Αφηρημένο

Η επίτευξη μιας αποτελεσματικής θεραπείας του καρκίνου είναι δύσκολη, ιδιαίτερα όταν η αντίσταση σε συμβατική χημειοθεραπεία έχει αναπτυχθεί. Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) δραστηριότητα διέπει αντοχής πολυ-φαρμάκου (MDR) ανάπτυξη σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων. Ταυτοποίηση των αντικαρκινικών παραγόντων με δυνατότητα να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα και συγχρόνως αναστέλλουν MDR είναι σημαντικό να εντείνει την αναζήτηση για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Εξετάσαμε τα αποτελέσματα της sulfinosine (SF), ένα ανάλογο αρκετά ανεξερεύνητα πουρίνης, το MDR (P-gp υπερεκφράζουν) μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) και κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος (NCI-Η460 /R και U87-TxR , αντίστοιχα). SF έδειξαν την ίδια αποτελεσματικότητα έναντι καρκινικών κυτταρικών γραμμών MDR και ευαίσθητο αντίστοιχά τους. Ωστόσο, ήταν μη τοξική για τα φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HaCaT). SF επαγόμενη κασπάσης-εξαρτώμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα MDR. Μετά την εφαρμογή SF, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παράχθηκαν και συγκέντρωση γλουταθειόνης (GSH) μειώθηκε. Η έκφραση του ένζυμο-κλειδί για τη σύνθεση GSH, γάμμα γλουταμυλ-κυστεΐνη-συνθετάση (γGCS) μειώθηκε, καθώς και την έκφραση του

GST-π

mRNA. Κατά συνέπεια, SF μείωσε σημαντικά την έκφραση του

HIF-1α

,

MDR1

και

VEGF

mRNAs ακόμη και σε συνθήκες υποξίας. SF προκάλεσε την αναστολή της P-gp (κωδικοποιείται από

MDR1

) έκφραση και δραστηριότητα. Η συσσώρευση του προτύπου χημειοθεραπευτικού παράγοντα – δοξορουβικίνη (ϋΟΧ) προκλήθηκε με SF σε συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Το καλύτερο αποτέλεσμα του SF λήφθηκε μετά από 72 ώρες, όταν επιτευχθεί το αποτέλεσμα των γνωστών αναστολέων της P-gp (Dex-βεραπαμίλη και tariquidar). Κατά συνέπεια, SF ευαισθητοποιημένα τα ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα να DOX σε μετέπειτα επεξεργασία. Επιπλέον, SF μείωσε την experssion του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) σε mRNA και το επίπεδο πρωτεΐνης και διαμορφωμένο έκκριση της. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα επί της P-gp (εμπλέκονται στην φαρμακοκινητική και MDR), GSH (εμπλέκονται στην αποτοξίνωση) και VEGF (εμπλέκεται σε όγκο αγγειογένεσης και προόδου) πληρούν τις προϋποθέσεις SF ως πολυ-ισχυρός αντικαρκινικός παράγοντας, ο οποίος πρέπει να θεωρείται χρήση , ιδίως για τις ανθεκτικές κακοήθειες

Παράθεση:. Dačević M, Ισάκοβιτς Α, Podolski-Renić Α, Ισάκοβιτς AM, Stanković Τ, ο Μιλόσεβιτς Ζ, et al. (2013) πουρίνης Αναλογική – Sulfinosine ρυθμίζει ποικίλους μηχανισμούς του καρκίνου Εξέλιξη στο Multi-Drug Resistant Lines Cancer Cell. PLoS ONE 8 (1): e54044. doi: 10.1371 /journal.pone.0054044

Επιμέλεια: Michihiko Kuwano, το Πανεπιστήμιο Kyushu, Ιαπωνία

Ελήφθη: 26 Ιουλίου, 2012? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Dačević et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογικής Ανάπτυξης της Σερβίας (αριθμοί επιχορήγηση ΙΙΙ 41031 και ΙΙΙ 41025) υποστήριξαν αυτή την έρευνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Sulfinosine ή SF (Σχήμα 1, [R, S] -2-αμινο-9-β-D-ribofuranosylpurine-6-σουλφιναμιδίου) είναι η οξειδωμένη μορφή του 6-θειογουανοσίνη [1]. Είναι μια αρκετά ανεξερεύνητη αντικαρκινικού παράγοντα σε σύγκριση με άλλα θειοπουρίνες (6-θειογουανίνη και 6-μερκαπτοπουρίνη). SF αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τουλάχιστον εν μέρει, με την ενσωμάτωση του φωσφορυλιωμένου παραγώγου του στο DNA. Η μεταβολική μετατροπή του SF στα αντίστοιχα παράγωγα 5′-μονοφωσφορική είναι πιο περίπλοκη από ό, τι εκείνη των άλλων θειοπουρίνες [2].

Η

Από SF χρησιμοποιεί διαφορετικές μεταβολικές οδούς για ενδοκυτταρική ενεργοποίηση της, η θεραπεία SF δεν προκαλεί αντίσταση σε καρκινικά κύτταρα. Σε αντίθεση, η διαγραφή ενός μόνο ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη μεταβολική ενεργοποίηση άλλων αναλόγων πουρίνης νουκλεοσιδίου είναι αρκετό για την ανάπτυξη της αντίστασης. SF καλύτερα διεισδύει στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) από τη γονική μόριο του – 6-θειογουανοσίνη και είναι πιο αποτελεσματική στη θεραπεία του καρκίνου. SF είναι χρήσιμη έναντι κακοηθειών ανθεκτικά σε άλλες θειοπουρίνες [3]. Παρά τους περιορισμούς για τη χρήση τους, κάποιοι ανάλογα πουρίνης στενά συνδεδεμένη με SF έδειξαν σημαντική αντι-αγγειογενετική δραστηριότητες που αξίζουν επιστημονική προσοχή [4].

Ο μεταβολισμός της SF περιλαμβάνει σύστημα της γλουταθειόνης των κυττάρων. SF προϊόντα προσθήκης ευκόλως εις ενώσεις σουλφυδρυλίου (γλουταθειόνη και κυστεΐνη) και με την καταστολή του συστήματος γλουταθειόνη αποτοξίνωση και την ανύψωση της συγκέντρωσης του αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), SF μπορεί να προκαλέσει τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων. [2]

Λόγω σημαντικής αποτελεσματικότητά της στη θεραπεία του καρκίνου και μέτρια τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα [2], SF είναι κατάλληλη για συνδυασμό με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. SF δρα συνεργικά με δοξορουβικίνη (ϋΟΧ), κουρκουμίνη (CUR) και βεραπαμίλη (VER) σε μη μικροκυτταρικό κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) [5] – [7]. Η αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης εφαρμογής με SF επέτρεψε τη χρήση αυτών των φαρμάκων σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις που είναι λιγότερο τοξικά με λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες. Υποθέσαμε ότι όλοι αναφέρουν αντικαρκινικές επιδράσεις του SF θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες για την αναστροφή της αντοχής σε χημειοθεραπευτικά.

αντοχή πολυφαρμάκου (MDR) είναι ο κύριος περιορισμός για την επίτευξη επιτυχούς θεραπείας του καρκίνου. MDR φαινότυπο συχνά σχετίζεται με την υπερ-έκφραση της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp), ένας μεταφορέας μεμβράνης που εξωθεί αποτελεσματικά τα κυτταροτοξικά φάρμακα από τα καρκινικά κύτταρα και αλλάζει τη φαρμακοκινητική τους. P-gp λειτουργεί ως αντλία εκροής για διάφορα υδρόφοβα αντικαρκινικών φαρμάκων όπως ανθρακυκλίνες, αλκαλοειδή βίνκα, ταξάνες, επιποδοφυλλοτοξίνες, και μερικά από τα νέα φάρμακα (π.χ. imatinib, nilotinib, everolimus). P-gp υπερ-έκφραση είναι κοινή σε πειραματικά μοντέλα καρκίνου, καθώς και σε καρκινικούς ιστούς από ασθενείς [8]. Ως εκ τούτου, P-gp έχει γίνει ένα κύριο θεραπευτικό στόχο για την αντιμετώπιση MDR.

Μεταξύ των πολλών επιλογών για την επιστροφή των MDR, οι παράγοντες με μια αντικαρκινική δραστηριότητα της δικής τους θα μπορούσε να εξεταστεί ως πιθανοί ρυθμιστές MDR. Έχουμε σκεφτεί νωρίτερα ότι εκτός από τη συνέργεια μεταξύ SF και DOX ως αντικαρκινικά φάρμακα που δρουν μέσω διαφορετικών οδών, οι μεταβολές της MDR που σχετίζονται με τα γονίδια έκφρασης και μείωση της δραστηριότητας της P-gp μπορεί να συμβάλλουν στο φαινόμενο του χημειο-ευαισθητοποίηση των SF [5], [6].

Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στη δράση SF σε ανθεκτικούς και ανίατες μορφές καρκίνου. Προς τούτο, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου MDR με την υπερ-έκφραση της Ρ-gp (ΝΟΙ-Η460 /R και U87-TxR) [9], [10]. Μελετήσαμε το δυναμικό του SF για να σκοτώσει ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα και να επάγει autophagy καθώς και για την διαμόρφωση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, όπως η γλουταθειόνη (GSH) σύστημα αποτοξίνωσης, P-gp μεταφορές μεσολάβηση φάρμακο, αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) έκφραση and.secretion. Βρήκαμε ότι η τροποποίηση των οξειδοαναγωγική κατάσταση με SF οδήγησε στη μείωση της έκφρασης της υποξίας επαγώγιμου παράγοντα-1α (HIF-1α), η οποία ρυθμίζει την έκφραση της Ρ-gp και VEGF. Έτσι, η διαμόρφωση των MDR από SF είναι η συνέπεια της καταστολής GSH συστήματος αποτοξίνωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ναρκωτικά

SF ([R, S] -2-αμινο -9-β-D-ribofuranosylpurine-6-σουλφιναμιδίου) συντέθηκε από 6-θειογουανοσίνη σύμφωνα με τη δημοσιευμένη διαδικασία [1]. λύση DOX λήφθηκε από Ebewe Arzneimittel GmbH, Βιέννη, Αυστρία. R ± Verapamil (Dex-VER) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Γερμανία. Tariquidar (ΔΠ) παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Sven Rottenberg από το Ολλανδικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Άμστερνταμ. CoCl

2 ελήφθη από τη Fisher Scientific, USA. SF διατηρήθηκε στους -20 ° C. Πριν από τη θεραπεία, SF και CoCl

2 είχαν πρόσφατα αραιωμένου σε νερό, ενώ κλάσματα του DOX αποψύχθηκαν από -20 ° C. Dex-VER διατηρήθηκε ως 1 mM διάλυμα παρακαταθήκης σε θερμοκρασία δωματίου. TQ αραιώθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και 10 μΜ δείγματα διατηρήθηκαν στους -20 ° C.

Χημεία

RPMI 1640, Minimum Essential Medium (ΜΕΜ), πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη λύση, αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό λύση, L-γλουταμίνη και θρυψίνη /EDTA αγοράστηκαν από ΡΑΑ, Βιέννη, Αυστρία. Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS), σουλφοροδαμίνη Β (SRB) και πορτοκαλί της ακριδίνης ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Γερμανία. Matrigel παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Σάνια Μιγιάτοβιτς από το Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών «Σίνισα Στάνκοβιτς», του Πανεπιστημίου του Βελιγραδίου, Σερβία. Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) αγοράστηκε από την Roche Applied Science, Βασιλεία, Ελβετία και αννεξίνη-V-FITC (AV) από Abcam, Cambridge, UK. FITC-συζευγμένο αντι-Ρ-gp αντίσωμα που παρέχεται από BD Biosciences, Ηνωμένο Βασίλειο, ενώ ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα αντι-νΕΟΡ αποκτήθηκε από R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ USA. Ηλεκτριμιδυλικό εστέρα καρβοξυφλουοροσκεϊνης (CFSE), dihydroethidium (DHE) ελήφθη από την Molecular Probes®, Invitrogen, CA, USA. Πρωτογενή αντισώματα έναντι της κασπάσης 3 και β-ακτίνης αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology Inc, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ, ενώ πρωτογενές αντίσωμα έναντι της συνθετάσης γ-glutamylcysteine ​​(γGCS) ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr Bato Κόρατς, Ινστιτούτο Βιολογικών Ερευνών και Μελετών «Σίνισα Στάνκοβιτς «, Πανεπιστήμιο του Βελιγραδίου, Σερβία. Η συζευγμένη υπεροξειδάση IgG κατσίκας αντι-κουνελιού ελήφθη από την Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, ΡΑ, USA.

Cells and Cell Culture

κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η460 και U87 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection, Rockville, MD. κύτταρα NCI-H460 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 4,5 g /γλυκόζη L, 10.000 U /mL πενικιλλίνη, 10 mg /mL στρεπτομυκίνη, /mL διάλυμα 25 μg αμφοτερικίνη Β εις 37 ° C στο

2 ατμόσφαιρα υγροποιημένη 5% CO. ΝΟΙ-Η460 /R κύτταρα επελέγησαν αρχικά από κύτταρα ΝΟΙ-Η460 στο εργαστήριο μας και καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε 100 ηΜ DOX όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. κύτταρα U87 καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, L-γλουταμίνη (2 mM) και 5000 U ml πενικιλίνη, 5 mg /ml στρεπτομυκίνη διάλυμα /. κύτταρα U87-TxR επιλέχθηκαν από κύτταρα U87 στο εργαστήριο μας μετά από συνεχή έκθεση σε σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις της πακλιταξέλης (100-300 ηΜ) για μια περίοδο 9 μηνών που έχουν ήδη δημοσιευθεί [10]. κυτταρική σειρά HaCaT (φυσιολογικών ανθρώπινων κερατινοκυττάρων που λαμβάνονται από την CLS – κυττάρων Γραμμές Υπηρεσία, Eppelheim, Γερμανία) ήταν γενναιόδωρο δώρο από τον καθηγητή Andra Jorg, Τμήμα Βιοφυσικής, Ερευνητικό Κέντρο Borstel, Leibniz-Κέντρο Ιατρικής και Βιοεπιστημών, Borstel, Γερμανία. κύτταρα HaCaT καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 4 g /L γλυκόζη, L-γλουταμίνη (2 mM) και /ml πενικιλίνη, 5 mg /ml στρεπτομυκίνη διάλυμα 5000 U. MDR καρκινικά κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν σε διαστήματα 72 ώρες χρησιμοποιώντας 0,25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ και σπάρθηκαν μέσα σε ένα φρέσκο ​​μέσο στις ακόλουθες πυκνότητες: 8000 κύτταρα /cm

2 για ΝΟΙ-Η460, 16.000 κύτταρα /cm

2 για NCI-Η460 /R και U87, 32.000 κύτταρα /cm

2 για U87-TxR. κύτταρα HaCaT υπο-καλλιεργήθηκαν σε διαστήματα 144 ώρες χρησιμοποιώντας 0,25% θρυψίνη /ΕϋΤΑ και σπάρθηκαν μέσα σε ένα φρέσκο ​​μέσο στους 64, 000 κύτταρα /cm

2.

σουλφοροδαμίνη Β Δοκιμασία

Cells καλλιεργούνται σε 25 cm

2 φιάλες ιστού θρυψινοποιήθηκαν, σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας επίπεδου πυθμένα 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Διερευνηθεί κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η460, ΝΟΙ-Η460 /R, U87, U87-TxR και τα κύτταρα HaCaT σπάρθηκαν σε 4, 000, 8000, 8000 και 16000 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως. επεξεργασία SF (1-100 μΜ) διήρκεσε 72 ώρες. Οι κυτταρικές πρωτεΐνες βάφτηκαν με σουλφοροδαμίνη Β (SRB) δοκιμασία, μετά ελαφρώς τροποποιημένο πρωτόκολλο του Skehan et al [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων σταθεροποιήθηκαν σε 50% τριχλωροξικό οξύ (50 μί /φρεάτιο) για 1 ώρα στους 4 ° C, ξεπλύθηκαν σε νερό βρύσης και βάφονται με 0,4% (w /v) σουλφοροδαμίνη Β σε 1% οξικό οξύ (50 μί /φρεάτιο) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν τρεις φορές σε 1% οξικό οξύ για την απομάκρυνση του μη δεσμευμένου λεκέ. Ο λεκές πρωτεΐνη δεσμευμένη εκχυλίζεται με 200 μL 10 mM Tris βάση (ρΗ 10,5) ανά φρεάτιο. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 540 nm, με διόρθωση στα 670 nm (ΕΚΒ 5060-006 Micro αναγνώστη πλάκας, Βιέννη, Αυστρία).

Matrigel Ανάπτυξης

Όσον αφορά τα τρισδιάστατα (3-D ) καλλιέργειες, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στις ίδιες πυκνότητες όπως και για δύο (2-D) καλλιέργειες επάνω σε ανασύσταση (προ-γέλης) βασική μεμβράνη (Matrigel? BD Biosciences, San Jose, CA, USA) σε μέσο RPMI 1640 με 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες και φωτογραφήθηκε ζωντανά από μικροσκοπία φάσης.

Προσδιορισμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού (CFSE χρώσης)

Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων επισημάνθηκαν με καρβοξυφλουορεσκεϊνη ηλεκτριμιδυλ εστέρα ή CFSE [12]. Εν συντομία, ανεξάρτητο κύτταρα (5 × 10

6 κύτταρα /mL) βάφτηκαν με 1 μΜ CFSE για 10 λεπτά σε σκοτάδι στους 37 ° C, πλύθηκαν δύο φορές σε φρέσκο ​​μέσο, ​​εμβολιάστηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε 5 × 10

4 ανά φρεάτιο, και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε SF. Μετά από 72 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS. Τέλος, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Πράσινο εκπομπή φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό τηλέφωνα-Quest.

κυτταρικού θανάτου Ανίχνευση

Τα ποσοστά των αποπτωτικών, νεκρωτική και βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν με Annexin-V-FITC (AV) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) επισήμανσης. ΝΟΙ-Η460 /κύτταρα U87-TxR R και απλώθηκαν και επωάστηκαν για μία νύχτα σε τρυβλία 6 φρεατίων σε πυκνότητα 80.000 και 160.000 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως. Μετά από 72 ώρες αγωγής SF, οι συνημμένες και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Το σφαιρίδιο κυττάρων επαναιωρήθηκε σε 100 μL ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης περιέχει 10 mM HEPES /NaOH, 140 mM NaCl, 5 mM ΟαΟ

2 (ρΗ 7.4), συμπληρωμένο με 0.2 μg AV και 1 μg ΡΙ. Μετά την περίοδο επώασης (30 λεπτά στους 37 ° C σε σκοτάδι), επιπλέον 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης προστέθηκε και χρώση AV /ΡΙ αναλύθηκε μέσα σε 1 ώρα με κυτταρομετρία ροής. Η ένταση φθορισμού (πράσινο FL1-Η και κόκκινο FL2-Η) μετρήθηκε σε FACSClibur κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο). Σε κάθε δείγμα, 10.000 κύτταρα καταγράφηκαν (gated να αποκλείσει συντρίμμια κυττάρων), καθώς και τα ποσοστά των βιώσιμων (από τον μέσο ΡΙ-), πρώιμων αποπτωτικών (AV + ΡΙ-), αποπτωτικών και νεκρωτικές (AV + ΡΙ +), και ήδη νεκρός (από τον μέσο κύτταρα ΡΙ +) αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest Pro ανάλυσης δεδομένων.

Caspase Ενεργοποίηση

η ενεργοποίηση των κασπασών μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά την επισήμανση των κυττάρων με ένα κύτταρο-διαπερατό, ΡΙΤΟ-συζευγμένο παν- αναστολέας κασπάσες (ApoStat? Ε & amp? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αύξηση του πράσινου φθορισμού (FL 1-Η) ως μέτρο της δραστικότητας της κασπάσης εντός μεμονωμένων κυττάρων του υπό θεραπεία πληθυσμού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας FACSCalibur κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο).

Autophagy Αξιολόγησης

Η εμφάνιση των όξινων κυστιδίων αυτοφαγικά ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Αφού τα κύτταρα θεραπεία SF θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C με 1 μΜ πορτοκαλί της ακριδίνης. Ακριδίνης πορτοκαλί-βάφονται πυρήνες κυττάρων είναι φθορίζον πράσινο, ενώ αυτοφαγικά λυσοσώματα είναι φθορίζον πορτοκαλί-κόκκινο. Η αύξηση στο κόκκινο έναντι πράσινο (FL3 /FL 1) αναλογία φθορισμού, αντανακλώντας την αυτοφαγία, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο) και Cell Quest λογισμικό Pro.

Western Blot

τα κύτταρα που αυξήθηκαν σε 100 mM δίσκους Petri στο εξής πυκνότητες: 400.000 κύτταρα ανά τρυβλίο για ΝΟΙ-Η460 /R και 750.000 ανά πιάτο για U87-TxR λύθηκαν μετά από θεραπεία SF με ρυθμιστικό λύσης (30 mM Tris-HCl ρΗ 8.9, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40) που περιείχε 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Γερμανία). Μετά από 30 λεπτά σε πάγο, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 14 000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε 6-15% πηκτώματα και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Μετά την επώαση με πρωτογενή αντισώματα έναντι κασπάσης 3, β-ακτίνη και glutamylcstein συνθετάση γάμμα (γGCS) και συζευγμένο με υπεροξειδάση IgG αίγας αντι-κουνελιού ως το δευτερεύον αντίσωμα, ειδικό πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Amersham ECL (GE Healthcare Life Sciences, UK) . Τα επίπεδα πρωτεΐνης του γGCS ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ και εκφράζεται σε σχέση με β-ακτίνη.

DHE Χρώση

κυτταρομετρίας ροής μετρήσεις dihydroethidium (DHE) -fluorescence χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί ROS συγκέντρωση σε καρκινικά κύτταρα MDR. Τα προσκολλημένα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε PBS με 10% FBS και 10 μΜ DHE για 45 λεπτά. DHE-φθορισμός αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (διέγερση 488 nm, και εκπομπή 585 nm, FL2-H κανάλι). Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) υπολογίστηκε μετά από διόρθωση για αυτοφθορισμό.

χρωματομετρική ανίχνευση της γλουταθειόνης (GSH)

Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 25 εκατοστά

2 φιάλες ιστού θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. Ο ίδιος αριθμός κυττάρων (2.5 χ 10

6) για κάθε δείγμα εκτέθηκε σε περαιτέρω διαδικασία. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 700 χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Στη συνέχεια, το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 0,5 ml παγωμένο PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 700 χ g για άλλα 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα λύθηκαν σε 80 μΙ παγωμένου Γλουταθειόνης Buffer (GSH χρωματομετρική ανίχνευση Kit, Bio-Vision, CA) για 10 λεπτά επί πάγου. Στη συνέχεια, 20 μΙ 5% σουλφοσαλικυλικό οξύ προστέθηκε και τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 8000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε έναν φρέσκο ​​σωλήνα και χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασία GSH. Η γλουταθειόνη Buffer προστέθηκαν σε κάθε (πλάκα 96 φρεατίων) και σε όγκο 160 μΐ και επωάστηκαν 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, 20 μΙ είτε παρασκευασμένα πρότυπα ή δείγματα προσετέθησαν σε κάθε φρεάτιο και επωάζεται για άλλα 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, 20 μΙ του διαλύματος υποστρώματος (GSH χρωματομετρική ανίχνευση Kit, BioVision, CA) προστέθηκε και η απορρόφηση των παραγόμενων προϊόντων (2-νιτρο-5-θειοβενζοϊκό οξύ) μετρήθηκε στα 405 nm (ΕΚΒ 5060-006 Micro Plate Reader, Βιέννη , Αυστρία). Οι συγκεντρώσεις των GSH προσδιορίστηκαν με τη χρήση της πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης GSH και σχετίζονται με τις συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών στα κυτταρολύματα. Η ανίχνευση GSH για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε τουλάχιστον έξι φορές.

RNA Εκχύλιση και RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από μη επεξεργασμένα κύτταρα /R και U87-TxR ΝΟΙ-Η460 και τα κύτταρα αντιμετωπίζονται με SF. Η απομόνωση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA προσδιορίστηκε ποσοτικά σε φασματοφωτόμετρο και την ποιότητα προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής (RT) χρησιμοποιώντας 25 μg ολικού RNA διεξήχθησαν με ολιγο-dT εκκινητές χρησιμοποιώντας τα M-MLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Gibco BRL, Η.Π.Α.) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν με εκκινητές ειδικούς για,

GST-π

,

VEGF

,

MDR1

και

HIF-1α

[13] – [16 ], β

β-ακτίνης

[17] και

GAPDH

[18] χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος και συν-ενισχύεται με γονίδια που μας ενδιαφέρουν σε όλα τα πειράματα PCR.

οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν το σύστημα PCR GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems, CA, USA) υπό τις ακόλουθες προϋποθέσεις για την

HIF-1α

,

MDR1

και

GST-π

: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, 24, 25 ή 28 κύκλους (αντίστοιχα) στους 95 ° C για 15 s, 56 ° C για 30 s, 72 ° C για 30 s και στους 4 ° C επ ‘αόριστον. Όταν PCR πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση του

VEGF

γονίδιο, 35 κύκλοι εφαρμόστηκαν με την θερμοκρασία ανόπτησης των 62 ° C. Οι

GAPDH

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε ακόλουθες αναλογίες: 1:04 έως τις

MDR1

εκκινητών και 1:06 στο

HIF-1α

εναύσματα για την επίτευξη γραμμικής ενίσχυσης συνθήκες. Το β

ακτίνη

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σε ακόλουθες αναλογίες: 1:02 έως τις

GST-π

εκκινητών και 1:05 για να το

VEGF

εναύσματα για την επίτευξη συνθήκες γραμμική ενίσχυση. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε πηκτές αγαρόζης 2% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο. Multi-Αναλυτής Εικόνα Λογισμικό /Υ Ανάλυση (Bio-Rad Gel Doc 1000, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση πυκνομετρίας.

DOX Δοκιμασία Συσσώρευσης

συσσώρευση DOX αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας η ικανότητα του DOX να εκπέμπουν φθορισμό. Η ένταση του φθορισμού ήταν ανάλογη με τη συσσώρευση DOX. Μελέτες διεξήχθησαν μετά από 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες θεραπείας SF. ΝΟΙ-Η460 /R και U87-TxR κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες, θρυψίνη και επαναιωρήθηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρησης 10 ml σε ένα μέσο που περιέχει ϋΟΧ-(20 μΜ). Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 120 min. Στο τέλος της περιόδου συσσώρευσης, τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και τοποθετήθηκαν σε ψυχρό PBS. Τα δείγματα διατηρούνται επί πάγου σε σκοτεινά μέχρις ότου η ανάλυση σε FACScalibur κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο). Ο φθορισμός της DOX αξιολογήθηκε στο κανάλι φθορισμού 2 (FL2-Η) στα 530 nm. Ένα ελάχιστο 10000 συμβάντα αναλύθηκαν για κάθε δείγμα. Οι διαφορές στο σχήμα της καμπύλης ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας Komogorov-Smirnov μη παραμετρική στατιστική. Οι τιμές Ρ υπολογίστηκαν (διαθέσιμο κατόπιν αίτησης) σε CellQuest Pro και να τρέξει σε έναν υπολογιστή Macintosh.

κυτταρομετρίας ροής Ανάλυση της P-gp και VEGF έκφραση

κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της P επίπεδα -gp και έκφραση του VEGF σε καρκινικά κύτταρα MDR. Ακατέργαστο και SF κατεργασμένα κύτταρα (2 χ 10

5), συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν σε ψυχρό PBS, και στη συνέχεια απευθείας ανοσο-χρώση με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-Ρ-gp αντίσωμα σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών (BD βιοεπιστήμες, Ηνωμένο Βασίλειο). Μια IgG2bκ έλεγχος ισοτύπου (Abcam, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο) αξιολογήθηκε για κάθε πειραματικό δείγμα για τη διάκριση του επιπέδου υποβάθρου φθορισμού των αρνητικών κυττάρων. Για την ανάλυση της έκφρασης του VEGF, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε σαπωνίνη 0.05% (w /v) ρυθμιστικό και επωάστηκαν με αντίσωμα συζευγμένο με ΡΕ αντι-VEGF σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών ( Ε & amp? D Systems, USA). Ένα IgG2a ισότυπο ελέγχου (Abcam, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο) αξιολογήθηκε για κάθε πειραματικό δείγμα για τη διάκριση του επιπέδου υποβάθρου φθορισμού των αρνητικών κυττάρων. Μέση ένταση φθορισμού προσδιορίστηκε για θετικώς βαμμένων κυττάρων. Τα δείγματα διατηρούνται επί πάγου σε σκοτεινά μέχρις ότου η ανάλυση σε FACScalibur κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο). Ο φθορισμός του FITC-συζευγμένο αντι-Ρ-gp αξιολογήθηκε στο κανάλι φθορισμού 1 (FL1-Η) στα 530 nm, ενώ ΡΕ-συζευγμένο αντι-VEGF αξιολογήθηκε στο κανάλι φθορισμού 2 (FL2-Η) στα 585 nm. Ένα ελάχιστο 10000 συμβάντα αναλύθηκαν για κάθε δείγμα (πύλη εξαιρούνται τα κυτταρικά υπολείμματα και τα νεκρά κύτταρα) και τα ληφθέντα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση Cell Quest Pro Software (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο).

Δοκιμασία ΜΤΤ

κυττάρων μεταβολική δραστηριότητα αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ με βάση την μείωση του 3- (4,5-διμεθυλο-2-thizolyl) -2,5-διφαινυλο-2Η-τετραζολίου (ΜΤΤ, Sigma, St Louis , ΜΟ) σε φορμαζάνη βαφή με δραστικές μιτοχόνδρια των ζώντων κυττάρων. Τα συνδυασμένα αποτελέσματα της ταυτόχρονης και η επακόλουθη επεξεργασία μελετήθηκαν επί καρκινικών κυτταρικών γραμμών MDR. κύτταρα U87-TxR παρασκευάζονται για ταυτόχρονη θεραπεία ΝΟΙ-Η460 /R και σπάρθηκαν σε 4, 000 και 8000 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως. θεραπεία SF (5 μΜ) σε συνδυασμό με διαφορετικές συγκεντρώσεις DOX διήρκεσε 72 ώρες. Οι επόμενες κατεργασίες εκτελέστηκαν σε ΝΟΙ-Η460 /R και κύτταρα U87-TxR αρχικά σπάρθηκαν σε χαμηλότερες πυκνότητες (500 κύτταρα /φρεάτιο και 1.000 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως). Η προεπεξεργασία με 5 μΜ SF διήρκεσε για 72 ώρες και ακολούθησε πρόσθετη θεραπεία 72 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις του DOX. Προστέθηκε ΜΤΤ σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg /ml σε κάθε φρεάτιο μιας μικροπλάκας 96 φρεατίων και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Στη συνέχεια, DMSO προστέθηκε για να διαλυθεί φορμαζάνης προϊόν, το οποίο ποσό ήταν ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων. Η απορρόφηση της διαλυμένης βαφής μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο αναγνώστη μικροπλάκας (ΕΚΒ 5060-006 Micro Plate Reader, Βιέννη, Αυστρία). Η αναστολή της ανάπτυξης (Ι) προσδιορίστηκε σύμφωνα με την ακόλουθη ιππασίας:. όπου το Α είναι η απορρόφηση για

IC

50 τιμή ορίστηκε ως η συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου που ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη κατά 50%. IC

50 υπολογίστηκε με ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το λογισμικό Excel.

ELISA για την ανίχνευση της ανθρώπινης VEGF

165 στο Cell Culture Medium

MDR κύτταρα (NCI-Η460 /R και U87-TxR), εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SF. Το κυτταρικό μέσο (υπερκείμενο) συνελέγη 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες μετά τη θεραπεία για τον προσδιορισμό της εκκρινόμενης VEGF

165 πρωτεΐνης με το κιτ ανοσοδοκιμασίας VEGF (Quantikine Human VEGF ELISA Kit, R &? D Systems, Minneapolis, USA). Η διαδικασία τηρήθηκε σύμφωνα με το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν με βάση την ίδια ποσότητα κυττάρων αναλύθηκε. Μία πρότυπη καμπύλη παρήχθη χρησιμοποιώντας ανασυνδυαστικό VEGF

165 παρέχεται με το κιτ. Οι συγκεντρώσεις του VEGF στα υπερκείμενα καλλιέργειας άνευ κυττάρου εξετάστηκαν εις τριπλούν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με Statistica 6.0 λογισμικό. Τα αποτελέσματα ελέγχθηκαν για ομαλότητα. Αν ληφθούν τιμές δεν είχαν κανονική κατανομή, οι ομάδες συγκρίθηκαν με

t

Φοιτητών – τεστ. Για κανονικά κατανεμημένα μεταβλητές, χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Όταν παρατηρήθηκε στατιστική σημασία, εφαρμόστηκε η δοκιμή (HSD) Tukey τίμιος σημαντική διαφορά. Η στατιστική σημαντικότητα έγινε δεκτή αν p & lt? 0,05 (*), p & lt? 0.01 (**), p & lt?. 0.001 (***)

Αποτελέσματα και Συζήτηση

SF αναστέλλει την ανάπτυξη των MDR Τα καρκινικά κύτταρα

Εμείς ιδρύθηκε NSCLC και γλοιοβλαστώματος P-gp υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές (NCI-Η460 /R και U87-TxR) με MDR φαινότυπο, προκειμένου να διερευνήσει πιθανές αντικαρκινικές ουσίες [9], [10 ]. NCI-Η460 /R και U87-TxR είναι καρκινικές κυτταρικές σειρές MDR που προήλθαν από NCI-Η460 (κυτταρική σειρά NSCLC) και U87 (κυτταρική σειρά γλοιοβλαστώματος). Οι γονικές κυτταρικές σειρές θεωρούνται ως ευαίσθητα αφού τα κύτταρα που προέρχονται από ασθενείς που δεν είχαν υποβληθεί σε χημειοθεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να αποσαφηνιστεί η δράση του sulfinosine (SF), ένα ανάλογο νουκλεοσιδίου πουρίνης συνθετικό, σε αυτές τις δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου MDR. Επιλέγουμε SF λόγω των αποδεικτικών στοιχείων που θεραπευτικά αποτελεσματικές συγκεντρώσεις της δεν θα μπορούσε να προκαλέσει την αντίσταση. SF, επίσης, διεισδύει αποτελεσματικά σε ΚΝΣ [2]. Επιπλέον, πρόσφατη κλινική μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία συνδυασμού συμπεριλαμβανομένων 6-θειογουανίνη (στενά συνδεδεμένη μόριο να SF) είναι πολλά υποσχόμενη για ασθενείς με υποτροπιάζοντα υψηλού βαθμού αναπλαστικό γλοιώματος [19].

Τα αποτελέσματα του SF στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μετά από 72 ώρες θεραπείας εκτιμήθηκαν με την χημειο-ευαισθησία της ανάλυσης – σουλφοροδαμίνης Β (SRB). SF ανέστειλε την ανάπτυξη ευαίσθητων και MDR κυτταρικές γραμμές καρκίνου με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α, C). Επειδή η εφαρμογή του αντικαρκινικών παραγόντων περιορίζεται από την τοξικότητά τους στα φυσιολογικά κύτταρα, ελέγξαμε την επίδραση της SF σε κύτταρα HaCaT (κανονικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα). Οι επιδράσεις στην ανάπτυξη των HaCaT μετά από συνεχή θεραπεία 72 ώρες αξιολογήθηκαν επίσης με δοκιμασία SRB. SF δεν μείωσε σημαντικά τον αριθμό των φυσιολογικών κυττάρων, ακόμη και με την υψηλότερη συγκέντρωση (100 μΜ) (Σχήμα 2C). Δείξαμε ότι η SF αναστέλλει την ανάπτυξη των ευαίσθητων καθώς και ανθεκτικών κυττάρων NSCLC και γλοιοβλαστώματος σε μικρο-μοριακή κλίμακα συγκεντρώσεων, και ότι η αποτελεσματικότητά του δεν επηρεάστηκε από την παρουσία του φαινοτύπου MDR. Επιπλέον, SF ήταν μη τοξικές για τα φυσιολογικά κύτταρα (HaCaT) στην περιοχή συγκεντρώσεων αναγκαίο να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης του SF επί ΝΟΙ-Η460 και ΝΟΙ-Η460 /R ( Α), U87, U87-TxR και HaCaT (C) κύτταρα αναπτύσσονται επί πλαστικών μετά τη θεραπεία 72 ώρες αξιολογήθηκαν με δοκιμασία SRB. Μέσος όρος ± Τ.Α. τιμές υπολογίστηκαν από πέντε ανεξάρτητα πειράματα (η = 5). NCI-Η460 και ΝΟΙ-Η460 /R (Β), U87 και U87 κύτταρα-TxR (D) βάφτηκαν με CFSE και επωάστηκαν για 72 ώρες με 10 μΜ SF. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού (CFSE απόκλιση) προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής στο κανάλι FL1. Μικροσκοπία φωτός της ΝΟΙ-Η460 και ΝΟΙ-Η460 /R (E), U87 και U87-TxR (F) κυτταρική ανάπτυξη σε πλαστικά (2-D καλλιέργειας) και την ανάπτυξη matrigel (3-D καλλιέργειας) μετά από 72 ώρες από 10 μΜ SF θεραπεία.

η

στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την κυτταροστατική επίδραση 10 μΜ SF σε κάθε κυτταρική σειρά με CFSE χρώσης (Σχήμα 2Β, D). CFSE είναι ένα ζωτικής σημασίας χρωστική σταθερός στο κυτταρόπλασμα για περίπου 7-8 γενιές, αλλά η ένταση του φθορισμού CFSE μειώνεται λόγω της προοδευτικής μείωση κατά το ήμισυ της εντός θυγατρικά κύτταρα μετά από κάθε κυτταρική διαίρεση. Με τον τρόπο αυτό, η κατανομή CFSE στα κύτταρα μπορεί να εκτιμήσει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η κατανομή CFSE στον έλεγχο και SF κατεργασμένα δείγματα απεικονίζεται με κυτταρομετρία ροής προφίλ ιστογράμματα (Σχήμα 2Β, D). Η αναστολή του πολλαπλασιασμού που παρατηρείται παρουσία της SF ήταν η πιο pronunced σε κύτταρα ΝΟΙ-Η460 /R. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού είναι εν μέρει υπεύθυνη για την αντικαρκινική δραστικότητα του SF.

Δεδομένου ότι κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος NSCLC και έχουν υψηλού μεταστατικού δυναμικού, συγκρίναμε τις επιδράσεις της SF να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων μετά από 72 h σε πλαστικά (καλλιέργεια 2-D) και σε ανασυσταθέν βασική μεμβράνη – matrigel (καλλιέργεια 3-D) (Σχήμα 2Ε, F). Βρήκαμε ότι η SF ανέστειλε την ανάπτυξη σε 3-D καλλιέργειας με την ίδια αποτελεσματικότητα που παρατηρείται σε 2-D καλλιέργεια. Το γεγονός ότι τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από κάθε κατεργασία άλλο μετά SF σε matrigel, ειδικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος, επισημαίνει την αλλαγή στην συγκολλητικές τους ιδιότητες. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι SF θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη συγγένεια των καρκινικών κυττάρων να εισβάλλουν τα αιμοφόρα αγγεία, προκαλούν όγκους αγγειογένεση και μετάσταση.

SF Προκαλεί κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση σε MDR Cancer Cells

Στη συνέχεια, προχωρήσαμε να εξεταστεί αν η επαγωγή της απόπτωσης συμβάλλει στην δράση κατά του καρκίνου του SF σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές MDR. Για να εκτιμηθεί η απόπτωση που επάγεται από SF μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε βέλτιστη πυκνότητα για την καλλιέργεια τους ιδιότητες. Με αυτόν τον τρόπο, οι χωρίς θεραπεία ελέγχους δεν επέτυχαν συρροή στο τέλος της περιόδου επώασης. Annexin-V-FITC /ιωδιούχου προπιδίου χρώση αποκάλυψε ότι η SF αυξάνει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (AV + ΡΙ-) και στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου MDR. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο (Σχήμα 3Α, Β, C, D): ζωντανά κύτταρα είναι αρνητικά για τα δύο, Annexin-V και ιωδιούχου προπιδίου (AV-ΡΙ-)?