Abstract

Vav1 είναι μια πρωτεΐνη μετατροπέας σήματος που λειτουργεί ως παράγοντας εναλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης για την Rho /Rac ΟΤΡάσες στο αιματοποιητικό σύστημα όπου εκφράζεται αποκλειστικά. Πρόσφατα, Vav1 δείχθηκε ότι εμπλέκεται σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων του νευροβλαστώματος, του καρκίνου του πνεύμονα, και παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDA). Παρά το γεγονός ότι ορισμένοι παράγοντες που επηρεάζουν

vav1

έκφρασης είναι γνωστά, ούτε η φυσιολογική ούτε παθολογικές ρύθμιση του

vav

1 έκφρασης είναι πλήρως κατανοητός. Έχουμε αποδείξει στο παρόν ότι οι μεταλλάξεις στο υποθετικό παράγοντα μεταγραφής θέσεις δέσμευσης στο

vav

1 προαγωγός επηρεάζει τη μεταγραφή του σε κύτταρα διαφόρων ιστολογικών προέλευσης. Μεταξύ αυτών των θέσεων είναι μια συναινετική θέση για c-Myb, έναν παράγοντα μεταγραφής αιμοποιητικών ειδικό που βρίσκεται επίσης σε Vav1 εκφράζουν κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Η εξάντληση του c-Myb χρησιμοποιώντας siRNA οδήγησε σε δραματική μείωση των

vav

1 έκφραση σε αυτά τα κύτταρα. Σε συμφωνία με αυτό, συν-διαμόλυνση του c-Myb ενεργοποιημένη μεταγραφή ενός

vav1

υποκινητή-λουσιφεράσης κατασκεύασμα γονιδίου αναφοράς σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα στερείται έκφρασης Vav1. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το c-Myb εμπλέκεται σε

vav

1 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Έχουμε διερευνηθούν επίσης την κατάσταση μεθυλίωσης του

vav

1 υποκινητή. Όξινο θειώδες αλληλουχίας αποκάλυψε ότι το

vav

1 υποστηρικτής ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένα σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, αλλά μετουσιωμένο σε διάφορους βαθμούς σε ιστούς που συνήθως δεν εκφράζουν

vav

1. Η

vav

1 προαγωγός δεν περιέχει CpG νησιά κοντά στην θέση έναρξης της μεταγραφής? Ωστόσο, δείξαμε ότι η μεθυλίωση του δινουκλεοτιδίου CpG σε μία θέση πρόσδεσης συναινετική Sp1 στην

vav

1 υποκινητή παρεμβαίνει με πρωτεΐνη σύνδεσης

in vitro

. Τα δεδομένα μας εντοπίσει δύο ρυθμιστικούς μηχανισμούς για

vav

1 έκφραση: σύνδεση του c-Μγβ και CpG μεθυλίωση των 5 ‘ρυθμιστικών αλληλουχιών. Μετάλλαξη άλλες θέσεις πρόσδεσης παράγοντα υποτιθέμενη μεταγραφή φαίνεται ότι η πρόσθετη παράγοντες ρυθμίζουν

vav1

έκφρασης, καθώς και

Παράθεση:. Ilan L, Κατσάβ S (2012) Ανθρώπινα Vav1 έκφραση σε αιμοποιητικά και Καρκίνος Γραμμές κυττάρων είναι ρυθμίζεται από c-Μγβ και από CpG μεθυλίωση. PLoS ONE 7 (1): e29939. doi: 10.1371 /journal.pone.0029939

Επιμέλεια: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Γαλλία

Ελήφθη: 16 Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 7η Δεκεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 του Ιανουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Ilan, Κατσάβ. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Ισραήλ Ακαδημία Επιστημών, το Ισραήλ Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο, ο ισραηλινός Σύλλογος Καρκίνου και του Hubert H. Humphrey Κέντρο Πειραματικής Ιατρικής και Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι προδιαγραφές και η συντήρηση των ιστών αποτελεί θεμελιώδη πτυχή της ανάπτυξης, με τη μεσολάβηση εν μέρει από ιεραρχικά δίκτυα των μεταγραφικών παραγόντων και

cis-ρυθμιστικών

στοιχεία που ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση. Επιπλέον, σωματικά επιγενετικές κληρονομικότητα, ιδίως μέσω της μεθυλίωσης του DNA και επαναμοντελοποίηση χρωματίνης, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης των πολυκύτταρων ευκαρυωτικών οργανισμών [1].

αιμοποίησης είναι ένα από τα καλύτερα μελετημένα παραδείγματα ανάπτυξη και διαφοροποίηση από βλαστικών κυττάρων συντήρησης στη δέσμευση γράμμωσης και διαφοροποίηση [2].

Vav

1 έκφρασης, η οποία περιορίζεται αυστηρά στο αιμοποιητικό σύστημα [3], ρυθμίζεται αυξητικά στην περιοχή αορτή-γονάδων-mesonephros (AGM) του εμβρύου κατά τη διάρκεια του διακόπτη από την πρωτόγονη στην οριστική αιμοποίηση [4] και στη συνέχεια εκφράζεται μόνο σε κύτταρα του συστήματος των ενηλίκων αιμοποιητικών [3]. Το AGM είναι μια σημαντική πηγή intraembryonic αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων και η εμφάνιση αυτών των βλαστικών κυττάρων συσχετίζεται με την προς τα πάνω ρύθμιση του

vav

1 έκφρασης. Οριστικά αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα φαίνεται να διαφοροποιούνται από το κοιλιακό ενδοθήλιο hemogenic του ραχιαίου αορτής και εισάγετε την ανάπτυξη κυκλοφορικό σύστημα για τους σπόρους του εμβρυϊκού ήπατος [5], όπου ερυθροκυτταρικού, μυελοειδή, λεμφοειδή και γραμμώσεις αναπτυχθεί. Σε νεογέννητα και ενήλικα ποντίκια,

vav

1 εκφράζεται ειδικά σε αιμοποιητικά κύτταρα από τον θύμο αδένα, λεμφαδένα, μυελό των οστών, και της σπλήνας [5]. Vav1 εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε μια οθόνη για ογκογονιδίων στην οποία τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 επιμολύνθηκαν με DNA από διάφορα καρκινώματα του οισοφάγου [3]. Η ανάλυση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων αποκάλυψε ότι το ογκογονίδιο Vav1 ενεργοποιήθηκε

in vitro

και το απομονωμένο μεταλλαγμένη μορφή δεν ήταν παρούσα στο αρχικό δείγμα του όγκου [3].

Πολλά χαρακτηριστικά δομικά μοτίφ ενεργοποιήσετε τη λειτουργία μετατροπέα σήματος Vav1 του [6] – [8]. Η πιο γνωστή λειτουργία του Vav1 είναι ως παράγοντας ανταλλαγή /GTP ΑΕΠ για Rho /Rac, μια λειτουργία ελέγχεται αυστηρά από φωσφορυλίωση τυροσίνης [6] – [8]. ενεργοποίηση Rho /Rac οδηγεί σε κυτταροσκελετικές αναδιάταξη κατά την διάρκεια της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων [6] – [8]. Υπάρχει επίσης ολοένα και περισσότερες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι Vav1 έχει άλλες επιδράσεις που είναι ανεξάρτητες από τις δραστηριότητες ανταλλαγής του, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της JNK, ΕΚΚ, Ras, NF-kB και NFAT μονοπάτια. Αυτές οι επιπτώσεις είναι πιθανό διαμεσολαβούνται από σπονδυλωτή τομείς Vav1 μέσω της αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της Shc, NCK, SLP-76, GRB2, και Crk [6] – [8].

Αρχικά χαρακτηρίζεται η

vav

1 υποστηρικτής πριν από 20 χρόνια [9]. Ανάλυση της περιοχής προαγωγέα καθόρισε τις θέσεις έναρξης μεταγραφής και έδειξε ότι ο προαγωγός δεν έχει αναγνωρίσιμα στοιχεία υποκινητή πυρήνα, όπως ένα κουτί ΤΑΤΑ ή ένα εκκινητή. Ωστόσο, αυτό δεν περιέχει αρκετές θέσεις σύνδεσης συναίνεση για τόσο πανταχού παρούσα μεταγραφικών παραγόντων (π.χ., Sp1, AP-1 και ΑΡ-2) (πρωτεΐνες GATA, Μγβ, ΟΚΤ και ETS) και ιστού-περιορισμένο [9]. Ο υποκινητής ποντικού κλωνοποιήθηκε στη συνέχεια [10], [11]. πειράματα προστασίας RNase διεξήχθησαν σε mRNA από τις γραμμές κυττάρων αντιπροσωπευτικά των διαφορετικών αιμοποιητικών καταγωγών. Όλα αυτά τα δείγματα RNA απέδωσε ένα πρότυπο θραυσμάτων που αντιστοιχούν σε ένα σύμπλεγμα μείζονος και ελάσσονος θέσεις έναρξης 95 έως 133 bp ανοδικά του κωδικονίου έναρξης της μετάφρασης, κοντά στις πολλαπλές θέσεις έναρξης χαρτογραφηθεί για τον ανθρώπινο

vav

1 mRNA [10 ], [11]. Ετσι, μία απλή

vav

1 υποκινητή φαίνεται να είναι λειτουργική σε όλη την αιμοποιητικά διαμέρισμα. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο υποκινητής του

vav

1 δείχθηκε να οδηγήσουν την έκφραση διαγονιδίου σε πολυδύναμα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα που κατοικούν στο μυελό των οστών των ενήλικων ποντικών, καθώς και σε διάφορα αιμοποιητικά όργανα [12] – [14]. Για παράδειγμα, αρκετές ανεξάρτητες γραμμές ανθρώπινων διαγονιδιακών ποντικών ΝΡΜ-ΑΙΚ δημιουργήθηκαν με τη χρήση του αιμοποιητικού κυττάρου-ειδική

vav

1 προαγωγό. Αυτό το νέο διαγονιδιακό μοντέλο παρέχεται ένα σύστημα για τη διερεύνηση των ογκογόνο γεγονότα που προκαλούνται από ΝΡΜ-ΑΙΚ in situ [14]. Επίσης, οι φορείς λεντοϊών που εκφράζουν την κοινή κυτοκίνης αλυσίδα γάμμα υποδοχέα κάτω από τον έλεγχο του εγγύς

vav

1 γονίδιο υποκινητή δείχθηκαν να είναι αποτελεσματικές για τη διόρθωση των ελαττωμάτων σηματοδοτήσεως και το X-συνδεδεμένο σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID-X1) φαινοτύπου νόσου σε ένα μοντέλο ποντικού [13].

Αν και

vav

1 υποκινητής έχει χρησιμοποιηθεί για να οδηγήσει ειδική έκφραση στο αιμοποιητικό σύστημα, λίγα είναι γνωστά για τους παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν τη δράση του. Σε μια σειρά μελετών, Denkinger

et al.

Απέδειξαν ότι PU.1 είναι απαραίτητη για την μεταγραφική δραστικότητα του

vav

1 προαγωγό σε μυελοειδή κύτταρα, αλλά όχι σε άλλα αιμοποιητικά κύτταρα [15] . Επιπλέον, Vav1 και PU.1 προσλαμβάνονται με τον προαγωγό CD11b σε APL προερχόμενα προμυελοκύτταρα, υποδηλώνοντας ότι ο ATRA επαγόμενη αύξηση της έκφρασης Vav1 και φωσφορυλίωση τυροσίνης μπορεί να εμπλέκεται στην πρόσληψη PU.1 να συναινετική αλληλουχία της για την προαγωγό CD11b και, τελικά, σε ρύθμιση της έκφρασης CD11b κατά τα τελευταία στάδια της διαφοροποίησης των ουδετερόφιλων του APL προερχόμενων προμυελοκύτταρα [16].

Vav1 μεταλλάξεις δεν έχουν ανιχνευθεί μέχρι τώρα στον καρκίνο του ανθρώπου. Έτσι, αν και ακρωτηριασμένες εκδοχές του Vav1 χωρίς τα αμινοάκρο μετασχηματισμό ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες [9], [17] και συνεργούν με ενεργό Ras στο μετασχηματισμό [18], [19], ο ρόλος τους στην ανθρώπινη ογκογένεση αμφισβητείται [20]. Ένας αριθμός ομάδων, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έχουν ανιχνεύσει την έκτοπη έκφραση των Vav1 σε νευροβλάστωμα [21], παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDA) [22] και τον καρκίνο του πνεύμονα [23]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η έκτοπη έκφραση Vav1 μπορεί να είναι ένα γενικότερο φαινόμενο που επηρεάζει πρόσθετους τύπους όγκων. Τον προσδιορισμό του τι οδηγεί ανώμαλη έκφραση Vav1 σε ιστούς εκτός του αιμοποιητικού συστήματος είναι σημαντική για την κατανόηση της συμμετοχής Vav1 στον ανθρώπινο καρκίνο.

τρέχουσα μελέτη μας αποκαλύπτει τη συμμετοχή του αιμοποιητικού μεταγραφικού παράγοντα c-Μγβ στην έκφραση του

vav

1 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Μπορούμε επίσης να αποδεικνύουν τη συμβολή των CpG δινουκλεοτιδίου μεθυλίωσης του

vav

1 υποκινητή στην έκφραση της σε αιμοποιητικά και καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Jurkat (οξεία λευχαιμία κυττάρων Τ, ευγενικά μας δόθηκε από τον Δρ Weiss [24]), 937 (μονοκύτταρα, ιστιοκυτταρικό λέμφωμα [25]), Η441 (θηλώδες αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, ευγενικά μας δόθηκε από τους Δρ. Gazdar και Minna [ ,,,0],26]), Η460 (καρκίνος του πνεύμονα μεγάλων κυττάρων ευγενικά μας δόθηκε από τους Δρ. Gazdar και Minna [26]) και Η358 (βρογχοκυψελιδικού μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα, ευγενικά μας δόθηκε από τους Δρ. Gazdar και Minna [26]) κύτταρα αναπτύσσονται σε μέσο RPMI. PANC1 (καρκίνωμα του παγκρέατος αγωγό επιθηλιοειδής, ευγενικά μας δόθηκε από τον Δρ Billadeau [22]) και Α549 (καρκίνωμα πνεύμονα επιθηλιακά, ευγενικά μας δόθηκε από τους Δρ. Gazdar και Minna [26]), τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM (Sigma). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη και Ε-γλουταμίνη (Biological Industries, Israel) και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

κατασκευάσματα Promoter-reporter και τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση

Η πυγολαμπίδας φορέα λουσιφεράσης pGL3-βασικό και

Renilla

φορέα λουσιφεράσης pRL-CMV (Promega, USA) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το εγγύς 5 ‘περιοχή της ανθρώπινης

vav

1 γονίδιο [-287 έως +301 σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS)] κλωνοποιήθηκε με εκκινητές lil30 και lil32 (Πίνακας 1) και εισάγεται εντός πλαισίου σε pGL3 διάνυσμα -Βασικές δημοσιογράφος χρησιμοποιώντας θέσεις περιορισμού SacI και XhoI για τη δημιουργία κατασκεύασμα LE2. LE2 στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως το εκμαγείο για να δημιουργήσει μια σειρά σημειακών μεταλλάξεων και διαγραφές (Πίνακας 1). Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Pfu-X πολυμεράσης (Jena Bioscience, Germany) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 94 ° C, 5 λεπτά? 35 κύκλοι (94 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 55-62 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 1 λεπτό για lil30 και lil31, και για 4 λεπτά για τα άλλα ζεύγη εκκινητών όπως περιγράφεται στον Πίνακα 1). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν από πήκτωμα αγαρόζης 1% χρησιμοποιώντας τον Οδηγό SV Gel και PCR Clean-Up System (Promega, USA). Η lil30-32 θραύσμα υπέστη πέψη με SacI και XhoI ένζυμα περιορισμού και προσδέθηκε σε φορέα pGL3 χρησιμοποιώντας Fast-Link DNA κιτ απολίνωσης (Epicentre, USA). Τα προϊόντα PCR από τοπο-κατεύθυνση μεταλλαξογένεσης αυτο-προσδέθηκε.

Η

Παροδικές επιμολύνσεις και αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν και επιμολύνθηκαν μετά από 24 ώρες κάτω από συνθήκες που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Τα κύτταρα συγκομίζονται 24 ή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. ανιχνεύσεις αναφοράς λουσιφεράσης εκτελέστηκαν με Dual-Luciferase Reporter System (Promega, USA) χρησιμοποιώντας λουμινόμετρο Μίθρας (Berthold Technologies, Germany). Για τα πειράματα υπερέκφρασης c-Myb, 1 μg c-Myb εκφράζουν πλασμίδιο (Open Biosystems, USA # 6069320) συν-επιμολύνθηκαν με κατασκευή αναφοράς LE2 και

Renilla

σε κύτταρα Η460. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μεθυλιωμένος LE2 πλασμίδιο παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας CpG μεθυλοτρανσφεράσης (M.SssI) (New England Biolabs, USA).

Η

Bisulfite αλληλούχιση

DNA από κανονικούς ανθρώπινους ιστούς ελήφθη από BioChain (USA) . Bisulfite αντίδραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας EZ μεθυλίωσης του DNA-Direct Kit (Zymo Research, USA). Οι αλληλουχίες που ενδιαφέρουν ενισχύθηκαν με PCR με εκκινητές lil11 (ACACACCTAAACCCCATC) και lil53 (GGGTTGGATTAGATAGAGGA) χρησιμοποιώντας 2 μΙ 10 μΙ συνολικού όγκου της αντίδρασης bisulfitization, Tm = 55 ° C, 35 κύκλοι. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδιο pGEMT (Promega, USA). Συνδεδεμένα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν για να μετασχηματίσουν ικανά κύτταρα ϋΗ5α. PCR πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια στις βακτηριακές αποικίες με πρότυπο εκκινητές για Τ7 και SP6 υποκινητές. Τα προϊόντα PCR του σωστού μήκους αλληλουχήθηκαν με Macrogen (Κορέα).

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

Πυρηνικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν όπως περιγράφεται [15]. Για να αποκτήσετε βραχείς ιχνηλάτες δίκλωνο DNA, μονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδια (IDT, USA) (Πίνακας 3) ανοπτήθηκαν και στη συνέχεια επισημάνθηκε με διγοξιγενίνη ολιγονουκλεοτίδιο 3′-άκρο Labeling Kit (Roche, Ελβετία). Η μακρά άγριου τύπου ιχνηλάτη LE2 δημιουργήθηκε με PCR με διγοξιγενίνη σημασμένο εκκινητές lil46 (5′-GCTGCAGGTGCTCC-3 ‘) και lil47 (5′-CCTGCTCGCCTGTG-3’) χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο LE2 ως μήτρα DNA. Για ανιχνευτές που περιέχουν μεταλλάξεις, ίδιο εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν και των αντίστοιχων μεταλλαγμένο πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα. Οι αντιδράσεις πρόσδεσης ϋΝΑ-πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά σε ένα συνολικό όγκο 20 μΙ. Η αντίδραση περιείχε 60 fmole σημασμένο ανιχνευτή DNA, 4 μg πυρηνικό εκχύλισμα, 2 μg πολυ (δι • dC) και ρυθμιστικό σύνδεσης (1 mM Tris ρΗ 7,5, 7,5 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0.7% γλυκερίνη). Για τις δοκιμασίες ανταγωνισμού, η 1- έως 10-φορές μη επισημασμένου διπλόκλωνου DNA προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης 10 λεπτά πριν από την προσθήκη σημασμένου ανιχνευτή. Τα μίγματα της αντίδρασης στη συνέχεια διαχωρίστηκαν επί 4% μη μετουσιωτικής πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση σε 0,5 × ρυθμιστικό ΤΒΕ σε θερμοκρασία δωματίου στα 60 volt επί 1 ώρα. Τα συμπλέγματα ϋΝΑ-πρωτεΐνης μεταφέρθηκαν σε θετικά φορτισμένη μεμβράνη νάιλον (Roche, Ελβετία), με σταυροειδείς δεσμούς με υν χρησιμοποιώντας υν Stratalinker 2400 (Stratagene, USA). Διγοξιγενίνη-σημασμένο DNA ανιχνεύθηκε με DIG Gel Kit Shift, 2

δεύτερης γενιάς, με τη χρήση CDP-Star υποστρώματος (Roche, Ελβετία). Εικόνες εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για 15-20 λεπτά.

Η

Ανόπτηση

λυοφιλοποιημένες συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια αραιώθηκαν σε 100 μΜ, και στη συνέχεια αναμιγνύεται σε ισομοριακές συγκεντρώσεις σε ρυθμιστικό διάλυμα ανόπτησης (10 mM Tris, ρΗ 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) για τελική συγκέντρωση 3 μΜ το καθένα. μίγμα ανόπτησης θερμάνθηκε στους 100 ° C για 5 λεπτά και βραδέως ψύχθηκε στους 30 ° C κατά τη διάρκεια 1 ώρα. μεταγραφής

RNA

απομόνωση RNA και αντίστροφη απομονώθηκε με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε αντίστροφα με την M-MLV πολυμεράση και τυχαίους εξαμερείς εκκινητή (Promega, USA) σε ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 20 μΙ. PCR πραγματοποιήθηκε με GoTaq Πράσινο Master Mix (Promega, USA) και 1 μΐ του cDNA? για την ανίχνευση ακτίνης cDNA αραιώνεται στο δεκαπλάσιο. Οι εκκινητές για την διαφορετικά γονίδια που παρατίθενται στον Πίνακα 4.

Η

κυτταρικές σειρές Ανοσοστύπωμα Δοκιμασία

Jurkat, Η441 και Η460 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και κηλίδωση Western με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris ρΗ 7,6, 150 mM NaCl 5 mM EDTA, 0.5% ΝΡ40) που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης (0,1 mM φαινυλ-μεθυλ σουλφονυλ φθορίδιο? Ανάσχεση Αναστολέα Πρωτεάσης κοκτέιλ (Thermo Scientific), 5 mM EDTA), διατηρήθηκε στους 4 ° C για 15 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 12000 g και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Είκοσι πέντε μα προϊόντων λύσης πρωτείνης διαχωρίστηκε σε 8% SDS-PAGE. Αποφασισμένοι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν επί στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά ταχεία έκπλυση σε TBST (50 mM Τπδ.ΗΟΙ, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 0,2% Tween), οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε 3% BSA για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για c-Myb (Santa Cruz), Vav1 (Upstate Biotechnology Inc, USA), και β-ακτίνης (Santa Cruz) (αραιωμένο σε 1% BSA σε TBST) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε (3 χ 10 λεπτά) σε TBST σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύτηκαν με αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση 1:10000 αραιωμένο χρένο για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε 3 χ 10 λεπτά με TBST . Το σήμα ανιχνεύθηκε με ένα κιτ χημειοφωταύγειας ECL (Pierce, USA).

Αποτελέσματα

Ο ελάχιστος περιοχή προαγωγέα της ανθρώπινης vav1 και ιστοειδική έκφραση του

Οι αλληλουχίες των ελάχιστη περιοχή προωθητή του ανθρώπου και ποντικού

vav

1 έχουν δημοσιευτεί (ID Gene: 7409 και Gene ID: 22324, αντίστοιχα). Ανάλυση του ανθρώπινου

vav

1 προαγωγέα με TESS (Transcription System Element αναζήτησης? https://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess) αποκαλύπτει πολυάριθμες υποθετικές θέσεις σύνδεσης για παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων ETF, Sp1, E2F, NF-e, c-Μγβ, TCFα, PU.1 και ELF-1 (Σχήμα 1, εγκλωβιστούμε). Επιπλέον, ο υποκινητής περιέχει 8 πιθανές θέσεις CpG μεθυλίωσης (Σχήμα 1, επισημαίνεται με κόκκινο χρώμα και αριθμούνται αυθαίρετα 1-8).

Κουτιά υποδεικνύουν πιθανές θέσεις δέσμευσης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες όπως προβλέπεται από βιοπληροφορικής. Η θέση τους υποδεικνύεται σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (1 θέση). Οι υποθετικές θέσεις για CpG μεθυλίωσης επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα, οι αυθαίρετες σειριακούς αριθμούς τους κύκλο σε πράσινο.

Η

Tissue-ειδική έκφραση των γονιδίων μπορεί να επιτευχθεί με δραστηριότητα των μεταγραφικών παραγόντων ιστο-ειδικών, καθώς και από τον κανονισμό της συγγένειας μεταξύ παραγόντων δέσμευσης DNA και αλληλουχίες υποκινητή. Να προσδιορίσει ρυθμιστικές αλληλουχίες που απαιτούνται για την περιορισμένη έκφραση του

vav

1, δημιουργήσαμε ένα pGL3-

vav

1 κατασκεύασμα ανταποκριτή (LE2) που περιέχει τις ελάχιστες ρυθμιστικές αλληλουχίες του

vav

περιοχή προαγωγού 1 εγγύτερο [από νουκλεοτιδίου (nt) -287 έως +301 σε σχέση προς Μεταγραφή Έναρξη Ιστοσελίδας (TSS)] ανάντη ενός γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης. Για να επικυρωθεί ότι η έκφραση του LE2 αντιστοιχεί με το ενδογενές έκφραση του

vav

1 σε κύτταρα διαφορετικών ιστολογικών προελεύσεων, το πλασμίδιο επιμολύνθηκε σε Jurkat Τ κύτταρα και U937 κύτταρα μονοκυττάρων στο οποίο

vav

1 εκφράζεται φυσιολογικά, και σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα, όπου είναι παρεκκλίνοντα υπερεκφράζεται [23]. LE2 επίσης επιμολύνθηκε σε

vav

1-αρνητικές κυτταρικές σειρές: καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Η460 και Α549 [23]) και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής PANC1 [22] (Εικόνα 2Α).. Μετά την επιμόλυνση, λουσιφεράση εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα στους Vav1-κύτταρα που εκφράζουν (Jurkat, U937 και Η441), αλλά το επίπεδο έκφρασης του ήταν πολύ χαμηλό στο

vav

1-αρνητικές κυτταρικές γραμμές (Η460, Α549 και PANC1 ) έκφραση λουσιφεράσης σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα ήταν ακόμη υψηλότερο από ό, τι σε Jurkat Τ κύτταρα (Σχ. 2Α).

(Α) Εκφραση του άγριου τύπου (wt) γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (LE2) σε κυτταρικές σειρές από διάφορους προέλευση των ιστών. LE2 επιμολύνθηκε στις κυτταρικές γραμμές, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 24 ώρες αργότερα. Τα δεδομένα δείχνουν δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε ως προς

Renilla

ελέγχου αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και υπολογίζεται σε σχέση με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του ένα άδειο φορέα έκφρασης, pGL3. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν πέντε φορές. (Β) Σχηματική χάρτη της ρυθμιστικής περιοχής 5 ‘του ανθρώπινου

vav

1 γονίδιο. Οι θέσεις πρόσδεσης τρεις υποθετικές μεταγραφικού παράγοντα τονίζεται από κουτιά. Οι αλλαγές που εισάγονται σε αυτές τις περιοχές έχουν ως εξής: αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων (κόκκινο) και διαγραφές (τεθλασμένες γραμμές). (Γ) Η επίδραση αυτών των μεταλλάξεων /διαγραφές αναλύθηκε σε Jurkat Τ κύτταρα, μυελοειδή κύτταρα U937 και Η441 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα. Μετά την επιμόλυνση με πλασμίδια που περιέχουν λουσιφεράση υπό wt (LE2) ή μεταλλαγμένες

vav

1 προαγωγέα, η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε και πλάσια επαγωγή της δραστικότητας υπολογίστηκε σε σχέση με τη δραστηριότητα της LE2. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν πέντε φορές. Στατιστικά διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο τεστ Student Τ. (**) Δηλώνει ρ & lt? 0,05 αξίας και (***) υποδεικνύει ρ & lt?. 0.01

Η

Για να χαρακτηριστούν οι περιοχές προαγωγού που εμπλέκονται στην

vav

1 έκφρασης, δημιουργήσαμε αρκετές σημείο μεταλλάξεις και διαγραφές στο προβλεπόμενο παράγοντα μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης (υποδεικνύεται στο Σχήμα 2Β) και δοκιμάστηκε η έκφραση των κατασκευασμάτων ρεπόρτερ που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις σε διάφορες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2C). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι κάθε υποκατάσταση νουκλεοτιδίου ή διαγραφή στο υποθετικές αλληλουχίες σύνδεσης παράγοντα μεταγραφής μείωσε τη δραστικότητα του προαγωγού σε σχέση με το κατασκεύασμα άγριου τύπου, LE2 (Σχ. 2C). Για ορισμένες μεταλλάξεις, παρατηρήσαμε επίσης σημαντικές διαφορές μεταξύ των έκφρασή τους σε κύτταρα Jurkat, U937 και Η441. Για παράδειγμα, Le12, Le15 και Le17 είναι καλύτερα εκφράζονται σε Jurkat Τ κύτταρα παρά σε κύτταρα U937, υποδεικνύοντας ότι ακόμη και μεταξύ των κυττάρων αιματοποιητικής προέλευσης, υπάρχουν διαφορές στη ρύθμιση του

vav

1 έκφρασης. Le15 και Le17 μεταλλάξεις μεταφορά στην θέση πρόσδεσης PU.1, υποστηρίζοντας την ανάγκη για δέσμευση σε κύτταρα U937 PU.1. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές της διαφορικής απαιτήσεων για PU.1 για έκφραση Vav1 σε διαφορετικά αιμοποιητικά κύτταρα [15]. Le7 και Le12, τα οποία έχουν αντικαταστάσεις ζευγών βάσεων σε μια τοποθεσία υποτιθέμενη E2F /NF-e /δέσμευσης c-Μγβ, εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη έκφραση της λουσιφεράσης σε αιμοποιητικά κύτταρα? Ωστόσο, αυτές οι μεταλλάξεις έχουν μικρή μόνο επίδραση στην έκφραση λουσιφεράσης σε Η441 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η διαγραφή ολόκληρης της θέση E2F /NF-e /c-Myb (Le13) καταργεί λουσιφεράσης έκφραση σε όλες τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Μια σημειακή μετάλλαξη στο /θέση σύνδεσης Sp1 ETF (Le19) έχει μικρότερη επίδραση επί της έκφρασης γονιδίου αναφοράς σε αιμοποιητικών κυτταρικών γραμμών από ό, τι στην κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα, αλλά και πάλι, η διαγραφή ολόκληρου του θέση δέσμευσης (Le20) καταργεί την έκφραση λουσιφεράσης σε όλες οι κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Μεταλλαξιγένεση στο /PU.1 /ιστοσελίδα TCFα ELF-1 πρόσδεσης (Le15 και Le17) υποχωρεί λουσιφεράσης έκφρασης με παρόμοιο τρόπο σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν την εμπλοκή πολλών παραγόντων μεταγραφής στη ρύθμιση της έκφρασης Vav1 στα κύτταρα των διαφόρων ιστολογικών προέλευσης.

Για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι μεταλλάξεις μεταβάλλουν δέσμευσης των πυρηνικών πρωτεϊνών στο

vav

1 υποκινητή , πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA). Διγοξιγενίνη-επισημασμένο δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια -98 να +25 (lil 46-47) του

vav

1 προαγωγέα (Εικ. 3) χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτές σε παρουσία πυρηνικά εκχυλίσματα από Jurkat και Η441 κύτταρα. Άγρια ολιγονουκλεοτίδιο τύπος και ολιγονουκλεοτίδια με μεταλλάξεις που αντιστοιχούν στις μεταλλάξεις στα κατασκευάσματα ανταποκριτή χρησιμοποιήθηκαν (Εικ. 2Β). Τα σύμπλοκα πρωτεΐνης που συγκεντρώνουν για την αλληλουχία άγριου τύπου DNA στο πυρηνικό εκχύλισμα εμφανίζονται ως πέντε κύριες ζώνες (με την ένδειξη 1-5) σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές? Ωστόσο, η ένταση των ζωνών αυτών διαφέρει μεταξύ των δύο (Εικ. 3 κάτω). Έτσι, ζώνη 5 παρουσιάζει μια μεγαλύτερη ένταση στο πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα Η441 σε σχέση με το πυρηνικό εκχύλισμα από Jurkat Τ κύτταρα (19,2% έναντι 4,9%). Η σύνδεση του συμπλόκου πρωτεΐνης που αντιπροσωπεύεται από ζώνη 5 ήταν εν μέρει ή εντελώς χαθεί σε ορισμένες από τις μεταλλαγμένες αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (Εικ. 3). Αυτή η μπάντα εξαφανιστεί εντελώς στο GA & gt? AC και διαγραφή (-25 έως 38) μεταλλάξεις σε Jurkat Τ κύτταρα, ενώ σε Η441 εξαφανίστηκε μόνο στο -25 έως 38 μετάλλαγμα διαγραφής, έτσι πιθανώς αντιστοιχεί σε απώλεια δραστικότητας προαγωγού της διαγραφής μετάλλαξη στα κύτταρα Η441 (Σχ. 2C). Επιπλέον, η ένταση της ζώνης 4 είναι χαμηλότερη στην GA & gt? AC και διαγραφή (-25 έως 38) μεταλλάξεις σε Jurkat Τ κύτταρα, ενώ δεν αλλάζει σε κύτταρα Η441 (Εικ. 3). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σαφώς την υπάρχουν διαφορές σε σύμπλοκα πρωτεΐνης συναρμολογούνται στην περιοχή του υποκινητή σε κύτταρα από διαφορετικές προελεύσεις. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η περιοχή του

vav

1 υποκινητή μεταξύ -98 και 25 είναι κρίσιμης σημασίας για το

vav

1 έκφρασης σε διάφορες κυτταρικές σειρές και κωδικοποιεί υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για αρκετούς παράγοντες μεταγραφής.

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) με Jurkat και Η441 πυρηνικά εκχυλίσματα διεξήχθη παρουσία lil46-47 διγοξιγενίνη-σημασμένο ανιχνευτή (νουκλεοτίδια -98 να +28 του

vav1

προαγωγέα). Για την παραγωγή των μεταλλαγμένων ολιγονουκλεοτιδίων, τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα πλασμίδια (που φαίνεται στο Σχ. 2Β σχηματική) χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρα για την PCR. Μία σχηματική ρυθμιστικών αλληλουχιών

vav

1 5 ‘, το εξόνιο 1 και η σχετική θέση ολιγονουκλεοτιδίου εμφανίζεται στο κάτω μέρος. Τα δεσμευμένα συμπλέγματα πρωτεΐνης αριθμούνται από το 1 έως 5. Το βέλος δείχνει τη θέση του συμπλόκου 5, το βαρύτερο σύμπλεγμα που είναι ευαίσθητη στις μεταλλάξεις που εισάγονται στην αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίου. Τα κάτω πάνελ του σχήματος δείχνουν σχηματικά την σχετική ένταση των ζωνών 1-5 του πειράματος EMSA όπως καθορίζεται με πυκνομετρία (λογισμικό ImageJ).

Η

c-Myb εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης vav1 σε αιμοποιητικά και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

Ενώ PU.1 εκθέματα ειδικότητα για το μυελοειδούς κυτταρικής γραμμής, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [27] – [29], τα περισσότερα από τους άλλους παράγοντες μεταγραφής φαίνεται να εκφράζεται παντού, αν και σε διαφορετικά επίπεδα. Ένας παράγοντας μεταγραφής που μπορεί να επηρεάζουν το επίπεδο των

vav

1 έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα είναι c-Μγβ. c-Myb εκφράζεται έντονα σε ανώριμα αιμοποιητικά κύτταρα και ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης [30], [31]. Για να καθοριστεί αν η θέση δέσμευσης c-Μγβ στο

vav

1 υποστηρικτής συμμετέχει στην παραγωγή των συμπλόκων πρωτεΐνης, χρησιμοποιήσαμε ένα διπλής έλικας ολιγονουκλεοτιδίων που περιλαμβάνει τις θέσεις δέσμευσης για τους παράγοντες μεταγραφής Ε2Ρ /NF1-e /c-Μγβ και TCFα /PU.1 /ELF1 (Lil 157-158, Πίνακας 3). Οι μεταλλάξεις που εισάγονται στη θέση σύνδεσης c-Myb (ΤΤ & gt? AA) επηρέασε τη συγγένεια του Τ Jurkat πολύπλοκα κύτταρα πρωτεΐνη όπως προσδιορίζεται με μία δοκιμασία ανταγωνισμού (Σχήμα 4Α.), Ενώ η επίδραση της μετάλλαξης στη θέση πρόσδεσης E2F (GA & gt? AC ) είχε μικρότερο αποτέλεσμα (Σχ. 4Α). Με τη χρήση μιας μικρότερης ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει μόνο την θέση c-Myb /Ε2Ρ πρόσδεσης (Πίνακας 3, lil87-88)? παρατηρήσαμε ότι μόνο ένα σύμπλοκο πρωτεΐνης σχηματίζεται με πυρηνικά εκχυλίσματα από Jurkat Τ κυττάρων (Σχ. 4Β). Αυτό το σύμπλοκο πρωτεΐνης είναι εντελώς διαταράσσεται όταν ο ΤΤ & gt? Χρησιμοποιείται μετάλλαξη ΑΑ (θέση δέσμευσης c-Μγβ), ενώ η GA & gt? Μετάλλαξη AC (E2F θέση δέσμευσης) εξακολουθεί να αποτελεί μια παρόμοια ταινία με το ολιγονουκλεοτίδιο άγριου τύπου (WT), αν και σε ένα χαμηλότερο επίπεδο (Σχ. 4Β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα του Σχήματος 4Α, μετάλλαξη στο c-Myb επηρεάσει την ικανότητα του συμπλόκου πρωτεΐνης να δεσμεύει DNA και GA & gt? AC υποκατάσταση έχει ένα μικρότερο αλλά σημαντικό αποτέλεσμα

(Α) προσδιορισμός μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. (EMSA) με Jurkat πυρηνικών εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε με την παρουσία του με διγοξιγενίνη σημασμένο ανιχνευτή που καλύπτει τα νουκλεοτίδια -45 έως 0 από

vav1

υποκινητή και περιέχουν E2F /NF-e /c-Myb και TCFα /PU.1 /θέσεις ELF1 πρόσδεσης (lil157-158? Πίνακας 3). Η δοκιμασία ανταγωνισμού διεξήχθη με το σεσημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο και μη επισημασμένο ανταγωνιστή ολιγονουκλεοτίδια με σημειακές μεταλλάξεις όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 3 σε γραμμομοριακή αναλογία 1:01 και 1:05. Το βέλος δείχνει τη θέση του συμπλόκου που παρουσιάζει ευαισθησία στις εισαχθείσες μεταλλάξεις. (Β) EMSA που εκτελούνται με σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει μόνο /E2F θέση δέσμευσης /NF-e c-Μγβ (Lil 87-88? Πίνακας 3).

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω αν C-

myb

εμπλέκεται στην έκφραση Vav1, αναλύσαμε την έκφραση της σε κύτταρα διαφορετικών ιστολογικών προελεύσεων και διαπίστωσε ότι

c-myb

mRNA και η πρωτεΐνη είναι παρούσα σε Jurkat Τ κύτταρα και σε χαμηλότερα επίπεδα σε καρκίνο του πνεύμονα Η441 κύτταρα, αλλά είναι δύσκολα ανιχνεύσιμη σε Η460 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα που δεν εκφράζουν

vav

1 (Σχ. 5Α). Για να εξεταστεί εάν το c-Myb συμμετέχει στη ρύθμιση του

vav

1 έκφραση, μπορούμε συνεπιμολύνονται φορέα έκφρασης c-Myb είτε με ένα κενό φορέα ή με LE2 σε κύτταρα Η460 (Εικ. 5Β). Συν-trasnfection του

c-myb

με LE2 αυξάνει σημαντικά την έκφραση του γονιδίου αναφοράς σε σύγκριση με την έκφραση του LE2 μόνο (άνω πάνελ). Μπορούμε επίσης να προσδιορίσει το επίπεδο του

c-myb

έκφραση mRNA και πρωτεΐνης στα διαμολυσμένα κύτταρα (κάτω πίνακας). Κάτω ρύθμιση του

c-myb

με επιμόλυνση του siRNA σε Η441 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μειώθηκε σημαντικά

vav

1 έκφρασης (Εικ. 5C). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι το c-Myb παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του

vav

1 σε επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) Ενδογενής έκφραση του

c-myb

mRNA σε Jurkat Τ κύτταρα, Η441 (

vav

1-θετικό) και Η460 (

vav

1-αρνητικό) κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ανιχνεύθηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western. (Β) άδειο φορέα pGL3 ή το κατασκεύασμα ανταποκριτή wt LE2 διαμολύνθηκε είτε μόνο ή με ένα c-Myb εκφράζουν πλασμιδίου σε Η460 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (όπως στο Υλικά και Μέθοδοι). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση (άνω πάνελ). Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης εκφράζεται ως φορές επαγωγής σε σχέση με τις βασικές έκφραση pGL3. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος των πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων? σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη ζευγαρωμένο τεστ Student Τ. (***) Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01. Το κάτω πάνελ δείχνει το επίπεδο της

c-myb

και mRNA ακτίνης και η έκφραση πρωτεΐνης στα επιμολυσμένα κύτταρα όπως προσδιορίζεται με RT-PCR και κηλίδωση Western αντίστοιχα. (Γ) Η441 καρκίνου πνεύμονος κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με κωδικοποιημένο DNA (-) ή με siRNA εναντίον c-Myb. Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, τα επίπεδα του mRNA της

c-myb

,

vav1

και

ακτίνη

ανιχνεύθηκαν με RT-PCR.

Η

η μεθυλίωση των επί μέρους περιοχών CpG σε ανθρώπινο υποκινητή vav1 είναι σημαντική για την ρύθμιση της έκφρασης του

Οι αλλαγές στην προσβασιμότητα DNA για παράγοντες DNA δεσμευτικών συμμετέχουν επίσης στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ένας μηχανισμός που επηρεάζει την προσβασιμότητα DNA είναι μεθυλίωση των CpG δινουκλεοτιδίων σε ειδικές θέσεις δέσμευσης πρωτεΐνης [32]. Έχει αποδειχθεί ότι επιγενετικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένων μεθυλίωση, παίζουν σημαντικό ρόλο στην παρεκκλίνουσα

vav

1 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [22]. Ωστόσο, η μελέτη αυτή δεν αποκρυπτογραφήσουν τον μηχανισμό σε βάθος. Για να αρχίσει να αξιολογηθεί ο ρόλος της μεθυλίωσης στη ρύθμιση της έκφρασης Vav1, αναλύσαμε μεθυλίωση του

vav

1 προαγωγό σε δείγματα από διαφορετικούς φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς (Πίνακας 5). Περίπου 600 bp του

vav

1 αλληλουχίες υποκινητή ανάντη και κατάντη του TSS αναλύθηκαν με όξινο θειώδες αλληλούχιση. Εντυπωσιακά, στα λεμφοκύτταρα, παρατηρήσαμε καμία μεθυλίωση οποιαδήποτε από τις υποθετικές θέσεις μεθυλίωσης CpG αλληλουχία. Αντίθετα, στο DNA από ιστούς που συνήθως δεν εκφράζουν Vav1, ανιχνεύσαμε διάφορους βαθμούς μεθυλίωσης σε σημεία του

vav

1 υποκινητή (Πίνακας 5). Για παράδειγμα, το επίπεδο μεθυλίωσης στο πάγκρεας είναι 48-100%, στον πνεύμονα, το επίπεδο είναι μεταξύ 22-50%, ενώ στο παχύ έντερο, το ποσοστό της μεθυλίωσης είναι πολύ χαμηλή (μεταξύ 4 έως 15 τοις εκατό). 2Α.