Αφηρημένο

Η επίδραση της χημειοθεραπείας του γαστρικού καρκίνου (GC) παραμένει πολύ κακή λόγω της αντίστασης σε πολλαπλά φάρμακα (MDR). Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν MDR του GC παραμένει μακριά από πλήρως κατανοητή. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η παρουσίαση των πιθανών μηχανισμών της MDR του GC στο κυρίως επίπεδο μακρύ μη-κωδικοποίησης RNA (lncRNA). Σε αυτή τη μελέτη, κυτταρική σειρά GC, sublines SGC7901, και δύο MDR, SGC7901 /VCR και SGC7901 /ADR υποβλήθηκαν σε ανάλυση lncRNA μικροσυστοιχιών. Βιοπληροφορική και πειράματα επαλήθευση διεξήχθησαν για να διερευνήσει τις πιθανές lncRNAs εμπλέκονται στην ανάπτυξη του MDR. ανάλυση έδειξε ότι Pathway 15 μονοπάτια αντιστοιχούσε σε κάτω ρυθμισμένα μεταγραφές και ότι το 20 μονοπάτια αντιστοιχούσε σε πάνω ρυθμισμένα μεταγραφές (ρ-τιμή cut-off είναι 0,05). GO ανάλυση έδειξε ότι τα υψηλότερα εμπλουτίζεται ΚΟ στόχαστρο up-ρυθμίζονται οι μεταγραφές ήταν «ανάπτυξη του συστήματος» και τα υψηλότερα esenriched ΚΟ στόχο των κάτω-ρυθμίζονται οι μεταγραφές ήταν «η διαδικασία βιοσύνθεσης στερολών». Η μελέτη μας είναι η πρώτη για να ανακρίνουν διαφορικά εκφρασμένων lncRNAs σε ανθρώπινες κυτταρικές GC γραμμή και MDR sublines και δείχνει ότι lncRNAs είναι χρήσιμο για περαιτέρω μελέτη για να είναι τα νέα υποψήφια βιοδεικτών για την κλινική διάγνωση της πολυανθεκτικής και πιθανοί στόχοι για περαιτέρω θεραπεία.

Παράθεση: Wang Υ, Wu Κ, Yang Z, Zhao Q, Fan D, Xu P, et al. (2015) με αντοχή πολυφαρμάκου Σχετικές Long μη-κωδικοποίησης RNA Έκφραση Προφίλ Ανάλυση του καρκίνου του στομάχου. PLoS ONE 10 (8): e0135461. doi: 10.1371 /journal.pone.0135461

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 24, Δεκεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 22 του Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 20 Αυγούστου του 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλες οι πρώτες στοιχεία δεδομένων και κανονικοποιούνται παρουσιάστηκαν στο https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342 (GSE69342)

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Εθνική πρόγραμμα για τις βασικές Βασική Ερευνητικό πρόγραμμα ( «973» του προγράμματος, Νο 2010CB529302, Νο 2010CB529305, Νο 2010CB529306)? Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81301763)? Henan επαρχιακό κλειδί επιστημονικών και τεχνολογικών σχεδίων (Νο 142 102 310 473)? Βασικά Πρόγραμμα, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81030044)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πολυφαρμακευτική αντίσταση ( MDR) εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για την αποτυχία της χημειοθεραπείας στη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου, η οποία είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Πολλαπλές πολυφαρμακευτική αντίσταση που σχετίζεται με πρωτεΐνες (MRPs) [1] ή miRNAs [2] που διαμεσολαβούν MDR μέσω διαφορετικών μηχανισμών έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν MDR του GC παραμένει μακριά από πλήρως σαφής.

γονιδιώματα αλληλουχίας έδειξε ότι γονιδιωμάτων ευκαρυωτικών που κωδικοποιεί ένα εκπληκτικά μεγάλο αριθμό των αντιγράφων μη κωδικοποιητική σε σύγκριση με προκαρυώτη γονιδιώματα. Μεταξύ αυτών των μη κωδικοποιητική μεταγραφές, πολλοί είναι μακρύς μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής του mRNA ή της μετάφρασης στο μεταγραφικό ή μετα-μεταγραφικό επίπεδο. lncRNAs είναι RNAs που στερούνται δυναμικό κωδικοποίησης, τα οποία είναι & gt? 200 bp και αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον το 80% των μεταγραφών του συνόλου του γονιδιώματος [3]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι lncRNA παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του mRNA [4], οργανίδιο βιογένεση [5], η υποκυτταρική διακίνηση των μορίων [6], και την ανάπτυξη των κυττάρων [7] [8].

LncRNA απορρύθμισης συμμετείχε σε πολλαπλούς τύπους ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου

[

4

,

9

,

10

]. Δηλαδή, lncRNAs μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση, μετάσταση και διεισδυτικότητα των πολλαπλών κακοήθων όγκων μέσω επηρεάζουν ογκογονιδίου έκφρασης. Για παράδειγμα, η COX-2-lncRNA, PACER, μπορεί να δράσει ως ένα νέο πιθανός στόχος για την COX-2-διαμόρφωση σε φλεγμονή και τον καρκίνο [11]? Μεσολάβηση RNAi knock-down του LINC01081 σε φυσιολογικούς ινοβλάστες εμβρύου πνεύμονα έδειξε ότι αυτή η lncRNA θετικά ρυθμίζει επίπεδο μεταγραφής FOXF1, υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι μείωση στην έκφραση LINC01081 μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη των κυψελιδικών τριχοειδών δυσπλασίας με κακή ευθυγράμμιση των πνευμονικών φλεβών [12]? lncRNA Hotair μπορεί επίσης να είναι ένα πολύτιμο προγνωστικό για διαχείριση καρκίνου του παχέος εντέρου [13] και MALAT1 θα μπορούσε να θεωρηθεί ως πιθανός προγνωστικός δείκτης και μπορεί να είναι ένας στόχος για τη διάγνωση και γονιδιακή θεραπεία για αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου [14]? υπερέκφραση του lncRNA Η19 ενισχύει καρκινογένεση και μετάσταση του καρκίνου του στομάχου και την επίδραση της Η19 σε GC διαμεσολαβείται από την άμεση ρύθμιση προς τα άνω του ISM1 και την έμμεση καταστολή της έκφρασης CALN1 μέσω miR-675 [15]. Ως εκ τούτου, για να πάρει προκαταρκτική γνώση των μοριακών μηχανισμών της MDR του GC, μελετήσαμε το προφίλ έκφρασης lncRNA του GC MDR sublines.

Εδώ, μελετήσαμε τα διαφορικά προφίλ έκφρασης των lncRNAs και mRNAs μεταξύ cellline GC SGC7901 και MDR sublines SGC7901 /ADR και SGC7901 /βίντεο χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών lncRNA. Σύγκριση των διαφορικά εκφραζόμενων μεταγραφές μεταξύ των sublines και γονικής cellline αποκάλυψε 15 οδούς που αντιστοιχούσε σε κάτω ρυθμισμένα μεταγραφές και 20 μονοπάτια που αντιστοιχούσε σε πάνω ρυθμισμένα μεταγραφών (ρ τιμή αποκοπής ήταν 0,05). Γονιδιακή οντολογία (GO) ανάλυση έδειξε ότι τα πιο υψηλά εμπλουτισμένο όρους GO για τις up-ρυθμίζονται οι μεταγραφές ήταν «η ανάπτυξη του συστήματος», «νουκλεοσώματος», και «δεσμευτικές» και τα πιο υψηλά εμπλουτισμένο όρους GO για τους κάτω-ρυθμίζονται οι μεταγραφές ήταν «στερόλη βιοσυνθετική διαδικασία »,« κελί περιφέρεια », και« στεροειδούς αφυδρογονάσης δραστηριότητα ». Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα προφίλ έκφρασης lncRNA και mRNA διέφεραν σημαντικά μεταξύ sublines MDR και γονική κυτταρική οικογένεια. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι τα ανώμαλα επίπεδα έκφρασης lncRNAs θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη των MDR του GC. Η περαιτέρω μελέτη των διαφορών στο προφίλ έκφρασης lncRNA μπορεί να παρέχει νέες δυνατότητες μέθοδοι για την αναστροφή της MDR φαινότυπο του GC.

Αποτελέσματα

διαφορικά εκφράζονται lncRNAs

Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών highthroghput lncRNA έδειξε μια συνολικά 27.883 lncRNAs εκφράζονται σε γαστρικό καρκίνο cellline, SGC7901 και δύο sublines πολυανθεκτικά αντίσταση, SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR (S1 πίνακα). Να συναγάγει τις σχέσεις μεταξύ των δειγμάτων, ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης χρησιμοποιήθηκε για να κανονίσετε celllines σε ομάδες ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης τους, παρουσιάζοντας τις σχέσεις των τρόπων έκφρασης lncRNA μεταξύ celllines (Σχήμα 1Α και 1Β). Η περαιτέρω μελέτη των στοιχείων αυτών παρουσίασαν κατά μέσο όρο 1637 εκφράζονται διαφορικά lncRNA. Μεταξύ αυτών, 638 ήταν σταθερά πάνω ρυθμισμένα και 999 ήταν σταθερά κάτω-ρυθμιζόμενη (πάσο change≥2.0) (S2 Πίνακας). ASHG19A3A028863 (πάσο αλλαγή: 146.0139) ήταν η πιο (αλλαγή φορές: 58.7105) up-ρυθμίζονται lncRNA, και ASHG19A3A007184 ήταν το πιο κάτω-ρυθμίζονται lncRNA. Επιπλέον, κάτω-ρυθμίζονται lncRNAs ήταν πιο συχνές από ό, τι μέχρι ρυθμιζόμενες lncRNAs στα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας (S2 Πίνακας).

Α. Το διάγραμμα διασποράς του προφίλ έκφρασης lncRNA. Β Θερμότητας χάρτη και ιεραρχική ομαδοποίηση δενδρόγραμμα της lncRNA μάρκες.

Η

διαφορικά εκφράζονται mRNAs

Υπήρχαν 19.644 mRNA που προσδιορίζονται στα sublines GC MDR αναλύθηκαν με την έκφραση του mRNA προφίλ δεδομένων με τη χρήση ανάλυσης μικροσυστοιχιών και η ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης παρουσιάζονται οι σχέσεις μεταξύ των τρόπων έκφρασης του mRNA που ήταν παρόντες στις sublines GC MDR και τη γονική κυτταρική οικογένεια τους (Σχήμα 2Α και 2Β) (S3 Πίνακας). Μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων mRNA μεταξύ SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR και SGC7901, 730 ήταν σταθερά πάνω-ρυθμίζονται και 650 ήταν σταθερά κάτω-ρυθμίζονται σε SGC7901 /ADR και celllines SGC7901 /VCR σε σύγκριση με SGC7901 (Σχήμα 2Β). (S4 Πίνακας). NM_000735 (σύμβολο του γονιδίου: CGA, φορές αλλαγή: 106,19) ήταν η πιο up-ρύθμιση του mRNA, και NM_001136574 (σύμβολο του γονιδίου: LANCL1, διπλώστε μεταβολή: 25,43) ήταν το πιο κάτω-ρυθμίζονται mRNA (Σχήμα 2Β)

Α. χάρτης θερμότητας και ιεραρχική ομαδοποίηση δενδρόγραμμα του mRNA μάρκες. B. Μορφές δείχνει top 10 διαφορικά εκφρασμένων mRNAs.

Η

GO ανάλυση

Για να προσδιοριστεί το γονίδιο και τα χαρακτηριστικά προϊόντος γονιδίου σε βιολογικές διεργασίες, κυτταρικά συστατικά και μοριακές λειτουργίες, Gene Ontology (GO) ανάλυση έγινε δια του παρόντος. ακριβής δοκιμασία του Fisher γίνεται για να ελέγξετε εάν υπάρχουν περισσότεροι επικάλυψη μεταξύ της λίστας DE και ο κατάλογος σχολιασμό GO από ό, τι θα αναμενόταν από την τύχη. Η τιμή p υποδηλώνει τη σημασία των GO όρων εμπλουτισμού στα γονίδια DE. Όσο χαμηλότερη είναι η τιμή p, τόσο πιο σημαντικό το GO Όρος (p-value & lt? = 0,05 συνιστάται). Έδειξε ότι τα υψηλότερα εμπλουτίζεται ΚΟ στόχαστρο μεταγραφές μέχρι ρυθμιζόμενων ήταν ομοιόσταση των ιστών (GO: 0048731? Οντολογία: βιολογική διαδικασία? P = 6.84E-08) (Εικόνα 3Α), νουκλεοσώματος (GO: 0000786? Οντολογία: κυτταρικού συστατικού? P = 2.10E-07) (Εικόνα 3Β) και δεσμευτική (GO: 0005488? οντολογία: μοριακή λειτουργία? p = 0,001) (Εικόνα 3C) και ότι οι υψηλότερες εμπλουτίζεται ΚΟ στόχο των κάτω-ρυθμίζονται οι μεταγραφές ήταν η διαδικασία βιοσύνθεσης στερολών (GO: 0016126? οντολογία: βιολογική διαδικασία? p = 0,000) (Εικόνα 3D), περιφέρεια κυττάρων (GO: 0071944? οντολογία: κυτταρικού συστατικού? p = 3.80E-06) (Σχήμα 3Ε) δραστηριότητα στεροειδούς αφυδρογονάσης (GO: 0016229? οντολογία: μοριακή λειτουργία?. p = 0,001) (Σχήμα 3F) (S5 Πίνακας)

Το γράφημα πίτας εμφανίζει τις δέκα κορυφαίες κατηγορίες των σημαντικών όρων εμπλουτισμό. Η οντολογία καλύπτει τρεις τομείς: βιολογική διαδικασία, Κυτταρικής και Μοριακής Στοιχείο Λειτουργία. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιείται για να βρούμε αν υπάρχει περισσότερο επικάλυψη μεταξύ της λίστας DE και ο κατάλογος σχολιασμό GO από ό, τι θα αναμενόταν από την τύχη. Η τιμή p υποδηλώνει τη σημασία των GO όρων εμπλουτισμού στα γονίδια DE. Όσο χαμηλότερη είναι η τιμή p, τόσο πιο σημαντικό το GO Όρος (p-value & lt? = 0,05 συνιστάται) (AC) Τα υψηλότερα εμπλουτίζεται ΕΠ στοχεύουν μέχρι ρυθμίζεται μεταγραφές: Α, Βιολογική διαδικασία (ΒΡ), Β, κυτταρικό συστατικό ( CC), C, Μοριακή λειτουργία (MF). (DF) Τα υψηλότερα εμπλουτίζεται ΚΟ στόχαστρο κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές: Α, Βιολογική διαδικασία (ΒΡ), Β, κυτταρικό συστατικό (CC), C, Μοριακή λειτουργία (MF)

Η

ανάλυση Διαδρομή

σε αυτή τη μελέτη, την ανάλυση της οδού εμφάνισαν ότι 20 μονοπάτια αντιστοιχούσαν με συνέπεια να ρυθμίζεται προς τα πάνω μεταγραφές και ότι η πιο εμπλουτισμένο δίκτυο ήταν «Αλκοολισμός-Homo sapiens (άνθρωπος)» (Fisher-P value = 3.66E-08) που αποτελείται 24 στοχευμένων γονιδίων (Σχήμα 4Α)? Επιπλέον, η ανάλυση οδός έδειξε επίσης ότι το 15 μονοπάτια αντιστοιχούσε σταθερά προς τα κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές και ότι η πιο εμπλουτισμένο δίκτυο ήταν «στεροειδές βιοσύνθεση-Homo sapiens (άνθρωπος)» (Fisher-P value = 0,00044) αποτελείται από 5 στοχευμένων γονιδίων (Σχήμα 4Β ) (S6 πίνακα, η προτείνουμε p-τιμή αποκοπής είναι 0,05). Μεταξύ αυτών των οδών, η κατηγορία γονίδιο διάσπαση «κιρκάδιου ρυθμού» έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου [16], χρόνια μυελοειδή λευχαιμία [17], το κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [18], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [19 ], καρκίνωμα του ενδομητρίου [20], και του καρκίνου του μαστού [21]. Η κατηγορία γονίδιο «NOD-σαν μονοπάτι σηματοδότησης υποδοχέα», η οποία αποτελείται από NOD1, έχει έδειξε ότι NOD1 /CARD4 και NOD2 /CARD15 πολυμορφισμοί γονίδιο μπορεί να σχετίζεται με αλλαγμένη κίνδυνο γαστρικού [22], του παχέος εντέρου [23], του πνεύμονα [24 ], του λάρυγγα [25], της χοληδόχου κύστης [26], παγκρεατικό [27], του λεπτού εντέρου, νεφρού [28], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης [29], τον καρκίνο του δέρματος, λέμφωμα [30] και της λευχαιμίας [31]. Εδώ, θα εξεταστεί περαιτέρω η έκφραση και η λειτουργία του ARNT (αρυλο υδρογονανθράκων υποδοχέα πυρηνικής μεταθέτη) με τη μεσολάβηση MDR1 (αντίσταση σε πολλά φάρμακα 1) προς τα πάνω ρύθμιση οδού. Διαπιστώθηκε ότι ARNT και MDR1 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε κυτταρικές γραμμές /VCR SGC7901 SGC7901 /ADR και σε σύγκριση με SGC7901, η επίδραση των σημαντικών πάνω ρύθμιση MDR1 διαμεσολαβείται από ARNT διαμόλυνση φορέας έκφρασης έχει παραβιαστεί μέσω Sp1 siRNAs διαμόλυνση. δοκιμασία σχηματισμού αποικίας πλάκα έδειξε ότι SGC7901 /ADR ρυθμούς σχηματισμού αποικιών κυττάρων ήταν remarably υψηλότερα σε pARNT + /siSp1- ομάδα σε σύγκριση με pARNT + /siSp1 + ομάδα με το συμπλήρωμα αδριαμυκίνη (ADR) στον πολιτισμό Meida (p & lt? 0.0001) (Σχήμα 5).

(Α) Pathway: Αλκοολισμός-Homo sapiens (άνθρωπος). (Β) Η Οδός: στεροειδών βιοσύνθεση-Homo sapiens (άνθρωπος) .Το οικόπεδο γραμμή δείχνει την πρώτη δεκάδα Εμπλουτισμός βαθμολογίας (-λογ10 (τιμή Ρ)) αξία της σημαντικής οδού εμπλουτισμό.

Η

(Α) έκφραση ARNT, MDR1 κίτρινο σημειώνονται οι κόμβοι συνδέονται με γονίδια που ρυθμίζονται προς τα κάτω, πορτοκαλί σημειώνονται οι κόμβοι συνδέονται με up-ρύθμιση ή μόνο ολόκληρα γονίδια σύνολο δεδομένων, πράσινο κόμβοι δεν έχουν καμία σημασία. και Sp1, a, κηλίδωση Western, b, qRT-PCR. (Β) Η επίδραση της siARNT επιμόλυνσης στην έκφραση της ARNT, MDR1 και Sp1, ένα, western αποτύπωση, β, qRT-PCR του SGC7901 /ADR, c, qRT-PCR του SGC7901 /VCR. (Γ) Η επίδραση της pARNT (ARNT φορέας έκφρασης) και siSp1 διαμόλυνση επί της εκφράσεως του ARNT, MDR1 και Sp1, ένα, κηλίδωση Western, b, qRT-PCR του SGC7901 /ADR. δοκιμασία σχηματισμού (D) αποικία πλάκα των κυττάρων SGC7901 /ADR με την αδριαμυκίνη συμπλήρωμα στο μέσο καλλιέργειας (1 μg /ml) σε καθορισμένο χρόνο. (Δεδομένα μέσα από τρία ξεχωριστά πειράματα (μέση τιμή ± SEM), μονόδρομη ANOVA ανάλυση, *** p & lt? 0.0001)

Η

πραγματικού χρόνου ποσοτική επικύρωση PCR

Για να. εξετάζει τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, έξι επάνω ρυθμισμένη lncRNAs και δέκα υπό-ρυθμιζόμενη lncRNAs επιλέχθηκαν τυχαία από τα σταθερά εκφράζονται διαφορικά lncRNAs χρησιμοποιώντας SGC7901 /ADR, SGC7901 /VCR και SGC7901 κυτταρικές οικογένειες και η qRT-PCR αποτελέσματα και τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών είναι συνεπή (Σχ 6Α )? να μελετήσει περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης των εν λόγω lncRNAs σε ανθεκτικά στα φάρμακα γαστρικών ιστών, είκοσι ανθεκτικών στα φάρμακα γαστρικών δειγμάτων και αντιστοιχισμένο μη πολυανθεκτικά ιστοί εξετάστηκαν για το επίπεδο έκφρασης αυτών των lncRNAs χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) (Σχήμα 6Β) .Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η γαστρική δείγματα καρκίνος αντιμετωπίζεται με ADR για 5 ημέρες παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά των επιπέδων έκφρασης αυτών των δεκαέξι lncRNAs afformentioned σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Σχήμα 6C). Επιπλέον, η ανάλυση έδειξε ότι η συσχέτιση επίπεδα έκφρασης lncRNA NR_015379 είχαν αρνητική συσχέτιση με τα ποσοστά αναστολή αυτών των είκοσι ανθεκτικών στα φάρμακα γαστρικών δείγματα (Σχήμα 6D και 6Ε, ρ & lt? 0,01).

επίπεδα έκφρασης Δεκαέξι lncRNAs (Α) σε SGC7901 /ADR και SGC7901 /celllines VCR σε σύγκριση με SGC7901 κυτταρική οικογένεια. (Β) Σχηματικό διάγραμμα του γαστρικού δειγμάτων καρκίνο που έλαβαν αγωγή με HDRA ακολουθούμενη από qRT-PCR και προσδιορισμός ρυθμός αναστολής. Επίπεδα έκφρασης Δεκαέξι lncRNAs σε είκοσι γαστρικό δείγματα καρκίνο που έλαβαν αγωγή με ADR σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (C). Επίπεδα έκφρασης (DE) lncRNA NR_015379 ήταν συσχετίζεται αρνητικά με τα ποσοστά αναστολή της γαστρικής δείγματα καρκίνου αντιμετωπίζονται με ADR.

η

Συζήτηση

προηγούμενη έρευνά μας έχει ήδη διαπιστώσει ότι το miR-21 μπορεί να προωθήσει την αντίσταση του φαρμάκου διαφόρων μορφών καρκίνου [32 ]? LncRNA-MRUL προάγει την έκφραση ABCB1 σε πολυανθεκτικά γαστρικού sublines καρκινικών κυττάρων [33]? δραστηριότητα CUTL1 είναι αντιστρόφως συνδέονται με αντοχή φαρμάκου και έτσι είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για ρυθμίζουν αντοχή πολυφαρμάκου σε γαστρικό καρκίνο [34]? γαστρικό ΚΕΠ εντοπίστηκαν από VCR-προετοιμασία SGC7901 κυτταρική γραμμή, η οποία χαρακτηρίζεται από υψηλή ογκογενετικότητας και την ικανότητα για αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [35]? ΜΑϋ2 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου και ότι αποσιώπηση του γονιδίου ΜΑϋ2 μπορεί να βοηθήσει για την αντιμετώπιση της αντοχής σε πολλαπλότητα φαρμάκων του γαστρικού καρκίνου κυττάρων [36] και η έκφραση MGr1-Ag /37LRP υποξία προκλήθηκε ενεργοποιούνται από HIF-1 εξαρτάται την ERK. Οι εκδηλώσεις αυτές εξαρτώνται από αντιδραστικά ενδιάμεσα οξυγόνου [37] .Ωστόσο, οι μηχανισμοί αντοχής σε πολλαπλά φάρμακα του GC είναι πολύ πιο διευκρινιστεί και lncRNAs απορύθμιση του GC MDR sublines δεν έχουν ακόμα μελετηθεί.

Σε αυτή τη μελέτη, η κυτταρική γραμμή GC , SGC7901, και δύο MDR sublines, SGC7901 /VCR και SGC7901 /ADR υποβλήθηκαν σε ανάλυση lncRNA μικροσυστοιχιών. Βιοπληροφορική και πειράματα επαλήθευση διεξήχθησαν για να διερευνήσει τις πιθανές lncRNAs εμπλέκονται στην ανάπτυξη του MDR. ανάλυση έδειξε ότι Pathway 15 μονοπάτια αντιστοιχούσε σε κάτω ρυθμισμένα μεταγραφές και ότι το 20 μονοπάτια αντιστοιχούσε σε πάνω ρυθμισμένα μεταγραφές (ρ-τιμή cut-off είναι 0,05). GO ανάλυση έδειξε ότι τα υψηλότερα εμπλουτίζεται ΚΟ στόχαστρο μεταγραφές μέχρι ρυθμιζόμενων ήταν «ανάπτυξη του συστήματος» και τα υψηλότερα esenriched ΚΟ στόχο των κάτω-ρυθμίζονται οι μεταγραφές ήταν «η διαδικασία βιοσύνθεσης στερολών».

Αύξηση αποδεικτικά στοιχεία έδειξαν ότι lncRNA ( μακρύ μη κωδικοποιητικό RNA) θα μπορούσε να παίξει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και εισβολή και μετάσταση όγκου [38]. Για παράδειγμα, ο John [39] κλπ απέδειξαν ότι lncRNA

PCGEM1

σχετίζεται με τον καρκίνο του προστάτη? αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης-β επαγόμενη lncRNA-Smad7 βρέθηκε να αναστέλλει την απόπτωση των κυττάρων του καρκίνου του μαστού ποντικού JygMC (Α) και ως εκ τούτου προτείνουμε να ed έναν πολύπλοκο μηχανισμό για τη ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών και ογκο-προοδευτική πτυχές του ΤΟΡ-β σηματοδότηση [40] ? lncRNA, καρκίνο του προστάτη που σχετίζεται με μεταγραφή 29 (PCAT29), χαρακτηρίστηκε μαζί με τη σχέση της με τον υποδοχέα ανδρογόνων, λειτούργησε ως ανδρογόνο ρυθμίζονται ογκοκατασταλτικών στον καρκίνο του προστάτη [41]? Yuan κλπ ανακαλύψει μία νέα ΤΟΡ-β επαγόμενη lncRNA, lncRNA-ATB, η οποία ενίσχυσε ΕΜΤ μέσω απομόνωσης miR-200S και διευκολύνεται ο αποικισμός σταθεροποιώντας

IL-11 mRNA

, προωθώντας έτσι τόσο νωρίς και αργά βήματα της μετάστασης του καρκίνου [42].

έχει βρεθεί ότι lncRNAs παίξει καθοριστικό ρόλο στην μεταβολή της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη μέσω cis- ή trans-μηχανισμών. Εδώ βρήκαμε ότι lncRNAs πάνω ρυθμισμένα σε SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR σε σύγκριση με SGC7901lncRNA όπως AF119893, η οποία ήταν ιντρονικές αντινόημα προς NRP2 (νευροπιλίνη-2). Έχει προταθεί ότι ο άξονας NRP2 /VEGF-C παίζει ένα ρόλο στην αντίσταση θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και της οδού VEGF-παξιλλίνη-NRP2 θα μπορούσε να αποτελέσει ένα νέο θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο και άλλες ασθένειες που σχετίζονται με αγγειογένεση. lncRNA AF461897 ήταν ιντρόνιο αίσθηση-επικάλυψη των ABCB9. Dong κλπ απέδειξε ότι miR-31 που ασκείται μία αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα πιθανότατα μέσω της αναστολής της ABCB9 και έτσι παρέχουν μία νέα στρατηγική που περιλαμβάνει τη χρήση του miR-31 ως ένας πιθανός στόχος σε NSCLC χημειοθεραπεία. lncRNA BC065904 ήταν ιντρόνιο αίσθηση-επικάλυψη των CTBP2, μία από τις μεταγραφικές συγκαταστολείς της C-τελικής πρωτεΐνης δέσμευσης (CtBP) της οικογένειας, το οποίο λειτουργούσε ως συν-καταστολέα του E2F7 και ως ρυθμιστής της απόκρισης βλάβης του DNA. lncRNA NR_026900 ήταν εξόνιο αίσθηση-επικάλυψη των QSOX1, η οποία αποδείχθηκε ότι μειώνουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του μαστού in vitro και μειώνει την ανάπτυξη του όγκου in vivo.

Από την άλλη πλευρά, lncRNAs ρυθμισμένα προς τα κάτω σε SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR σε σύγκριση με SGC7901lncRNA όπως AF113689 ήταν φυσικό αντίθετης φοράς να RRM1. Khatri κλπ έχουν αναφέρει ότι η προ-έκθεση του RRM1 siRNA μείωσε την τιμή IC50 του υδροχλωρική γεμσιταβίνη 5 πτυχώσεις σε Α-549 κύτταρα σε σύγκριση με μονοθεραπεία υδροχλωρική γεμσιταβίνη, υποδεικνύοντας ότι RRM1 ήταν ένας πιθανός ογκογονίδιο του καρκίνου του πνεύμονα. lncRNA uc010iyh ήταν ιντρονικές αντινόημα του ΝΑΙΡ (νευρωνική απόπτωση Πρωτεΐνη Παρεμποδίσεως), η οποία είναι μία από τις οικογένειας ΙΑΡ. Έχει δειχθεί ότι ΙΑΡ θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην διαταραχή του προστάτη (ΚΥΠ, ΡΙΝ και PC) ανάπτυξη αφού θα μπορούσε να προκαλέσει αναστολή της απόπτωσης και στη συνέχεια πολλαπλασιασμό των κυττάρων. LncRNA uc003jsd ήταν εξόνιο αίσθηση-επικάλυψη των PDE4D, δηλαδή, cAMP-ειδική 3 ‘, 5’-κυκλικής φωσφοδιεστεράσης 4D. Lin κλπ έδειξε ότι λειτουργεί PDE4D ως παράγοντας προαγωγής όγκων και αποτελεί ένα μοναδικό στόχευσης ένζυμο των καρκινικών κυττάρων. LncRNA NR_002332 ήταν εξόνιο αίσθηση-επικάλυψη των ST7, καταστολέα ογκογένεσης 7, το οποίο έχει προταθεί να είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο στην περιοχή του χρωμοσώματος 7q31.1-q31.2.

ανάλυση Διαδρομή αποκάλυψε δυνητικές οδούς που εμπλέκονται στην η ανάπτυξη αντοχής πολυφαρμάκου (MDR) του γαστρικού καρκίνου. ARNT ήταν ένα από τα 20 μονοπάτια αντιστοιχούσε με συνέπεια να ρυθμίζεται προς τα πάνω μεταγραφές και αναφέρθηκε ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη αντοχής σε πολλαπλότητα φαρμάκων πολλαπλών κακοήθων όγκων [43], συμπεριλαμβανόμενου του πολλαπλού μυελώματος [44], και AML (οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας) [45] . MDR1 κωδικοποιεί την Ρ-γλυκοπρωτεΐνη η οποία είναι μια ενέργεια που εξαρτάται αντλίας εκροής που θα μπορούσε να εξάγει επίπεδη υδρόφοβα μόρια συμπεριλαμβανομένων μερικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων όπως η αδριαμυκίνη, σισπλατίνη, ταξόλη και ούτω καθεξής από το κύτταρο [46, 47]. Εδώ, βρήκαμε ότι ARNT και MDR1 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε κυτταρικές σειρές /VCR SGC7901 compacared να SGC7901, το αποτέλεσμα της σημαντικής προς τα πάνω ρύθμιση των MDR1 διαμεσολαβείται από ARNT επιμόλυνση φορέα έκφρασης SGC7901 /ADR και τέθηκε σε κίνδυνο μέσω του Sp1 siRNAs επιμόλυνση, η οποία ορίζει τον ρόλο της ARNT-MDR1pathway στον φαινότυπο MDR του γαστρικού καρκίνου.

Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι μερικά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο φαινότυπο και την ανάπτυξη των κακοηθών όγκων φαρμακευτικής αντίστασης ίσως ήταν cis-ρυθμίζεται από συσχετισμένης lncRNAs . Για παράδειγμα, ABCB1 (κασέτα ΑΤΡ-δέσμευσης, υπο-οικογένεια B (MDR /TAP), μέλος 1, P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) κωδικοποίησης γονιδίων), που βρίσκεται 400kb ανάντη lncRNA MRUL (NR_024549: MDR-σχετίζονται και ανάντη ρυθμίζονται lncRNA), ήταν σημαντικά up-ρυθμίζονται μέσα από τη δυνατότητα βελτίωσης μοιάζει ρόλο που διαδραματίζουν οι MRUL και προωθείται φαινότυπος φαρμακευτικής αντίστασης των SGC7901 /ADR και SGC7901 κύτταρα /VCR [33]? ADAM22, ένα υποψήφιο γονίδιο για κακοήθη εξαλλαγή των ωοθηκών ενδομητρίωση [48], συσχετίστηκε με lncRNA AL133090 σε ένα εξόνιο έννοια-επικαλυπτόμενα τρόπο? PLCG1 συσχετίστηκε με lncRNA AK021471 σε ένα ιντρόνιο έννοια επικαλυπτόμενες τρόπο και επαναλαμβανόμενες μεταλλάξεις στο PLCG1 εντοπίστηκε σε αγγειοσαρκώματα [49]? FYN συσχετίστηκε με lncRNA AK AK090692 σε ένα ιντρόνιο έννοια επικαλυπτόμενες τρόπο και antagomir-1290 καταστέλλει CD133 (+) κυττάρων σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα με τη στόχευση Fyn σχετίζονται Src κινάσης τυροσίνης της οικογενείας [50], κλπ

Αυτή η μελέτη κατέδειξε ότι η απορρύθμιση του lncRNAs ενεπλάκη με την ανάπτυξη της πολυφαρμακευτικής αντοχής phynotype του γαστρικού καρκίνου. Περαιτέρω ανάλυση αυτών των lncRNAs και των σχετικών οδών θα μπορούσε να προσφέρει διορατικότητα στους μηχανισμούς της χημειοθεραπείας ανθεκτικότητας στα φάρμακα του καρκίνου του στομάχου και να παρέχουν νέες κατευθύνσεις για την αντίστροφη πολυφαρμακευτικής αντίστασης phynotype.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για όλα τα δείγματα ασθενών.

κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Η κυτταρική σειρά ανθρώπινου GC SGC7901 ελήφθη από την Ακαδημία Στρατιωτικής Ιατρικής Επιστήμης (Πεκίνο, Κίνα). Δύο πολυανθεκτική υποσειρές, SGC7901 /VCR και SGC7901 /ADR, αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο μας [51]. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR και SGC7901 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 (Thermo Scientific Co., USA), που συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Thermo Scientific Co., USA) σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO2 στους 37 ° C. VCR (1,0 μg /ml) ή ADR (0,5 μg /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας των κατάλληλων κυττάρων για τη διατήρηση του φαινοτύπου ανθεκτικών στα φάρμακα.

απομόνωση RNA, την επισήμανση και τη συστοιχία υβριδισμού

Ολικό RNA συλλέχθηκε από SGC7901, SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, CA, USA) και το RNeasy κιτ (Qiagen Co., Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, που περιλαμβάνει ένα στάδιο πέψης DNase. Ολικό RNA από κάθε cellline ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας NanoDrop ND-1000 (OD 260 nm, NanoDrop, Wilmington, DE), η ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας πρότυπες μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, και η καθαρότητα κρίθηκε από την αναλογία της απορρόφησης στα 260 nm για να 280 nm (Α260 /Α280). Double-κλώνου cDNA (ds-cDNA) συνετέθη χρησιμοποιώντας 5 μg ολικού RNA από ένα κιτ σύνθεσης ds-cDNA Invitrogen SuperScript παρουσία 100 pmol ολίγο dT εναρκτήρες. Στη συνέχεια, οι ds-cDNA σημάνθηκε και εκτελέστηκε υβριδοποίηση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [52]. Η υβριδοποίηση επισήμανση RNA και μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε από KangChen Bio-tech, Σαγκάη, PR China.

Highthroughput lncRNA προφίλ έκφρασης ανάλυση

Αναγνωρισμένα RNA χρησιμοποιήθηκε για να συνθέσει δίκλωνου cDNA χρησιμοποιώντας Superscript Double- έλικος cDNA Synthesis Kit (Invitrogen Co., USA). Το δίκλωνο cDNA σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε με τον ανθρώπινο LncRNA μικροσυστοιχία V2.0 (Arraystar Co. USA). μικροσυστοιχιών V2.0 περιέχει περίπου 33.000 lncRNAs συλλέγονται από τις έγκυρες πηγές δεδομένων, συμπεριλαμβανομένων NCBI REFSEQ, UCSC, RNAdb, LncRNAs από λογοτεχνίες και UCRs. Ακολουθίες επιλέχθηκαν με ιδιόκτητο στρατηγικές. Επαναλάβετε ακολουθίες και ncRNAs μικρότερη από 200 bp διαγράφηκαν. Για να ενισχυθεί η στατιστική εμπιστοσύνη, κάθε ανθρώπινη σειρά lncRNA αποτελούνταν από 60.302 διακριτές ανιχνευτές (60 μερή) και κάθε μεταγραφή εκπροσωπήθηκε από 1-5 ανιχνευτές. Κάθε μεταγραφή εκπροσωπήθηκε από ένα συγκεκριμένο εξόνιο ή συναρμογής διασταύρωση ανιχνευτής για τον εντοπισμό μεμονωμένων μεταγραφές με ακρίβεια. Η hibridization μικροσυστοιχιών και βιοπληροφορική ανάλυση έγινε με KangChen Bio-tech, Σαγκάη, PR China. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα ένταση και κανονικοποιημένα δεδομένα παρουσιάστηκαν στη γονιδιακή έκφραση Omnibus (GSE69342: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE69342).

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

Το συνολικό RNA του SGC7901, SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, CA, USA) και ακολούθως μεταγράφηκε ανάστροφα με χρήση PrimeScript RT κιτ αντιδραστηρίου με gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Dalian της Κίνας), σύμφωνα με σκευών του κατασκευαστή. Η έκφραση του οκτώ επάνω ρυθμισμένη lncRNAs και έξι κάτω ρυθμισμένα lncRNAs μετρήθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας δοκιμασίες SYBRGreen (Takara, Dalian, Κίνα), και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα 1. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε lncRNA παρουσιάστηκε ως φορές μεταβολής χρησιμοποιώντας 2- △△ μεθόδους Ct. Το επίπεδο έκφρασης των lncRNAs διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ SGC7901 και MDR sublines SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έλεγχος τ με το λογισμικό SPSS (έκδοση 17.0 του SPSS LNC). Μια τιμή του ρ & lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Η

ιστοκαλλιέργεια Δοκιμασία Απόκρισης Φαρμάκων (HDRA) καρκινικός ιστός Φρέσκο ​​GC συλλέχθηκε από κάθε χειρουργικά δείγματος και τοποθετούνται σε ένα 24-φρεατίων. Κύβοι σπόγγου γέλης κολλαγόνου (1 cm

3) βυθίστηκαν σε 1 mL RPMI 1640 συμπλήρωση με 20% ορό εμβρύου μόσχου. ιστοί όγκων τοποθετήθηκαν επάνω σε σπόγγο κολλαγόνου ADR προστέθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 6 μg /ml και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO2 εξής. ιστούς όγκων αγωγή με φυσιολογικό ορό (N.s) χωρίς ADR χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. μέθοδοι αξιολόγησης και υπολογισμού είναι όπως περιγράφηκε προηγουμένως [53]. Το ποσοστό αναστολής (IR) της αύξησης του όγκου = (1-μέσης απορρόφησης επεξεργασμένων φρεατίων ανά γραμμάριο όγκου /μέση απορρόφηση των φρεατίων ελέγχου ανά γραμμάριο όγκου) × 100. Σε αυτή τη μελέτη, η τιμή αποκοπής IR ίση ή μεγαλύτερη από 30% (IR30) ορίστηκε ως χημειοευαισθησία σύμφωνα με προκαταρκτική μελέτη αποτέλεσμα [54]. Ακριβώς όπως με τις οδηγίες, η κλινική παθολογική πληροφορίες της πηγής του ιστού του όγκου που χρησιμοποιούνται για HDRA θα πρέπει να δοθεί αντίστοιχα παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Η

Οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Το κύτταρο ανθρώπινου GC γραμμή SGC7901 ελήφθη από την Ακαδημία Στρατιωτική Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). Πολυανθεκτική sublines SGC7901 /VCR και SGC7901 /ADR αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο μας. SGC7901 /VCR, SGC7901 /ADR, και SGC7901 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Thermo Scientific, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (ThermoScientific) σε ένα 5% CO2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C. Βινκριστίνη (VCR? Sigma, Inc., St. Louis, ΜΟ? 1,0 μg /ml) και ADR (Sigma, Inc., St. Louis, ΜΟ? 0,5 ​​μg /ml) προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας των κατάλληλων υποσειρές κυττάρων να διατηρούν τον φαινότυπο ανθεκτικών στα φάρμακα

Κατασκευή pcDNA3.1 (+) -. ARNT πλασμίδιο

Για να υπερεκφράζουν ARNT, pcDNA3.1 (+) – ARNT πλασμίδιο κατασκευάστηκε. Το ανθρώπινο φορέα έκφρασης ARNT cDNA (pcDNA3.1 (+) – ARNT) κατασκευάστηκε από CW Biotech Co., Ltd, Πεκίνο, Κίνα. Εν συντομία, το πλασμίδιο pcDNA3.1 (+) – ARNT δημιουργήθηκε σύμφωνα με την αλληλουχία cDNA από GenBank. Το γονίδιο ARNT δημιουργήθηκε με PCR ενίσχυση. Το πλασμίδιο pcDNA3.1 (+) εξήχθη μέσω ενός κιτ Maxi Παρασκευής (Omega, Georgia, USA). Το προϊόν PCR υποκλωνοποιήθηκε στο BamHI (Takara, Mountain View, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) και Hind III (Takara) θέσεις ροϋΝΑ3.1 πλασμιδίου με Τ4 (Takara, Mountain View, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Η pcDNA3.1 (+) -. ARNT κατασκεύασμα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA (Invitrogen, Grand Island, USA) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών ARNT

SGC7901 /ADR κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 12 φρεατίων με 1.0 × 10

5 κύτταρα σε κάθε φρεάτιο, σε έναν επωαστήρα με σταθερή παροχή 5% CO2 στους 37 ° C. Το μέσο αλλάχθηκε 24 ώρες αργότερα με διαφορετικές συγκεντρώσεις G418 αντιβιοτικό G418 (600 μg /mL) και αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες για 14 ημέρες μετά την καλλιέργεια κυττάρων. Γονικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με το pcDNA3.1 (+) – ARNT πλασμίδια χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η πυκνότητα των κυττάρων ήταν 2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων. αποικία Μονοκλωνικά κυττάρου με αντίσταση G418 παρήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο περιοριστικής αραίωσης με καλλιέργεια απλού κυττάρου σε 100 μικρόλιτρα μέσου σε πλάκες 96-φρεατίων για 24 ώρες. αποικίες Μονοκλωνικά κύτταρο χωνεύτηκαν 15 ημέρες αργότερα για περαιτέρω ενίσχυση για την καλλιέργεια κυττάρων με σταθερή ARNT έκφραση σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε φιάλη καλλιέργειας κυττάρων μέχρι υπήρχε περίπου 90% συρροή. Οι υπερ-εκφράζεται κυτταρικές σειρές ARNT επιμολυσμένα με pcDNA3.1 (+) – ARNT ονομάστηκαν ως SGC7901 /ADR ARNT

Μικρές παρεμβολές RNA (siRNA) επιμόλυνση

Για να νοκ ντάουν η έκφραση ARNT mRNA. , siRNA διαμόλυνση εκτελέστηκε. Για επιμολύνσεις, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και 50 ηΜ siRNA (Gene Pharma Co., Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [55]. Οι αλληλουχίες siRNA που χρησιμοποιούνται είναι: 5′-AGUUUAUCCACAUCAUCUGGG-3 ‘, 5′-CAGAUGAUGUGGAUAAACUUC-3’

κηλίδωση Western

συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (1 mM. ) στον πάγο. Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση διαμέσου γελών SDS πολυακρυλαμιδίου 12% και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Millipore, Massachusetts, USA). 5% άπαχο γάλα σε σκόνη που χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει τις μεμβράνες σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και τα πρωτεύοντα αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με HRP επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου μετά από τρεις 10 λεπτών πλύσεις σε τριαιθανολαμίνη ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween (TBS-T). Τέλος, τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) και οι μεμβράνες σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, California, USA) σύστημα απεικόνισης με λογισμικό απεικόνισης (Έκδοση 1.0) .