς τους ιστούς HCC προσδιορίστηκαν με ανάλυση qPCR, με τα ποσοτικά αποτελέσματα παρουσιάζονται ως σε σχέση με το επίπεδο του τμήματος ΝΤ του κανένας ασθενής. 8. (D) Η έκφραση της πρωτεΐνης του ADAR2 και ADAR1 σε αυτά τα τέσσερα ζευγάρια των ιστών HCC εξετάστηκε από κηλίδωση Western.

Η

Από

in vitro

μελέτες μας έδειξαν ότι αυτές οι αλλαγές νουκλεοτιδίων θα μπορούσε να προκληθεί από ADAR2 υπερέκφραση, εξετάσαμε αν ADAR2 ανυψώθηκε σε HCC δείχνει συγκεκριμένες αλλαγές νουκλεοτιδίων. Τα επίπεδα έκφρασης για RNA και πρωτεΐνης ADAR2 σε αυτά τα τρία ζεύγη των HCCs εξετάστηκαν με qPCR και στύπωμα Western, με ένα ζεύγος HCCs χωρίς αλλαγές νουκλεοτιδίου όπως με τον έλεγχο (ασθενής αρ. 8). Τόσο το RNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του ADAR2 ήταν σημαντικά αυξημένα στους ιστούς HCC αυτών των τριών ασθενών, αλλά όχι στην περίπτωση ελέγχου (Σχ. 2C, 2D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ADAR2 μεσολάβηση γεγονότων επεξεργασίας RNA θα μπορούσε επίσης να συμβεί σε ένα υποσύνολο του HCC, η οποία είναι καλά σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση του ADAR2.

Επεξεργασία του RNA μεταγραφής συμπληρωματικά προς το RNA μεταγραφές του Pri-ΜΙΚ 214 και Pri-miR-122

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι επεξεργασίας RNA από ADAR2 προκαλεί κυρίως τους /τις αλλαγές A-to-I (G) [8]? Ωστόσο, οι περισσότερες από τις αλλαγές νουκλεοτιδίων που προσδιορίστηκαν για pri-miR-214 και PRI-miR-122 προδρόμους σε ADAR2-υπερεκφράζεται κύτταρα Huh-7 ήταν U-to-C μεταβολές, εκτός από ένα στην θέση -7 του miR-122 (Σχ . 1D και 1Ε). Δεδομένου ότι αυτές οι ασυνήθιστες U-to-C αλλαγές είναι συμπληρωματικά με τις αναμενόμενες A-to-G αλλαγές, προτείναμε την πιθανότητα ότι η ADAR2 μεσολάβηση Α-προς-Ι επεξεργασίας θα μπορούσε να συμβεί στις μεταγραφές RNA συμπληρωματικό προς αυτά τα δύο pri-miRNAs.

Για να δοκιμάσει αυτή τη δυνατότητα, πήραμε την προσέγγιση που υπερεκφράζουν είτε το PRI-miR-214 /PRI-miR-122 (με νόημα) ή συμπληρωματικές μεταγραφές τους RNA (αντιπληροφοριακό) σε Huh-7 κύτταρα μεμονωμένα, σε συνδυασμό με υπερέκφραση του ADAR2. ένα τέτοιο σχέδιο μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση των γεγονότων επεξεργασίας ούτε στις pri-miRNAs ή τις συμπληρωματικές αντίθετης φοράς μεταγραφές. Σύμφωνα με την υπερέκφραση του είτε μεταγραφές τόσο για pri-miRNAs (& gt? 50-φορές, αποκαλύφθηκε με ανάλυση qPCR), βρήκαμε ότι ADAR2 μπορούσε να προκαλέσει U-to-C αλλάζει μόνο στα κύτταρα που υπερεκφράζουν τα συμπληρωματικά αντιπληροφοριακά μετάγραφα (Σχήμα 3Α,. -28 και -37 για AS του miR-214? Σχ. 3Β, 57 για AS του miR-122) .Σε αντίθεση, οι αλλαγές A-to-G εντοπίστηκαν μόνο στα κύτταρα που υπερεκφράζουν το PRI-miR-122 ( Εικ. 3Β, -7 για S του miR-122). Αυτό υποστηρίζεται ότι η παρατηρούμενη U-to-C αλλαγές θα μπορούσαν να οφείλονται σε ο ADAR2 μεσολάβηση Α-προς-Ι επεξεργασία Στο μεταγραφές RNA συμπληρωματικό προς αμφότερα pri-miRNAs. Αυτές οι αλλαγές δεν συμβαίνουν στα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με lenti-ADAR1S ή lenti-ADAR1L, το οποίο ενισχύει αυτά τα γεγονότα επεξεργασίας που πρέπει να μεσολαβεί από ADAR2.

Τα κύτταρα Huh-7 επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο κατασκευάσματα που εκφράζουν είτε την αίσθηση (S) ή το συμπληρωματικό antisense (AS) μεταγραφές του PRI-miR-214 (Α) και PRI-miR-122 (Β), και στη συνέχεια μολύνθηκαν με lenti-ADARs όπως υποδεικνύεται. Το RNA εκχυλίστηκε από κάθε κυτταρικό παρασκεύασμα για RT-PCR και εν συνεχεία ανάλυση άμεση αλληλούχιση. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ είναι αντιπροσωπευτικά, εστιάζοντας στις περιοχές που καλύπτουν τα υπολείμματα προσδιορίζονται ως τα μεγάλα sites επεξεργασίας (όπως αποκαλύπτεται στο Σχήμα 2), συμπεριλαμβανομένων των -37 και -28 για pri-miR-214 και -7 και +57 για pri-miR -122 (σημειώνονται με βέλη). Τα υπολείμματα νουκλεοτιδίων που δείχνει μοντάζ γεγονότα που σημειώνονται με κόκκινο αστερίσκους.

Η

Από το γενικό RT-PCR και αλληλούχιση ανάλυση χρησιμοποιήσαμε παραπάνω δεν μπορούν να διακρίνουν τα γεγονότα επεξεργασίας στο νόημα ή αντινόημα μεταγραφές. έτσι προσπαθήσαμε να ελέγξει το συγκεκριμένο A-to-Ι επεξεργασία στο αντίθετης φοράς μεταγραφές των pri-miR-214 από την πτυχή συγκεκριμένο RT-PCR και αλληλούχιση ανάλυση. RNA που εξάγεται από τα τρία HCC με αυξημένα ADAR2 (Σχ. 2, οι ασθενείς 11, 13, και 20) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τον κλώνο ειδικό RT-PCR, για την ενίσχυση των πρωτογενών μεταγράφων αυτών των δύο pri-miRNAs και επίσης συμπληρωματικό antisense μεταγραφές τους, για ανάλυση αλληλούχισης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, στα κύτταρα νευροβλάστωμα, Loebel et al. έχουν ήδη αναφερθεί ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί miR-214 βρίσκεται μέσα σε μια μη κωδικοποιητική 7,9-kb μεταγράφημα συμπληρωματική προς την ιντρονική περιοχή του dynamin-3 (DNM3), μεταξύ εξονίου 12 και 13 αυτού του γονιδίου (Σχ. 4Α) [18]. Με τη βοήθεια των δύο βάσεων δεδομένων, GeneMark και GENSCAN, σε μικρή μεταγραφής συμπληρωματικά προς miR-122 έχει προβλεφθεί (Εικ. 4Β).

Σχηματική απεικόνιση των δομών γονιδίου για το μεταγραφών RNA συμπληρωματικό προς (Α) πρω- miR-214 και (Β) PRI-miR-122. (C) Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα για αλληλούχιση του κλώνου-ειδικά προϊόντα RT-PCR από HCC με υποτιθέμενο γεγονότα επεξεργασίας, με την έννοια (S) και αντίθετης φοράς (AS) μεταγραφές των pri-miR-214 και pri-miR-122, με έμφαση στην οι περιοχές που καλύπτουν τις περιοχές με δυνατότητες συμβάντα επεξεργασία με την επεξεργασία που σημειώνονται με κόκκινο αστερίσκο.

η

ο προσδιορισμός της αλληλουχίας αποτελέσματα έδειξαν ότι τα γεγονότα επεξεργασίας συνέβη κυρίως στις μεταγραφές συμπληρωματικά προς pri-miR-214, αλλά όχι το μεταγραφές νόημα σε αυτά τα δείγματα HCC (Εικ. 4C, αριστερό πάνελ, -28 και -37 των pri-miR-214). Υποστηρίζει ότι οι ADAR2 αλλαγές που προκαλούνται από U-to-C μπορούσε να αποδοθεί σε μια-προς-Ι επεξεργασία στις συμπληρωματικές μεταγραφές του pri-miR-214 σε κλινικά δείγματα. Σε αντίθεση, η εκδήλωση μοντάζ σε χώρους με ένα μοτίβο A-to-G συνέβη κυρίως στην απομαγνητοφώνηση αίσθηση σε αυτά τα HCC (Εικ. 4C, δεξιά πάνελ, -7 των pri-miR-122).

ADAR2 μεσολάβηση επεξεργασία στο RNA Απομαγνητοφώνηση Συμπληρωματικά προς Pri-miR-214 επηρεάζει λειτουργικά Ο στόχος Gene του miR-214

το επόμενο ζήτημα είναι να εξετάσει το λειτουργικό αποτέλεσμα του ADAR2 μεσολάβηση επεξεργασίας για την βιογένεση των δύο αυτών miRNAs. Για πρώτη έμφαση στην miR-214, το αποτέλεσμα των ADAR2 υπερέκφραση σε miR-214, καθώς και των προδρόμων του αναλύθηκε σε κύτταρα Huh-7, με τα κύτταρα που υπερεκφράζουν ADAR1S και ADAR1L περιλαμβάνονται ως μάρτυρες. Η ενδογενής miR-214 μειώθηκε σημαντικά από υπερέκφραση ADAR2 αλλά όχι από ADAR1S και ADAR1L (Εικ. 5Α, αριστερό πλαίσιο). Τόσο pri-miR-214 και το συμπληρωματικό antisense (AS) μεταγραφές RNA (ενδογενείς) μειώθηκαν επίσης από υπερέκφραση του ADAR2 (Εικ. 5Α, μεσαία και δεξιά πάνελ).

(α) το RNA που εξάγεται από Huh -7 κύτταρα μολυσμένα με ατομικές lenti-ADARs όπως αναφέρεται χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των επιπέδων των ενδογενών miR-214 (αριστερά), pri-miR-214 (μέση), και συμπληρωματικά αντίθετης φοράς μεταγραφή του miR-214 (δείγμα-AS-RNA ) (δεξιά). (Β) Τα επιμέρους lenti-ADARs μολύνθηκαν σε κύτταρα Huh-7, τα οποία είχαν ήδη επιμολυσμένα με τα πλασμίδια που εκφράζουν είτε εξωγενώς το PRI-miR-214 ή το συμπληρωματικό antisense μεταγραφής (συνθ-AS-RNA) όπως υποδεικνύεται. Το RNA εκχυλίστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων των δύο μεταγραφές ανάλογα. (C) Τα κύτταρα Huh-7 επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο που εκφράζει το αγρίου τύπου comp-AS-RNA, ή αυτά εισάγοντας είτε την ενιαία μετάλλαξη ως Α (-37) G ή διπλές μεταλλάξεις ως Α (-37 /-28 )ΣΟΛ. Τα επίπεδα μεταγραφής χωρίς νόημα στη συνέχεια προσδιορίστηκε με qRT-PCR. (Δ) Τα κύτταρα Huh-7 δεν μολύνθηκαν (mock), μολυσμένα με lenti-σι-GFP ελέγχου (si-GFP), ή έχουν μολυνθεί με lenti-σι-AS-214, το οποίο στοχεύει στην μεταγραφή του RNA συμπληρωματικά προς pri-miR -214, για την αξιολόγηση των επιπτώσεων σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης του δείγμα-AS-RNA (αριστερά), pri-miR-214 (μέση), και miR-214 (δεξιά). (Ε) Τα κύτταρα Huh-7 διαμολύνθηκαν με τον φορέα ελέγχου ή το πλασμίδιο που εκφράζει το δείγμα-AS-RNA, για την αξιολόγηση της επίδρασης στα επίπεδα comp-AS-RNA (αριστερά), PRI-miR-214 (μέση) και ωριμάζουν miR-214 (δεξιά). (F) Οι πρωτεΐνες λύματα εκχυλίζονται από κύτταρα Huh-7 μη μολυσμένα ή μολύνθηκαν με lenti-σι-Luc ή lenti-PRI-miR214 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση (αριστερά). Τα κύτταρα Huh-7 επιμολυσμένα με pGL3-φορέα ή pGL3-Rab15-3’UTR κατασκευάσματα δημοσιογράφος μολύνθηκαν με lenti-σι-GFP ή lenti-pri-miR214. Η επίδραση επί της δραστικότητας ανταποκριτή φάνηκε σε σχέση με εκείνο του pGL3-φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα μολυσμένα με lenti-σι-GFP (μέση). Τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης που εξάγεται από Huh-7 κύτταρα είτε μη μολυσμένα είτε μολυσμένα με διάφορα φακοϊούς, όπως περιγράφεται υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για κηλίδωση Western, ανίχνευση με αντισώματα εναντίον Rab15, ADAR1, ADAR2, και β-ακτίνη (δεξιά).

Η

για να εξετασθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα επεξεργασίας σε κάθε μεταγράφημα ξεχωριστά, το PRI-miR-214 και συμπληρωματικό antisense μεταγραφήματα υπερεκφράζεται σε κύτταρα Huh-7 χωριστά, σε συνδυασμό με την ατομική ADARs. Μόνο το συμπληρωματικό RNA μεταγράφημα μειώθηκε κατά ADAR2 (Σχ. 5Β, αριστερό πλαίσιο). Εισαγωγή των αλλαγών A-to-G στις θέσεις -28 και -37 του συμπληρωματικού μεταγραφής μειωμένο επίπεδο του RNA, παρόμοια με εκείνη που προκαλείται από υπερέκφραση του ADAR2 (Εικ. 5C). Έτσι, αποδεικνύεται ότι ADAR2 θα μπορούσε να προκαλέσει μείωση της μεταγραφής RNA συμπληρωματικό προς pri-miR-214, μέσω του A-to-Ι επεξεργασία σε συγκεκριμένα υπολείμματα του -28 και -37 θέσεις.

Όπως σημειώσαμε , δεν υπάρχει άμεση επίδραση της ADAR2 για υπερεκφρασμένης pri-miR-214 (Εικ. 5Β, δεξιά πάνελ, λωρίδα 4), η οποία όμως προκάλεσε μείωση της ενδογενούς pri-miR-214 (εικ. 5Α, μεσαίο πάνελ, λωρίδα 4). Διατύπωσε την πιθανότητα ότι η επεξεργασία ADAR2 προκάλεσε μείωση του συμπληρωματικού μεταγραφής, το οποίο με τη σειρά του μείωσε τη μεταγραφή του RNA των pri-miR-214. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, έχουμε γκρέμισε την μεταγραφή του RNA συμπληρωματικά προς pri-miR-214 σε Huh-7 κύτταρα (Εικ. 5D, αριστερό πάνελ), η οποία οδήγησε σε μείωση των pri-miR-214 (Εικ. 5D, μεσαίο πλαίσιο) . Μια θετική ρυθμιστική επίδραση από τη συμπληρωματική μεταγραφής στο επίπεδο των pri-miR-214 ήταν έτσι εμπλακεί. Σύμφωνα με αυτό, η υπερέκφραση των συμπληρωματικών αντιπληροφοριακό RNA αυξηθεί τόσο η pri-miR-214 και ωριμάζουν miR-214 (σχ. 5Ε).

Για να εξετάσει περαιτέρω το λειτουργικό αποτέλεσμα του ADAR2 μεσολάβηση περίπτωση επεξεργασίας για την γονιδίου στόχου της miR-214, προσπαθήσαμε πρώτα να προσδιορίσει υποθετικό γονίδιο στόχο της στα ηπατοκύτταρα. Οι αλγόριθμοι PicTar, TargetScan και Miranda επεσήμανε Rab15, ένα μέλος του ογκογονιδίου οικογένεια RAS, ως υποθετικό γονίδιο στόχο miR-214. Για να ελεγχθεί αυτό, υπερεκφράζεται miR-214 σε κύτταρα Huh-7 από μόλυνση με lenti-pri-miR-214 φακοϊούς, η οποία οδήγησε σε μείωση του επιπέδου των Rab15 πρωτεΐνης (Εικ. 5F, αριστερό πάνελ). Η μόλυνση των lenti-pri-miR-214 θα μπορούσε επίσης να καταστείλουν τη δραστηριότητα λουσιφεράσης pGL3-Rab15-3’UTR (Εικ. 5F, μεσαίο πάνελ), υποστηρίζοντας ότι το miR-214 θα μπορούσε να καταστείλει την έκφραση του Rab15 μέσω της στόχευσης 3’ΙΙΤΡ του. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ADAR2, αλλά όχι ADAR1S και ADAR1L, προκάλεσε αύξηση του Rab15 (Εικ. 5F, δεξί πάνελ), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ADAR2 μεσολάβηση συμβάν επεξεργασίας έχει λειτουργική επίδραση επί του γονιδίου-στόχου του miR-214.

το RNA Απομαγνητοφώνηση Συμπληρωματικά προς Pri-miR-122 Ρυθμίζει το επίπεδο έκφρασης του miR-122

Μια παρόμοια ανάλυση για το miR-214 εφαρμόστηκε επίσης να αντιμετωπίσει το φαινόμενο της ADAR2 μεσολάβηση επεξεργασίας για miR-122. Πρώτον, η επίδραση των μεμονωμένων ADARs σε ώριμα miR-122 αξιολογήθηκε σε κύτταρα HepG2, αλλά δεν έδειξαν σημαντικές επιδράσεις (Σχ. 6Α). Εισαγωγή ενός-προς-G μετάλλαξη στην θέση -7 του pri-miR-122 πρακτικά, το μεγαλύτερο επεξεργασία ιστοσελίδα, δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στο επίπεδο του miR-122 (Εικ. 6Β). Ως εκ τούτου, η ADAR2 μεσολάβηση επεξεργασίας για pri-miR-122 μεταγραφή δεν επηρέασε τη διαδικασία βιογένεση του.