Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNAs που μπορεί να λειτουργήσει ως ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικό γονιδίων σε ανθρώπινους καρκίνους. Οι αναδυόμενες απόδειξη αποκαλύπτει ότι η απορρύθμιση των miRNAs συμβάλλει στην ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-132 ήταν δραματικά μειωμένα σε εξετάζονται κυτταρικές σειρές NSCLC και κλινικά δείγματα NSCLC ιστού. Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι η εισαγωγή του miR-132 κατέστειλε σημαντικά την μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων in vitro, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-132 μπορεί να είναι μια νέα ογκοκατασταλτικό. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι το ΕΜΤ-συγγενή παράγοντα μεταγραφής ZEB2 ήταν ένας άμεσος γονιδίων στόχων του miR-132, αποδεικνύεται από την άμεση δέσμευση του miR-132 με το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’ UTR) του ZEB2. Περαιτέρω, miR-132 θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση των ZEB2 στα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, ο δείκτης EMT Ε-καδερίνης ή βιμεντίνη, μεταγενέστερος του ZEB2, επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω ή προς τα πάνω ρυθμισμένη μετά από θεραπεία miR-132. Επιπλέον, η υπερβολική έκφραση ή φίμωση ZEB2 ήταν σε θέση να ανυψώσει ή να αναστέλλουν την μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα, παράλληλα με την επίδραση του miR-132 επί των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Εν τω μεταξύ, νοκ ντάουν της ZEB2 ανέτρεψε την αυξημένη μετανάστευση και την εισβολή που προκαλείται από αντι-miR-132. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-132 καταστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC μέσω της στόχευσης ZEB2 που αφορούν τη διαδικασία της EMT. Έτσι, το εύρημα μας παρέχει νέα εικόνα για το μηχανισμό της εξέλιξης NSCLC. Θεραπευτικά, miR-132 μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα ανθρώπου

Παράθεση:. Μπορείτε J, Li Υ, Fang Ν, Liu Β, Zu L, Chang R, et al. (2014) MiR-132 καταστέλλει την μετανάστευση και την διείσδυση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

μέσω

Στόχευση την EMT Ρυθμιστής ZEB2. PLoS ONE 9 (3): e91827. doi: 10.1371 /journal.pone.0091827

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊβάν

Ελήφθη: 19η Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 15 Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Μπορείτε et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη εν μέρει υποστηρίζεται από τις επιχορηγήσεις από το Πρόγραμμα Key από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81000950), Εθνική 863 Πρόγραμμα (No.2012AA02A201, No.2012AA02A502), Εθνική 973 Πρόγραμμα (No.2010CB529405), Tianjin Επιστημονικό Πρόγραμμα Σύστημα Καινοτομίας (No.07SYSYSF05000, No.07SYSYJC27900), Κίνα-Σουηδίας Ίδρυμα Συνεταιρισμός (No.09ZCZDSF04100), και μεγάλο έργο Tianjin Πρόγραμμα υποστήριξης Sci-Tech (No.06YFSZSF05300). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις πιο κοινές αιτίες των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και την πλειοψηφία των καρκίνων του πνεύμονα είναι η μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), η οποία περιλαμβάνει περίπου το 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα [1 ]. Οι ασθενείς που φέρουν NSCLC είναι συχνά διαγιγνώσκεται ως ένα προχωρημένο στάδιο, πάσχουν από metastatically ή τοπικά προχωρημένο ασθένειες, καθιστώντας σχεδόν το 90% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα πεθαίνουν από μετάσταση [2]. Παρά το γεγονός ότι έχουν μεγάλες προσπάθειες και προόδους έχουν γίνει στη μελέτη του καρκίνου του πνεύμονα κατά τις τελευταίες δεκαετίες, ο μοριακός μηχανισμός της μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει άπιαστο.

Η microRNA (miRNA) είναι μια κατηγορία των μικρών, μη-κωδικοποίησης RNAs με περίπου 19-25 νουκλεοτίδια. Ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του γονιδίου στο επίπεδο μετα-μεταγραφής μέσω αλληλεπίδρασης με το 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (3’-UTRs) των mRNA στόχου [3], [4]. MiRNAs είναι φυλογενετικά συντηρημένη και παίζουν κρίσιμους ρόλους σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, το μεταβολισμό, την ασυλία και την πρόοδο του όγκου [5], [6]. Επίσης, η αύξηση στοιχεία δείχνουν microRNAs μπορεί να διαμορφώσει την έναρξη του όγκου και της εξέλιξης και της λειτουργίας των κυττάρων του όγκου σε εισβολή και τη μετάσταση [7], [8], [9], [10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν τεκμηριώσει τους ρόλους του miR-132 στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των νευρώνων ντοπαμίνης [11] και την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου για τη διευκόλυνση της παθολογικής αγγειογένεσης [12]. Στην ογκογένεση, αναφέρεται ότι ρύθμιση προς τα κάτω του miR-132 συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος [13]. Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος του miR-132 στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα δεν έχει ακόμη τεκμηριωθεί.

ZEB2 /SIP1 είναι μέλος του deltaEF-1 οικογένεια με τα δύο χέρια παράγοντες δακτύλου ψευδαργύρου και διαδραματίζουν ζωτικό ρόλο στην η ανάπτυξη μιας ποικιλίας καρκίνων, όπως γαστρικό, ωοθήκης, πλακώδους και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [14], [15]. ZEB2 καταστέλλουν ειδικά την έκφραση της Ε-καδερίνης μέσω σύνδεσης προς CACCT (G) μοτίβο στον υποκινητή Ε-καδερίνης διάρκεια epithelial- μετάβαση μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) [16], [17]. Εκτός από E-cadherin, άλλα γονίδια όπως plakophilin 2 και ΖΟ-3 που περιλαμβάνουν επιθηλιακά διασταυρώσεις κυττάρου-κυττάρου επίσης καταστέλλεται από ZEB2 [18]. Πρόσφατα, ZEB2 φέρεται να μεταγραφικά up-ρυθμίζουν βιμεντίνη

μέσω

συνεργασία με SP1 κατά τη διάρκεια της EMT [19].

Στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να διερευνήσει την υποτιθέμενη ρόλο του miR-132 στην μετάσταση του NSCLC. Βρήκαμε ότι miR-132 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα και μεταστατικού κλινικά δείγματα ιστών, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-132 θα μπορούσε να δράσει ως καταστολέας όγκου. Εντοπίσαμε ότι η ZEB2 ρυθμιστής EMT είναι μία από τις άμεσες γονιδίων στόχων του miR-132. MiR-132 είναι σε θέση να αναστείλουν EMT και τη μετάσταση των κυττάρων NSCLC μέσω παραλύοντας τη λειτουργία της ZEB2.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Ηθική Επιτροπή της Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Κίνα, και γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς που μελετήθηκαν.

γραμμές κυττάρων και κλινικά δείγματα

Ο υπο-κυτταρικές σειρές, υψηλής μεταστατικό L9981 και χαμηλής μεταστατικό NL9980, απομονώθηκαν και καθορίστηκε από ανθρώπινο πνεύμονα μεγάλων κυττάρων καρκινώματος κυτταρική γραμμή [20]. Η υψηλής μεταστατικό 95δ και χαμηλής μεταστατικό 95C ήταν sublines της κυτταρικής γραμμής καρκινώματος ανθρώπινου γίγαντας-πνεύμονα [21]. Η κυτταρική σειρά NSCLC YTMLC-9 [22], [23] ιδρύθηκε το ινστιτούτο μας. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό μόσχου (Invitrogen, USA), 100 IU /ml πενικιλλίνη και 100 IU /ml στρεπτομυκίνη. Η NSCLC Α549 κυτταρική γραμμή, που αγοράστηκε από την American Tissue Culture Collection (ATCC), καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 U /mL στρεπτομυκίνη. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Για τις διαμολύνσεις, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή και επιμολύνονται με πλασμίδια χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Ένα σύνολο 90 περιπτώσεων δειγμάτων NSCLC ελήφθησαν από Γενικό Νοσοκομείο της Tianjin Medical University. Όλοι οι 90 ασθενείς δεν είχαν λάβει θεραπεία με ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Δείγματα ιστών για χρήση αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. Το σύστημα TNM στάσης της UICC (1997) χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των δειγμάτων και τους χρόνους επιβίωσης που υπολογίζεται από την ημέρα της επέμβασης στο θάνατο μέσω της αξιολόγησης της υποτροπής και της μετάστασης μέχρι την τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία. Η παρακολούθηση των ασθενών που επιβίωσαν κατά μέσο όρο 32,55 μήνες και κυμαινόταν από 1 έως 96 μήνες. Η μελέτη έχει εγκριθεί από το νοσοκομείο επιτροπή δεοντολογίας. Κλινικοπαθολογοανατομικών ενημέρωση των ασθενών σχετικά με την ηλικία, το μέγεθος του όγκου, ιστολογικό τύπο, τη διαφοροποίηση, το στάδιο και μετάσταση στους λεμφαδένες λήφθηκε από τους φακέλους των ασθενών, τα οποία συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT- PCR), ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR) και Werstern Blot Δοκιμασία

το συνολικό RNA εκχυλίζεται από το mirVana Kit (Applied Biosystems, CA) αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA με την αντίστροφη μεταγραφή stem-loop έναυσμα για την ανίχνευση miRNA. Αντίστροφη μεταγραφή του miR-132 και U6 εσωτερικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανάστροφης μεταγραφάσης Μ-ΜΕν (Takara, Ιαπωνία). Η qRT- PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara) ακολουθώντας το πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας ένα προθερμασμένο μέσο πραγματικό χρόνο (Invitrogen). Όλα τα αρχικά τεμάχια που φαίνονται στον Πίνακα S1. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν για να αναλύσουν σχετική γονιδιακή έκφραση και κάθε δείγμα εξετάστηκε εις τριπλούν. τιμές Ct χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί η έκφραση των επιπέδων RNA. Η ποσότητα της έκφρασης του γονιδίου-στόχου (2

-ΔΔCt) ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αναφορά U6.

Το πλασμίδιο Κατασκευές

γονιδιωματική αλληλουχία

ανθρώπινης miR-132, συμπεριλαμβανομένων πλευρική αλληλουχία -200 bp, ήταν ενισχύθηκε από ανθρώπινο γονιδίωμα, στη συνέχεια εισάγεται εντός της θέσης BamHI /EcoRI του φορέα pcDNA3.1 (Invitrogen), που ονομάζεται ως pcDNA3.1-miR-132. Η 3 ‘αμετάφραστη περιοχή πλήρους μήκους (3’UTR) του ZEB2 ενισχύθηκε από το ανθρώπινο γενωμικό DNA, και κλωνοποιήθηκε στον κατάντη της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας περιοχή κωδικοποίησης του διανύσματος pMIR-GLOTM λουσιφεράσης (Promega, USA). Η ανασυνδυαστεί φορέας ονομάστηκε ως pMIR-ZEB2. Μεταλλάξεις των θέσεων δέσμευσης miR-132 εισήχθησαν με κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση και την οδήγησε φορέας ονομάστηκε pMIR-ZEB2-Mut. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τις κατασκευές που αναφέρονται στον πίνακα S1. Όλες οι κατασκευές επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

Αντισώματα και siRNAs

Τα πρώτα αντισώματα χρησιμοποιούνται σε στύπωμα Western ήταν κουνελιού αντι-ZEB2 (Santa Cruz, USA), αντι-Ε-καδερίνης (Santa Cruz) , αντι-βιμεντίνη (Santa Cruz) και αντι-β-ακτίνης ποντικού (Sigma, Aldrich, St. Louis, ΜΟ). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) που στοχεύουν την ανθρώπινη ZEB2 mRNA, αρνητικός έλεγχος siRNA (siControl), miR-132 αναστολέα (αντι-miR-132), και αναστολέα αρνητικού ελέγχου (αντι-miR-NC) αγοράστηκαν από Ruibobio (Guangzhou, Κίνα ). Ολες οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίου που παρατίθενται στον Πίνακα S1.

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η κυτταρική μετανάστευση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Boyden δοκιμασίες θάλαμο χρησιμοποιήθηκαν για να εξετάζουν την ικανότητα εισβολής των κυττάρων. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 1 μα pcDNA3.1 ή pcDNA3.1-miR-132 φορέα. Δεκαέξι ώρες αργότερα, τα επιμολυσμένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν. 1,0 × 10

5 κύτταρα σε 300 μΙ μέσο καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε άνω θαλάμους (Millipore). Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 500 μΙ πλήρους μέσου με 10% FBS. Μετά από επώαση για 12 ώρες στους 37 ° C, μη-εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή του θαλάμου με ένα βαμβάκι. Τα μεταναστευτικά κύτταρα στην κάτω επιφάνεια των ενθεμάτων σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες, και πέντε τυχαία πεδία για κάθε ένθετο μετρήθηκαν στα 100 × μεγεθύνσεις.

Luciferase Assay Reporter Gene

τα προσκολλημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με 200 ng pMIR-ZEB2 ή pMIR-ZEB2-Mut φορέα και 80 ng του pcDNA3.1-miR-132 φορέα ή pcDNA 3.1 κενούς φορείς, και το pRL-ΤΚ πλασμίδιο (Promega, Madison, WI) το οποίο χρησιμοποιείται ως εσωτερικό ομαλοποίηση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 36 ώρες και λύθηκαν με τη χρήση του ρυθμιστικού λύσης (Promega). προσδιορισμό γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης υλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε συγκρίνοντας τις μέσες τιμές (± SD) χρησιμοποιώντας τα

t-

δοκιμασία του Student για ανεξάρτητες ομάδες και ήταν υποτίθεται για

σ

& lt? 0,05 (*) και

p

& lt?. 0.01 (**)

Αποτελέσματα

MiR-132 είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων και των ιστών Δείγματα

Αξιολογήσαμε την έκφραση του miR-132 από qRT-PCR σε αρκετές NSCLC κυτταρικές σειρές με ξεχωριστές μεταστατικό ικανότητες. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα miR-132 εμφάνισαν ένα μεταβαλλόμενο πρότυπο σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση του miR-132 σε εξαιρετικά μεταστατικό L9981 και 95δ κύτταρα δραματικά μειωθεί, σε σχέση με εκείνο των αντίστοιχων κακώς μεταστατικό NL9980 ή κυτταρικές γραμμές 95C, αντίστοιχα (Εικόνα 1Α). Περαιτέρω, ανιχνεύσαμε έκφραση miR-132 σε 45 ζεύγη κλινικές πρωτογενούς ιστού καρκίνου του πνεύμονα και τα δείγματα καρκινικού ιστού μεταστατικού λεμφαδένα. Σε σύγκριση με πρωτογενή ομολόγους τους, οι λεμφαδένες δείγματα μεταστατικών ιστών έτρεφε μια σημαντική χαμηλότερα επίπεδα miR-132 (Εικόνα 1Β,

P

& lt? 0.001, μαθητή

t

-τεστ). Επίσης, η ανάλυση σχετικά με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με NSCLC έδειξε ότι η έκφραση του miR-132 είχε σημαντική συσχέτιση με την κατάσταση των λεμφαδένων (Πίνακας 1,

P

= 0,011). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μειωμένη έκφραση του miR-132 είναι ένα συχνό συμβάν σε ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα NSCLC και ιστών, η οποία μπορεί να εμπλέκεται στην μετάσταση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) Τα σχετικά επίπεδα mRNA του miR-132 ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR και κανονικοποιήθηκαν έναντι ενός ενδογενούς ελέγχου (U6 RNA) σε διάφορες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές με ξεχωριστές μεταστατική ικανότητα. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD για τρία ανεξάρτητα πειράματα (**

P

& lt? 0,01, του Student

t

– test). (Β) ανάλυση qRT-PCR του miR-132 έκφρασης σε 45 ζεύγη των πρωτογενών ιστών NSCLC και μεταστάσεις τους κόμβος που αντιστοιχεί λέμφου. MiR-132 έκφρασης σε αυτούς τους δύο τύπους ιστών συγκρίθηκε με τον τρόπο του Wilcoxon signed-rank test (***

P

& lt? 0.001, του Student

t

– test).

miR-132 είναι ικανή να αναστείλει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC in vitro

στη συνέχεια, ελέγξαμε τη λειτουργική σημασία του miR-132 σε κύτταρα NSCLC. Τραύματος δοκιμασία επούλωσης έδειξε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-132 σε L9981 ή Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε την δοκιμασία θαλάμου Boyden να διερευνηθεί η επίδραση της miR-132 στην κυτταρική εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β και 2C, όταν επιμολύνονται με pcDNA3.1-miR-132 πλασμίδια, η ικανότητα εισβολής των κυττάρων Α549 επέδειξε μια μείωση πάνω-3 φορές, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Εντούτοις, τα κύτταρα έδειξαν μία αυξημένη εισβολή κατά τη θεραπεία του miR-132 αναστολέα (Σχήμα 2Β, 2C). Επιπλέον, παράλληλα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε 95d και κυτταρικές γραμμές L9981 (Σχήμα 2C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία δείχνουν έντονα ότι το miR-132 είναι σε θέση να καταστείλει την μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC

in vitro

.

(Α) Η επούλωση του τραύματος ή χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η μετανάστευση ικανότητα του L9981 και Α549 κύτταρα, αντίστοιχα. (B, C) δοκιμασία θαλάμου Boyden χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η ικανότητα εισβολής των 95d, L9981, και τα κύτταρα Α549, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα ήταν από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, του Student

t

– test). Η μεταναστευτική αριθμός κυττάρων σε κάθε ομάδα κανονικοποιήθηκε με το μάρτυρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 (NC) ή pcDNA3.1-miR-132 (MIR-132) κατασκευάζει, και αναστολέα miR-132 (αντι-miR-132) ή τον έλεγχο αναστολέα (αντι-miR-NC). Τα μεταναστευτικά Α549 κύτταρα στο κάτω θαλάμους από ένα πείραμα που φαίνεται στο Β

Η

MiR-132 αναστέλλει άμεσα την έκφραση της ZEB2 μέσω 3’UTR του και ρυθμίζει την EMT του NSCLC κύτταρα

Για την ανίχνευση του μοριακού μηχανισμού με τον οποίο miR-132 καταστέλλει την μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων, είχαμε προβλέψει τις υποτιθέμενες γονιδίων στόχων του miR-132 σε ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας το εργαλείο

Miranda

,

PicTar

και

TargetScans

. Μεταξύ των προβλεπόμενων υποψηφίων, ZEB2 ήταν ενδιαφέρον σε αυτή τη μελέτη, λαμβάνοντας υπόψη τις κρίσιμους ρόλους του ZEB2 στην ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκίνων [14], [15]. Για να ελεγχθεί αν miR-132 στοχεύει άμεσα ZEB2 (Σχήμα 3Α), το άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη αλληλουχία 3 ‘UTR του ZEB2 κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρεπόρτερ pMIR, αντίστοιχα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β. Η δραστικότητα λουσιφεράσης των pMIR- ZEB2 κατασκευάσματος 3 ‘UTR-wt ήταν σημαντικά μειωμένη από την υπερ-έκφραση του miR-132 σε κύτταρα NL9980, ενώ μεταλλαγμένο ομόλογό της δεν ήταν (Εικόνα 3C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα επίπεδα πρωτεΐνης ZEB2 σε L9981 mRNA ή ή 95d κύτταρα μειώνεται δραματικά με miR-132, αντίστοιχα (Σχήμα 3Δ, 3Ε, και 3F). Έχει αναφερθεί ότι ZEB2 είναι ένα ζωτικό επαγωγέας ΕΜΤ μέσω καταστολής της Ε-καδερίνης ή επαγωγή έκφρασης βιμεντίνης στον ανθρώπινο καρκίνο [16], [19]. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι ZEB2 ενεργεί ως στόχο του miR-132, εξετάζουμε την επίδραση του miR-132 σε αυτές τις δύο κατάντη δράστες των ZEB2 με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε και 3F, ο κατασκευαστής EMT Ε-καδερίνης ή βιμεντίνη ήταν δραματικά τα πάνω ρυθμισμένη ή προς τα κάτω ρυθμισμένα με την υπερέκφραση του miR-132 σε αμφότερα L9981 και 95d κύτταρα. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το miR-132 αναστέλλει άμεσα την έκφραση ZEB2

μέσω

στόχευση ‘UTR του 3 και προκαλεί EMT των κυττάρων NSCLC.

(Α) Η θέση δέσμευσης miR-132 προβλέψει στην η 3’UTR της ZEB2 mRNA. (Β) Mutant δημιουργήθηκε στην περιοχή του σπόρου ZEB2 3 ‘UTR όπως υποδεικνύεται από το υπογράμμιση. Ένα θραύσμα 3 ‘UTR του ZEB2 mRNA που περιέχουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη της αλληλουχίας δέσμευσης miR-132 κλωνοποιήθηκε στην κατάντη του γονιδίου λουσιφεράσης σε φορέα pMIR. (C) κύτταρα L9981 διαμολύνθηκαν με φορείς ρεπόρτερ pMIR περιέχουν είτε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο ZEB2 3’UTR (υποδεικνύεται ως pMIR-ZEB2-3 ‘UTR-wt και pMIR-ZEB2-3’ UTR-mut) είτε με pcDNA3.1 (υποδεικνύεται ως NC) ή φορέα pcDNA3.1-miR-132 (υποδεικνύεται ως miR-132). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. (D) ZEB2 mRNA ανιχνεύθηκε με qRT-PCR σε κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 (υποδεικνύεται ως NC) ή pcDNA3.1-miR-132 φορέα (υποδεικνύεται ως miR-132). (Ε, F) Τα επίπεδα πρωτεΐνης του ZEB2, Ε-καδερίνης ή βιμεντίνη εξετάστηκε με στύπωμα Western σε κύτταρα επιμολυσμένα με διαφορετικά πλασμίδια. Το Σχήμα F παρουσιάζει τις σχετικές τιμές του γκρι της κάθε ζώνης (ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη). Πρωτεΐνη συγκροτήματα από τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες κηλίδος Western ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad, USA). Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD (**

P

& lt? 0,01, του Student

t

– test).

Η

ZEB2 Συμβάλλει στην miR-132- Καταστολής μετανάστευση και εισβολή του NSCLC Cells

στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση του mRNA ή της πρωτεΐνης του ZEB2 σε διάφορα κύτταρα NSCLC, καθώς και 45 περιπτώσεις πρωτογενούς πνεύμονα καρκινικούς ιστούς και μεταστατικών ιστών λεμφαδένα. Τα στοιχεία έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης του ZEB2 στην άκρως μεταστατική L9981 ή 95d κυττάρων ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, σε σύγκριση με την κακώς μεταστατικό NL9980 ή 95C κύτταρα, αντιστοίχως (Σχήμα 4Α). Επίσης, το ίδιο αποτέλεσμα για τα επίπεδα του mRNA της ZEB2 παρατηρήθηκε σε μεταστατικούς ιστούς λεμφαδένα, σε σχέση με τους ιστούς πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα (Σχήμα 4Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση της ZEB2 εμφανίζεται μια αντίστροφη συσχέτιση με το επίπεδο miR-132 σε ιστούς NSCLC (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν ZEB2 είναι καθοριστικής σημασίας για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC. Η έκτοπη έκφραση του ZEB2 σε NL9980 ή 95C κύτταρα σημαντικά ενισχυμένη εισβολή κυττάρων (Εικόνα 4D), ωστόσο, φίμωση ZEB2 με siRNAs στα κύτταρα L9981 σαν αποτέλεσμα μειωμένη μετανάστευση και εισβολή ικανότητα των κυττάρων (Σχήμα 4Ε, 4F), αποκαλύπτοντας θετικούς ρόλους του στην συμβολή της μετανάστευσης NSCLC κυττάρων και εισβολή. Εν τω μεταξύ, ο διαμολύνον ή αποσιώπηση της αποτελεσματικότητας των ZEB2 στα κύτταρα ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 4D και 4F,

κατώτερο

). Στη συνέχεια, θα έχετε πρόσβαση αν η λειτουργική δράση του miR-132 σε κύτταρα NSCLC εξαρτιόταν από ZEB2. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4G και 4Η, εισαγωγή των αντι-miR-132 σε NL9980 κύτταρα οδήγησε σε αύξηση της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής, ενώ σιωπή του ZEB2 με siRNAs καταργηθεί εν μέρει το εξάρτημα. Παράλληλα, το επίπεδο πρωτεΐνης ZEB2 επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα 4Η,

κατώτερο

). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ZEB2 λειτουργεί ως στόχο του miR-132, υπεύθυνη για miR-132-μεσολάβηση ρύθμιση της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων NSCLC.

(Α) Η έκφραση της ZEB2 εξετάστηκε από τους δυτικούς κηλίδα στα κύτταρα NSCLC. (Β) Τα σχετικά επίπεδα mRNA του ZEB2 ανιχνεύθηκαν σε 45 ζεύγη ιστούς πρωτογενούς όγκου NSCLC και των ομολόγων τους μετάσταση λεμφαδένα. ZEB2 έκφρασης σε αυτούς τους ιστούς σε σχέση με τον τρόπο του Wilcoxon signed-rank test (***

P

& lt? 0.001, t-test του Student). (C) αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-132 και έκφραση ZEB2 στους ιστούς NSCLC. ZEB2 έκφραση αναλύθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. Η έκφραση miR-132 ανιχνεύθηκε με ανάλυση qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση U6. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συντελεστή συσχέτισης κατά Pearson (r = -0.68, ***

P

& lt? 0.001). (Δ) Η εισβολή των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία θαλάμου Boyden σε NL9980 ή 95C κύτταρα επιμολυσμένα με pCMV ή pCMV-ZEB2 φορείς, αντίστοιχα. (E, F) Η επίδραση των ZEB2 νοκ ντάουν στην κυτταρική μετανάστευση ή την εισβολή εκτιμήθηκε από την επούλωση των πληγών ή δοκιμασία Boyden θάλαμο, αντίστοιχα (**

P

& lt? 0,01, του Student

t

– δοκιμή). Επιπλέον, η αποδοτικότητα σίγηση του ZEB2 με siRNA εξετάστηκε με στύπωση Western. (G, H) Η επούλωση του τραύματος ή δοκιμασία θαλάμου Boyden χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της μετανάστευσης ή εισβολής ικανότητα των κυττάρων NL9980 με διαφορετικές θεραπείες, αντίστοιχα (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, του Student

t

– test). Επιπλέον, η απόδοση αποσιώπηση των ZEB2 από siRNA εξετάστηκε από κηλίδα Western.

Η

Συζήτηση

Η ομάδα μας έχει επίκεντρο το μοριακό μηχανισμό της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ανάπτυξη τα τελευταία χρόνια, ειδικά αφιερώνει στην έρευνα του NSCLC μετάσταση. Τα miRNAs που εμπλέκονται στην παθογένεση NSCLC και έχουν προφίλ έκφρασης τους έχουν χρησιμοποιηθεί για την ταξινόμηση των καρκίνων [25], [26], [27]. Ως εκ τούτου, αναμένεται ότι η dyregulation των microRNAs μετάστασης που σχετίζονται μπορεί να διευκολύνει την προηγμένη εξέλιξη των NSCLC. Miao LJ,

et

,

al.

Διαπίστωσε ότι το miR-449c θα μπορούσε να αναστείλει την εισβολή των κυττάρων NSCLC στοχεύοντας c-Myc mRNA [28]. Επίσης, η αποστέωση Liu,

et al.

Ανέφερε ότι το miR-26a μπορεί να προωθήσει την μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων μέσω ενεργοποίησης ΑΚΤ στοχεύοντας PTEN [29]. MiR-132, που προκύπτουν από το σύμπλεγμα miR-212/132 [30], έχει τεκμηριώσει ρόλο στην προώθηση της ανάπτυξης του καρκίνου του παγκρέατος

μέσω

ενεργοποίηση AKT οδό σηματοδότησης [31]. Ωστόσο, το δυναμικό λειτουργία αυτού του microRNA στην ανθρώπινη εξέλιξη NSCLC έχει λίγες αναφορές. Στην παρούσα μελέτη, μας ενδιαφέρει το δυνητικό ρόλο του miR-132 στην μετάσταση των κυττάρων NSCLC.

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-132 ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε εξαιρετικά μεταστατικό NSCLC κυτταρικές σειρές και δείγματα ιστών. Έτσι, υποτίθεται ότι το miR-132 μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα ογκοκατασταλτικό miRNA και dyregulation της μπορεί να περιλαμβάνει την προηγμένη εξέλιξη του καρκίνου στον άνθρωπο. Άλλωστε, στην αρχική ογκογένεση, Shuyu Zhang και ο συνάδελφός του διαπίστωσαν ότι το miR-132 που ασκείται τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης σε πρωτογενείς όγκους του παγκρέατος και μπορεί να σχετίζεται με την πρώιμη ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος [13]. Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος του miR-132 στην πρώιμη εξέλιξη του NSCLC πρέπει ακόμη να διερευνηθεί περαιτέρω. Για τον μηχανισμό που περιλαμβάνει miR-132 κάτω ρύθμιση, Shuyu Zhang,

et al.

Ανέφερε ότι η υπερ-μεθυλίωση της περιοχής υποκινητή ήταν υπεύθυνη για τη μειωμένη έκφραση του miR-132 [13]. Ως εκ τούτου, έχουμε σκεφτεί ότι αυτή η τροποποίηση του DNA θα μπορούσε να προκαλέσει την αλλοίωση του miR-132 έκφρασης στο ανθρώπινο NSCLC.

Στη συνέχεια, μελετήθηκε η λειτουργία των miR-132 στο NSCLC. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η επανεισαγωγή των 132 κατασταλεί δραματικά την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC

in vitro

. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι η μειωμένη έκφραση του miR-132 μπορεί να συμβάλει στην μετάσταση των καρκινικών κυττάρων και κατά συνέπεια διευκολύνει την ανάπτυξη προηγμένων ανθρώπινων καρκίνων όπως NSCLC. Εμείς χαρακτηρίστηκε περαιτέρω ZEB2 ως λειτουργικό στόχο miR-132 με δοκιμασίες αναφοράς λουσιφεράσης γονίδιο, RT-PCR και ανάλυση στυπώματος Western, αντιστοίχως. ZEB2 /SIP1, ως μέλος της deltaEF-1 οικογένεια των δύο χέρια παράγοντες ψευδαργύρου-δακτύλου, συχνά εκφράζεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του παγκρέατος [31], του μαστού [32], γαστρικό [33], [34 ], νεφρικών [35], κεφαλής και λαιμού [36], γλοίωμα [37], ηπατοκυτταρικό [38], των ωοθηκών [39], πλακώδους και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [14], [15]. Ο σημαντικός ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα ZEB2 έχει έντονα υπογραμμισμένο σε πολυάριθμα έγγραφα, λόγω της λειτουργίας του σε επαγωγή epithelial- μετάβαση μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) και τη διευκόλυνση της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων [37], [40], [41]. Για παράδειγμα, Βιετνάμ EH,

et al

. ανέφερε ότι θα μπορούσε να προκαλέσει ZEB2 ΕΜΤ και εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων

μέσω

ειδικά καταστέλλοντας την έκφραση της Ε-cateherin και up-ρύθμιση της έκφρασης βιμεντίνη [42]. Επιπλέον, Cong Ν και ο συνάδελφός του διαπίστωσαν ότι κάτω-ρυθμίζονται microRNA-200 οικογένεια ήταν σε θέση να προωθήσει EMT μέσω μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης στοχεύοντας E-cadherin καταστολείς ZEB1 /ZEB2 στο γαστρικό αδενοκαρκίνωμα [33]. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι είχαν ένα ZEB2 συχνά υψηλή έκφραση σε μεταστατικά κύτταρα NSCLC και η κλινική τους ιστούς λεμφαδένα. Και ZEB2 ήταν υπεύθυνος για το miR-132-διαμορφωμένη τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρατηρήσαμε ότι Ε-καδερίνης ή βιμεντίνη, ο καθοδικός τελεστής του ZEB2, επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω ή προς τα πάνω ρυθμισμένα με miR-132, υποδεικνύοντας ότι miR-132 μπορεί να ασκήσει τις λειτουργίες στη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC μέσω διαμόρφωσης EMT. Αυτές

in vitro

δεδομένων συνεπάγεται την απαραίτητη συμβολή των εξασθενημένων miR-132 στην προώθηση της μετάστασης των κυττάρων σε καρκίνους. Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν μια mesenchymal- επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ) σε μεταστάσεις που επέτρεψε δημιουργία καρκινικών κυττάρων σε μια απομακρυσμένη τοποθεσία [43]. Ωστόσο, ο πιθανός ρόλος του miR-132 σε αυτή τη διαδικασία πρέπει ακόμα να επεξηγηθεί περαιτέρω.

Εν ολίγοις, μελετήσαμε το ρόλο του miR-132 στην ανάπτυξη NSCLC. Το εύρημά μας υποδηλώνει ότι το miR-132 μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα ογκοκατασταλτικό miRNA. MiR-132 τεμάχια τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων NSCLC μέσω της στόχευσης της ZEB2 ρυθμιστή EMT. Τα στοιχεία μας παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με την μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την ανάπτυξη του ανθρώπινου NSCLC. Επιπλέον, miR-132 μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή θεραπευτική υποψήφιος για τη θεραπεία του NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στο χαρτί εισήχθησαν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091827.s001

(DOC)