Αφηρημένο

βλεννών διαμεμβρανικές, MUC4 και MUC 16 συνδέονται με την εξέλιξη του όγκου και μεταστατικό δυναμικό σε ανθρώπινο παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα. Ανακαλύψαμε ότι miR-200c αλληλεπιδρά με ειδικές αλληλουχίες μέσα στην αλληλουχία κωδικοποίησης του MUC4 και MUC 16 mRNAs, και αξιολόγησε την κανονιστική φύση αυτής της σύνδεσης. Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές σειρές S2.028 και t3m-4 επιμολυσμένα με miR-200c έδειξαν 4.18 και 8.50 φορές κάτω ρύθμιση των MUC4 mRNA, και 4,68 και 4,82 φορές προς τα κάτω ρύθμιση των MUC 16 mRNA σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε επίσης σημαντική μείωση της έκφρασης γλυκοπρωτεΐνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-200c υπερέκφραση ρυθμίζει MUC4 και MUC 16 βλεννινών σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με άμεση στόχευση του mRNA αλληλουχία κωδικοποίησης του καθενός, με αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα MUC4 και MUC 16 mRNA και πρωτεΐνης. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι, εκτός από τη ρύθμιση των πρωτεϊνών που διαμορφώνουν EMT, επιρροές miR-200c έκφραση βλεννινών επιφάνεια των κυττάρων στον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Radhakrishnan P, Mohr πμ, Grandgenett μμ, Steele MM, Batra SK, Hollingsworth ΜΑ (2013) microRNA-200c ρυθμίζει την έκφραση των MUC4 και MUC 16 με απευθείας στόχευση Κωδικοποίηση τους αλληλουχίες στο ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (10): e73356. doi: 10.1371 /journal.pone.0073356

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Radhakrishnan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις ακόλουθες επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου: σπορίων (1P50CA127297), η έγκαιρη ανίχνευση Δίκτυο Έρευνας (5U01CA111294), η Συμμαχία των Glycobiologist για την ανίχνευση του καρκίνου και κινδύνων (5U01CA128437), στο μικροπεριβάλλον του όγκου δικτύου (U54 CA163120), και R01CA57362 . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρές (~ 20-22 νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης RNAs που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω αλληλεπίδρασης με είτε το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’ UTR) ή περιοχή κωδικοποίησης των mRNAs στόχου. Η έκφραση του στοχευόμενου γονιδίου προϊόντων επηρεάζονται από miRNA επαγόμενη αποικοδόμηση mRNA ή αναστολή της μετάφρασης [1]. Η αλλαγμένη έκφραση των miRNAs στα αποτελέσματα του καρκίνου σε λειτουργίες προώθηση του όγκου και καταστολής όγκων. Για παράδειγμα, το miR-155, miR-17-5p και miR-21 έχουν γνωστό ογκογόνο δραστηριότητες [2,3], ενώ, miR-15a, miR-16-1, ας-7 και miR-145 λειτουργούν ως καταστολείς των όγκων [ ,,,0],4-9]. Έχει δειχθεί ότι miR-200c εκφράζεται διαφορικά σε καρκίνο του παγκρέατος, όπου η υψηλή έκφραση συσχετίστηκε με καλύτερη επιβίωση και χαμηλή έκφραση συσχετίζεται με χειρότερη επιβίωση [10]. Η υπερέκφραση του miR-200c αναστέλλει τον καρκίνο εισβολή των κυττάρων με τη διαμόρφωση παράγοντες σημαντικό EMT [10]. Η έκτοπη έκφραση του miR-200c προκαλεί υψηλότερα επίπεδα της E-cadherin στην μαστού και καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μέσω της άμεσης στόχευσης του μεταγραφικού παράγοντα 8 (TCF8 /ZEB1), ένας αρνητικός ρυθμιστής της E-cadherin [11-14]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα με υψηλά επίπεδα miR-200c έχουν μια πιο επιθηλιακά και λιγότερο φαινότυπο μεσεγχυματικών που μπορεί να επηρεάσουν τη μετάσταση. Πρόσφατα, η υπερέκφραση του miR-200c αποδείχθηκε ότι αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου του μελανώματος και της αντίστασης στα φάρμακα [15].

Η ανώμαλη έκφραση των γλυκοπρωτεϊνών βλεννίνης συνδέεται με παγκρεατική εξέλιξη του καρκίνου σε μετάσταση. Οι βλεννίνες διαμεμβρανική MUC4 και MUC 16, τα παρεκκλίνοντα υπερεκφράζεται σε πολλούς αδενοκαρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρωπίνων παγκρεατικού καρκίνου [16-18]. Το MUC4 βλεννίνη είναι μία μεγάλη γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται από επιθηλιακά κύτταρα σε μια ποικιλία ιστών. MUC4 δεν εκφράζεται στους φυσιολογικούς πάγκρεας, αλλά εκφράζεται μη φυσιολογικά σε ένα υψηλό ποσοστό των προκαρκινικών και κακοήθων βλαβών στο πάγκρεας [16,19]. MUC4 προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση εν μέρει μέσω αλληλεπίδρασης με τον HER2 ογκοπρωτεΐνη [20,21]. MUC 16 (ΟΑ125) είναι ένα υψηλού μοριακού βάρους βλεννίνης γλυκοπρωτεΐνη που εκφράζεται κανονικά σε οφθαλμική επιφάνεια, στην αναπνευστική οδό και τα αναπαραγωγικά όργανα που περιέχουν επιθηλιακά κύτταρα [22]. CA125, ένα επιτόπιο επί MUC 16, χρησιμοποιείται ως δείκτης όγκου για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών σε ορούς ασθενών [23] και την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών MUC 16 επιρροές και μετάσταση [24]. Η αυξημένη έκφραση του MUC 16 παρατηρείται επίσης σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος [17,18], και έχουμε δείξει πρόσφατα ότι υπάρχει αυξημένη έκφραση σε μεταστατικές αλλοιώσεις των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος [25].

Αναφέρουμε εδώ ότι ΜΙΚ 200C αλληλεπιδρά με ειδικές αλληλουχίες μέσα στην αλληλουχία κωδικοποίησης του MUC4 και MUC 16 mRNAs και ρυθμίζει τα επίπεδα της έκφρασης. Υψηλότερη έκφραση του διαμεμβράνης βλεννινών και απώλεια miR-200c είναι ιδιαίτερα σχετίζεται με μεταστατικό χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος Capan-1 (American Type Culture Collection, ATCC), S2.007, S2.013, S2.020, S2.028 [26], ΗΡΑΡ (γενναιόδωρη δωρεά από την RS Metzgar, Τμήμα Μικροβιολογίας και Ανοσολογίας, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina), και t3m-4 (είδος δώρου από Tetsuro Okabe, Πανεπιστήμιο του Τόκυο, Ιαπωνία) αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) (Hyclone, Logan, UT, USA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Valley Biomedical Inc., Winchester, VA, USA), 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 100 μονάδες /ml πενικιλίνη (Mediatech Inc., Manassas, VA, USA) και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε ένα υγροποιημένο εκκολαπτήριο.

απομόνωση microRNA και η Ρεάλ ανάλυση χρόνου-PCR (RT-PCR) του miR-200c

miRNA εξήχθησαν από τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας mirVana miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion, Carlsbad, CA, USA). Έκφραση του miR-200c προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού TaqMan microRNA (ΑΒΙ, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

miRNA-200c υπερέκφραση στο S2.028 και t3m-4 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές

τα ολιγονουκλεοτίδια του πρωτογενούς μεταγραφή του miR-200c κλωνοποιήθηκαν σε ρ

σιλανσιέ

4.1-CMV πλασμίδιο (Ambion, Carlsbad, CA, USA) (Πίνακας S1) για τη δημιουργία ενός σταθερού φορέα έκφρασης. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 75 x10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο (12 φρεατίων πλάκα) την ημέρα πριν από την επιμόλυνση, και 1 μg πλασμιδίου επιμολύνθηκε μέσα στα κύτταρα την επόμενη ημέρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX με PLUS αντιδραστήριο (τεχνολογίες ζωή Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν υπό επιλογή με G418 (200 μg /ml) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι κλώνοι στη συνέχεια συλλέγονται και αναλύονται για έκφραση miR-200c στην κυτταρική γραμμή S2.028 (κλώνος 7), ενώ ένα πολυκλωνικό επιλεγμένο πληθυσμό χρησιμοποιήθηκε για την κυτταρική γραμμή t3m-4. Κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο αλληλουχία που περιέχει τον φορέα από το κιτ (Ambion, Carlsbad, CA, USA) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Η έκφραση του miR-200c ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan κιτ δοκιμασίας microRNA (ΑΒΙ, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. U6 rRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση υπολογίστηκε με τη χρήση του 2

-ΔΔCt μέθοδο [27].

μπλε μεθυλενίου κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια χρωστική κυανούν του μεθυλενίου κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. S2.028 και t3m-4 ελέγχου και miR-200c που εκφράζουν κύτταρα μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν σε 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων και 200 ​​μΐ συνολικός όγκος, οκτώ επαναλήψεις για κάθε χρονικό πλαίσιο. Σε κάθε χρονικό σημείο (24, 48, 72 και 96 ώρες) μέσα αφαιρέθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με 150 μΐ του Dulbecco PBS και σταθεροποιήθηκαν με 150 μL 10% φορμαλίνη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Φορμαλίνη απομακρύνθηκε και τα κύτταρα χρωματίστηκαν για 2 ώρες με 80 μΙ 1% μπλε του μεθυλενίου (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, USA) αραιωμένου με 0.01 Μ ρυθμιστικό διάλυμα βορικού, ρΗ 8.5. Τα κύτταρα πλύθηκαν με 150 μΙ βορικού ρυθμιστικού διαλύματος 0,01, ρΗ 8.5, τέσσερις φορές. Μεθυλενίου μπλε εκχυλίστηκε με 100 μί 0.1 Ν ΗΟΙ /αιθανόλης (1: 1) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η απορρόφηση στα 650 nm προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρική ανάλυση. Δύο Way ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η στατιστική διαφορά μεταξύ των ομάδων. Μία τιμή ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Real-time PCR (RT-PCR) ανάλυση της έκφρασης βλεννίνης

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από S2.028 και τα κύτταρα t3m-4 χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, ΟΗ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Verso cDNA (Thermo, Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). Ανάλυση των επιπέδων MUC1, MUC4, MUC 16 και GAPDH mRNA διεξήχθησαν με κύριο μείγμα SYBR Green PCR (ΑΒΙ, Carlsbad, CA, USA). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για RT-PCR: MUC1, F-5-CTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTG-3? R-5- TGAACCGGGGCTGTGG CTGG-3? MUC4, F-5-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3? R-5-ATGGTGCCGTTGTAATT TGTTGT-3? MUC 16, F-5-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA-3? R-5-ACCAGTGGGCAT TCCAGAAAGAGA-3? GAPDH, F-5-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3? R-5-ACCAA ATCCGTTGACTCCGACCTT-3. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Οι διαφορές στην έκφραση γονιδίου βλεννίνης, που εκφράζεται ως πολλαπλών μεταβολών, υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικός έλεγχος.

ανάλυση ανοσοστυπώματος βλεννινών

ηλεκτροφόρηση γέλης

SDS-Αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν βλεννίνη έκφρασης όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Κύτταρα που εκφράζουν miR-200c ή με ένα ανακατωμένο έλεγχο συλλέχθηκαν και η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 1% ΝΡ-40, ρΗ 8.0) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Promega, Madison, WI, USA). Τα προϊόντα λύσης κυττάρου (50-100 μg πρωτεΐνες) διαχωρίστηκαν σε SDS (0,1%) – αγαρόζης (2%) ηλεκτροφόρηση γέλης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε σκόνη σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (150mM NaCl, 50mM Tris-HCl) με 0,1% Tween 20 ρΗ 7.4. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: MUC1 (AR20.5-Mouse IgG, Quest PharmaTech Inc, Έντμοντον, Αλμπέρτα, CA), MUC4 (8G7- Mouse IgG, ευγενική προσφορά από Dr. Surinder K Batra, Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακή βιολογία, UNMC), MUC 16 (AR9.6R333 Mouse IgG, Quest PharmaTech Inc, Edmonton, Alberta, CA) και α-τουμπουλίνης (Mouse IgG, Αναπτυξιακή τράπεζα μελέτες υβριδώματος, Iowa, USA) (1: 1000 αραιώσεις με 5% μη σε λιπαρά ξηρό γάλα σε σκόνη σε ΤΒδ-Τ), όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες ακολούθως πλένονται (3 χ 10 λεπτά) με ΤΒδ-Τ σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύθηκαν με 1: 5000 αραιωμένο Goat-anti HRP ποντικού συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ, USA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε 3 χ 10 λεπτά με ΤΒδ-Τ. Το σήμα ανιχνεύθηκε με Super σήμα

® West Pico υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Thermo επιστημονική, Rockford, IL, USA). Μια πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των MUC4 και ζωνών πρωτεΐνης MUC 16 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageJ (ΝΙΗ). Το φορές αλλαγή στην ένταση ζώνη πρωτεΐνης (τοις εκατό αυθαίρετες μονάδες) υπολογίσθηκε με διαίρεση της πυκνότητας πρωτεΐνη του miR-200c κύτταρα που εκφράζουν από την πυκνότητα πρωτεΐνης των κυττάρων ελέγχου φορέα. Ανίχνευση άλφα τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

κατασκευάσματα φορέα

περιοχές ORF του MUC 16 και MUC4 mRNA που προβλέπεται να αλληλεπιδρούν με miR-200c συντέθηκαν και εισήχθησαν σε pMIR-REPORT

TM miRNA σύστημα έκφρασης Reporter Vector (ΑΒΙ, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιώντας τις περιοριστικές θέσεις SpeI και HindIII (New England BioLabs, Ίπσουιτς, MA, USA). Άγριου τύπου και μεταλλαγμένου MUC4 και MUC 16 /miR-200c αλληλεπιδράσεις αλληλουχίες συντέθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας S1). Μεταλλάξεις εντός θέσεις πρόσδεσης δυναμικό miR-200c παρήχθησαν από νουκλεοτίδιο αντικατάσταση του άγριου τύπου αλληλουχία να αναστέλλουν τη δέσμευση miR-200c. Η εισαγωγή και ο προσανατολισμός του θραύσματος επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας. Τα πλασμίδια ονομάστηκαν pMIR-ΕΚΘΕΣΗ

TM-άγρια ​​(MUC 16 και MUC4 κ.β.) και pMIR-ΕΚΘΕΣΗ

TM-μεταλλαγμένων (MUC 16 και MUC4 mt) (Πίνακας S1).

Η επιμόλυνση και αναλύσεις λουσιφεράσης

κύτταρα καρκίνος του παγκρέατος (S2.028 και t3m-4) καλλιεργήθηκαν σε μια πλάκα 6 φρεατίων και επιμολύνθηκαν παροδικά σε 60-80% συμβολή με τα πλασμίδια που αναφέρονται ανωτέρω με τη χρήση του Λιποφεκταμίνη

αντιδραστήριο ΤΜ 2000 (Invitrogen τεχνολογίες ζωή, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με τη χρήση Λουσιφεράσης συστήματα Reporter Assay (Promega, Madison, WI, USA), 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε αναγνώστη 96 φρεατίων (Polar αστεριών Optima Microplate Reader, Offenburg, Germany). Όλες οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση ± SEM του σχετικές μονάδες της λουσιφεράσης (RLU) από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Μη ζευγαρωμένο t-test (two-tailed) εκτελέστηκε για στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GraphPad PRISM® Version 5.0. Διαφορές με τιμή p & lt? 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

miR-200c:. Προφίλ έκφρασης και υπερέκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος

Ερευνήσαμε την έκφραση του miR-200c σε 7 καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, 5 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των Capan-1, S2.007, S2.013, S2.028 και t3m-4, εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα miR-200c από τα κύτταρα S2.020 και ΗΡΑΡ.

(Α) Η έκφραση του miR-200c σε επτά παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα προσδιορίστηκαν από την Real-time PCR. Κάθε δείγμα εις τετραπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD. S2.028 (Β) και t3m-4 κύτταρα (C) που εκφράζουν σταθερά την πρωταρχική μεταγραφή του miR-200c αξιολογήθηκαν για έκφραση miR-200c με πραγματικού χρόνου PCR. Κάθε μέτρηση διεξήχθη εις τριπλούν. Αυτές οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με τον εσωτερικό έλεγχο U6 rRNA. Η πολλαπλάσια αύξηση των επιπέδων μεταγραφής τον έλεγχο φορέας εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. Η τιμή ρ προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student. Διαφορές με τιμή p & lt? 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Η

Η ώριμη αλληλουχία του miR-200c συνετέθη και κλωνοποιήθηκε σε έναν φορέα έκφρασης όπως περιγράφεται ανωτέρω (p

Silencer

4,1-CMV-miR-200c) , και σταθερά εκφράζονται σε S2.028 κύτταρα και t3m-4. Ποσοτική RT-PCR ανάλυση της έκφρασης miR-200c σε κύτταρα S2.028-miR-200c έδειξε 3.68 φορές αύξηση και κυττάρων t3m-4-miR-200c έδειξε μια 2.6 φορές αύξηση σε ώριμο επίπεδα miR-200c σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν διάνυσμα (Εικόνα 1Β και 1Γ). Επιβεβαιώσαμε ότι η ανασυνδυασμένη ώριμη μορφή του miR-200c ήταν ενεργός με την παρατήρηση προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του ZEB1, ενός γνωστού στόχο για miR-200c, και στις δύο S2.028 και t3m-4 κύτταρα (Σχήμα S1).

Εξετάσαμε επίσης τις αλλαγές στις ιδιότητες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του miR-200c εκφράζουν S2.028 και t3m-4 καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Μια σημαντική μείωση στο ρυθμό αύξησης των S2.028 miR-200c παρατηρήθηκε σε 72 και 96 ώρες (*** p & lt? 0,0001) σε σύγκριση με S2.028 κύτταρα ελέγχου φορέα (Σχήμα S2A). Ωστόσο, καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε όταν t3m-4 miR-200c συγκρίθηκε με τα κύτταρα ελέγχου φορέα σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο που εξετάστηκαν (Σχήμα S2B).

MUC4 και την έκφραση MUC 16 καταστέλλεται από miR-200c

Θα εκτιμηθεί η ικανότητα του miR-200c για τη ρύθμιση δεσμεύεται βλεννών μεμβράνη με την έκφραση του miR-200c (p

σιλανσιέ

4.1-CMV-miR-200c) στον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές S2.028 και t3m-4. Υπήρχε μια δραματική μείωση της MUC4 πρωτεΐνης σε κύτταρα S2.028-miR200c (1,7 φορές) και t3m-4-miR-200c (4,46 φορές) σε σχέση με κύτταρα μάρτυρες (Σχήμα 2Α και 2Β). Παρομοίως, υπήρξε μια σημαντική μείωση στο MUC 16 πρωτεΐνη (ισομορφές υψηλού και χαμηλού μοριακού βάρους) σε S2.028-miR200c (18,1 και 5,9 φορές αντίστοιχα) και t3m-4-miR-200c (5,2 και 6,1 φορές αντίστοιχα) κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Α και 3Β).

τα υλικά λύσεως από το (Α) S2.028 και (Β) t3m-4-miR-200c και αντίστοιχος έλεγχος φορέα επιμολυσμένα κύτταρα διαχωρίστηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-αγαρόζη, υποβάλλεται για στύπωμα western χρησιμοποιώντας ένα αντι-MUC4 αντίσωμα (αριστερά πάνελ) και τα σήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageJ (δεξιά πάνελ). Το miR-200c κύτταρα που εκφράζουν έδειξαν σημαντική μείωση του MUC4 πρωτεΐνης σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Α) S2.028 και (Β) t3m-4 κύτταρα. Ανίχνευση άλφα τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

(Α) S2.028 και (Β) t3m-4-miR200c και αντίστοιχος έλεγχος φορέα επιμολυσμένα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-αγαρόζης και υποβλήθηκε σε στύπωμα western με χρήση ενός αντισώματος αντι-MUC 16 (αριστερά πάνελ). ένταση Band ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageJ (δεξιά πάνελ). Σημαντικές μειώσεις τόσο υψηλού και χαμηλού βάρους MUC 16 ισομορφές μοριακού πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε miR-200c εκφράζουν S2.028 (Α) και t3m-4 κύτταρα (Β) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

στόχων miR-200c μεταγραφικά δεσμεύεται μεμβράνη βλεννών MUC4 και MUC 16

Παρατηρήσαμε επίσης σημαντική μείωση τόσο των επιπέδων MUC4 και MUC 16 mRNA σε miR200c κυτταρικές σειρές που εκφράζουν. μεταγραφές MUC4 μειώθηκαν 4,18 και 8,50 φορές σε S2.028-miR200c και t3m-4-miR200c αντιστοίχως (Σχήμα 4Α και 4Β) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. MUC 16 μεταγραφές μειώθηκαν 4,68 και 4,82 φορές σε S2.028-miR200c και t3m-4-miR200c αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4C και 4D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι miR-200c ρυθμίζει την έκφραση των ογκογόνων MUC4 και MUC 16 μεταγραφής και μετάφρασης.

ανάλυση qRT-PCR του MUC4 (Α και Β) και MUC 16 (C και D) διεξήχθησαν τον έλεγχο των φορέων και miR -200 ° C επιμολυσμένα S2.028 (Α και C) και t3m-4 κύτταρα (Β και D). Η σχετική έκφραση των MUC4 και MUC 16 αξιολογήθηκε από το 2

-ΔΔCt μέθοδο χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως εσωτερικός έλεγχος. Τα κύτταρα που εκφράζουν miR-200c (S2.028 και t3m-4) έδειξαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα MUC4 mRNAs σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου φορέα (Α και Β). Η έκφραση της MUC 16 μεταγραφής μειώθηκε σε miR-200c εκφράζουν S2.028 και t3m-4 κύτταρα (C και D). Όλες οι μετρήσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν. Η πολλαπλάσια αύξηση των επιπέδων μεταγραφής τον έλεγχο φορέα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± S.D. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Η

Πρόβλεψη των ακολουθιών για MUC4 και MUC 16

Οι πιθανοί miR-200c στόχευση περιοχών στη MUC4 δεσμευτική miR-200c και MUC 16 μεταγραφές ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την πρόβλεψη στόχου του web server RegRNA microRNA (https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). πρόβλεψη στόχος RegRNA miRNA εντοπίζονται υψηλή πιθανότητα για miR-200c σύνδεση προς αλληλουχίες κωδικοποίησης του MUC4 μεταξύ 820-842 ζευγών βάσεων (εξόνιο-1) (Σχήμα 5Α) (Σχήμα S3) και δέκα διαφορετικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένης εννέα διαφορετικά εξόνια μέσα στην αλληλουχία MUC 16 mRNA (Σχήμα 5Β) (Σχήμα S3). Τα στοιχεία αυτά μας οδήγησαν να καθορίσει εάν miR-200c θα μπορούσε άμεσα στοχεύουν MUC4 και MUC 16 μεταγραφές εντός των μεταφρασμένων περιοχών.

Πιθανή miR-200c στόχευση περιοχές MUC4 και MUC 16 ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την πρόβλεψη στόχου του web server RegRNA microRNA ( https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). Α, πρόβλεψη στόχος RegRNA miRNA δείχνει ότι το miR-200c συνδέει μεταξύ ζευγών βάσεων 820-842 στο πρώτο εξόνιο του MUC4. Β, Σε MUC 16 mRNA, το miR-200c προβλέπεται να δεσμεύσει εννέα διαφορετικά εξώνια συμπεριλαμβανομένων των Ε1, Ε3, Ε19, Ε39, Ε44, Ε49, Ε54, Ε64 και Ε73. Οι αριθμοί δείχνουν την περιοχή των mRNAs που αλληλεπιδρούν με miR-200c.

Η

miR-200c στοχεύει άμεσα τις ακολουθίες κωδικοποίησης των MUC4 και MUC 16

αξιολογήσαμε δέσμευση του miR-200c με το υποθετική αλληλουχία-στόχο με κλωνοποίηση των περιοχών που περιέχουν τα ανθρώπινα ακολουθίες κωδικοποίησης MUC4 και MUC 16 εντός του φορέα ρεπόρτερ pMIR-λουσιφεράσης (pMIR-MUC4 και MUC 16 κ.β.). Οι αρνητικοί έλεγχοι παρήχθησαν κατά την οποία η pMIR-MUC4 και MUC 16 αλληλουχίες μεταλλάχθηκαν στα υποθετικές θέσεις σύνδεσης για miR-200c και οι βλεννίνες (pMIR-MUC4 και MUC 16 mt) (Σχήμα 6Α). S2.028 και t3m-4 κύτταρα /miR-200c διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο DNA που κωδικοποιούν φορέα μόνο, άγριου τύπου MUC4 και MUC 16 αλληλουχίες στο φορέα, και μεταλλαγμένου τύπου MUC4 και MUC 16 αλληλουχίες στο φορέα. Παρατηρήσαμε ότι η δραστηριότητα ανταποκριτή λουσιφεράσης κατεστάλη σημαντικά τόσο για MUC4 και MUC 16 σε S2.028 και t3m-4 κύτταρα miR-200c επιμολυσμένα με φορείς αλληλουχία άγριου τύπου σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (*** ρ & lt? 0,0001, MUC4-wt , MUC 16-κβ vs φορέα ελέγχου) (Εικόνα 6Β-Ε). Εντούτοις, κύτταρα μετεμβολιασμένα με την μεταλλαγμένη αλληλουχία που περιέχει φορείς έδειξαν σημαντικά αυξημένη δραστικότητα λουσιφεράσης (*** ρ & lt? 0,0001, MUC4-wt vs MUC4-mt? MUC 16-wt vs MUC 16-mt)., (Σχήμα 6Β-Ε)

(Α) φυσικού τύπου και μεταλλαγμένες αλληλουχίες MUC4 και MUC 16 κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pMIR-λουσιφεράσης (pMIR-MUC4 wt και MUC 16 wt) και (pMIR-MUC4 mt και MUC 16 mt), αντίστοιχα. Φορείς που εκφράζουν pMIR-Luc, pMIR-MUC4 κ.β., pMIR-MUC 16 wt, pMIR-MUC4 mt και pMIR-MUC 16 mt διαμολύνθηκαν σε S2.028miR-200c (Β και D) και τα κύτταρα t3m-4miR-200c (C και Ε) και η δραστικότητα της λουσιφεράσης ποσοτικοποιήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης (Μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών). Η τιμή p προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student (

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει για πρώτη φορά ότι οι στόχοι MIRR-200c υψηλού μοριακού βάρους μουκίνης γλυκοπρωτεΐνες από στόχευση κωδικοποιητική αλληλουχία τους για την υποβάθμιση ή την αναστολή της μεταφράσεως. Συγκεκριμένα, miR-200c στοχεύει αλληλουχίες MUC4 και MUC 16 εξόνιο στη ρύθμιση των επιπέδων mRNA και πρωτεΐνης για κάθε μία από αυτές βλεννίνες. Έχουμε δείξει ότι miR-200c εκφράζεται διαφορικά σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Yu et al παρατηρείται σημαντικά υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος με υψηλότερα επίπεδα miR-200c σε σύγκριση με εκείνους με τα χαμηλότερα επίπεδα του miR-200c [10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν το miR-200c εμφανίζουν μειωμένη εισβολή και την αύξηση της επίπεδα του mRNA Ε-καδερίνης, υποδηλώνοντας ότι miR-200c παίζει ένα ανασταλτικό ρόλο σε παγκρεατικά ανάπτυξη και εισβολή [10] του καρκίνου. η υπερέκφραση του miR-200c αύξησε τον ρυθμό πολλαπλασιασμού στο κοστούμι-2, PANC-1 και ΚΡ-3 καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων [10], ωστόσο, παρατηρήσαμε μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων που εκφράζουν του S2.028 miR-200c κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι ιδιότητες ανάπτυξης των κυττάρων ρυθμίζεται από διαφορικά miR-200c εξαρτώνται πλαίσιο. MiR-200C έχει περιγραφεί ως ένα ισχυρό κύριος ρυθμιστής των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση σε καρκίνο του μαστού και κύτταρα ωοθηκών μεταβάλλοντας την έκφραση του ZEB1 και Ε-καδερίνης με σύνδεση προς 3 ‘UTRs και οδήγηση αποικοδόμηση ή παρεμπόδισης της μετάφρασης του mRNA στόχου [11-14]. Αποκατάσταση της έκφρασης miR-200c σε εξαιρετικά επιθετική του μαστού και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα μειώνονται σημαντικά εισβολή, τη μετανάστευση και την αντίσταση φαρμάκου αυτών των τύπων όγκων [30,31]. Οι εκθέσεις αυτές δείχνουν ότι η εισαγωγή του miR-200c σε καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να αντιστρέψει την εξέλιξη του όγκου και να παρέχει μια νέα θεραπευτική στρατηγική

Η πλειοψηφία των εκθέσεων δείχνουν ότι miRNAs στοχεύουν τη μη-κωδικοποίησης 3’UTR του mRNA.? Ωστόσο, πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι miRNAs μπορούν επίσης να στοχεύουν αλληλουχίες κωδικοποίησης των γονιδίων θηλαστικών. Αναφέρουμε εδώ ότι οι στόχοι miR-200c εξόνιο που κωδικοποιεί αλληλουχίες στο μεταγραφές υψηλού μοριακού βάρους γλυκοπρωτεΐνες βλεννίνης MUC4 και MUC 16 και μειώνει την έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης. Παρομοίως, Huang et al, ανέφεραν ότι miR-181α στοχεύει ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων δακτύλου ψευδαργύρου με σύνδεση προς αλληλουχίες κωδικοποίησης τους [32] και Duursma et al ανέφεραν ότι miR-148 στόχων ανθρώπινου DNA μεθυλοτρανσφεράση 3β (DNMT3b) αμινοξέος που κωδικοποιεί τις περιοχές [ ,,,0],33]. Ας-7 miRNA στοχεύει την περιοχή κωδικοποίησης του ενζύμου επεξεργασίας miRNA, Dicer [34]. Ποντικού Nanog, Oct4 και Sox2 γονίδια περιέχουν πολλές θέσεις σύνδεσης σε αλληλουχίες που κωδικοποιούν το εξόνιο για φυσικά miRNAs [35]. Οι εκθέσεις αυτές δείχνουν ότι miRNAs στοχεύουν συγκεκριμένες οικογένειες γονιδίων μέσα σε περιοχές κωδικοποίησης.

Κανονισμός του MUC4 και MUC 16 από miR-200c μπορεί να είναι μέσω των αποτελεσμάτων είτε μεταγραφή ή μετάφραση. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν εδώ, τα επίπεδα πρωτεΐνης MUC 16 μειώθηκαν σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι MUC4. Αυτή η αυξημένη στόχευση του MUC 16 με miR-200c μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των δέκα διαφορετικών περιοχών δέσμευσης miR-200c στο mRNA MUC 16 σε σύγκριση με την ενιαία περιοχή πρόσδεσης στην κωδικοποιητική MUC4 αλληλουχία, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι ο αριθμός των στόχευσης τοποθεσίες σε μια απομαγνητοφώνηση επηρεάζει την ευαισθησία της μεταγραφής του κανονισμού miRNA.

Πρόσφατα, Ponnusamy et al ανέφεραν ότι η υπερέκφραση της MUC4 αποτελέσματα σε επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της E-cadherin και την αυξημένη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή στον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα [36]. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τη μελέτη μας, η οποία δείχνει ότι η υπερέκφραση του μεσεγχυματικών σε επιθηλιακό προώθηση miR-200c κάτω ρυθμίζει ZEB1 και MUC4 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

MUC 16 είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται στον καρκίνο των ωοθηκών και μέτρια υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος , αλλά ο ρόλος του MUC 16 σε παγκρεατικά εξέλιξης του καρκίνου δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Η σημαντικά μειωμένο επίπεδο MUC 16 παρατηρείται σε miR-200c υπερεκφράζουν κύτταρα, μαζί με την καλά τεκμηριωμένη ρόλος του miR-200c σε πολλαπλά στάδια της εξέλιξης του καρκίνου δείχνει ότι MUC 16 μπορεί να έχει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων και τη μετάσταση. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι πάνω ρύθμιση βλεννινών και προς τα κάτω ρύθμιση του miR-200c ενίσχυση των κακοηθών ιδιοτήτων του καρκίνου κυττάρου και έτσι επάγουν παγκρεατική ανάπτυξη του καρκίνου και της μεταστάσεως.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι λαμβάνει χώρα ανώμαλη και αυξημένη έκφραση του MUC4 και MUC 16 κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του παγκρέατος σε μετάσταση [17-19,25]. Πρόσφατα, Mohr et al έδειξαν έκφραση miR-200c μειώθηκε σε πρωτογενείς ιστούς παγκρεατικού όγκου σε σύγκριση με ορισμένες μεταστατικές θέσεις [37]. Τα αποτελέσματα αυτά σε γενικές γραμμές υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι διακυμάνσεις στην miR-200c συμβάλλουν στην ρύθμιση της έκφρασης των MUC4 και MUC 16 κατά τη διάρκεια του παγκρέατος εξέλιξης του όγκου και των μεταστάσεων.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας παρουσιάζει την πρώτη απόδειξη ότι MUC4 και MUC 16 ρυθμίζονται σε η μετα-μεταγραφικό επίπεδο από miRNA, miR-200c, η οποία στοχεύει άμεσα MUC4 και MUC 16 εντός αμινοξέος κωδικοποίησης των περιφερειών τους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-200c έχει δυνητικό ανασταλτικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος και τη μετάσταση και συμπληρωματικές μελέτες που απαιτούνται για την οριοθέτηση της κανονιστικής σχέση μεταξύ δεσμεύεται μεμβράνη βλεννών και miR-200c.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. Ανάλυση

qRT-PCR της ZEB1. Η υπερέκφραση του miR-200c μείωσε σημαντικά την έκφραση του ZEB1 τόσο (Α) S2.028 και (Β) t3m-4 κύτταρα. Η πολλαπλάσια αύξηση των επιπέδων μεταγραφής τον έλεγχο φορέα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± S.D. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρείται ότι είναι στατιστικά σημαντική

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s001

(EPS)

Εικόνα S2.

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. S2.028 (Α) και t3m-4 (Β) (MIR-200c και τον φορέα ελέγχου) πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετρήθηκαν με κυανού του μεθυλενίου δοκιμασίας. Δύο Way ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η στατιστική σημασία (***, p & lt? 0.001? Ns, μη σημαντική)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s002

(EPS)

Εικόνα S3 .

Πρόβλεψη του miR-200c sites στο βλεννίνες δεσμεύουν. sites δυναμικό miR-200c δεσμευτικός ως προς όλα τα δεσμεύονται μεμβράνη βλεννών (MUC4 και MUC 16) μεταγραφές ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση του προγνωστικός στόχο web server RegRNA microRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s003

(EPS)

Πίνακας S1.

Λίστα των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για την έκφραση του miR-200c και λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού.

doi: 10.1371 /journal.pone.0073356.s004

(DOCX)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Ντέιβιντ Κέλι για εξειδικευμένη τεχνική βοήθεια στην δοκιμασία λουσιφεράσης

.