Αφηρημένο

Η ανίχνευση σπάνιων μεταλλάξεων με τη χρήση αλληλούχισης επόμενης γενιάς διαθέτει σημαντικές δυνατότητες για διαγνωστικές εφαρμογές . Ανίχνευση κυκλοφορούντων DNA του όγκου είναι η κύρια εφαρμογή αυτής της προσέγγισης. Το μεγαλύτερο εμπόδιο για την χρήση του είναι η υψηλή ανάγνωσης ποσοστό σφάλματος της sequencers επόμενης γενιάς. Αντί να αυξηθεί η ακρίβεια των τελικών αλληλουχιών, ανιχνεύσαμε σπάνιες μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας ένα sequencer ημιαγωγών και ένα σύνολο ανωμαλίας κριτήρια ανίχνευσης βασίζεται σε ένα στατιστικό μοντέλο του ποσοστού σφάλματος ανάγνωσης σε κάθε θέση σφάλματος. Στατιστικά μοντέλα είχαν συναχθεί από τα δεδομένα ακολουθία από φυσιολογικά δείγματα. Διαπιστώσαμε υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (

EGFR

) μεταλλάξεις στο DNA των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα πλάσματος. Single-pass βαθιά αλληλουχίας (& gt? 100.000 αναγνώσεις) ήταν σε θέση να ανιχνεύσει μια ενεργοποίηση μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε 10.000 κανονική αλληλόμορφα. Επιβεβαιώσαμε τη μέθοδο που χρησιμοποιεί 22 υποψήφιους και 155 αναδρομική δείγματα, ως επί το πλείστον αποτελείται από DNA καθαρίζεται από το πλάσμα. Μια χρονική ανάλυση έδειξε πιθανές εφαρμογές για τη διαχείριση της νόσου και για τη θεραπευτική διαδικασία λήψης αποφάσεων για την επιλογή του επιδερμικού αναστολείς της τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (EGFR-ΤΚΙ).

Παράθεση: Kukita Υ, Uchida J, Oba S, Nishino Κ, Kumagai Τ, Taniguchi K, et al. (2013) Ποσοτική Ταυτοποίηση μεταλλαγμένα αλληλόμορφα Προέρχεται από καρκίνο του πνεύμονα στο πλάσμα κυττάρων-Δωρεάν DNA μέσω ανίχνευσης Ανωμαλία Χρησιμοποιώντας Deep αλληλουχίας δεδομένων. PLoS ONE 8 (11): e81468. doi: 10.1371 /journal.pone.0081468

Επιμέλεια: Raya Khanin, Memorial Sloan Kettering,, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 13 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21, Νοεμ, 2013

Copyright: © 2013 Kukita et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Οσάκα Ιατρικό Κέντρο για τον Καρκίνο και καρδιαγγειακές νόσους. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

για ορισμένες μοριακή στοχευμένα φάρμακα κατά του καρκίνου, η εξέταση της γονιδιωματικής αλλαγές στα γονίδια-στόχους έχει γίνει μια διαγνωστική ρουτίνα και είναι απαραίτητη για τη λήψη αποφάσεων θεραπεία. Για παράδειγμα, οι ισχυρές επιδράσεις των αναστολέων της κινάσης τυροσίνης υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR-TKIs? Δηλαδή, gefitinib και erlotinib) είναι για τον καρκίνο μη-μικρών κυττάρων του πνεύμονα (NSCLC) συσχετίζεται με την ενεργοποίηση σωματικές μεταλλάξεις σε

EGFR

[1,2]. Οι ασθενείς που χορηγούνται αυτά τα φάρμακα επί του παρόντος επιλέγονται με βάση την παρουσία αυτών των μεταλλάξεων ενεργοποίησης. Η ταυτοποίηση των μεταλλάξεων βασίζεται σε δείγματα βιοψίας? η διαδικασία είναι επεμβατική και συχνά δύσκολο να εκτελέσει. Μία μη διεισδυτική διαγνωστική διαδικασία είναι επιθυμητή.

ελεύθερα κυττάρων DNA στο αίμα αποτελείται από DNA που προέρχεται από καρκινικούς ιστούς και έχει μελετηθεί για μη επεμβατικές διαγνωστικές διαδικασίες [3]. Αυτό το DNA, που ονομάζεται κυκλοφορούν DNA του όγκου (ctDNA), είναι σπάνια στο αίμα, και η ανίχνευση της είναι μια τεχνική πρόκληση. Ένας αριθμός μεθόδων έχουν εξεταστεί, αλλά οι περισσότεροι από αυτούς έχουν περιορισμούς ως προς την ευαισθησία και την ευρωστία. Ακτινοβολούν (χάντρες, γαλάκτωμα, η ενίσχυση και η μαγνητική) [4] είναι πιθανότατα η πιο ευαίσθητη μέθοδο. Σε ακτινοβολούν, τα προϊόντα PCR που έχουν ενισχυθεί από ένα μόνο μόριο στερεωμένο σε ένα ενιαίο μαγνητικό σφαιρίδιο χρησιμοποιώντας γαλάκτωμα PCR. Η θέση μετάλλαξης είναι επισημασμένο με μια φθορίζουσα ανιχνευτή ή εκκινητή επέκτασης, και το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ποσοτικά ανιχνεύεται μετρώντας τα σημασμένα με φθορισμό σφαιριδίων. Ακτινοβολούν ποσοτικά με επιτυχία

APC

και

KRAS

μεταλλάξεις στο ctDNA των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου [5,6] και

EGFR

μεταλλάξεις στο ctDNA των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα [7] . Παρά την υψηλή ευαισθησία του και την ικανότητα ποσοτικοποίησης, ακτινοβολούν δεν έχει κερδίσει σε δημοτικότητα, επειδή είναι μια επίπονη τεχνολογία και απαιτεί ολιγονουκλεοτιδίων για κάθε θέση μετάλλαξη.

Επειδή ακτινοβολούν και sequencers επόμενης γενιάς, δηλαδή, μαζικά παράλληλων sequencers, χρησιμοποιούν την ίδια ή πολύ παρόμοια τεχνική προετοιμασία πρότυπο, είναι δυνατή η εφαρμογή sequencers επόμενης γενιάς για τον ίδιο σκοπό. Υπήρξαν αρκετές μελέτες σχετικά με την βαθιά αλληλούχιση του ελεύθερου κυττάρων του DNA [8,9]. Αυτές οι μελέτες πρότειναν τη δυνατότητα της προσέγγισης, αλλά έλειπε κριτική αξιολόγηση των συστημάτων ανίχνευσης. Ειδικότερα, δεν αντιμετωπισθεί το πρόβλημα των πολλαπλών δοκιμών, η οποία είναι εγγενής σε διαγνωστικές εφαρμογές.

Στην έκθεση αυτή, έχουμε δημιουργήσει μια μέθοδο για την ανίχνευση

EGFR

μεταλλάξεις στο ctDNA στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με τη χρήση μίας περνούν βαθιά αλληλουχίας του ενισχυμένου

EGFR

θραύσματα . Η πρόσφατη ανάπτυξη μιας αλληλουχίας ημιαγωγού (Ion Torrent PGM) [10] αντιμετώπισε τις ελλείψεις των άλλων σήμερα διαθέσιμα sequencers (δηλαδή, ένα μεγάλο χρόνο λειτουργίας για μια μόνο ανάλυση και υψηλό λειτουργικό κόστος) και εφαρμόζεται για διαγνωστικούς σκοπούς. Εφαρμόσαμε ανωμαλία ανίχνευση [11,12] και προσδιορίζεται ένα σύνολο κριτηρίων ανίχνευσης βασίζεται σε ένα στατιστικό μοντέλο του ποσοστού σφάλματος ανάγνωσης σε κάθε θέση σφάλματος. Η μέθοδος ποσοτικά ανιχνεύεται

EGFR

μεταλλάξεις στο ελεύθερο κυττάρων του DNA σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με ακτινοβολούν, πολλά υποσχόμενη μη επεμβατική διαγνωστική που συμπληρώνουν βιοψία.

Αποτελέσματα

Αρχή της ανίχνευσης

Deep αλληλουχίας ενός ΡΟΚ-ενισχυμένου θραύσματος που περιέχει μια θέση μετάλλαξης μπορεί να διεξαχθεί για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό μεταλλαγμένα αλληλόμορφα από τον μεγάλο όγκο των κανονικών αλληλίων που προέρχονται από ιστούς του ξενιστή. Το κύριο πρόβλημα που συνδέεται με αυτή την προσέγγιση είναι η συχνότητα των σφαλμάτων που εισάγονται κατά την αλληλουχία και την ενίσχυση PCR. Το βασικό ζήτημα εδώ είναι η ρύθμιση και ακριβής αξιολόγηση των ορίων ανίχνευσης. Όταν η συχνότητα της αλλαγής βάσης σε ένα στοχευόμενο τόπο είναι υψηλότερη από ένα προκαθορισμένο ποσοστό σφάλματος διαβάσει (RER), μπορούμε να κρίνουμε την αλλαγή να οφείλεται στην παρουσία μιας μεταλλαγμένης αλληλουχίας. Δηλαδή, οι ανωμαλίες που μειωθεί σημαντικά εκτός της κατανομής RER θεωρούνται μεταλλάξεις. Το RER ορίζεται ως το ποσοστό σφάλματος που υπολογίζεται από την τελική δεδομένα αλληλουχίας, συμπεριλαμβανομένων των σφαλμάτων τόσο την αλληλούχιση και τα στάδια της PCR. Σε ανωμαλία ανίχνευση [11,12], όπως στις δοκιμές υπόθεση, ψευδώς θετικά αποτελέσματα ελέγχονται με βάση ένα στατιστικό μοντέλο. Στην περίπτωσή μας, η στατιστική μοντέλο του RER μπορεί να κατασκευαστεί από τα δεδομένα αλληλουχίας από τις περιοχές-στόχους ενός επαρκούς αριθμού φυσιολογικών ατόμων που δεν φέρουν μεταλλάξεις.

Αν συμβούν σφάλματα ανάγνωσης στο πλαίσιο μιας κατανομής πιθανοτήτων, μπορεί να υπολογιστεί ο αριθμός των διαβάζει απαιτείται για να επιτευχθεί ένα ορισμένο όριο ανίχνευσης. Σχήμα 1α δείχνει τη σχέση μεταξύ του ορίου ανίχνευσης μετάλλαξης, διαβάστε το βάθος, και RER σε επίπεδο σημαντικότητας ρ = 2×10

-5 για κάθε ανίχνευση χωρίς πολλαπλότητα διόρθωση, υποθέτοντας ότι σφάλματα ανάγνωσης συμβαίνουν μετά από μια κατανομή Poisson. Τα δεδομένα απεικονίζονται στο Σχήμα 1α παρέχονται στον Πίνακα S1. Με την αύξηση του βάθους ανάγνωσης και τη μείωση του RER, το όριο ανίχνευσης μειώνεται. Σε μια προηγούμενη μελέτη από την ομάδα μας [7], το όριο ανίχνευσης για σπάνιες μεταλλαγμένα αλληλόμορφα όταν χρησιμοποιούν ακτινοβολούν [4] ήταν 1 στους 10.000 (0,01%). Επειδή ένα δείγμα ανάλυσης του DNA στο πλάσμα περιέχει περίπου 5.000 μόρια, αυτό το όριο ανίχνευσης είναι λογικό. Ο στόχος αυτός μπορεί να επιτευχθεί με 100.000 διαβάζει όταν το RER είναι κάτω από 0,01%.

α, Σχέση μεταξύ του ποσοστού σφάλματος ανάγνωσης, διαβάστε το βάθος, και το όριο ανίχνευσης για μεταλλάξεις, όταν το επίπεδο σημαντικότητας είναι p = 2×10

-5. Οριζόντιο άξονα, διαβάστε το βάθος? κατακόρυφο άξονα, όριο ανίχνευσης (%). Από πάνω προς τα κάτω, κάθε γραμμή δηλώνει ρυθμό σφάλμα ανάγνωσης (RER) του 1%, 0,2%, 0,05%, ή 0,01%. β, Τρισδιάστατη αναπαράσταση του RER υποκατάστασης. x-άξονα, θέσεις βάσης του EGFR εξώνια 19-21. Από αριστερά προς τα δεξιά, οι αιχμές βελών δείχνουν τις θέσεις των Τ790Μ, L858R, και L861Q. άξονα γ, 48 δείγματα DNA από φυσιολογικά άτομα. Από εμπρός προς τα πίσω, μετατροπές A (πράσινο), C (κίτρινο), G (ματζέντα), ή Τ (μπλε) είναι ευθυγραμμισμένες για κάθε δείγμα. άξονα Ζ, RER (%). c, Τρισδιάστατη αναπαράσταση του σφάλματος εισαγωγής /διαγραφής. x-άξονα, θέσεις βάσης του EGFR εξώνια 19-21. Η ράβδος υποδεικνύει τη θέση του εξωνίου 19 διαγραφή. άξονα γ, 48 δείγματα DNA από φυσιολογικά άτομα. Μπλε, DNA πλάσματος? γαλάζιο, WBC DNA (μεγάλη ποσότητα)? σκούρο μπλε, WBC DNA (μικρή ποσότητα). άξονα Ζ, RER (%). d, Κατανομή του RER. Λευκή στήλη, λάθος αντικατάσταση? γκρι στήλη, εισαγωγή /διαγραφή σφάλματος. Οριζόντιο άξονα, το εύρος της RER (%)? κατακόρυφο άξονα, συχνότητα εμφάνισης (%).

Η

Σφάλμα ανάγνωσης του

EGFR

περιοχή-στόχο

Για τη θεραπεία του EGFR ΤΚΙ, μια ενεργοποίησης

EGFR

μετάλλαξης είναι ενδεικτική της θεραπείας αποτελεσματικότητας [ ,,,0],1,2]. Οι ασθενείς που πρόκειται να χορηγηθεί αυτά τα φάρμακα επί του παρόντος επιλέγονται με βάση την παρουσία αυτών των μεταλλάξεων ενεργοποίησης. Εκτός από την ενεργοποίηση

EGFR

μεταλλάξεις, μια ανθεκτική

EGFR

μετάλλαξη γνωστή ως Τ790Μ εμφανίζεται σε περίπου το ήμισυ των ασθενών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με EGFR ΤΚΙ [13,14]. Έτσι, τρεις μεταλλάξεις ενεργοποίησης, δηλαδή, μια διαγραφή σε

EGFR

εξόνιο 19 και L858R και L861Q σε

EGFR

εξόνιο 21, καθώς και το ανθεκτικό Τ790Μ μετάλλαξη στο

EGFR

εξόνιο 20 επελέγησαν ως θέσεις-στόχους.

Εμείς καθορίζεται τις rers σε μια περιοχή 169 βάση γύρω από την τόποι στόχο που αποτελείται από την εκτέλεση βαθιά αλληλουχίας των δειγμάτων DNA από φυσιολογικά άτομα. Χρησιμοποιήσαμε ένα Ion Torrent PGM [10] sequencer για το έργο αυτό. αλληλούχιση Single-pass διεξήχθη, και ο αριθμός των διαβάζει κυμαινόταν από 44.400 έως 373.000, με μέσο όρο 162.000. Χρησιμοποιήσαμε τρεις τύπους δειγμάτων DNA: Τα δείγματα DNA 19 πλάσματος με ποσότητες συγκρίσιμες με τα δείγματα των ασθενών, 16 λευκοκυττάρων (λευκών αιμοσφαιρίων, WBC) δείγματα DNA με ποσά που ήταν 10 ή 50 φορές το μέγεθος του δείγματος του ασθενούς, και 13 WBC DNA δείγματα με τα ποσά που ήταν το ένα δέκατο του μεγέθους του δείγματος του ασθενούς. Εμείς διαιρείται σφάλματα υποκατάσταση σε τέσσερις μορφές, που αντιστοιχούν σε μετατροπή σε Α, C, G, ή Τ Ετσι, υπήρχαν 507 πιθανούς τύπους υποκαταστάσεις (169 θέσεις βάσης x 3 σχέδια) στην περιοχή-στόχο. Ένα RER υποκατάσταση γραφικά παρουσιάζεται στο Σχήμα 1 b, με εξαίρεση τη μετατροπή από G σε Α στη θέση 2361, λόγω της συχνής SNP. Οι rers υποκατάσταση δεν είναι ομοιόμορφες, ούτε είναι ανεξάρτητες η μία από την άλλη, και οι υψηλές rers σχετίζονται με συγκεκριμένες θέσεις βάσης. Επιπλέον, ένα πρότυπο υποκατάστασης είναι κυρίαρχη σε κάθε θέση βάσεως. Μια RER εισαγωγής /διαγραφής φαίνεται γραφικά στο Σχήμα 1γ. Εμείς δεν έκανε διάκριση μεταξύ διαγραφής και εισαγωγής λάθη, όπως παρεμβολές συχνά αναγνωρίζονται ως διαγραφές και αντίστροφα από το λογισμικό ευθυγράμμισης ακολουθίας. Το RER εισαγωγή /διαγραφή είναι γενικά υψηλότερη από το RER υποκατάστασης. Μια τάση παρόμοια με εκείνη της υποκατάστασης παρατηρείται, σε αυτό το υψηλό εισαγωγής /Τα rers διαγραφή σχετίζονται με συγκεκριμένες θέσεις βάσης. Η Εικόνα 1δ παρουσιάζει την κατανομή των rers. Υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της υποκατάστασης και rers εισαγωγής /διαγραφής. Σε 410 από τις πιθανές 506 τύπους υποκατάσταση (81,0%), το RER ήταν χαμηλότερη από 0.01%. Αντίθετα, από τα 169 είδη των παρεμβολών /διαγραφής, το RER ήταν χαμηλότερη από 0,01% το μόνο 79 (46,7%). Αυτά τα αποτελέσματα συμφώνησαν με προηγουμένως αναφερθείσες παρατηρήσεις από την πλατφόρμα PGM [15]. Τα δεδομένα απεικονίζονται στα Σχήματα 1β και 1γ παρέχονται στους Πίνακες S2 και S3, αντίστοιχα.

Λόγω της υψηλής εισαγωγή /διαγραφή σφάλματα ανάγνωσης, χρησιμοποιήσαμε μια συγκεκριμένη μέθοδο για την ανίχνευση των εξόνιο 19 μεταλλάξεις διαγραφής. Είμαστε προετοιμασμένοι οκτώ πρότυπο εξόνιο 19 ακολουθίες με εκπρόσωπο διαγραφές και διαλογή των ακολουθιών διαγραφή μέσω της σύνδεσής τους με τις ακολουθίες πρότυπο. Η μέθοδος αυτή ήταν αρκετά αποτελεσματική για τη διαλογή έξω σφάλματα ανάγνωσης? Δεν ακολουθίες με διαγραφή σφάλματα ανάγνωσης βρέθηκαν ανάμεσα στα 48 δείγματα που ελέγχθηκαν.

Στατιστική μοντέλα των ποσοστών σφάλματος ανάγνωσης και τα κριτήρια για την ανωμαλία ανίχνευση

Στη συνέχεια εξετάστηκε στατιστικά μοντέλα των σφαλμάτων ανάγνωσης. Σε ένα μοντέλο κατανομής Poisson, η μέση και διακύμανση του αριθμού των περιπτώσεων αναμένεται να είναι η ίδια και καθορίζονται από την παράμετρο ένταση

λάμδα

. Εδώ, αντί να χρησιμοποιήσετε το RER, η συχνότητα εμφάνισης σφάλματος ανάγνωσης παρουσιάστηκε ως η συχνότητα εμφάνισης σε 100.000 διαβάζει, και το μέσο και διακύμανση της σε κάθε θέση βάσης υπολογίστηκαν. Οι σχέσεις μεταξύ της μέσης και διακύμανση που φαίνεται στο Σχήμα 2α και το Σχήμα S1 σε S1 αρχείου για την υποκατάσταση και εισαγωγή /διαγραφή σφάλματα ανάγνωσης, αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η διακύμανση καθίσταται μεγαλύτερη από το μέσο όρο σε ένα σημαντικό ποσοστό των περιπτώσεων. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η εφαρμογή της κατανομής Poisson θα οδηγούσε σε αύξηση του αριθμού των εσφαλμένων θετικών. Το φαινόμενο αυτό, που ονομάζεται «overdispersion», είναι κοινή σε βιολογικές μελέτες, και σε τέτοιες περιπτώσεις, μία αρνητική διωνυμική κατανομή εφαρμόζεται [16]. Overdispersion οφείλεται στις διακυμάνσεις της παραμέτρου έντασης, και είναι λογικό να υποθέσουμε ότι η παράμετρος ένταση ακολουθεί μια κατανομή γάμμα. Σύμφωνα με αυτό το σενάριο, ο αριθμός εμφάνισης ακολουθεί θεωρητικά αρνητική διωνυμική κατανομή. Στο Σχήμα 2b, η αύξηση του κατωφλίου για υποκατάσταση από ένα Poisson σε αρνητική διωνυμική κατανομή παρίσταται γραφικώς έναντι του μέσου λόγου διακύμανσης /του σφάλματος ανάγνωσης για τους τύπους υποκατάσταση των οποίων διακύμανση μέσος λόγος /κυμαινόταν από 1 έως 2. Όταν η αναλογία υπερβεί περίπου 1.2 έως 1.4, υπήρχαν ουσιαστικές αυξήσεις σε κατωφλίου. Έτσι, κατασκευάσαμε στατιστικό μοντέλο μας κάθε υποκατάσταση υπό τα ακόλουθα κριτήρια.

α, Σχέση μεταξύ του μέσου και της διακύμανσης του σφάλματος υποκατάστασης παρουσιάζεται ως ο αριθμός ανά 100.000 διαβάζει. Οριζόντιο άξονα, κατά μέσο όρο? κατακόρυφο άξονα, διακύμανσης. Η κόκκινη γραμμή δηλώνει όπου ο μέσος και η διακύμανση είναι ίσες. β, Διαφορά μεταξύ κατώτατων ορίων υπολογίζεται σύμφωνα με την αρνητική διωνυμική κατανομή και κατανομή Poisson. Το όριο είναι ο ελάχιστος αριθμός των αλλαγών βάσης σε 100.000 διαβάζει την επίτευξη του επιπέδου στατιστικής σημαντικότητας (p-0.01). Οριζόντιο άξονα, η μέση αναλογία διακύμανσης /της υποκατάστασης διαβάσει λάθος? κατακόρυφο άξονα, διαφορά μεταξύ των ορίων. Οι τύποι των υποκαταστάσεων των οποίων διακύμανσης μέσος λόγος /κυμαινόταν από 1 έως 2 σχεδιάζονται. c, Ακρίβεια ποσοτικοποίησης. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών προσδιορισμών. Οριζόντιος άξονας, κλάσμα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα σε τεχνητά προϊόντα? κατακόρυφο άξονα, κλάσμα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα εκτιμάται από βαθιά αλληλούχιση. d, Αναπαραγωγιμότητα του ποσοτικού προσδιορισμού. Οριζόντιο άξονα, βάση ρυθμός αλλαγής στην πρώτη δίκη? κατακόρυφο άξονα, βάση ρυθμός αλλαγής στη δεύτερη δίκη.

Η

1. Όταν το μέσο σφάλμα ανάγνωσης σε 100.000 διαβάζει ήταν λιγότερο από 1, μια κατανομή Poisson με λ σετ με 1 εφαρμόστηκε (169 τύπους των αντικαταστάσεων).

2. Όταν ο μέσος όρος ήταν μεγαλύτερη από 1 και η μέση αναλογία διακύμανσης /του σφάλματος αναγνώσεως ήταν λιγότερο από 1.2, μια κατανομή Poisson εφαρμόστηκε (15 τύποι αντικαταστάσεων).

3. Όταν ο μέσος όρος ήταν μεγαλύτερη από 1 και η μέση αναλογία διακύμανσης /του σφάλματος αναγνώσεως ήταν μεγαλύτερη από 1,2, ένα αρνητικό διωνυμική κατανομή εφαρμόστηκε (323 τύποι αντικαταστάσεων).

Η

Το εξόνιο 19 διαγραφή και L858R ανήκαν στην πρώτη κατηγορία, ενώ οι θέσεις μετάλλαξης L861Q και Τ790Μ ανήκε στη δεύτερη και την τρίτη κατηγορία, αντίστοιχα. Τα όρια ανίχνευσης για την εξόνιο 19 διαγραφή και την L858R, L861Q, και μεταλλάξεις υποκατάστασης Τ790Μ σε επίπεδο σημαντικότητας ρ = 2×10

-5 ήταν λιγότερο από 0,01% και λιγότερο από 0,01%, 0,01% και 0,05%, αντίστοιχα . Στην ανάλυση που ακολουθεί, χρησιμοποιήσαμε p = 2×10

-5 ως το όριο σημαντικότητας για κάθε μεμονωμένη ανίχνευση, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη μια διόρθωση πολλαπλότητα, περιμένοντας ένα ψευδώς θετικό σε 50.000 δείγματα.

Το περίγραμμα της μεθόδου είναι 1) ενίσχυση του

EGFR

θραυσμάτων με εξόνιο-ειδικούς εκκινητές από το DNA στο πλάσμα? 2) βαθιά αλληλουχίας του

EGFR

θραύσματα με PGM (& gt? 100.000 διαβάζει /τεμάχιο), συνδυάζοντας τα προϊόντα της PCR? 3) που ταιριάζουν τις ακολουθίες εξόδου με

EGFR

ακολουθίες πρότυπο? 4) ανίχνευση διαγραφές και αντικαταστάσεις, και τη μετατροπή του αριθμού των γεγονότων σε ότι 100.000 διαβάζει? και 5) την αξιολόγηση των αλλαγών βάσης με τα κριτήρια ανίχνευσης ανωμαλίας. Σε ανωμαλία ανίχνευση, οι αλλαγές βάσεων κριθεί ως μεταλλάξεις, όταν ο αριθμός των γεγονότων σε 100.000 διαβάζει είναι ίση με ή υπερβαίνει την τιμή κατωφλίου (εξόνιο 19 διαγραφή, 7? L858R, 7? L861Q, 12? Τ790Μ, 60). Μια σχηματική παράσταση παρουσιάζεται στο σχήμα S2 σε S1 αρχείου.

Quantitativity και επαναληψιμότητα

Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε την ικανότητα ποσοτικοποίησης της μεθόδου. Είμαστε προετοιμασμένοι δείγματα δοκιμής, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων κλασμάτων των προϊόντων PCR των μεταλλαγμένων

EGFR

θραύσματα. Υπήρξε μια πολύ καλή γραμμικότητα (

r = 0,998

) μεταξύ των εμβολιάστηκαν ποσότητες των προϊόντων της PCR και των παρατηρούμενων μεταλλαγμένη προς φυσιολογικούς λόγους αλληλόμορφο συναχθεί από βαθιά αλληλουχίας (Σχήμα 2c). Στη συνέχεια εξετάστηκε η δυνατότητα αναπαραγωγής της μεθόδου χρησιμοποιώντας δείγματα πλάσματος από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα του οποίου η κύρια βλάβες επιβεβαιώθηκαν να μεταφέρουν ενεργοποίηση μεταλλάξεων. Τα κλάσματα των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων μετρήθηκε σε δύο δοκιμασίες σχεδιάζονται στο Σχήμα 2d. Μια υψηλή αντιστοιχία (

r = 0,989

) παρατηρήθηκε, εκτός από τα δείγματα που περιείχαν μικρές ποσότητες των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, που αντιστοιχεί σε κλάσμα περίπου 0.3% των αλληλομόρφων παρίστανται ή λιγότερο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η αρχική φάση της ενίσχυσης PCR ήταν πιθανό να είναι ανεπιτυχής, λόγω των χαμηλών αριθμών μεταλλαγμένων templates, εκτιμάται σε 15 αντίγραφα ή λιγότερο. Έτσι, το όριο ποσοτικοποίησης ήταν περίπου 0,3%.

Επικύρωση με δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα

αξιολογηθεί περαιτέρω η μέθοδος μας χρησιμοποιώντας δείγματα βιοψίας από καρκίνο του πνεύμονα, η δειγματοληψία του DNA στο πλάσμα και την κύρια βλάβη ταυτόχρονα ως μέρος μιας προοπτικής μελέτης. Τα αποτελέσματα για τα δείγματα από 22 ασθενείς έδειξαν 86% συμφωνία (95% διάστημα εμπιστοσύνης, 66 – 95), 78% (44 – 93) ευαισθησία, και το 92% (66 – 98) η εξειδίκευση, τη ρύθμιση της βιοψίας ιστού, όπως το πρότυπο. Τα αποτελέσματα αυτά υπόσχεται σε σχέση με την ανάπτυξη ενός διαγνωστικού εργαλείου για τη συμπλήρωση βιοψία καρκίνου του πνεύμονα.

Στη συνέχεια ανέλυσε ένα σύνολο 155 δειγμάτων: 144 δείγματα από το πλάσμα, οκτώ από εγκεφαλονωτιαίο υγρό, και από ένα από τα ούρα, υπεζωκοτική συλλογή, και βρογχικό έκπλυμα. Όσο για τα δείγματα πλάσματος, δύο ή περισσότερα δείγματα λήφθηκαν από 32 ασθενείς σε διαφορετικά χρονικά σημεία από τα μαθήματα της νόσου. Όλα τα ληφθέντα δεδομένα φαίνονται στον Πίνακα S4. Κλινικών δεδομένων των ασθενών, συμπεριλαμβανομένων στάδιο, ιστολογία, τη θεραπεία και την κατάσταση της αντοχής σε EGFR-ΤΚΙ επίσης απαριθμούνται στον παρακάτω πίνακα. Μεταξύ των 33 ασθενών που συνδέονται με μια κύρια βλάβη που περιέχει το εξόνιο 19 διαγραφή, η μετάλλαξη αυτή βρέθηκε σε τουλάχιστον ένα από τα δείγματα πλάσματος από 24 ασθενείς (72,7%). Από τους 23 ασθενείς για τους οποίους οι πρωτογενείς βλάβες εμφάνιζε τις L858R ή L861Q υποκαταστάσεις, αυτές οι μεταλλάξεις βρέθηκαν σε τουλάχιστον ένα από τα δείγματα πλάσματος από 18 ασθενείς (78,2%). Μία διπλή μετάλλαξη (ταυτόχρονη ανίχνευση του εξωνίου 19 διαγραφή και L858R) παρατηρήθηκε σε 12 δείγματα πλάσματος, αν και διπλές μεταλλάξεις δεν είναι συχνές σε δείγματα βιοψίας. Διαφορές μεταξύ των τύπων μετάλλαξη ενεργοποίησης εντοπίστηκαν σε δείγματα βιοψίας και DNA στο πλάσμα παρατηρήθηκαν σε πέντε δείγματα πλάσματος. Τ790Μ βρέθηκε σε 13 από 57 δείγματα πλάσματος (22,8%) από τους ασθενείς με αντίσταση EGFR-ΤΚΙ, και σε 7 από τα 87 δείγματα πλάσματος (8.0%) χωρίς αντίσταση EGFR-ΤΚΙ.

Χρονική αλλαγές του

EGFR

της επίπεδα μετάλλαξη κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου

Ένας σημαντικός αριθμός από δείγματα συλλέχθηκαν από τον ίδιο ασθενή σε διαφορετικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της νόσου. Χρονικές μεταβολές του

EGFR

επίπεδα μετάλλαξη στο DNA του πλάσματος από ασθενείς με τρία ή περισσότερα δείγματα φαίνονται σχηματικά στην Εικόνα 3. Λόγω της σχετικά μικρής περιόδου δειγματοληψίας, τα δείγματα ελήφθησαν από μέρος μόνο του μαθήματος νόσου στις περισσότερες περιπτώσεις . Εστιάσαμε σε δύο μεταβάσεις: μετάβαση λόγω της έναρξης της θεραπείας EGFR-ΤΚΙ και ότι μετά την απόκτηση αντοχής EGFR-ΤΚΙ. Δεδομένων πριν από την έναρξη της θεραπείας ελήφθησαν σε έξι περιπτώσεις. Μια σημαντική μείωση στην ενεργοποίηση των επιπέδων μετάλλαξης με τη θεραπεία παρατηρήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις (ρ = 1.7×10

-4). Εκκαθάριση των ctDNA από την έναρξη της θεραπείας είναι ένα γενικό φαινόμενο.

Κάθε κουκίδα αντιπροσωπεύει ένα χρονικό σημείο δειγματοληψίας. Το διάγραμμα δεν είναι ακριβής αναπαράσταση της κλίμακας χρόνου, και μόνο η σειρά των στιγμών είναι έγκυρες πληροφορίες. Αριθμοί αντιπροσωπεύουν

EGFR

μεταλλάξεις σε 10.000 ακολουθία έχει ως εξής: το μαύρο, το εξόνιο 19 διαγραφή? μπλε, L858R? κόκκινο, Τ790Μ. Τα μόνα στοιχεία που υπερβαίνουν τα όρια της περιόδου αυτής. «Τύπος Μετάλλαξη» υποδεικνύει ότι στα δείγματα βιοψίας.

Η

Τα στοιχεία ελήφθησαν τόσο πριν όσο και μετά την απόκτηση αντοχής EGFR-ΤΚΙ σε επτά περιπτώσεις. Μετά την απόκτηση αντοχής, η ενεργοποίηση του επιπέδου μετάλλαξης αυξήθηκε σε πέντε ασθενείς (218, 226, 259, 61, 66), μειωμένη σε έναν ασθενή (44), και αυξημένη με καθυστέρηση σε άλλο ασθενή (178). Αύξηση της ενεργοποίησης των μεταλλάξεων μπορεί να συσχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου. Παρά τη σαφή συσχέτιση μεταξύ Τ790Μ και την κατάσταση του EGFR ΤΚΙ-αντίσταση στην παραπάνω μελέτη επικύρωσης, στη δυναμική της Τ790Μ κατά την πορεία της νόσου δεν ήταν τόσο σαφής όπως αυτή της ενεργοποίησης των μεταλλάξεων? T790M συχνά εμφανίστηκε πριν από την απόκτηση αντοχής.

Οι Τρεις ασθενείς περιγράφονται με περισσότερες λεπτομέρειες. Ασθενής 226 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με gefitinib ως πρώτη χημειοθεραπεία γραμμή. Η θεραπεία gefitinib διεκόπη αρκετές φορές λόγω ανεπιθύμητων ενεργειών. Μία ακτινολογική ανταπόκριση (μερική απόκριση, PR) παρατηρήθηκε από το μήνα 1 έως το μήνα 9, και την εξέλιξη της νόσου παρατηρήθηκε σε μήνες 10. Πριν από την gefitinib θεραπεία, το κλάσμα του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου ήταν πολύ υψηλή (& gt? 50%), αλλά μετά από μόνο μία εβδομάδα από αυτή τη θεραπεία, το κλάσμα του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου μειώθηκε στο 0,3%, πριν από κάθε ακτινολογικές αλλαγές (Εικόνα S3a σε File S1). T790M εμφανίστηκε σε 10 μήνες, όταν άρχισε την εξέλιξη της νόσου. Ασθενής 243 παρουσίασαν επίσης μια ασύμμετρη μείωση στο μεταλλαγμένο κλάσμα αλληλόμορφο κατά την έναρξη της θεραπείας gefitinib (Σχήμα S3b σε File S1). Ο ασθενής υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τη χειρουργική επέμβαση και επικουρική χημειοθεραπεία (CDDP συν VNR) προηγουμένως, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε gefitinib. Ασθενής 41 παρουσιάζονται με την εξέλιξη της νεοπλασματική μηνιγγίτιδα, και υποβλήθηκε σε συνδυασμό erlotinib-θεραπείας με πεμετρεξίδη. Προηγούμενες θεραπείες ήταν CDDP συν gemicitabine, gefitinib και erlotinib. Μια μικρή ραδιολογική απόκριση παρατηρήθηκε από μήνα ένα έως τέσσερα, και την εξέλιξη της νόσου έλαβε χώρα στη συνέχεια. Υπήρξε μια ασύμμετρη μείωση στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο κλάσμα κατά την έναρξη της θεραπείας, και η αύξηση κατά την εξέλιξη της νόσου ήταν μόνο ελαφρά (Εικόνα S3C σε File S1). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η respose του ctDNA την έναρξη της θεραπείας EGFR-ΤΚΙ ήταν ταχεία και στις τρεις περιπτώσεις (ασθενής 229, μια εβδομάδα? 243, δύο εβδομάδες? 41, ένα μήνα).

ανίχνευση μεταλλάξεων σε ολόκληρη την περιοχή-στόχο

Εμείς διερευνηθεί η δυνατότητα εντοπισμού μεταλλάξεων υποκατάστασης σε ολόκληρο το στόχο

EGFR

περιοχή που αντιστοιχεί σε 503 τύπους των αντικαταστάσεων, με εξαίρεση L858R, L861Q και Τ790Μ. Επειδή το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p = 2×10

-5 για κάθε ανίχνευση, ψευδώς θετικά αναμένεται να εμφανίζονται μία φορά σε 100 δείγματα. Στην πραγματικότητα, η μέση τιμή των τριών αντικαταστάσεις βρέθηκαν ανά δείγμα. Η κατανομή του αριθμού των υποκαταστάσεων ανά δείγμα φαίνεται στο Σχήμα 4α. Με βάση την εμπειρία που αποκτήθηκε από τα δείγματα βιοψίας, οι περισσότερες από αυτές τις υποκαταστάσεις ήταν πιθανό να είναι ψευδώς θετικά. Ένα σημαντικό κλάσμα των διαφόρων τύπων των αντικαταστάσεων δεν παρουσίασε ψευδή θετικά (56,2%, Εικόνα 4Β), και τα στατιστικά μοντέλα ήταν πρακτική χρήση με αυτούς τους τύπους των αντικαταστάσεων. Για άλλους, η εκτίμηση των παραμέτρων από τα δεδομένα από 48 φυσιολογικά άτομα δεν ήταν αρκετά συντηρητική για τον αποκλεισμό των ψευδών θετικών αποτελεσμάτων.

a, κατανομή του αριθμού των διαφορετικών τύπων υποκαταστάσεων κριθεί ως μεταλλάξεις ανά δείγμα. Οριζόντιος άξονας, ο αριθμός των τύπων των αντικαταστάσεων? κάθετο άξονα, ο αριθμός των δειγμάτων. b, κατανομή του αριθμού των δειγμάτων με έναν τύπο υποκατάσταση κρίνεται ως μετάλλαξη. Οριζόντιο άξονα, ο αριθμός των δειγμάτων με έναν τύπο υποκατάσταση κρίνεται ως μετάλλαξη? κάθετο άξονα, ο αριθμός των τύπων των υποκαταστάσεων.

Η

Συζήτηση

Σπάνια ανίχνευση μετάλλαξης των τόπων προορισμού, μέσω της βαθιάς αλληλουχίας του πλάσματος ελεύθερο κυττάρων του DNA έχει μια ανάλογη ευαισθησία για να ακτινοβολούν. Η ιδιαιτερότητα είναι επίσης αποδεκτή, επειδή η

EGFR

τύπους μετάλλαξης σε δείγματα βιοψίας και πλάσματος παρουσίασαν υψηλή συμφωνία. Έτσι, σπάνια ανίχνευσης μετάλλαξης με βαθιά αλληλουχίας έχει πλέον φθάσει σε ένα επαρκές επίπεδο για να προχωρήσει στην επιβεβαίωση μέσω μιας προοπτικής μελέτης. Η μέθοδος θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε ένα περιορισμένο αριθμό τόπων στόχου σε οποιαδήποτε θέση βάσης? χρησιμοποιώντας το ζεύγος-end μέθοδο ή προσδιορισμό της αλληλουχίας από την αντίθετη κατεύθυνση θα αυξήσει την ακρίβεια των θέσεων υψηλό ποσοστό σφάλματος, αυξάνοντας την ευαισθησία και ειδικότητα σε αποδεκτά επίπεδα.

Ωστόσο, είναι δύσκολο να επεκταθεί ανίχνευση μετάλλαξης σε μια μεγαλύτερη περιοχή. Η συχνότητα εμφάνισης εσφαλμένων θετικών δεν είναι αποδεκτό για διαγνωστικές εφαρμογές. εκτίμηση παραμέτρων με την αύξηση του αριθμού των κανονικών δειγμάτων και /ή πιο συντηρητικές μεθόδους εκτίμησης, όπως Μπεϋζιανή συμπερασματολογία, θα μπορούσε να μειώσει ψευδώς θετικά. Χρησιμοποιήσαμε μετάλλαξη χωρίς DNA από φυσιολογικά άτομα για την έρευνα του σφάλμα ανάγνωσης, αλλά η ανίχνευση μετάλλαξης διεξήχθη με DNA στο πλάσμα από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Μια πιθανή αιτία για την ανεπάρκεια των κατώτατων ορίων μπορεί να είναι η διαφορά στην ποιότητα του DNA. Η πρόσφατη ανακάλυψη της τεχνητής μεταλλάξεις που εισάγονται κατά τη διάρκεια πειραματικών διαδικασιών [17] προτείνει τη δυνατότητα ακόμα άγνωστα αίτια των αντικειμένων χρησιμοποιώντας δείγματα πλάσματος.

Η διαδικασία μας είναι βελτιστοποιημένο για τους στόχους μας και το κοινωνικό περιβάλλον, αλλά υπάρχει περιθώριο για τεχνική βελτίωση. Εκτός από το αντιστοιχισμένο-end μέθοδο [9], μεθόδους για την παραγωγή αλληλουχιών χωρίς σφάλματα μέσω της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας πρότυπα από ένα μόνο μόριο [18,19] θα μπορούσε να ισχύει για την ενίσχυση της ακρίβειας. Εμείς που χρησιμοποιούνται μικρές ποσότητες DNA στο πλάσμα για ενίσχυση PCR λόγω των ηθικών προτύπων του νοσοκομείου μας και των σχετικών περιφερειακών νοσοκομείων. Ωστόσο, σε ένα διαφορετικό κοινωνικό περιβάλλον, χρησιμοποιώντας αυξημένη ποσότητα DNA στο πλάσμα μπορεί να βελτιώσει την αναπαραγωγιμότητα της ανίχνευσης μεταλλάξεων χαμηλού επιπέδου.

Εκτός από το ότι εφαρμόζεται για την μη επεμβατική διάγνωση του

EGFR

μεταλλάξεις, όπως φαίνεται στα παραπάνω χρονική αναλύσεις, αυτή η μέθοδος είναι επίσης πληροφοριακό για την κατανόηση της δυναμικής των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα κατά τη διάρκεια της νόσου. Ειδικότερα, θα πρέπει να σημειωθεί ότι μια ασύμμετρη μείωση στο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο κλάσμα προηγήθηκε ακτινολογικές αλλαγές, που κατά πάσα πιθανότητα θα είναι χρήσιμη για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου.

Οι βιοψίες των προχωρημένες περιπτώσεις και επαναλαμβανόμενες βιοψίες είναι τεχνικά απαιτητική, και αντικατάσταση με μια μη επεμβατική μέθοδος θα ήταν επωφελής. Στο πλαίσιο αυτό, η παρακολούθηση Τ790Μ με τη μέθοδο μας θα έχει σημαντικά οφέλη για τη διαχείριση των ασθενών. Για παράδειγμα, την ανίχνευση της μετάλλαξης Τ790Μ σε δείγματα αίματος θα ήταν χρήσιμο για την επιλογή των ασθενών για θεραπεία με νέες EGFR-TKIs για καρκίνους του πνεύμονα που είναι ανθεκτικά σε gefitinib και erlotinib [20].

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν δύο άλλες δυνατότητες του ανάλυση ctDNA. Dawson et al. ακολούθησε τη δυναμική των ctDNA σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού με τη χρήση μεταλλάξεων στο

ΤΡ53

ή /και

PIK3CA

, και βρήκε αξία της για την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου [21]. Η χρήση κοινών μεταλλάξεων μπορεί να επιτρέψει την εφαρμογή του σε μια ευρεία ποικιλία όγκων. Αντιθέτως, η έρευνα μας εστίαση είναι πιο συγκεκριμένη, δηλαδή, ανίχνευση μετάλλαξης για θεραπευτική λήψη αποφάσεων, αν και η μέθοδος μας μπορεί επίσης να εφαρμοστεί για το σκοπό τους. Murtaza et al. πραγματοποιείται ανάλυση αλληλουχίας DNA με χρήση exome πλάσματος από ασθενείς με καρκίνο [22], Ανάλυση γονιδιωμάτων καρκίνο σε οποιοδήποτε στάδιο της πορείας της νόσου θα μπορούσε να αποκαλύψει γενετικές αλλαγές που οδηγούν στην εξέλιξη της νόσου ή την αντίσταση του φαρμάκου. Ανάλυση της ctDNA θα έχουν μια βαθιά αξία των επιστημονικών και διαγνωστικές πτυχές της έρευνας για τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών

Οι ασθενείς με την ενεργοποίηση μεταλλάξεις του EGFR σε ιστούς όγκων προσελήφθησαν στο Osaka Ιατρικό Κέντρο για τον Καρκίνο και καρδιαγγειακές νόσους. δείγματα του υπεζωκότα υγρό, εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή /και ούρα συλλέχθηκαν από μερικούς ασθενείς. Σε όλους τους ασθενείς, ενεργοποιώντας

EGFR

μεταλλάξεις βρέθηκαν σε δείγματα βιοψίας με τη χρήση της μεθόδου σφιγκτήρα PNA-LNA PCR [23]. Η ανταπόκριση στη θεραπεία και την εξέλιξη της νόσου αξιολογήθηκαν κυρίως από ακτινολογικών δεδομένων με βάση τα κριτήρια RECIST [24].

Εξαγωγή DNA από δείγματα υγρού

πλάσμα παρασκευάσθηκε μέσω φυγοκέντρησης 4-5 ml του EDTA επεξεργασμένου αίματος σε 800

g

για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το πλάσμα μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα και επανα-φυγοκεντρήθηκε στις 15.100

g

για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την φυγοκέντρηση, η άνω πλάσμα μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα. δείγματα υπεζωκότα υγρό και τα ούρα φυγοκεντρήθηκαν στις 800

g

για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε φρέσκους σωλήνες. Φυγοκεντρούμε υγρά δείγματα καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του DNA. Εγκεφαλονωτιαίο υγρό πάγωσε χωρίς φυγοκέντρηση. DNA εκχυλίστηκε από 1.5-2.0 ml ενός υγρού δείγματος (ή 5 ml ούρων) χρησιμοποιώντας το QIAamp κυκλοφορεί κιτ νουκλεϊκού οξέος (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού αντιγράφων LINE-1 [25] ή με τη χρήση του qubit ssDNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

αμπλικονίου κατασκευή της βιβλιοθήκης και βαθιά αλληλουχίας

κατασκευή της βιβλιοθήκης αλληλουχίας.

Για να ενισχυθούν οι περιοχές-στόχους του

EGFR

γονίδιο, ζεύγη εκκινητών PCR σχεδιάστηκαν με Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/). Primer ζευγάρια έχουν ευρετήρια 5-nt (σε διακρίσεις άτομα) και οι αλληλουχίες προσαρμογέα για ημιαγωγών-αλληλουχίας. Οι θέσεις των περιοχών PCR-στόχου και αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S5. PCR ενίσχυση διεξήχθη σε ένα 50 μΙ μείγμα αντίδρασης DNA που περιέχει πλάσμα που λαμβάνεται από 300 μΐ πλάσματος (10 ng ή περισσότερο), 20 pmol του κάθε εκκινητών και 1 μονάδα ΚΩΔ -Plus- DNA πολυμεράσης (Toyobo, Osaka, Japan). Για την ανάλυση της σφάλμα ανάγνωσης, χρησιμοποιήσαμε γενωμικό DNA από το πλάσμα ή τα λευκοκύτταρα από υγιή άτομα ως μήτρα PCR. Το προφίλ του ποδηλάτου είχε ως εξής: 2 λεπτά στους 94 ° C για την αρχική μετουσίωση, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 15 sec στους 94 ° C για μετουσίωση, 30 δευτερόλεπτα στους 55 ° C για ανόπτηση, και 50 sec στους 68 ° C για επέκταση. Τα προϊόντα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το QIAquick 96 PCR Kit Ο καθαρισμός (Qiagen) ή το MinElute PCR Purification Kit (Qiagen), και η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την Quant-iT ™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Life Technologies) ή ND-1000

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1. Εικόνα S2. Εικόνα S3.